一、IL-10基因克隆化与原核重组IL-10蛋白制备的实验研究（论文文献综述）
宋瑞其[1]（2021）在《基于IFN-γ分子佐剂的重组Cathepsin L免疫抗蜱效果分析研究》文中指出背景:蜱虫是一种仅次于蚊子的第二大媒介生物,放牧草食家畜的染蜱率可达100%,极易造成蜱传病的侵染（如梨形虫病等）,严重阻碍了区域性经济和畜牧养殖的健康发展。亚洲璃眼蜱（H.as）和小亚璃眼蜱（H.an）是广泛分布于欧亚大陆和北非的硬蜱种,具有重要的医学和兽医学意义,除了叮咬吸血造成皮肤损伤、炎症等直接致病作用外,也是牲畜重要疾病和某些人畜共患病的媒介。随着杀虫剂耐药性日益增加,通过接种疫苗控制蜱虫被视为一种可持续的替代方法,这也是学术界关注的焦点。抗蜱疫苗候选抗原——组织蛋白酶L（Cathepsin L,CPL）是一种高效的血红蛋白酶,在从宿主获得血液的消化过程中起着重要作用;干扰素-γ（IFN-γ）是一种免疫调节因子,在适应性免疫中起到重要作用。目的:为了综合防控媒介蜱虫,本文首次以IFN-γ分子作为抗蜱疫苗佐剂进行H.as CPL（Has CPL）免疫,评价抗H.as和H.an的保护效果,拟达到预防媒介蜱虫的目的。主要研究方法与结果如下:（1）亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱的生物学特性研究从新疆奇台和吐鲁番等2个流行地区分别采集了317和291只硬蜱,分别进行形态学和分子生物学鉴定,及不同发育阶段的生物学特性研究。结果显示,蜱虫种属鉴定为H.as和H.an,两者的亲缘关系（同源性>99.00%）与哈萨克斯坦、甘肃等株极为接近;形态对比发现,卵、幼蜱和若蜱间差异不明显,成蜱间呈现肛侧/下板和气门板特征差异;周期对比发现,卵期H.as出现“卵斑”（后期发育成肛门）的时间（19 d）晚于H.an（14 d）,H.as的产卵和卵孵化周期（27.5 d和31.5 d）长于H.an（12.0 d和20.5 d）,H.as饱血若蜱蜕皮和成蜱吸血时间（19.0 d和8.5 d）小于H.an（30.0 d和13.0 d）,H.as和H.an完成一个生活史平均需要131.5和112.5天。（2）亚洲璃眼蜱Has CPL基因的克隆表达及鉴定利用原核表达系统构建了Has CPL/p ET-28a重组质粒并高效表达纯化出His标签融合Has CPL重组蛋白（约18.07 k Da,0.9-1.3 mg/m L）,通过Western blot验证其能被相应阳性血清特异性识别,表现出良好的反应原性;利用真核表达系统构建了Has CPL/p EGFP-C3重组质粒,经转染至BHK-21细胞,通过IFAT验证真核细胞表达的Has CPL能与阳性血清反应产生特异荧光信号,表现出良好的免疫原性。（3）BALB/c小鼠IFN-γ基因的克隆表达及鉴定利用原核表达系统构建了BALB/c小鼠IFN-γ（Mus-IFN-γ）基因的重组质粒（Mus-IFN-γ/p ET-28a）,表达纯化出His标签融合Mus-IFN-γ重组蛋白（约18.51 k Da,0.5-0.8 mg/m L）,经Western blot分析显示其印迹与Mus-IFN-γ蛋白大小位置一致,通过生物信息学方法和IFN-γ-ELISA试剂盒检测确定为IFN-γ蛋白,为后续保护性免疫试验提供了材料。（4）重组Has CPL免疫效应及其抗亚洲璃眼蜱的效果评价将6只新西兰大白兔分成两组,第一组免疫纯化的重组Has CPL,对照组免疫PBS,经过3次免疫后,分别感染H.as成蜱和幼蜱,根据兔血清中抗体、细胞因子水平及蜱虫的饱血率、饱血重量和蜕皮率等指标分析抗蜱效果。结果显示,重组Has CPL免疫后可同时诱导机体产生体液免疫（抗体效价:102 400-409 600）和细胞免疫（细胞因子:IL-4↑、IL-10↑和IFN-γ↑）反应;免疫组产生的特异性抗Has CPL的血清与H.as蜱组织（中肠;唾液腺;卵巢）中天然CPL蛋白发生反应;免疫组雌蜱充血重量（429±21.44 mg）明显低于对照组（789.86±38.28 mg）（P<0.05）;免疫组幼蜱饱血率和蜕皮率（44.40%和39.01%）均分别显着低于对照组（70.13%和54.99%）（P<0.05）;对于抗H.as总体保护效果分析,免疫Has CPL对H.as雌蜱和幼蜱分别产生54.05%和55.09%抑制作用。