一、平滑肌内向整流钾通道(K_(IR))（论文文献综述）
徐艳艳[1]（2021）在《KCNJ11 rs5210位点多态性与非酒精性脂肪性肝病及冠心病的相关性研究》文中研究表明目的:内向整流钾通道蛋白J亚单位11号成员（potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 11,KCNJ11）基因rs5210与2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）的易感性密切相关,鉴于冠心病（coronary artery disease,CAD）、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）及T2DM同为代谢性疾病,有多种共同的危险因素,例如肥胖,胰岛素抵抗,高血压或高血脂,其亦可能具有共同的易感性多态性位点,目前,尚无同时纳入CAD及NAFLD患者的KCNJ11 rs5210的相关研究,本研究旨在探究在青岛地区汉族人群中,KCNJ11 rs5210位点多态性与NAFLD及CAD的相关性。方法:（1）本研究共纳入905人,分为四组,包括NAFLD组246人,CAD组201人,NAFLD+CAD组116人,健康对照组342人。（2）采集受试者的年龄、性别等基本临床信息及生物化学指标,包括空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、甘油三酯（triglycerides,TG）、总胆红素（Total bilirubin,TBil）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein,LDL）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、r-谷氨酰转移酶（Gama-glutamyl transferase,γ-GT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）。（3）提取全血基因组DNA,采用多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）的方法进行KCNJ11 rs5210基因型测定。（4）应用SPSS 25.0统计软件,认为P<0.05为差异具有统计学意义,应用单因素方差分析、卡方检验、Kruskal-Wallis H检验、非条件logistic回归分析等进行数据处理,分析KCNJ11 rs5210多态性与NAFLD、CAD、NAFLD+CAD发病风险的相关性。结果:（1）四组之间的一般临床资料及生化指标分别进行比较,结果表明,四组之间在年龄、性别、TG、TC、LDL、HDL、BMI、ALT、AST、r-GT、ALP、TBil、FPG之间具有统计学差异（P<0.05）。（2）经测序发现KCNJ11 rs5210具有AA、GA、GG 3种基因型,经统计学分析发现rs5210位点等位基因频率和基因型分布在NAFLD组、CAD组、对照组及NAFLD+CAD组之间均无统计学差异（P均>0.05）。两两比较,GG+GA携带者与AA携带者NAFLD及CAD发病风险无明显差异（P均>0.05）。经校正年龄、性别、BMI,亦无统计学差异（P均>0.05）。（3）在NAFLD组中,与携带AA基因型受试者相比,GA基因型携带者具有更高的BMI,更高的TBil水平（P均<0.05）,经进一步非条件logistic回归分析表明携带KCNJ11 rs 5210 G等位基因与BMI、TBil水平升高相关（P<0.05）,经校正年龄、性别、BMI,仍具有统计学差异（P<0.05）;全部受试人群中,携带AA基因型受试者ALP水平高于GA基因型（P<0.05）,而经进一步非条件logistic回归分析表明KCNJ11位点多态性与ALP水平无明显相关性（P>0.05）,经校正年龄、性别、BMI,仍无统计学差异（P>0.05）;NAFLD+CAD组中,携带KCNJ11 rs 5210 G等位基因与FPG水平升高相关（P<0.05）,经校正年龄、性别、BMI,仍具有统计学差异（P<0.05）。（4）经非条件logistic回归分析表明,BMI升高、HDL降低与NAFLD患病风险具有相关性;FPG升高、HDL降低与CAD、NAFLD+CAD患病风险具有相关性（P均<0.05）。结论:（1）KCNJ11 rs5210基因多态性与青岛地区汉族人群NAFLD、CAD、NAFLD合并CAD的发病风险无明显相关性。（2）携带KCNJ11 rs5210 G等位基因与NAFLD患者BMI、TBil水平升高有关,与NAFLD合并CAD患者FPG水平升高有关。
李思宇[2]（2021）在《基于冷冻电镜的离子通道门控调节机制分析》文中研究表明离子通道广泛地分布在人体的各个组织中,在众多生理过程中都起到了异常重要的作用。离子通道又可以具体划分为电压门控离子通道、配体门控离子通道和机械门控离子通道。离子通道的活性受到多种因素调节,除去电势变化、配体分子或表面张力这类固有的影响因素外,化学小分子和多肽类也可以对离子通道活性起到调控作用。对离子通道的活性调控研究是离子通道领域研究的基本科学问题之一,对我们理解离子通道的门控机制有着重要意义。在博士研究生阶段,我选择了电压门控离子通道KAT1和配体门控离子通道ASIC1a作为研究对象,借助结构生物学技术和膜片钳电生理技术,对上述离子通道的门控调节机制进行研究。本文的第一部分我们对KAT1的超极化激活机制进行了研究。KAT1是一个超极化激活的内向整流钾通道,存在于拟南芥中。我们解析了 KAT1的冷冻电镜结构,分辨率为3.2 A。这是第一个植物中的电压门控钾通道的电镜结构。我们发现,KAT1是一个同源四聚体,并且是“非结构域交换”的通道。其每一个单体都包含了六根螺旋形成的跨膜结构域、延伸到胞内区的C-linker结构域和C端的CNBD结构域。KAT1具有典型的钾离子选择性过滤器结构,能够选择性地渗透钾离子。通过结构分析我们发现,KAT1通道的孔道区处于关闭状态。KAT1是一个严格的超极化门控离子通道,我们对KAT1的S4螺旋上的带正电氨基酸进行分析,发现这些带正电氨基酸残基对电压感受非常重要。虽然KAT1结构中包含CNBD结构域,但是无论是结构分析或是功能实验,我们均发现cGMP不能对KAT1的通道活性进行调节。在KAT1通道中,S4-S5 linker是一段短loop结构,这个linker区域与C-linker之间的相互作用对通道的开放或关闭起到了重要的作用。如果将这两个结构域之间的相互作用削弱,则会导致通道不能正常开放。这表示S4-S5 linker和C-linker之间的相互作用是KAT1通道门控调节的关键。本文的第二部分,我们对多肽毒素如何结合并调控人源酸敏感离子通道ASIC1a活性进行了研究。人源酸敏感离子通道ASIC1a（hASIC1a）主要分布于中枢神经系统和外周神经系统中,ASIC1a通道主要参与疼痛感知、学习记忆等生理过程,是潜在的药物靶点。hASIC1a通道的活性受到质子浓度的调控,同时还有多种因素可以对通道活性进行调节,比如多肽毒素。非洲黑曼巴蛇毒Mambal对hASIC1a活性起到抑制作用。经过多重蛋白表达纯化优化步骤和结构解析方法的选择,我们最终利用冷冻电镜解析了 hASIC1a的apo状态和Mamba1-hASIC1a复合物的结构,分辨率分别为3.56A和3.9A。与已解析的鸡源ASIC1（cASIC1）结构相比,处于静息状态的hASIC1a与cASIC1通道具有相似的结构,是一个同源三聚体,其门控机制与cASIC1相似。Mamba1毒素主要结合于hASIC1a的胞外结构域,当毒素与通道结合后,通道局部发生了构象变化。Mamba1将hASIC1a锁定在关闭构象。我们发现虽然Mamba1对hASIC1a和cASIC1的亲和力相似,但毒素对hASIC1a的抑制作用强于对cASIC1通道的抑制作用。通过序列比对分析和结构比较,我们发现了对hASIC1a和cASIC1的抑制作用不同的关键氨基酸残基。Arg155和Glu102-Asp165对（分别对应于cASIC1中的Leu156和Arg103-Glu168）,导致了hASIC1a和cASIC1对Mamba1的反应不同。
苏金玉[3]（2020）在《抗氧化型低密度脂蛋白的抗体通过调节单核巨噬细胞的Ca2+/K+通道抑制MCP-1的释放》文中进行了进一步梳理动脉粥样硬化是一种由于脂质代谢不平衡,即高脂血症导致的慢性炎症疾病。氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）通过诱导巨噬细胞释放单核细胞趋化因子（MCP-1）和吞噬过多脂质导致泡沫细胞形成和脂质斑块在血管内膜的堆积。近几年来,研究发现oxLDL的疫苗及其抗体可以预防和治疗动脉粥样硬化,而且抗oxLDL的抗体（BI-204）在体外可以减少单核巨噬细胞释放致炎因子MCP-1。然而,目前并不清楚抗oxLDL的抗体（BI-204）抑制MCP-1释放的分子机制。本课题中,我们验证了 oxLDL通过TLR-4和MAPK信号通路诱导单核巨噬细胞释放MCP-1。用CD36、TLR-4、SR-AI和LOX-1的抑制性抗体作用于单核巨噬细胞,只有TLR-4的抑制性抗体才可以阻滞oxLDL诱导的MCP-1的释放。与此不同,分别抑制p38 MAPK、JNK和ERK信号通路均可抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放。我们的结果还显示,MCP-1的释放受单核巨噬细胞膜上的钙离子通道和钾离子通道的调节。应用钙离子通道抑制剂硝苯地平和钾离子通道（钾离子外流）抑制剂格列本脲呈剂量依赖性地抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放。而且在荧光共聚焦显微镜下,oxLDL显着地促进细胞外钙离子流入胞内,并导致细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）震荡增加。用膜片钳技术检测巨噬细胞膜上的离子通道电流,结果显示oxLDL明显抑制内向整流钾离子通道（Kir）活动。而且抑制JNK和ERK均阻滞oxLDL诱导的[Ca2+]i震荡和Kir通道的改变。而应用oxLDL的单克隆抗体BI-204显着地抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放,并且恢复了Kir通道的活性,而且BI-204是通过与单核巨噬细胞膜上的FcγRIIB结合来介导的抑炎作用。值得注意的是,BI-204特异性地抑制oxLDL诱导的ERK的磷酸化,而对JNK和p38 MAPK没有影响。综上,oxLDL通过TLR-4激活单核巨噬细胞内MAPK信号通路,被激活的JNK或ERK抑制Kir通道活动并增加钙离子内流从而促进MCP-1释放到胞外。而抗oxLDL的抗体BI-204则通过与Fcγ RIIB结合,特异性地抑制细胞内的ERK信号通路,继而恢复Kir的活动和减少钙离子流入胞内,从而抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放。所以我们的研究揭示了抗oxLDL的抗体BI-204在动脉粥样硬化动物模型中发挥抑炎作用的分子机制,为针对抗原的抗体治疗方法提供理论依据。
陈沛沛[4]（2020）在《利用诱导多能干细胞探索长QT综合征7型心肌发育分化相关致病调节机制》文中研究说明[背景]由KCNJ2基因突变引起的长QT综合征7型Andersen-Tawil综合征（Andersen-Tawil syndrome,ATS）常导致室性心律失常,周期性麻痹和骨骼发育畸形临床三联征。既往研究发现全基因敲除的动物出现发育畸形,且不能长期存活。已有研究证实该基因突变影响了颅面部发育时的膜电位电压变化,进而影响重要的颅面相关基因表达导致ATS患者颅面部发育畸形。因此证明该致病基因会影响正常器官发育。心肌细胞的发育分化及电生理成熟对心脏功能至关重要,其改变可能促进ATS疾病的病理生理。尽管人们初步了解ATS心肌QT间期延长的原因与内向整流钾通道相关,但KCNJ2基因对心肌细胞正常的发育分化影响知之甚少。[目的]本研究拟建立可特异性复现ATS疾病表型的人类心肌细胞模型,更好的了解KCNJ2基因对心肌细胞发育分化的致病调节机制,探索潜在的转录因子和相关靶基因。[方法]利用ATS患者的外周血重编程为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）,并同时和进行了 Crispr修复突变位点的修复CRISPR组iPSC一起定向分化为心肌细胞（induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,iPSC-CM）。iPSC经过形态学、核型分析、畸胎瘤实验、流式检测、免疫共聚焦染色及qPCR实验来鉴定。iPSC-CM经过形态学自主搏动记录、免疫共聚焦染色及膜片钳动作电位和Kir2.1通道电流变化来鉴定。根据发育分化经典的不同阶段进行基因及染色质开放性检测。使用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）对发育分化特定阶段的共表达基因群进行模块分类及权重评分,并将权重排名前100位的基因与人类转录因子JASPAR数据库进行比对获得潜在调控的转录因子,并利用同步检测的ATAC-seq染色质开放性表观遗传学数据来验证这些特定阶段潜在转录因子。最后通过新收集最接近临床表型的两组成熟心肌细胞,联合转录组和蛋白组数据,使用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）从通路角度整体进行联合分析,评估钾离子相关通路调控状态,同时也能在转录和蛋白水平关联分析中找出关键靶基因,并进行验证,以获得可能受到转录因子调控的疾病相关的关键靶基因。[结果]成功建立了稳定传代,均一的突变与修复组的诱导多能干细胞系,既保留了患者特异性的遗传信息,同时也具有可诱导定向分化的干细胞特性。并且成功分化了突变组与修复组的心肌细胞,可自主规律搏动,分化率>90%,突变组搏动率明显低于修复组,心肌特异性标志物（TNNT2和NKX2.5）均阳性。突变组的动作电位时程延长,内向整流钾离子通道Kir2.1电流呈现负向效应特征,与患者临床表型一致;修复组与健康对照组的电生理特征无明显差异。WCGNA分析结果显示一致性发育分化相关的染色质开放可及性增高的转录因子有5个:中胚层（Day2,MIXL1）;心脏中胚层前体细胞（Day4,GBX1）;早期搏动心肌（Day8,DLX5）;电生理成熟心肌（Day15,HOXB4）;晚期心肌（Day30,ZEB1）。致病性相关的转录因子仅有ZNF528,从心脏中胚层前体细胞阶段（Day4）开始开放调控,并在突变组持续低表达。上述转录因子均获得了 ATAC-seq数据的验证。随后在新收集的晚期心肌细胞中同步检测转录组和蛋白组,使用ssGSEA在基因和蛋白层面同时评估钾离子通道相关通路的整体调控状态,结果显示突变组与修复组有7条差异钾离子通道相关通路富集分数显着降低（P均<0.05）。含突变基因KCNJ2参与的3条钾离子相关通路与内向整流钾通道的钾离子进入细胞内发挥作用的全程相关,从电压门控钾通道复合体感应（GO:0008076）,随后钾离子跨膜进入到细胞内（GO:1990573）,最后到维持细胞内钾离子稳态（GO:0030007）的通路均受到抑制。另外同时受到影响的4条通路与调控钾离子跨膜途径和钠:钾交换ATP酶相关（P均<0.05）。这些下调的钾离子通道相关通路差异基因共有19个,差异蛋白有4个,关联交集分析获得趋势一致的差异低表达的基因蛋白有3个（KCNJ2、CTTN和ATP1B1）,即可能是潜在被转录因子ZNF528开放性降低所下调显着的关键靶蛋白。[结论]建立了特异性复现ATS疾病表型的人类心肌细胞模型可为探索疾病机制或药物治疗提供可靠的平台。验证了 ATS早期心肌发育分化不同阶段的转录因子（MIXL1、GBX1、DLX5、HOXB4和ZEB1）,以及致病性相关的潜在转录因子ZNF528。成熟的心肌细胞中钾离子内流全程和能量消耗相关通路受到明显抑制,受到突变KCNJ2基因的直接或间接影响,关联分析获得转录因子ZNF528潜在调节下调显着的3个关键靶蛋白（KCNJ2,CTTN和ATP1B1）。转录因子及关键靶蛋白的低表达可能导致或加重ATS患者心肌发育功能和电生理成熟的异常。今后有望通过干预关键调节转录因子,以达到调节靶基因的作用,从而改善ATS患者心肌电生理紊乱的症状,为治疗罕见病提供新的思路。
钮建国[5]（2019）在《氟啶虫酰胺对昆虫取食与排泄影响的毒理机制》文中研究表明氟啶虫酰胺是一种选择性杀虫剂,主要用于防治刺吸式口器害虫,但其作用机制一直未知,本实验室最近的研究发现该杀虫剂对内向整流钾离子通道（Kir）有高活性的抑制作用,指出氟啶虫酰胺的分子靶标是Kir通道。但Kir通道被抑制后影响了哪些生理过程,是什么生理功能的破坏并导致害虫致死的机制并不清楚。因此,本研究拟开展氟啶虫酰胺的生理毒理机制问题。首先通过分析褐飞虱与甜菜夜蛾Kir基因的组织表达特点,分析基因特异表达相关组织或器官的生理功能,开展氟啶虫酰胺对取食与排泄功能影响的研究,具体研究结果如下:1.褐飞虱和甜菜夜蛾Kir基因的组织表达特征在实验室前期研究已克隆得到3个褐飞虱Kir基因与5个甜菜夜蛾Kir基因的基础上,通过转录组信息分析,推测甜菜夜蛾仍有一个Kir基因未克隆到。本研究根据甜菜夜蛾的转录组数据及近缘种的基因组数据,设计特异性引物,克隆得到了第6个甜菜夜蛾Kir基因SeKir2C,该基因编码典型的内向整流钾离子通道,与前期得到的Kir 一样,具有两个跨膜结构域TM1和TM2、位于胞质域的N-端和C-端和负责钾离子选择性通过的螺旋孔区H5。利用荧光定量PCR技术,对褐飞虱和甜菜夜蛾的Kir基因进行组织表达分析,发现褐飞虱和甜菜夜蛾的Kir1基因在唾液腺表达水平最高,而Kir2和Kir3通道基因主要在马氏管的表达量较高,这种组织表达特征说明Kir通道参与对昆虫取食与排泄行为的调控作用。2.氟啶虫酰胺等药剂对昆虫取食的影响本研究以褐飞虱、甜菜夜蛾和美洲大蠊为研究对象,通过观察褐飞虱分泌的唾液鞘、测定甜菜夜蛾取食包菜面积、测定美洲大蠊取食类胡萝卜素的含量和美洲大蠊唾液腺分泌量来说明氟啶虫酰胺等药剂对昆虫取食的影响。发现氟啶虫酰胺处理后褐飞虱的唾液分泌显着被抑制,形成的唾液鞘数量减少（IC50=3.81 mg/L）,唾液鞘总长减少（IC50=4.16 mg/L）。同时也观察到氟啶虫酰胺对甜菜夜蛾幼虫取食的抑制作用,而且氟啶虫酰胺的代谢物三氟甲基烟酰胺也可抑制甜菜夜蛾幼虫的取食。还比较了氟啶虫酰胺以及代谢物与Kir通道抑制剂VU590、VU041对美洲大蠊取食与离体唾液腺分泌活性的影响,观察到氟啶虫酰胺、三氟甲基烟酰胺以及Kir通道抑制剂VU590、VU041,甚至哌虫啶对美洲大蠊取食的显着抑制作用。对美洲大蠊离体唾液腺分泌活性测定表明,氟啶虫酰胺及其代谢物三氟甲基烟酰胺与Kir通道抑制剂VU590、VU041一样,可抑制离体唾液腺的分泌活性,哌虫啶也可抑制离体唾液腺的分泌,但吡蚜酮与环氧虫啶对离体唾液腺的分泌没有影响。说明氟啶虫酰胺与VU590和VU041一样,通过抑制Kir通道影响昆虫唾液分泌,从而干扰了昆虫的取食行为。3.氟啶虫酰胺等药剂对昆虫排泄的影响本研究以褐飞虱与淡色库蚊为研究对象,采用测定褐飞虱蜜露排泄量和淡色库蚊马氏管的分泌量的方法说明氟啶虫酰胺等药剂对昆虫排泄的影响。发现氟啶虫酰胺处理后,褐飞虱的蜜露排泄量显着减少（LC50=6.94mg/L）,氟啶虫酰胺同样可抑制淡色库蚊的排泄（ED50=9.45 ng/头）,其代谢物三氟甲基烟酰胺也有类似的抑制作用（ED50=82.52ng/头）,甚至造成淡色库蚊的致死效应,ED50值分别为15.38 ng/头与47.53 ng/头。进一步分析发现氟啶虫酰胺、三氟甲基烟酰胺与VU590一样可显着抑制离体马氏管的分泌活性,哌虫啶也对离体马氏管的分泌活性有抑制作用,而吡虫啉和吡蚜酮对离体马氏管的分泌活性没有影响。说明氟啶虫酰胺通过抑制Kir通道,干扰破坏马氏管的正常分泌活性,从而影响昆虫的排泄并导致昆虫致死。通过上述取食与排泄测定研究,尤其是离体唾液腺分泌活性与离体马氏管排泄活性的研究,说明氟啶虫酰胺及其代谢物三氟甲基烟酰胺与Kir通道抑制剂一样,可影响唾液腺与马氏管的分泌活性,破坏昆虫的取食与排泄过程造成致死效应,这可能就是氟啶虫酰胺的毒理机制,同时还发现氟啶虫酰胺的代谢产物三氟甲基烟酰胺也有杀虫作用,推测氟啶虫酰胺可能是一种前药。另外,还发现过去认为是新烟碱类杀虫剂的哌虫啶也可抑制唾液腺与马氏管的分泌活性,Kir通道也可能是其作用靶标之一。
肖华[6]（2018）在《Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究》文中研究指明一、背景和目的目前构建心脏生物起搏细胞主要有两种策略:以基因为基础和以细胞为基础。前一种方法根据窦房结（SAN）细胞特异的离子通道和对胚胎SAN发育起关键作用的转录因子,采用单个基因或者多基因组合进行转染干预。过表达超级化激活环核苷酸门控（HCN）通道,产生对自主神经调节敏感的起搏电流（If）是以基因为基础的构建生物起搏点的策略之一,这种类型的通道产生的内向电流主要在舒张期,从而避免了对动作电位的干扰。T盒基因（Tbx）家族是心肌细胞形成和分化的主要调控因子,如Tbx3,Tbx5和Tbx18在胚胎SAN发育中起关键作用,而这些因子的上游是Tbx18,已有研究显示单用Tbx18转录因子即可将静止心肌诱导成心脏起搏样细胞并显示出该因子在构建心脏生物起搏器方面广阔的应用前景。后一种以细胞为基础构建的方法包括两个方面:直接将细胞转化为SAN样起搏细胞和将细胞作为基因的运输载体。骨髓间充质干细胞（MSCs）是心脏生物起搏器理想的干细胞来源,具有免疫豁免优势和相对电静止特性。且能够很容易通过缝隙连接与相邻的细胞进行偶联。MSCs具有直接分化为心肌细胞的能力,但这种能力非常弱。c-kit是心脏前体细胞的标记,在MSCs也有表达,犬MSCs（cMSCs）和心肌细胞一样都来自早期中胚层,不同的分化调控因子决定了其各自不同的分化方向。本实验将SAN发育过程中重要的调控因子Tbx18在c-kit+cMSCs过表达,研究是否能介导c-kit+cMSCs向SAN细胞分化,从而具有天然SAN细胞相似的表观特征。同时研究Tbx18转染的c-kit+cMSCs在与犬心房肌共培养的环境中能否与其形成偶联,从而构成功能性的合胞体。心脏的电偶联由缝隙链接介导,缝隙连接蛋白（connexin,Cx）组成的跨膜通道聚合体构成了细胞间的缝隙链接。不同的聚合体由于排列方式的不同分为同聚体同侧型、同聚体异侧型、异聚体同侧型和异聚体异侧型四类。通过允许小分子和离子沿其电化学梯度扩散,缝隙链接为电冲动的扩步提供了低电阻路径。目前在人类发现的Cx有21种,它们各自具有不同的生物物理学性质,包括电导、电压、PH、对离子和小分子（荧光染料）的选择性通透。细胞间的偶联由Cx的数量和Cx所构成通道的活性所决定,这些都受到上游转录调控因子的严格管控。目前在心脏发现有4种Cx表达:connexin43（Cx43）,Cx40,Cx45和Cx37。这些Cx在心脏不同区域表达目的是传递不同的被动电学特性,其中Cx45主要在哺乳动物SAN细胞表达,是对缝隙链接处电压变化最敏感的Cx,当其细胞质相对于周围细胞电位偏负时,Cx45通道将关闭,这将有效防止周围心肌的除极电流返流入SAN细胞,干扰正常电冲动的传导顺序。以往的在体研究仅单纯用HCN4病毒载体转染MSCs,这种构建方式得到的生物起搏频率远远低于正常SAN的起博频率,本实验采用编码Cx45的缝隙连接蛋白α7（gap junction protein-alpha 7,GJA7）基因与HCN4基因两个慢病毒载体共转染cMSCs,研究是否能进一步促使单纯HCN4病毒载体转染cMSCs向SAN样细胞分化。将HCN2过表达的MSCs注射入房室传导阻滞犬的左心室游离壁可以获得满足生理需要的起搏频率和对儿茶酚胺药物的反应性,但该起搏功能在注射后8周即开始下降,由于没有发生排斥反应和细胞凋亡现象,考虑该原因是由于细胞从注射部位迁移。因此采用生物材料将细胞包裹固定是目前的研究热点,壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,其在37°℃能发生溶液-凝胶转变,具有较少的化学交联毒性。本实验选用壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,将这种可注射生物材料包裹病毒转染的cMSCs,去评价这种生物高聚物能否作为细胞的输送载体为细胞的存活和固定提供适宜的基质环境,观察细胞在温敏水凝胶内的存活增殖情况,为下一步在体动物实验研究打下基础。研究方法:1.培养 cMSCs 和分选 c-kit+cMSCs。cMSCs首先从新生犬股骨和胫骨分离和培养。一部分正常培养传代,一部分用流式活细胞分选技术从P3代cMSCs中分选出c-kit+cMSCs,并进行细胞表面抗原鉴定（CD45/CD29/CD44）。2.构建hTbx18慢病毒载体转染c-kit+cMSCs;构建hHCN4和hGJA7慢病毒载体单独或者共同转染cMSCs。2.1 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>hTBX18[NM 001080508.2]:T2A:{EYFP}作为实验组,构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>{EYFP}作为对照组。将已构建好的两组慢病毒载体分别转染c-kit+cMSCs获得Tbx18-EYFP-c-kit+c MSCs和EYFP-c-kit+cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybr ene的最适浓度。细胞转染4天后行RT-PCR实验验证hTbx18基因在Tbx18-EYFP-c-ki t+cMSCs中过表达。2.2 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>hHCN4[NM 005477.2]和 pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJC1[NM005497.3]作为实验组,构建pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-Null作为对照组。将构建好的慢病毒载体分别转染cMSCs得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和GFP-cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybrene的最适浓度。在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs首先通过2μg/mL的嘌呤霉素纯化5天,再加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJ C1进行共转染。以上步骤共构建成功:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs及其对照组EYFP-c-kit+cMSCs;HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 和 HCN4+GJA7-cMS Cs共转染组。3.进行犬SAN和犬心房肌细胞原代分离培养及体外共培养环境。犬SAN原代细胞被分离后制备成悬浮细胞,新鲜分离的细胞作为阳性对照组,6小时内用于后续实验。