（5）重组Has CPL诱导交叉保护性免疫抗小亚璃眼蜱的效果评价分别对H.as和H.an两个CPL蛋白（Has CPL,Han CPL）的同源性、B细胞表位、抗原性、疏水性、等电点和温度系数等进行预测比对,然后采用Dot blot、ELISA和免疫组化（IHC）等方法进行验证,最后根据（4）中免疫方法进行交叉保护性实验。结果显示,2个CPL蛋白结构相似、同源性较高（达90.48%）;抗Has CPL血清可与H.as和H.an部分发育阶段蜱的天然CPL蛋白交叉反应;免疫组（Has CPL）饱血成蜱数量和产卵重量显着低于对照组（PBS）,抑制率分别达到21.43%（P<0.05）和38.84%（P<0.001）,对H.an侵染的交叉抑制率达到54.76%。（6）基于IFN-γ分子佐剂免疫重组Has CPL的抗蜱效果评价将实验BALB/c小鼠分为3组,第一组使用Has CPL联合IFN-γ分子共同免疫BALB/c小鼠（CPL+IFN-γ）,其他两组小鼠单独注射Has CPL（CPL）或PBS;经皮下和腹腔等2种途径免疫后,接种H.as和H.an的幼蜱,根据饱血率、蜕皮率等参数分析抗蜱效果。结果显示,联合IFN-γ分子佐剂可显着增强特异性抗体Ig G（Ig G1>Ig G2a）（P<0.001）和细胞因子（IFN-γ和IL-4,P<0.001）的产生;经流式细胞术检测,与PBS组（27.40%;6.24%）相比,用CPL+IFN-γ免疫的雌性BALB/c小鼠脾脏中CD4+T细胞水平（35.19%）显着高于CPL组（30.87%）（P<0.05）;CPL+IFN-γ组幼蜱的饱血率和蜕皮率显着低于CPL组和PBS组,且腹腔免疫效果要优于皮下免疫;皮下免疫试验显示CPL+IFN-γ组产生的抗H.as幼蜱的效果（85.11%）明显高于CPL组（63.28%）;腹腔免疫试验显示CPL+IFN-γ组产生的抗H.as和H.an幼蜱的效果（96.20%,83.41%）明显高于CPL组（62.46%,61.33%）。结论:建立了H.as和H.an实验室纯蜱饲养技术,掌握了这2种蜱虫之间生活史不同阶段的生物学特性和形态学特征的差异:“卵斑”出现时间、肛侧/下板和气门板;克隆高效表达了亚洲璃眼蜱Has CPL和BALB/c小鼠IFN-γ蛋白;Has CPL是一种潜在的交叉抗蜱候选抗原,免疫Has CPL可同时抗H.as和H.an蜱虫;Has CPL联合IFN-γ共同免疫BALB/c小鼠不仅增强了免疫应答,且增强了抗蜱效果;Has CPL有望作为一种有效的抗蜱亚单位疫苗抗原。
杨移斌[2]（2021）在《草鱼细胞因子IL-22、IL-26和EDA的表达及功能分析》文中研究说明草鱼（Ctenopharyngodon idella）又名鲩鱼,由中国农业出版社出版的2020年版《中国渔业统计年鉴》显示我国2019年草鱼的养殖总产量为553.3万吨,而全国淡水养殖总产量约为3013.7万吨,草鱼养殖总产量则占全国淡水养殖总产量18.4%左右,因此,草鱼是我国水产养殖生产实践中最重要的养殖对象之一。然而,随着草鱼养殖业的发展,病害频发,如草鱼老三病、草鱼出血病以及各种新发疾病等,严重困扰了草鱼养殖产业的健康可持续发展。因此解析草鱼免疫分子机制,寻求病害防控新方法成为了迫切需要解决的问题。研究已经在高等脊椎动物体内很清楚地发现了很多细胞因子均与机体免疫防御功能关系密切,白细胞介素（Interleukin,IL）及肿瘤坏死因子家族（Tumor necrosis factor,TNF）是这些细胞因子中的重要成员,在各种免疫反应中均扮演重要角色。据研究显示,白细胞介素具备参与调控机体的炎症反应及巨噬细胞的极化和迁移,增强吞噬细胞的吞噬活性,参与体液和细胞免疫应答,转变抗体类型,促进T淋巴细胞的成熟及分化等生物学功能。肿瘤坏死因子在机体免疫炎症,增殖分化和造血功能中发挥着多种作用。目前在脊椎动物中已经报道了多种白细胞介素可参与机体免疫防御,维护机体正常的功能运行,其中白细胞介素-22（Interleukin-22,IL-22）及IL-26均为重要的与炎症反应关系密切的细胞因子,但在草鱼中其具体的生物学功能尚未完全被解析。