犬心房肌从新生犬右心房分离,采用差速贴壁及5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）方法纯化培养细胞。原代心房肌细胞培养24小时后,以4:1的比例（80%心房肌细胞）分别与上述转染细胞混合进行共培养。4.各组细胞的功能检测。4.1 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs在转染后4天分别收集进行SAN特异型特征的检测,并于新生犬SAN细胞进行对比;Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后进行细胞膜片钳检测各组If电流生成情况,用Lucifer荧光黄染料进行细胞间缝隙连接评价,并于新生犬SAN细胞进行对比。4.1.1细胞内环磷酸腺苷[1]分析:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs细胞内 cAMP水平。4.1.2 RT-qPCR:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中Cx45,Kir2.1,PLB 和α-actinin相对mRNA表达水平。4.1.3 WB:监测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs中HCN4,Cx45,PLB,p-PLB和α-actinin的蛋白表达水平。4.1.4 免疫荧光:检测Cx45在犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中的免疫荧光显像。4.1.5共培养环境下转染细胞的电生理检测:采用全细胞膜片钳和穿孔全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案记录特征性的If电流,评价该通道的激活和失活特性,测试其对异丙肾上腺素药物刺激的反应,染料转移实验评价缝隙连接情况。4.2 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后,加入2μgmL的嘌呤霉素连续五天以清除心房肌细胞,收集各组细胞行SAN细胞特异性指标检测和细胞膜片钳检测If电流生成情况。4.2.1 RT-qPCR:检测 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs中Cx45,Cx43,Tbx3,Tbx18和编码同源异型盒蛋白Nkx-2.5的基因（Nkx2.5）相对mRNA表达水平。4.2.2细胞膜片钳检测:采用全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案对比各组记录到的特征性的If电流。5.转染细胞与温敏水凝胶共培养及功能检测。5.1浸提实验和CCK-8检测:用来评价温敏水凝胶材料的细胞毒性。以不含细胞的纯培养基为空白对照组,以培养基中含有0.64%萘酚为阳性对照组,以不含浸提液的纯培养基为阴性对照组,每组均设6个复孔。5.2 CCK-8检测转染细胞胶内增殖情况:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别于转染后72小时和温敏水凝胶共培养,cMSCs,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组,每组均设6个复孔,CCK-8试剂于1天,4天,7天检测,观察胶内细胞增殖情况。5.3 激光共聚焦检测:观察 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶材料共培养4天后凝胶内细胞形态。5.4 iCelligence实时检测:评价Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 在凝胶内实时生长情况,cMSCs,Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组。结果:1.流式活细胞分选将c-kit+细胞分选出来,分选后分析显示c-kit+细胞纯度大于90%,死细胞数小于10%,细胞表面抗原鉴定显示CD29+,CD44+,CD45-。2.pLV-hTbx18-EYFP或pLV-EYFP使用5μg/mL polybrene,以MOI=100的浓度分别转染c-kit+cMSCs 24小时得到Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs。病毒转染后48小时,转染的c-kit+cMSCs展现黄色荧光,6个不同随机视野下激光共聚焦显微镜分析pLV-hTbx18-EYFP的转染效率为94±3.5%,pLV-EYFP-cMSCs的转染效率为96±2.5%。RT-PCR显示基于人Tbx1 8设计的引物可以在Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs中检测到Tbx1 8的表达。使用6μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度转染24小时得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs,GFP-cMSCs,病毒转染后72小时,转染的cMSCs分别展现绿色,红色和绿色荧光,6个不同随机视野下荧光显微镜分析三组细胞的转染效率均大于90%,在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs中加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1 A>hGJC1,用6 μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度进行共转染,用2μg/mL嘌呤霉素纯化转染细胞5天,6个不同随机视野下荧光显微镜分析共转染细胞表达黄色荧光,转染效率大于95%。3.新鲜分离的犬原代SAN细胞以细条钩形居多,细胞出现不规则节律性搏动,新鲜分离的犬原代心房肌细胞培养24小时可见完全贴壁生长,呈长杆状。按照4（心房肌细胞）:1的比例将Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs或EYFP-c-kit+cMSCs或HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs或GFP-cMSCs或HCN4+GJA7-cMSCs与心房肌分别混合,3天后各组共培养细胞生长成单层细胞。4.Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs具有天然SAN细胞的关键特征。Tbx18-EYFP-c-kit+cMS Cs同SAN细胞一样具有高的细胞内cAMP水平（n=3）。Cx45,Kir2.1,PLB,α-actinin的相对mRNA表达水平在Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs是上调的。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和SAN细胞的HCN4,Cx45,PLB,p-PLB,α-actinin蛋白表达水平相似,与EYFP-c-kit+c MSCs明显不同。其中HCN4和Cx45的蛋白水平在Tbx18-c-kit+cMSCs分别是EYFP-c-kit+cMSCs的12倍和5.6倍。Cx45免疫荧光显像示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相似SAN细胞有Cx 45 表达,而 EYFP-c-kit+cMSCs 未见 Cx45 表达。在与犬心房肌共培养三天后,If电流的特征被记录。通过构建回归模型发现Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和 SAN的If电流趋势极其相似（I=-89.368+82.306 V-19.975 V 2+0.868 V3,F=693.056,Sig.<0.01,R2=0.983 vs.I=-110.892+102.927 V-26.637 V2+1.204 V3,F=649.977,Sig.<0.01,R2=0.982）。If电流的激活曲线显示V1/2在Tbx 18-EYFP-c-kit+cMSC s和S AN细胞之间有明显差异（-82.5±4.6,n=22 vs.-77.2±6.3 mV,n=18;P<0.05）,但是斜率因子K没有达到统计学意义上的差异（-7.7±0.4,n=22 vs.-8.1±0.2 mV,n=18;P=0.573）。相比SAN细胞,Tbx18-c-kit+cMSCs 有更正的反转电位（-18.41±1.2 mV,n=12 vs.-23.19±1.6 mV,n=10;P<0.05）。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的激活时间常数在 660±27（-120mV）～1880±103（-80mV）毫秒,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的失活时间常数在 1000±99（-70mV）～210±19（-40mV）毫秒。给予3μmol/L异丙肾上腺素,If电流的激活时间（-120 mV）减少了26±2%（n=8）。V1/2朝向去极化方向移动了大约 6.1 mV（从-84.9±5.6到-78.8±4.8 mV,n=8;P<0.05）。染料注入细胞5分钟后,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相邻的两个心房肌细胞也出现荧光显影,而EYFP-c-kit+cMSCs周围没有心房肌细胞显影。SAN细胞周围有一个细胞显影。HCN4+GJA7-cMSCs 促进 HCN4-GFP-cMSCs 或 GJA7-RFP-cMSCs 向窦房结样细胞分化。RT-qPCR显示GJA7-RFP-cMSCs相较GFP-cMSCs上调Tbx3的表达（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5的表达下降（n=8;p<0.05）,HCN4和Tbx18表达水平两组细胞没有明显差异（n=8;p>0.05）。HCN4+GJA7-cMSCs 共转染组的HCN4,Cx45,Tbx3表达水平比HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs组高（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5表达水平比单纯转染组低（n=8;p<0.05）,Tbx18表达水平在共转染组与单纯转染组之间无明显差异（n=8;p>0.05）。在与犬心房肌共培养三天后,全细胞膜片钳记录If电流的特征。GFP-cMSCs与GJA7-RFP-cMSCs均未记录到特征性的If电流HCN4+GJA7-cMSCs记录到的If 电流,其幅值增加（-1173.8±18.4 vs.-1057.9±14.6 mV,,与HCN4-GFP-cMSCs相比,n=3;p<0.05）,电流激活曲线右移,半数最大激活电压明显变正（-92.6±3.6 vs.-101.9±4.0 mV,n=3;P<0.05）,If通道的反转电位绝对值增加（-29.6±3.9 vs.-26.8±3.2 mV,n=3;p>0.05）。5.浸提实验第7天显示光密度（OD）值在12.5%,25%,50%,100%浸提液组分别为4.6247±0.099,4.5911±0.101,4.0057±0.087,4.5144±0.088,所有检测组的相对细胞增殖率均大于90%显示材料的细胞毒性在0～I级。CCK-8检测显示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.6754±0.10501,4.3294±0.20432,3.7682±0.41215,HCN4-GFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在 1 天,4天,7天分别为3.2820±0.00686,4.4947±0.23174,4.3849±0.43016,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.0181±0.31104,4.1634±0.26420,4.1348±0.36887,所有转染细胞在凝胶中存活4天达到增殖高峰,7天左右生长趋于平稳。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别与温敏水凝胶共培养4天后于激光共聚焦显微镜下观察,可见黄色、绿色、红色荧光细胞在凝胶内不同层面分布生长。iCelligence检测示不同时间点温敏水凝胶内细胞的平均细胞指数未见明显变化。结论:1.Tbx18过表达c-kit+cMSCs介导其向SAN样细胞分化。2.HCN4+GJA7共转染cMSCs通过增强If电流的幅值,利于电信号的扩步促进HCN4-GFP-cMSCs向S AN样细胞分化。3.温敏水凝胶对生物起搏细胞的存活和生长提供了适宜的环境。
范芳文[7]（2017）在《氯化钡阻滞内向整流钾通道所致大鼠冠状动脉收缩的作用机制》文中指出目的:1.通过观察内向整流钾通道(inward rectifier potassium channels,Kir)阻滞剂氯化钡（BaCl2,0.1-1.0 mmol/L）对离体大鼠冠状动脉（Rat coronary artery,RCA）静息张力的影响,研究Kir阻滞对RCA的收缩作用。2.采用去钙-复钙的方法,研究BaCl2收缩RCA对细胞内钙([Ca2+]i)释放和细胞外钙([Ca2+]o)内流的依赖性。3.通过观察氯通道阻滞剂NPPB和尼氟灭酸（NFA）,钙通道阻滞剂硝苯地平对BaCl2收缩RCA作用的影响,从氯通道和钙通道角度探讨其收缩机制;通过抑制剂（环氧合酶抑制剂吲哚美辛、MAPK抑制剂PD98059和SB239063）实验,探讨BaCl2收缩RCA与前列腺素合成及MAPK通路之间的关系。方法:1.正常成年雄性Sprague-Dawley大鼠,200-250 g,腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉,断头,放血处死,迅速取出心脏,置于4℃预冷生理盐溶液（physiological salt solution,PSS）中。在解剖显微镜下沿右心室打开心腔,钝性分离冠状动脉（直径150260μm）。将血管剪成长度约为2 mm的血管环,使用两根直径为40μm的钢丝固定于Multi Myograph System-610M微血管张力记录仪（DMT）浴槽（盛有5mL PSS,37℃）中。采用PowerLab张力记录系统观察RCA血管张力变化。血管环标准化并平衡1 h后,采用KCl（60 mmol/L）刺激血管环三次,待血管环对KCl（60 mmol/L）的收缩可重复后开始正式实验。静息状态时,向浴槽中累积加入BaCl2（0.1,0.3,1.0mmol/L）,记录血管张力变化,结果以KCl（60 mmol/L）引起的最大收缩幅度为100%,计算BaCl2各浓度所致收缩幅度的百分比,并构建BaCl2浓度-效应曲线。2.采用去钙-复钙的方法,观察细胞外钙([Ca2+]o)内流和细胞内钙([Ca2+]i)释放在BaCl2收缩RCA中的作用。当RCA对BaCl2（0.3 mmol/L）的收缩幅度可重复时,先用含有EGTA（1.0 mmol/L）的无钙PSS液洗脱血管环三次,再用不含有EGTA的无钙PSS液洗脱三次,稳定20 min后,向浴槽内加入BaCl2使其在浴槽内的终浓度为0.3 mmol/L,观察RCA血管张力的变化。10 min后,向浴槽中加入CaCl2（2.5mmol/L）,观察复钙后RCA血管张力的变化。计算复钙前后BaCl2所致收缩占总收缩的百分比,以此反映BaCl2引起的RCA收缩对细胞内外钙的依赖性,以KCl（60mmol/L）为比较对照。3.待RCA对BaCl2（0.1-1.0 mmol/L）反应可重复后,分别观察以下抑制剂对BaCl2收缩RCA的影响:L-型电压依赖性钙通道阻滞剂硝苯地平（0.3μmol/L）、ERK1/2抑制剂PD98059（3μmol/L）、p38MAPK抑制剂SB239063（3μmol/L）、环氧合酶抑制剂吲哚美辛（10,30,100μmol/L）、氯通道阻滞剂NFA（10,30,100μmol/L）和NPPB（10,30,100μmol/L）。用不同浓度抑制剂分别预孵30 min后,在抑制剂持续存在的情况下,用同浓度的BaCl2刺激RCA。结果以KCl（60 mmol/L）引起的收缩幅度为100%,分别计算预孵不同浓度抑制剂前后BaCl2的收缩幅度。结果:1.静息状态下,BaCl2（0.1-1.0 mmol/L）浓度依赖性地引起RCA收缩。BaCl2（0.1,0.3,1.0 mmol/L）的收缩幅度分别为（0.42±0.12）mN、（2.63±0.51）mN、（5.68±1.62）mN,分别相当于KCl（60 mmol/L）收缩幅度的（7.64±2.13）%、（49.32±6.46）%、（104.56±10.15）%。其EC50值为0.34mmol/L。2.BaCl2（0.3 mmol/L）在正常PSS液中的收缩幅度为（2.83±0.98）mN,相当于KCl（60 mmol/L）收缩幅度的（49.92±5.83）%。在无钙液中和复钙后的幅度分别占BaCl2总收缩幅度的（31.63±5.23）%、（68.37±5.94）%。KCl（60 mmol/L）在正常PSS液中的收缩幅度为（5.78±1.21）mN,在无钙液中和复钙后的收缩百分比分别为KCl总收缩的（5.58±1.63）%、（94.42±11.27）%。3.硝苯地平（0.3μmol/L）对BaCl2最大收缩的抑制率为（87.82±5.43）%（P<0.01）。NFA（10,30,100μmol/L）、NPPB（10,30,100μmol/L）浓度依赖性地使BaCl2浓度-效应曲线右移,并抑制最大反应。NFA（30,100μmol/L）对BaCl2最大收缩的抑制率分别为（28.29±5.37）%（P<0.05）、（82.24±7.69）%（P<0.01）,IC50为56.34μmol/L。NPPB（30,100μmol/L）使BaCl2对RCA的最大收缩幅度分别减小了（40.45±6.91）%（P<0.05）,（90.83±10.42）%（P<0.01）,IC50为37.81μmol/L。4.吲哚美辛（10,30,100μmol/L）浓度依赖性地使BaCl2浓度-效应曲线右移,并使其最大效应降低。Indo（100μmol/L）对BaCl2最大收缩的抑制率为（73.23±5.47）%（P<0.01）,IC50为93.42μmol/L。5.预孵PD98059（3μmol/L）对BaCl2最大收缩的抑制率为（40.62±5.29）%（P<0.05）;预孵SB239063（3μmol/L）对BaCl2最大收缩的抑制率为（54.95±8.32）%（P<0.05）。结论:1.静息状态下,BaCl2（0.1-1.0 mmol/L）浓度依赖性地收缩离体RCA。2.BaCl2收缩RCA所需要的Ca2+大部分来源于细胞外钙内流,小部分来源于细胞内钙释放。3.BaCl2收缩RCA的机制可能与具有缩血管作用的前列腺素类物质（PGs）合成增加、氯通道和L-型电压依赖性钙通道活性增加以及MAPK信号通路激活有关。
任淼淼[8]（2017）在《褐飞虱和甜菜夜蛾内向整流钾通道的功能研究》文中研究说明内向整流钾通道（Inwardly rectifying potassium channel,Kir）作为钾通道中的一员,在控制静息电位、维持细胞内稳态和传导细胞兴奋性等方面起到重要的作用,也是开发新型治疗药物的重要靶标,甚至可作为新型杀虫剂靶标进行开发。本研究以农业害虫褐飞虱和甜菜夜蛾为研究对象,针对昆虫的内向整流钾通道在基因克隆、表达分析以及功能方面开展了初步探索。本研究克隆得到了褐飞虱和甜菜夜蛾中的内向整流钾通道基因,利用荧光定量PCR技术分析了其在褐飞虱和甜菜夜蛾不同发育阶段以及幼虫不同组织中的表达分布,通过将褐飞虱和甜菜夜蛾的Kir1通道异源表达于HEK293细胞中,利用全细胞膜片钳技术检测了这两种昆虫Kir1通道的内向整流特性,并发现杀虫剂氟啶虫酰胺对Kir1通道的内向电流具有阻断效应。根据铊离子和钾离子具有等效性的特点建立了针对昆虫内向整流钾通道的高通量筛选技术-铊离子荧光法,可进行作用于内向整流钾通道药物的高通量筛选。一、褐飞虱和甜菜夜蛾Kir通道基因的克隆和序列分析本研究中,我们得到了 3个褐飞虱的Kir基因和5个甜菜夜蛾Kir基因。在褐飞虱和甜菜夜蛾Kir基因的蛋白序列中均含有两个跨膜结构域（TM1、TM2）,位于胞内的N-端和C-端以及两个跨膜域中间的孔区（H5）,该孔区包含有孔螺旋特征序列“TXGYG”,控制钾离子选择性透过。通过与双翅目昆虫和人类Kir通道蛋白序列进行比对分析,褐飞虱和甜菜夜蛾的Kir基因分属于3个不同的亚家族Kir1、Kir2和Kir3。其中昆虫的Kir1亚家族都只含有1个基因;Kir2和Kir3亚家族在进化过程中有新成员出现,新基因的出现可能与昆虫进化过程中对外界环境的适应有关。二、褐飞虱和甜菜夜蛾Kir通道基因的表达模式通过荧光定量PCR技术,对褐飞虱和甜菜夜蛾中Kir基因进行了表达模式研究。褐飞虱的3个Kir基因中,Kir1基因在卵和若虫阶段的表达水平明显高于成虫阶段,Kir2和Kir3在若虫阶段的表达水平明显高于成虫和卵。在褐飞虱的各组织器官中,Kir通道的3个基因在头、腹部和触角的中表达水平较高,其中Kir1和Kir2在翅中的表达水平也较高。在对甜菜夜蛾不同发育阶段的研究中,Kir1、Kir2A和Kir3A在甜菜夜蛾的幼虫时期表达水平明显高于其他发育阶段,Kir2B和Kir3B在甜菜夜蛾卵中表达水平最高。在不同的组织表达量的结果中,Kir1通道在脂肪体中的表达水平较高,其他的Kir通道基因在中肠、后肠和马氏管中都有较高的表达。三、褐飞虱Kir1和甜菜夜蛾Kir1通道的内向整流特性为明确褐飞虱和甜菜夜蛾的内向整流钾通道的电生理特性,我们利用pEGFP-N1质粒,将褐飞虱Kir基因（N1Kir1）和甜菜夜蛾Kir基因（SeKir1）分别与增强型荧光蛋白进行融合表达,形成pEGFP-N1-N1Kir1和pEGFP-N1-SeKir1质粒,采用脂质体法瞬时转染至HEK293细胞中,使用全细胞膜片钳技术记录转染细胞钾电流。在表达N1Kir1和SeKir1通道的HEK293细胞上均能检测到典型的内向电流,并表现为整流特性。利用Kir的抑制剂BaC12溶液进行灌流后,能够显着减弱内向整流钾通道的电流,进一步证明了所记录的电流为内向整流钾通道电流。四、氟啶虫酰胺和呱虫啶对Kir通道的抑制作用通过测定杀虫剂对这两种昆虫内向整流钾通道电流的影响,表明氟啶虫酰胺和派虫啶对褐飞虱和甜菜夜蛾的内向整流钾通道都存在抑制作用并且表现出剂量依赖效应。其中氟啶虫酰胺对N1Kir1和SeKir1通道的IC50分别为0.64μM和0.16μM,;哌虫啶对N1Kir1和Kir1的IC50值分别为5.32 μM和3.37 μM,而吡蚜酮和吡虫啉在对这两种昆虫的内向整流钾通道即使在100μM时也不存在抑制作用。五、基于铊离子荧光技术的靶向昆虫Kir药物筛选平台建立了针对昆虫内向整流钾通道的高通量筛选技术-铊离子荧光检测法。该方法主要利用铊离子在钾通道的选择通过性上与钾离子相似的特性,根据铊离子与进入细胞内的荧光染料结合发荧光的特点,以荧光强度的大小测定内向整流钾通道的开放情况。本研究中建立了稳定转染N1Kir1和SeKir1通道的HEK293细胞系,测定得到了氟啶虫酰胺对N1Kir1通道和SeKir1通道的抑制中浓度分别为1.96μM和4.37μM;哌虫啶对N1Kir1通道和SeKir1通道的抑制中浓度分别为173.6μM和13.99μM。吡蚜酮和吡虫啉在高浓度时对SeKir1和N1Kir1也不存在抑制作用。
王苏阳[9]（2016）在《埃他卡林对体循环、脑循环、肺循环微动脉内皮细胞SUR2B/Kir6.1通道的激活作用及能量代谢物质的调节作用》文中研究指明在高血压病的情况下,全身的血管持续承受过高灌注压,容易造成整个循环系统的病变,诱发诸多心血管疾病,对人类健康形造了极大的威胁。血液在小动脉和微动脉中流动时,其受到的阻力远大于主动脉和容量血管等直径较大的血管,所以人类的动脉总压力降当中的绝大部份存在于微循环中的微动脉和微静脉之间,因此微动脉是阻力血管的主要组成部分。高血压病的最基本的病理机制即是微小动脉的异常收缩,管壁对血液流动的阻碍作用增加,最终导致血压升高。但遗憾的是目前临床所使用的高血压药物当中,扩血管类药物普遍不具备阻力血管选择性,对大中血管的影响引起了一系列不良反应的发生。ATP敏感性钾通道（KATP）开放剂因其强大的扩血管作用被广泛研究并用于高血压的治疗。在不同组织中,KATP通道亚型的组成和分布不同,功能各异,是细胞膜上可以偶联细胞兴奋性和能量代谢的一类重要分子。其SUR 2B/Kir 6.1和SUR 2B/Kir 6.2是血管上存在的主要KATP亚型,SUR 2B/Kir 6.1在微小血管表达尤其丰富,选择性激活SUR 2B/Kir 6.1亚型的KATP可以达到扩张阻力血管而同时不影响主动脉和容量血管的目的,有效避免了其他KATP开放剂因为同时作用于多种亚型因而在相应的组织当中产生的毒副作用。埃他卡林是我室研发的具有自主知识产权的新型KATP通道开放剂。大量的前期工作已经证实埃他卡林降压作用显着,药效持续时间长而稳定,能够保护在高血压状态下极易受损的重要器官或组织,包括心、脑、肺、肾、心血管等,减轻胰岛素抵抗。埃他卡林的降血压作用具有高血压状态选择性,能够降低患有高血压病的动物和患者的血压,而不影响正常人和动物的血压。埃他卡林产生上述治疗作用的主要机制是基于强效的血管内皮保护作用。近期结果显示,埃他卡林能够选择性舒张高血压状态下的阻力血管而对大血管无明显影响,这种调控作用可被格列本脲（KATP特异性阻断剂）所拮抗,在去处内皮组织的微动脉环上,埃他卡林的舒张作用大幅减弱,只有完整微动脉环的30%左右。这一结果进一步提示了埃他卡林发挥的靶向阻力血管的降压作用主要是由内皮细胞上的KATP所介导。而异源表达不同亚型KATP通道的实验结果证实,埃他卡林能够高选择性的开放SUR 2B/Kir 6.1亚型的KATP通道。因此,本文第一部分采用电生理学结合细胞内微灌流的方法,就埃他卡林对于构成阻力血管的两种细胞,即平滑肌细胞和内皮细胞上KATP的开放作用特点以及确切的分子靶标进行深入研究。我们发现在急性分离的大鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞上给予埃他卡林10-8、10-7、10-6、10-5、10-4和10-3mol/L时,给药后全细胞电流的幅度分别为给药前的（96.91±3.05）%、（111.89±1.93）%、（127.07±8.6）%、（148.27±6.87）%、（195.48±12.32）%和（190.12±19.42）%（n=6）,在给予格列本脲10-6mol/L后,电流幅度降低至（89.76±2.63）%（n=6）。在Kir 6.1基因敲除小鼠模型上,埃他卡林能够激活野生型（WT）小鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞KATP:给予埃他卡林10-6、10-5、10-4mol/L,全细胞电流分别增加至（119.25±4.08）%、（134.04±1.92）%和（180.98±14.86）%（n=6）,该电流可被格列本脲拮抗至（89.72±5.51）%（n=6）。在杂合子（Kir 6.1+/-）小鼠的实验中,埃他卡林的激活作用仍然存在:给予埃他卡林10-6、10-5、10-4mol/L,电流幅度显着增大,分别是给药前的（126.62±8.84）%、（149.44±5.88）%和（205.42±24.22）%（n=6）,给予格列本脲后电流幅度减小为（94.06±2.22）%（n=6）。埃他卡林高剂量（10-4mol/L）在纯合子（Kir 6.1-/-）小鼠上并未引起全细胞电流幅度的改变。结果表明埃他卡林对阻力血管的作用确实是由激活SUR 2B/Kir 6.1亚型的KATP通道所介导。在大鼠肠系膜微动脉内皮细胞上,埃他卡林和吡那地尔激活KATP的作用均依赖于胞内能量物质ATP、ADP、UDP的存在。埃他卡林在胞内ATP、ADP、UDP浓度为1001000μM时才产生显着的激活作用,而吡那地尔在内灌ATP浓度在105000μM,ADP、UDP浓度为103000μM的情况下,均可产生激活作用,提示埃他卡林对于细胞所处的能量状态具有选择性。镁离子对埃他卡林和吡那地尔激活大鼠肠系膜微动脉内皮细胞KATP的作用都是必要的。对埃他卡林而言,不水解的ATP衍生物ATPγs不能替代ATP支持其开放KATP通道的功能,而ATPγs存在时,吡那地尔的开放作用较ATP存在时显着增强。这表示吡那地尔的激活作用是基于ATP的配体作用,埃他卡林开放肠系膜微动脉内皮细胞KATP通道则依赖ATP的水解。以缺血、缺氧损伤为病理基础发生发展形成的各种血管疾病是非常严重的健康和社会问题,可导致重要器官产生不可逆损伤,甚至死亡。脑卒中是脑血液的供给减少或中断直接导致脑缺氧缺血从而引起的神经功能障碍和脑血管疾病。在缺血缺氧性脑损伤过程中,脑微循环内皮细胞损伤直接导致血脑屏障功能遭受破坏,引起血管病变及脑水肿,进而引发神经元受损。慢性低氧性肺动脉高压的主要病理特点是肺血管痉挛和肺血管重构。低氧条件下的肺微小动脉剧烈收缩,其内皮细胞损伤是诱发肺动脉压升高的重要原因。因此,研究针对改善微小血管内皮功能的药物对治疗肺动脉高压意义十分重大。近些年来,我们的研究成果表明埃他卡林在脑缺血、缺氧模型上有显着的神经保护作用,其治疗作用机制与KATP高度相关。在内皮素-1诱导的或者低氧所致的肺动脉高压模型上,埃他卡林对肺微动脉具有明显的剂量依赖性的扩张作用,同时可以逆转肺小动脉重构,改善肺微动脉内皮功能。脑、肺微动脉内皮细胞上均有KATP表达,该通道的开放受细胞内ATP/ADP调控,在多种组织和细胞中具有抗缺血/缺氧损伤的内源性保护作用。第一部分的实验结果证实埃他卡林能够直接激活体循环阻力血管内皮细胞上SUR 2B/Kir 6.1亚型的KATP,其激活作用与细胞能量代谢状态相关,于是本文的第二、三部分就埃他卡林能否在脑循环、肺循环的微动脉内皮细胞上实现其保护作用,为能量代谢异常导致的血管疾病提供一种可能的治疗途径进行初步探索。我们采用与肠系膜微动脉内皮细胞上相同的实验方法发现:埃他卡林在ATP、ADP、UDP浓度为1000μM时可显着的激活脑微动脉内皮细胞KATP。在肺微动脉内皮细胞上,在ATP浓度为1001000μM、ADP浓度为301000μM、UDP浓度为1001000μM时,埃他卡林可产生激活作用。在胞内无镁离子存在以及内灌ATPγs两种实验情况下,埃他卡林不激活脑、肺微动脉内皮细胞上的KATP。综上所述,本文结论如下:1埃他卡林可以浓度依赖性的开放阻力血管平滑肌细胞KATP通道,起效浓度为10-7 mol/L,在10-4 mol/L时作用最强,并且是选择性作用于KATP通道SUR2B/Kir 6.1亚型的。2埃他卡林能够开放大鼠肠系膜、脑、肺微动脉内皮细胞的KATP通道,开放作用均依赖于胞内能量物质ATP、ADP、UDP、Mg2+的存在且具有显着的细胞能量状态选择性,与ATP的水解作用相关。3作用于脑微动脉内皮细胞KATP时,埃他卡林的激活作用最强,且药物起效所需的能量物质浓度范围明显窄于其它两种内皮细胞,仅在ATP、ADP或者UDP浓度为1000μM时才产生显着的激活作用,在能量物质处于其他浓度时均不进一步激活细胞的KATP,提示药物的脑保护作用与能量代谢有极高的相关性。
凌明英[10]（2013）在《KATP通道在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用及分子机制研究》文中研究指明研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是严重危害人类健康的疾病,其中易损斑块是急性冠脉综合征（acute coronary syndrome, ACS）以及脑血管疾病的基础病变,易损斑块发病机制和治疗靶点的探索成为当今医学发展的重大挑战。动脉粥样硬化斑块的主要细胞成分包括巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。易损斑块的病理改变包括平滑肌细胞和胶原纤维含量减少,有大的脂质核,斑块内大量的巨噬细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润。越来越多的研究表明离子通道与血管功能密切相关,在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥重要作用。已有研究报道,内皮细胞钙离子通道、钾离子通道和氯离子通道在剪切力应激和炎症反应中具有调节作用；TRPC通道介导的血管平滑肌细胞、内皮细胞、单核/巨噬细胞和血小板功能失调参与了动脉粥样硬化的病理过程。由此可见,离子通道在动脉粥样硬化中的作用不容忽视。而且,钾离子通道是膜电位的重要组成部分,在维持细胞电稳态中具有重要作用,可以调节细胞内钙离子的浓度进而发挥对细胞功能的调节作用。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）敏感的钾通道（KATP）是由四个孔道形成亚基-Kir6亚基和四个调节亚基-SUR亚基组成的八聚体蛋白。对细胞内腺苷酸变化敏感,是重要的代谢感受器,偶联细胞内代谢状态细胞膜电活动。近年来,KATP通道在糖尿病和心血管疾病中同时发挥的重要作用逐渐得到认可,作为几类不同药物的作用靶点,成为研究活跃的领域。现有的研究主要集中在以下几个方面：心脏功能的调节,包括缺血再灌注、心肌梗死、心肌重构、心衰、缺血预适应和应激的环境中心肌细胞KATP通道的调节作用；血管平滑肌细胞的KATP通道研究也很丰富,包括各种内源性和外源性血管舒缩物质的调节作用以及在高血压和感染的环境中的表达和功能的改变；同样的,血管内皮细胞的KATP通道也越来越受到重视,包括在内皮素和NO释放中的调节作用研究。但是,对于KATP通道在动脉粥样硬化中的作用却没有直接的报道。因此,本研究提出如下假说：KATP通道在动脉粥样硬化病变的病理生理过程中发挥重要作用,KATP通道可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。目的1.建立动脉粥样硬化病变发展的动物模型；2.观察斑块平滑肌细胞、巨噬细胞、胶原纤维和脂质表达,评测斑块易损性；3.探讨KATP通道药物体内干预对动脉粥样硬化病变发展的影响。方法本研究以ApoE-/-小鼠80只为研究对象,9周龄始予高脂饮食,10周龄时（25-30g）行右侧颈动脉套管术；8周后,高分辨率小动物显微超声检测颈动脉斑块病变,随后,小鼠随机分为空白对照组,转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.lacZ对照组和转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.p53实验组,后两组分为转染后1天组、4天组和14天组,转染后4天组和14天组又分为格列苯脲（Glibenclamide）干预组和非干预组,给予相应处理。检测下列指标：1.血生化分析：血液标本收集,检测血糖（glucose, Glu）、谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase, GPT）谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase, GOT）、甘油三酯（triglyceride, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TC）含量；2. ApoE-/-小鼠取材,病理组织学检测：实验动物按照实验分组,分别于转染后0天、1天、4天和14天时处死,留取组织用于病理染色及分子生物学实验。苏木素-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色用以检测组织结构变化,油红O（Oil-red O）染色用以检测组织l脂质含量,天狼猩红（Sirius-red）染色用以检测组织胶原纤维含量,p53、SMC-α actin、MOMA-2的免疫组织化学染色分别用以检测组织p53的表达、平滑肌细胞和巨噬细胞的含量；3.计算斑块易损指数：易损指数=（MOMA-2阳性面积/斑块面积+脂质面积/斑块面积）/（SMC-α actin阳性面积/斑块面积+胶原纤维面积/斑块面积）。结果1.格列苯脲干预对ApoE-/-小鼠血生化及肝脏组织的影响格列苯脲灌胃后小鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇、转氨酶水平以及肝脏组织结构没有明显变化（P>0.05）。2.ApoE-/-小鼠颈动脉套管手术及p53转染效率检测小鼠显微超声示右侧颈动脉套管及套管近心端斑块形成；转染后1天、4天、14天,p53表达在Ad5-CMV.p53转染组比Ad5-CMV.lacZ组明显增多（P<0.05）。3.ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块平滑肌细胞及胶原纤维染色斑块平滑肌细胞含量与胶原纤维含量变化趋势基本一致,在p53转染4天和14天组明显少于相应时间点的lacZ转染组（P<0.05）。4.ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块巨噬细胞及脂质染色斑块巨噬细胞含量与脂质含量变化趋势一致,在转染后4天和14天时,p53组显着高于相应时间点的lacZ组（P<0.05）。5.ApoE-/-小鼠格列苯脲体内干预稳定颈动脉粥样硬化斑块格列苯脲体内干预14天,在p53转染组巨噬细胞含量、脂质含量明显降低（P<0.05）,斑块胶原成分显着增加（P<0.05）,尽管平滑肌细胞含量无明显变化（P>0.05）,但是斑块病变改善显着。6.斑块易损指数计算在转染后4天和14天时,p53组易损指数比lacZ显着升高,而且时间点愈后p53转染组的易损指数升高愈显着（P<0.05）；在p53转染14天组,格列苯脲体内干预使易损指数明显下降（P<0.05）。结论1. ApoE-/-小鼠高脂饮食、颈动脉套管术后局部转染Ad5-CMV.p53诱导斑块易损指数增加；2.格列苯脲体内干预对Ad5-CMV.p53转染ApoE-/-小鼠血.生化及肝组织结构无明显影响；3. ApoE-/-小鼠格列笨脲体内干预改善p53转染诱导的颈动脉粥样硬化斑块病变。研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）与细胞膜离子通道关系密切。K+电流是细胞膜电位的主要组成部分,对于细胞功能至关重要。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）敏感的钾通道（KATP）是细胞膜离子通道的重要组成部分,通过调节细胞内外钾离子浓度,在维持细胞膜电位、调节其他生物离子进出细胞和调市细胞功能中发挥不可替代的作用,而且是联系细胞电活动与细胞代谢的桥梁。缺血、缺氧、代谢性酸中毒等导致细胞内ADP/ATP升高时,KATP通道开放,细胞膜超极化,电压依赖性钙通道（voltage-dependent calcium channels,VDCCs）关闭,钙内流减少,细胞内[Ca2+]降低,介导缺血-再灌注损伤及心力衰竭中的心肌保护等作用。KATP,通道是一种异源八聚体复合物,四个Kir6.X亚基构成孔道形成亚基转运钾离子,四个SURs亚基组成调节亚基,根据细胞内ATP水平调节通道活性。Kir6.X存在Kir6.1和Kir6.2两个亚型；磺脲类受体SURs（sulfonylurea receptors）有SUR1和SUR2两种亚型,后者有两种主要的剪接体SUR2A和SUR2B,连接Kir6亚基构成功能性的K/ATP通道。KATP通道在多种组织农达,承载了重要的细胞功能,并且KATP通道的亚基组成具有组织特异性,在同时表达Kir6.1.Kir6.2亚基的细胞系,亚基常常以不同比例组成异源多聚体；相应地,不同组织中的KATP通道有不同的生理特性,也是特异性药物试剂作用于特定组织KATP通道以调节不同细胞功能的重要生理基础。例如,心肌细胞主要表达SUR2A/Kir6.2亚型,在缺血缺氧及其他应激的环境中发挥保护心肌细胞的重要作用；胰腺p细胞主要表达SUR1/Kir6.2亚型,可以调节胰岛素的分泌；SUR2B/Kir6.1主要在血管平滑肌细胞和内皮细胞表达,在调节血管张力、血管的舒缩和内皮保护中发挥重要作用。KATP通道是重要的代谢感受器,而动脉粥样硬化及炎症反应与细胞代谢密切相关。因此,本研究提出如下假说：KATP通道在动脉粥样硬化斑块的平滑肌细胞、内皮细胞和／或巨噬细胞中表达,与动脉粥样硬化斑块的易损性关系密切。目的1.检测KATP通道SUR1、SUR2A、SUR2B亚基和Kir6.1、Kir6.2亚基在动脉粥样硬化斑块的表达和分布；2.分析KATP通道亚基表达量和AS斑块成分含量、易损指数的相关性；3.探讨AS斑块平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中KATP通道在病变发展过程中的作用。方法本研究以50只ApoE-/-小鼠为研究对象,9周龄始予高脂饮食,10周龄时（25-30g）行右侧颈动脉套管术；8周后,高分辨率小动物显微超声检测颈动脉斑块病变,随后,小鼠随机分为空白对照组,转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.lacZ对照组和转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.p53实验组,后两组分为转染后1天组、4天组和14天组,给予相应处理,分别于相应时间点处死小鼠,留取取标本,检测下列指标：1.病理组织学染色：HE染色检测组织形态结构的改变、油红O染色检测标本脂质含量、天狼猩红染色检测标本胶原含量；2. SMC-a actin和MOMA-2免疫组织化学染色：检测AS斑块平滑肌细胞和巨噬细胞含量；3. KATP通道亚基免疫组织化学染色：检测AS斑块KATP通道亚基SUR1、 SUR2A、SUR2B、Kir6.1和Kir6.2含量,观察各亚基在斑块平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞的表达分布情况；4.相关性分析：计算分析AS斑块成分含量、易损指数和KATP通道亚基SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6.1、Kir6.2表达的相关性；5.AS相关的KATP通道亚基和相应细胞的免疫荧光双标染色：观察AS斑块细胞和主要KATP通道亚型的共同定位表达；6. KATP通道亚基实时定量逆转录聚合酶连反应（RT-PCR）定量分析：RT-PCR检测ApoE-/-小鼠颈动脉KATP通道亚基SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6.1和Kir6.2的（?）nRNA表达。结果1.AS斑块KATP通道亚基免疫组织化学染色结果SUR2A和Kir6.2亚基阳性染色主要积聚在粥样硬化斑块肩部和脂质条纹等巨噬细胞聚集的部位,定量分析表明二者变化趋势基本一致,在p53转染4天组表达最高,显着高于lacZ转染4天组（P<0.05）; SUR1亚基阳性染色在巨噬细胞密集的斑块肩部和脂质条纹区域,以及血管内膜内皮细胞表现突出,定量分析显示,SUR1亚基表达在p53转染4天组增长最为显着,明显多于lacZ转染4天组（P<0.05）; Kir6.1亚基阳性染色在斑块肩部及脂质条纹巨噬细胞聚集的区域、血管内皮细胞、血管中膜及纤维帽平滑肌细胞较丰富的区域均有表现,在转染后1天和4天,p53处理组Kir6.1亚基表达均高于lacZ处理组（P<0.05）；SUR2B亚基阳性染色主要分布在血管中膜及斑块纤维帽平滑肌细胞较集中的部位和血管内皮细胞,SUR2B亚基表达在p53转染4天组明显减少,显着少于lacZ转染4天组（P<0.05）。2. KATP通道亚基mRNA表达结果小鼠颈动脉RT-PCR结果显示,KATP通道SUR2A、Kir6.2和SUR1亚基mRNA表达在p53转染4天组增加最为显着,明显高于lacZ转染4天组（P<0.05）;Kir6.1亚基在p53转染1天组表达高于lacZ转染1天组（P<0.05）; SUR2B亚基在空白对照组表达水平最高（P<0.05）。3.AS斑块KATP通道染色与斑块负荷相关性分析结果KATP通道SUR2A亚基和Kir6.2亚基染色,与斑块易损指数正相关,与斑块巨噬细胞含量成正相关,与斑块平滑肌细胞含量负相关（P<0.05）。4.AS斑块MOMA-2与SUR2A、Kir6.2共表达免疫荧光双标染色显示,SUR2A亚基和MOMA-2共同定位表达于斑块内及血管壁粘附浸润的泡沫巨噬细胞,这些部位同样粘附聚集Kir6.2亚基和MOMA-2双染巨噬细胞。结论1. KATP通道亚基在AS斑块平滑肌细胞、内皮细胞以及巨噬细胞表达；2. KATP通道SUR2A、Kir6.2亚基与AS斑块负荷密切相关；3. KATP通道SUR2A/Kir6.2主要在斑块巨噬细胞表达。研究背景动脉粥样硬化斑块的主要细胞成分包括巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。与血管平滑肌细胞和内皮细胞显着不同,巨噬细胞来源于循环中的单核细胞,是免疫系统炎症反应的重要组成部分,单核/巨噬细胞粘附、聚集、迁移和分泌炎症因子的功能贯穿动脉粥样硬化斑块的起始、发展和破裂的全过程。以往的研究发现,单核/巨噬细胞离子通道在动脉粥样硬化病变中发挥重要作用。单核/巨噬细胞TRPC通道通过调节细胞内钙离子浓度,介导细胞的氧化应激,加剧动脉粥样硬化病变：周围的细胞因子和细胞本身的功能状态能够调节单核细胞电压依赖性内向整流钾通道Kir （voltage-dependent inwardly rectifying potassium channels）和延迟外向整流钾通道Kdr （delayed outwardly rectifying potassium channels）诱导单核细胞的活化和分化；单核/巨噬细胞容量调节性氯离子通道（volume-regulated Cl channels）功能失调,促进巨噬细胞吞噬脂质,形成泡沫细胞。更重要的是,MCP-1和LPC通过调节氯离子通道和钙离子激活的钾通道可以促进单核细胞的迁移。单核细胞的迁移是动脉粥样硬化的始动环节,而大量泡沫细胞的形成是不稳定粥样斑块的重要标志。然而,ATP敏感钾通道（ATP-sensitive K+channels, KATP）在动脉粥样硬化中的作用至今鲜有报道。KATP,通道是异源八聚体蛋白复合物,由四个内向整流K+通道（inwardly rectifying potassium channel, Kir） Kir6.X亚基形成孔道,四四个ATP结合盒（ATP binding cassette, ABC）家族的磺脲类受体（sulfonylurea receptor, SUR）蛋白组成调节亚基。不同组织表达的KATP通道Kir6.X和SUR亚基不尽相同,Kir6.X包括Kir6.1和Kir6.2亚型,SUR包括SUR1、SUR2A和SUR2B亚型,因而呈现出组织特异性的生理学和病理生理学特征。有研究报道,KATP通道阻断剂格列苯脲能够抑制低氧血症和酸中毒时脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的促炎性细胞因子的释放。而单核/巨噬细胞的炎症反应在动脉粥样硬化病变的形成、发展以及晚期易损斑块破裂中扮演重要角色。LPS是单核/巨噬细胞的有效激活剂,与Toll样受体（TLRs）结合,主要通过NF-κB和MAPKs信号通路的激活,后者包括p38、JNK和ERK1/2信号转导途径,诱导TNF-α等促炎性细胞因子分泌。因此,我们提出下列假说：单核/巨噬细胞KATP通道在LPS诱导的细胞炎症反应中发挥作用,从而影响动脉粥样硬化病变的发生、发展；单核/巨噬细胞KATP通道通过NF-κB和MAPKs （ERK1/2、p38和JNK）信号转导通路调节细胞的炎症反应。目的1.观察LPS对巨噬细胞KATP通道和TNF-α表达的影响；2.探讨KATP通道对LPS诱导的巨噬细胞TNF-α表达的调节作用；3.揭示KATP通道对LPS诱导的巨噬细胞内NF-κB和MAPKs信号通路的影响。方法本研究以单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,KATP通道开放剂吡那地尔或阻断剂格列苯脲预处理后予LPS刺激,采用实时定量聚合酶连反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（western blot）等实验方法,检测：1.LPS （1μg/ml）处理RAW264.7细胞不同时间（0、2、4、8、24h）后,检测KATP通道各亚基（SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6.1、Kir6.2）和炎症因子TNF-α表达；2. KATP通道开放剂（吡那地尔,10μM）或阻断剂（格列苯脲,10μM）预处理后,检测LPS刺激RAW264.7细胞TNF-α的表达,检测不同刺激时间（15min、30min、1h、24h） NF-κB和MAPKs信号通路蛋白的磷酸化改变；3. NF-κB信号通路抑制剂预处理后,检测KATP通道各亚基的表达改变,检测KATP通道干预对RAW264.7细胞TNF-α表达的影响。结果1.LPS诱导RAW264.7细胞KATP通道亚基和TNF-α表达与空白对照组相比较,KATP通道SUR1、SUR2A、Kir6.1和Kir6.2亚基在LPS （1μg/ml）刺激细胞4小时后表达明显升高（P<0.05）,同时,TNF-α表达显着增加（P<0.05）,但是各组均未检测到SUR2B亚基mRNA的表达。2. KATP通道药物干预后RAW264.7细胞TNF-α表达和NF-κB、MAPKs蛋白磷酸化改变与LPS刺激4小时组相比较,KATP通道阻断剂格列苯脲（10μM）预处理后细胞TNF-α表达降低（P<0.05）,开放剂吡那地尔（10μM）预处理后细胞TNF-α表达略增加（P<0.05）。与LPS刺激15分钟组相比较,格列苯脲（10μ,M）预处理后细胞p65、ERK1/2蛋白磷酸化水平下降（P<0.05）,而吡那地尔（10μ,M）预处理对细胞p65、ERK1/2蛋白磷酸化水平影响没有统计学意义（P>0.05）；格列苯脲和吡那地尔对p38蛋白磷酸化水平没有明显改变（P>0.05）；与空白对照组相比较,LPS刺激15分钟、1小时或24小时JNK蛋白磷酸化无显着变化（P>0.05）。3. KATP通道位于RAW264.7细胞LPS诱导活化的NF-κB信号通路上游与LPS刺激4小时组相比较,NF-κB信号通路抑制剂PDTC（100μM）和DMFR（100μM）预处理显着降低RAW264.7细胞TNF-α的mRNA表达（P<0.05）；KATP通道阻断剂格列苯脲（10μM）能够增强NF-κB抑制剂的作用（P<0.05）,而开放剂吡那地尔（10μM）拮抗NF-κB抑制剂的作用（P<0.05）。与LPS刺激4小时组相比较,PDTC （100μM）和DMFR （100μM）预处理显着增加了RAW264.7细胞KATP通道SUR1、SUR2A、Kir6.1和Kir6.2亚基的表达（P<0.05）。结论1.LPS绣导巨噬细胞KATP通道表达：2.巨噬细胞KATP通道参与调节LPS诱导的炎症反应；3.巨噬细胞KATP通道通过NF-κB和ERK1/2信号转导通路调节细胞炎症反应。
二、平滑肌内向整流钾通道(K_(IR))（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、平滑肌内向整流钾通道(K_(IR))（论文提纲范文）
（1）KCNJ11 rs5210位点多态性与非酒精性脂肪性肝病及冠心病的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 研究对象和方法 |
| 1 主要仪器、试剂及来源 |
| 2 研究对象 |
| 3 研究方法 |
| 4 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 NAFLD组、CAD组、NAFLD+CAD组、健康对照组间的一般临床资料及生化指标比较 |
| 2 四组之间的Hardy-Weinberg遗传平衡检验 |
| 3 KCNJ11 rs5210基因型及等位基因的频率分布 |
| 4 KCNJ11 rs5210基因型与等位基因的发病风险 |
| 5 KCNJ11 rs5210位点多态性不同基因型之间各临床资料及生化指标比较 |
| 6 患病风险因素分析结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 KCNJ11基因多态性与代谢综合征的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）基于冷冻电镜的离子通道门控调节机制分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 离子通道综述 |
| 1.1 电压门控离子通道 |
| 1.1.1 电压门控钾通道 |
| 1.1.2 电压门控钠通道 |
| 1.1.3 电压门控钙通道 |
| 1.2 配体门控离子通道 |
| 1.2.1 五聚体配体门控离子通道 |
| 1.2.2 四聚体配体门控离子通道 |
| 1.2.3 三聚体配体门控离子通道 |
| 1.3 机械门控离子通道 |
| 1.4 课题目的与意义 |
| 工作一 内向整流钾通道KAT1超极化激活机制分析 |
| 第2章 KAT1蛋白背景介绍 |
| 2.1 植物中钾离子通道简介 |
| 2.2 KAT1通道功能与生理作用 |
| 2.3 KAT1研究进展 |
| 2.4 超极化激活HCN1通道介绍 |
| 2.5 本课题意义 |
| 第3章 KAT1表达纯化优化及结构解析 |
| 3.1 KAT1克隆及病毒扩增 |
| 3.1.1 KAT1分子克隆以及重组质粒构建 |
| 3.1.2 用于转染昆虫sf9细胞的KAT1病毒扩增 |
| 3.2 KAT1蛋白纯化过程 |
| 3.3 KAT1纯化条件优化 |
| 3.4 KAB1辅助蛋白 |
| 3.5 KAT1-KAB1冷冻电镜数据收集与处理 |
| 3.6 KAT1-KAB1模型搭建 |
| 3.7 电生理功能实验对通道功能进行验证 |
| 3.7.1 KAT1转染HEK293T细胞实验流程 |
| 3.7.2 HEK293T记录KAT1电流实验流程 |
| 第4章 KAT1结构分析与讨论 |
| 4.1 KAT1整体结构 |
| 4.1.1 KAB1对KAT1功能验证 |
| 4.1.2 KAT1整体结构 |
| 4.2 KAT1选择性过滤器和孔道结构域分析 |
| 4.2.1 KAT1钾离子选择性的结构基础 |
| 4.2.2 KAT1的孔道区处于关闭状态 |
| 4.3 KAT1电压感受结构域分析 |
| 4.3.1 KAT1处于去极化状态 |
| 4.3.2 KAT1中S4螺旋的电荷分布 |
| 4.4 KAT1电压感受结构域与孔道结构域的偶联 |
| 4.5 KAT1超极化激活模型 |
| 4.6 本课题小结 |
| 工作二 蛇毒多肽Mamba1结合并抑制人源酸敏感离子通道ASIC1a机制分析 |
| 第5章 酸敏感离子通道ASIC背景介绍 |
| 5.1 酸敏感离子通道ASIC生理意义 |
| 5.1.1 ASIC通道的分类和分布 |
| 5.1.2 ASIC通道生理意义 |
| 5.2 ASIC通道的药理学研究 |
| 5.2.1 神经肽 |
| 5.2.2 有机化合物 |
| 5.2.3 二价和三价阳离子 |
| 5.2.4 动物毒素多肽 |
| 5.3 ASIC通道目前结构研究进展 |
| 5.4 本课题意义 |
| 第6章 hASIC1a表达纯化优化及结构解析 |
| 6.1 hASIC1a克隆及病毒扩增 |
| 6.1.1 hASIC1a分子克隆以及重组质粒构建 |
| 6.1.2 用于转染昆虫sf9细胞的hASIC1a病毒扩增 |
| 6.2 hASIC1a蛋白纯化及Mamba1-hASIC1a复合物组装过程 |
| 6.3 hASIC1a~(△C)及复合物结构解析尝试 |
| 6.3.1 晶体法解析hASIC1a~(△C)及复合物结构 |
| 6.3.2 冷冻电镜解析hASIC1a~(△C)及复合物结构 |
| 6.4 hASIC1a~(△C)及hASIC1a~(△C)-Mamba1冷冻电镜数据收集与处理 |
| 6.5 hASIC1a~(△C)及hASIC1a~(△C)-Mamba1模型搭建 |
| 6.6 电生理功能实验对蛋白功能进行验证 |
| 6.6.1 hASIC1a转染CHO细胞实验流程 |
| 6.6.2 CHO记录hASIC1a电流流程 |
| 第7章 hASIC1a结构分析与讨论 |
| 7.1 hASIC1a~(△C)结构分析 |
| 7.1.1 hASIC1a~(△C)整体结构 |
| 7.1.2 hASIC1a处于静息状态 |
| 7.2 hASIC1a~(△C)-Mamba1结构分析 |
| 7.3 Mamba1将hASIC1a锁定在关闭构象 |
| 7.4 Mamba1对hASIC1a和cASIC1抑制效果不同机制研究 |
| 7.5 本课题小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（3）抗氧化型低密度脂蛋白的抗体通过调节单核巨噬细胞的Ca2+/K+通道抑制MCP-1的释放（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 动脉粥样硬化 |
| 1.2 氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)与动脉粥样硬化 |
| 1.3 抗oxLDL抗体与动脉粥样硬化 |
| 1.3.1 抗oxLDL抗体 |
| 1.3.2 抗oxLDL抗体的致病性 |
| 1.3.3 抗oxLDL抗体保护动脉粥样硬化 |
| 1.4 单核细胞趋化因子-1(MCP-1)与动脉粥样硬化 |
| 1.5 单核细胞、巨噬细胞与动脉粥样硬化 |
| 1.5.1 单核细胞 |
| 1.5.2 巨噬细胞 |
| 1.6 清道夫受体与动脉粥样硬化 |
| 1.6.1 清道夫受体(SR) |
| 1.6.1.1 SR-A1 |
| 1.6.1.2 CD36 |
| 1.6.1.3 LOX-1 |
| 1.7 Toll样受体4(TLR-4)与动脉粥样硬化 |
| 1.8 FcγR与动脉粥样硬化 |
| 1.9 MAPK信号通路与动脉粥样硬化 |
| 1.10 离子通道与动脉粥样硬化 |
| 1.10.1 离子通道 |
| 1.10.1.1 钙离子通道 |
| 1.10.1.2 钾离子通道 |
| 1.11 研究目的 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 细胞 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 从PBMCs分离CD14~+人单核细胞 |
| 2.2.1.1 从人的外周血(PBMCs)分离单个核细胞 |
| 2.2.1.2 用CD14 MicroBeads标记细胞 |
| 2.2.1.3 使用LS柱子和人工操作的分MACS分选器分离CD14阳性细胞 |
| 2.2.2 准备oxLDL和不含oxLDL的血清 |
| 2.2.3 BCA法蛋白定量 |
| 2.2.4 细胞复苏、传代及冻存 |
| 2.2.5 细胞内钙离子成像 |
| 2.2.6 离子通道电生理学的记录 |
| 2.2.7 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.8 MCP-1酶联免疫吸附测定实验 |
| 2.2.9 oxLDL酶联免疫吸附测定实验 |
| 2.2.10 统计分析方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 OxLDL通过TLR-4和依赖MAPK的信号通路诱导单核巨噬细胞释放MCP-1 |
| 3.2 OxLDL通过钾离子通道和钙离子通道诱导单核巨噬细胞MCP-1的释放 |
| 3.3 OxLDL抑制RAW264.7细胞内向整流钾离子通道(K_(ir))的活动 |
| 3.4 OxLDL通过TLR-4、ERK-和JNK抑制K_(ir)通道的活动 |
| 3.4.1 OxLDL通过TLR-4抑制K_(ir)通道的活性 |
| 3.4.2 OxLDL通过ERK和JNK抑制K_(ir)通道的活动 |
| 3.5 oxLDL通过ERK和JNK信号通路诱导巨噬细胞内的钙离子浓度震荡 |
| 3.6 抗oxLDL抗体(BI-204)通过FcγRIIB抑制MCP-1释放 |
| 3.7 抗oxLDL抗体(BI-204)通过结合FcγRIIB逆转oxLDL诱导的Kir通道关闭 |
| 3.8 OxLDL通过TLR-R激活ERK |
| 3.8.1 OxLDL呈剂量依赖性地激活MAPK信号通路 |
| 3.8.2 OxLDL通过TLR-4激活MAPKs |
| 3.9 抗OxLDL抗体(BI204)拮抗oxLDL诱导的ERK的激活 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读学位期间发表学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）利用诱导多能干细胞探索长QT综合征7型心肌发育分化相关致病调节机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 长QT综合征7型——Andersen-Tawil综合征患者特异性诱导多能干细胞系的建立与鉴定 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1、收集临床信息 |
| 2、患者及匹配健康对照者的外周血单核细胞的提取备用 |
| 3、患者特异性诱导多能干细胞系的转染重编程过程 |
| 4、患者特异性诱导多能干细胞系的鉴定 |
| 5、对照组的选择 |
| (三) 实验结果 |
| 1、CRISPR修复成功 |
| 2、类干细胞克隆鉴定结果 |
| (四) 实验小结 |
| 第二部分 突变及CRISPR组的诱导多能干细胞系定向分化为心肌细胞及电生理实验结果 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1、诱导多能干细胞向心肌细胞定向分化 |
| 2、诱导多能干细胞来源的心肌细胞形态学变化记录、冻存及爬片制备 |
| 3、诱导多能干细胞来源的心肌细胞的鉴定 |
| (三) 实验结果 |
| 1、诱导多能干细胞定向分化为心肌细胞的形态学变化 |
| 2、诱导干细胞来源的心肌细胞鉴定及电生理检测 |
| (四) 实验小结 |
| 第三部分 LQT7型诱导多能干细胞来源的心肌细胞分化发育的加权基因共表达分析及染色质开放性变化的鉴定 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1、转录组样本收集和准备 |
| 2、数据分析 |
| 3、ATAC-seq染色体可及性样本收集和准备 |
| 4、ATAC-seq联合分析染色质开放的可及性 |
| (三) 实验结果 |
| 1、突变组与CRISPR组样本转录组整体分析 |
| 2、突变组与CRISPR组样本进行发育分化阶段WGCNA分析 |
| 3、染色质在心肌细胞发育分化阶段的高度动态变化分析 |
| (四) 实验小结 |
| 第四部分 LQT7型诱导多能干细胞来源的心肌细胞转录组和蛋白组联合分析验证转录因子调控关键靶基因 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1、转录组实验 |
| 2、蛋白组测序TMT步骤 |
| (三) 实验结果 |
| 1、突变组与CRISPR组晚期心肌细胞样本蛋白组分析 |
| 2、突变组与CRISPR组晚期心肌细胞样本转录组联合蛋白组分析 |
| (四) 实验小结 |
| 讨论 |
| (一) 患者外周血单核细胞来源的特异性诱导多能干细胞的建立与鉴定 |
| (二) Andersen-Tawil综合征患者特异性诱导多能干细胞来源心肌细胞模型建立成功 |
| (三) KCNJ2基因突变导致Andersen-Tawil综合征的hiPSC-CM发育分化相关致病调节机制探索 |
| 本课题的创新点 |
| 研究结论 |
| 局限与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 干细胞定向分化为心肌细胞发育过程中的电生理特征及应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间科研工作 |
| 致谢 |
（5）氟啶虫酰胺对昆虫取食与排泄影响的毒理机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 氟啶虫酰胺 |
| 1.1.1 氟啶虫酰胺的研发、登记与应用 |
| 1.1.2 氟啶虫酰胺的毒理特性 |
| 1.1.3 氟啶虫酰胺的作用靶标 |
| 1.2 内向整流钾通道 |
| 1.2.1 哺乳动物内向整流钾离子通道 |
| 1.2.2 昆虫内向整流钾通道 |
| 1.2.3 靶向昆虫Kir通道的杀虫剂研发 |
| 1.3 拟解决的科学问题及研究目的意义 |
| 第二章 Kir基因克隆及组织表达特征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 主要药剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 甜菜夜蛾Kir通道基因的确定 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾Kir基因在不同发育阶段的表达模式 |
| 2.2.3 甜菜夜蛾Kir基因在幼虫不同组织的表达模式 |
| 2.2.4 褐飞虱Kir基因在不同组织的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 氟啶虫酰胺对昆虫唾液分泌与取食的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 氟啶虫酰胺对褐飞虱唾液分泌的影响 |
| 3.2.2 药剂对甜菜夜蛾取食影响 |
| 3.2.3 氟啶虫酰胺对美洲大蠊取食的影响 |
| 3.2.4 氟啶虫酰胺对美洲大蠊唾液分泌的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 氟啶虫酰胺对昆虫马氏管分泌与排泄的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 氟啶虫酰胺对褐飞虱蜜露排泄影响 |
| 4.2.2 药剂对淡色库蚊排泄的影响 |
| 4.2.3 药剂对淡色库蚊马氏管分泌的影响 |
| 4.2.4 淡色库蚊毒力测定 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 转录因子Tbx18介导c-kit~+犬间充质干细胞(cMSCs)在体外共培养环境中定向分化为窦房结样细胞的实验研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 使用流式细胞仪分选c-kit~+c MSCs犬窦房结、犬心房肌细胞原代分离培养.. |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 构建Tbx18 慢病毒载体转染c-kit~+cMSCs |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Tbx18 过表达促使c-kit~+cMSCs向窦房结样细胞分化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第二部分 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCN4和GJA7慢病毒载体构建与转染cMSCs |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化及检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第三部分 温敏水凝胶对Tbx18、HCN4、GJA7 基因转染cMSCs生物学活性的影响 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶体外细胞毒性检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶内细胞生长情况评价 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 心脏生物起搏器的研究进展和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文及期刊 |
| 致谢 |
（7）氯化钡阻滞内向整流钾通道所致大鼠冠状动脉收缩的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 BaCl_2对RCA静息张力的影响 |
| 2.2 BaCl_2 收缩RCA对细胞内外钙的依赖性 |
| 2.3 不同离子通道阻滞剂对BaCl_2 收缩RCA的影响 |
| 2.4 吲哚美辛对BaCl_2 收缩RCA的影响 |
| 2.5 MAPK抑制剂SB239063和PD98059对BaCl2 收缩RCA的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）褐飞虱和甜菜夜蛾内向整流钾通道的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物内向整流钾通道 |
| 1.1.1 Kir通道的结构和分类 |
| 1.1.2 Kir通道的组织分布与功能 |
| 1.2 昆虫内向整流钾通道 |
| 1.2.1 Kir通道分类与进化 |
| 1.2.2 Kir通道的分布和功能 |
| 1.3 膜片钳技术 |
| 1.4 钾离子通道药物的高通量筛选方法 |
| 1.5 氟啶虫酰胺 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 褐飞虱与甜菜夜蛾Kir通道的基因克隆和序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 褐飞虱和甜菜夜蛾Kir通道基因的确定与分类 |
| 2.2.2 褐飞虱和甜菜夜蛾Kir通道基因的蛋白结构分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 褐飞虱和甜菜夜蛾Kir基因的表达模式 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 褐飞虱Kir通道基因表达模式 |
| 3.2.2 甜菜夜蛾Kir通道基因表达模式 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 褐飞虱和甜菜夜蛾Kir1通道的内向整流特性以及杀虫剂影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 构建pEGFP-N1-N1Kir1和pEGFP-N1-SeKir1载体 |
| 4.2.2 Kir1通道电流的内向整流特性 |
| 4.2.3 杀虫剂对Kir1通道电流的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 铊离子荧光法筛选靶向Kir1通道的药物 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 稳定表达SeKir和N1Kir1通道细胞株的建立 |
| 5.2.2 铊离子荧光法测定药剂对Kir通道的抑制作用 |
| 5.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果目录 |
（9）埃他卡林对体循环、脑循环、肺循环微动脉内皮细胞SUR2B/Kir6.1通道的激活作用及能量代谢物质的调节作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 埃他卡林对体循环微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir 6.1 通道的激活作用及其药理学特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 药品配置 |
| 1.4 耗材与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 肠系膜微动脉平滑肌细胞的急性分离 |
| 2.2 肠系膜微动脉平滑肌细胞K_(ATP)电流记录 |
| 2.3 大鼠肠系膜微动脉内皮细胞的原代培养 |
| 2.4 大鼠肠系膜微动脉内皮细胞特性及纯度鉴定 |
| 2.5 大鼠肠系膜微动脉内皮细胞K_(ATP)电流记录 |
| 3 数据分析与统计方法 |
| 结果 |
| 1 埃他卡林激活SUR 2B/Kir 6.1 通道体内研究的证据 |
| 1.1 大鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞的形态学观察 |
| 1.2 Kir 6.1 基因敲除小鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞的形态学观察 |
| 1.3 埃他卡林对大鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞K_(ATP)电流的影响 |
| 1.4 埃他卡林对Kir 6.1 基因敲除小鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞K_(ATP)电流的影响 |
| 1.4.1 埃他卡林对野生型(WT)小鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞K_(ATP)电流的影响 |
| 1.4.2 埃他卡林对杂合子(Kir 6.1~(+/-))小鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞K_(ATP)电流的影响 |
| 1.4.3 埃他卡林对纯合子(Kir 6.1~(-/-))小鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞K_(ATP)电流的影响 |
| 2 埃他卡林对肠系膜微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir 6.1 通道的激活作用及其药理学特征 |
| 2.1 大鼠肠系膜微动脉内皮细胞的观察与鉴定 |
| 2.2 胞内能量代谢物质对埃他卡林开放大鼠肠系膜微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir 6.1 通道作用的影响 |
| 2.2.1 胞内ATP浓度对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 2.2.2 胞内ADP浓度对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 2.2.3 胞内UDP浓度对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 2.2.4 胞内ATP水解以及镁离子存在对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 第二章 埃他卡林对脑循环微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir 6.1 通道的激活作用及其药理学特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 药品配置 |
| 1.4 耗材与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 大鼠脑微动脉内皮细胞的原代培养 |
| 2.2 大鼠脑微动脉内皮细胞特性及纯度鉴定 |
| 2.3 大鼠脑微动脉内皮细胞K_(ATP)电流记录 |
| 3 数据分析与统计方法 |
| 结果 |
| 1 大鼠脑微动脉内皮细胞的观察与鉴定 |
| 2 胞内能量代谢物质对埃他卡林开放大鼠脑微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir 6.1 通道作用的影响 |
| 2.1 胞内ATP浓度对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 2.2 胞内ADP浓度对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 2.3 胞内UDP浓度对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 2.4 胞内ATP水解以及镁离子存在对埃他卡林开放K_(ATP)电流作用的影响 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 第三章 埃他卡林对肺循环微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir 6.1 通道的激活作用及其药理学特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 药品配置 |
| 1.4 耗材与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 大鼠肺微动脉内皮细胞的原代培养 |
| 2.2 大鼠肺微动脉内皮细胞特性及纯度鉴定 |
| 2.3 大鼠肺微动脉内皮细胞K_(ATP)电流记录 |
| 3 数据分析与统计方法 |
| 结果 |
| 1 大鼠肺微动脉内皮细胞的观察与鉴定 |
| 2 胞内能量代谢物质对埃他卡林开放大鼠肺微动脉内皮细胞K_(ATP)功能的影响 |
| 2.1 胞内ATP浓度对埃他卡林激活K_(ATP)作用的影响 |
| 2.2 胞内ADP浓度对埃他卡林激活K_(ATP)作用的影响 |
| 2.3 胞内UDP浓度对埃他卡林激活K_(ATP)作用的影响 |
| 2.4 胞内ATP水解以及镁离子存在对埃他卡林激活K_(ATP)作用的影响 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| ATP 敏感性钾通道在心血管疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 简历 |
| 致谢 |
（10）KATP通道在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化模型的建立及格列苯脲的干预研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ K_(ATP)通道在ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块的表达及其与斑块易损性的关系 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文 Ⅲ K_(ATP)通道在LPS诱导巨噬细胞活化中的作用及信号转导机制 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 附件 |
| 英文文章Ⅰ |
| 英文文章Ⅱ |
四、平滑肌内向整流钾通道(K_(IR))（论文参考文献）
- [1]KCNJ11 rs5210位点多态性与非酒精性脂肪性肝病及冠心病的相关性研究[D]. 徐艳艳. 青岛大学, 2021(02)
- [2]基于冷冻电镜的离子通道门控调节机制分析[D]. 李思宇. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [3]抗氧化型低密度脂蛋白的抗体通过调节单核巨噬细胞的Ca2+/K+通道抑制MCP-1的释放[D]. 苏金玉. 南方医科大学, 2020
- [4]利用诱导多能干细胞探索长QT综合征7型心肌发育分化相关致病调节机制[D]. 陈沛沛. 北京协和医学院, 2020
- [5]氟啶虫酰胺对昆虫取食与排泄影响的毒理机制[D]. 钮建国. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究[D]. 肖华. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [7]氯化钡阻滞内向整流钾通道所致大鼠冠状动脉收缩的作用机制[D]. 范芳文. 山西医科大学, 2017(01)
- [8]褐飞虱和甜菜夜蛾内向整流钾通道的功能研究[D]. 任淼淼. 南京农业大学, 2017(04)
- [9]埃他卡林对体循环、脑循环、肺循环微动脉内皮细胞SUR2B/Kir6.1通道的激活作用及能量代谢物质的调节作用[D]. 王苏阳. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(11)
- [10]KATP通道在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用及分子机制研究[D]. 凌明英. 山东大学, 2013(10)