EDA基因参与皮肤上鳞片形成,而皮肤对于多种病原性生物具有强烈的抵抗作用,EDA是否也参与其中,是否也能调控机体炎症反应尚未见相关报道。1草鱼白细胞介素-22（IL-22）表达及功能鉴定白细胞介素（IL）-22在调节感染性病原体的炎症清除中起重要作用。在鱼类中发现了IL-22同系物,但其功能和IL-22的来源尚未完全阐明。本研究在草鱼中鉴定了一个IL-22同系物,并对其生物学活性进行了研究。草鱼IL-22在组织中呈组成性表达,在鳃和后肠中表达量最高。IL-22在感染柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和草鱼呼肠孤病毒后的脾脏中,以及在LPS、IL-2、IL-21和IL-34刺激下的原代头肾和脾脏白细胞中,其表达均上调。相反,它被Th2细胞因子如IL-4/13B和IL-10下调。细菌产生的重组IL-22对原代头肾白细胞和CIK细胞炎性细胞因子、STAT3、SOCS3及抗菌肽的表达有促进作用。此外,用抗IL-22重组蛋白的单克隆抗体（GC3-22）在共聚焦显微镜下观察到IL-22阳性细胞在柱状黄杆菌感染后24h在后肠和头肾中被诱导。同时也发现IL-22炎症条件下可由CD4+T细胞分泌;经凋亡实验发现,IL-22可降低CCCP对CIK细胞诱导的凋亡率。研究也解析了草鱼IL-22蛋白结构,发现其具有典型IL-10家族细胞因子结构。我们的数据表明,IL-22在调节粘膜和系统免疫抵抗细菌和病毒感染方面起着重要作用。2草鱼白细胞介素-22受体1（IL-22RA1）表达分析IL-22的功能受体蛋白是一个复合物,由IL-22RA1和IL-10R2两个亚基组成,是IL-22唯一的膜上受体,其中IL-22RA1是IL-22特有受体,而IL-10R2是IL-10家族多数成员共用受体。高等脊椎动物IL-22通过IL-22RA1-IL-10R2蛋白二聚体向细胞内传递信号,而且这也是IL-22唯一传递信号的途径,在这哺乳动物中已经很明确。然而,目前关于低等脊椎动物如硬骨鱼类IL-22受体在病原微生物感染导致的炎症反应中的分子特征和作用的信息不多。根据基因染色体定位及基因同源性,从草鱼中鉴定了IL-22RA1同系物,预测发现其具有信号肽及跨膜区,是一种典型膜上蛋白结构。分析了草鱼IL-22RA1组织分布,显示其在后肠和鳃表达水平最高。在细菌、病毒等病原微生物刺激下,IL-22RA1表达水平显着上调;多种炎症细胞因子也可在不同细胞中诱导IL-22RA1表达;在原核表达系统中制备了His-rCiIL-22RA1重组膜外区域蛋白,可为进一步研究草鱼IL-22的生物学功能提供支撑。3草鱼白细胞介素-22胞外结合蛋白（IL-22BP）表达分析IL-22结合蛋白（IL-22 binding protein,IL-22BP）作为IL-22功能抑制性受体,其是一种天然的可溶性单链蛋白。哺乳动物中已经证实IL-22BP通过与IL-22功能受体蛋白复合物竞争,直接结合IL-22,阻止该细胞因子与细胞表面受体复合物相互作用,从而中和其生物活性。基于同源基因序列,通过本地BLAST在草鱼基因组CDS区数据库中找到了草鱼IL-22BP部分系列,从而设计引物克隆鉴定了草鱼IL-22BP。rCiIL-22BP序列含一段24 aa的信号肽,而又无跨膜区,因此其是一种典型的外分泌蛋白。经q PCR分析,结果显示IL-22BP在皮肤表达水平最高,在病原微生物感染初期均出现下调;抑炎细胞因子及LPS等可上调草鱼IL-22BP;制备了草鱼IL-22BP重组蛋白,同时也制备了单克隆抗体;研究也发现草鱼IL-22BP在炎症情况下可由CD4+T细胞分泌;解析了部分草鱼IL-22BP蛋白结构。研究可为进一步探究IL-22-IL-BP轴在硬骨鱼类炎症反应中的作用提供支撑。4草鱼IL-22与其受体互作研究IL-22及其受体（IL-22R及IL-22BP）互作在哺乳动物炎症反应中发挥着重要的作用。低等脊椎动物中特别是硬骨鱼类中,关于IL-22与其受体互作研究较少。本研究拟利用免疫沉淀、免疫荧光、q PCR及Western blot技术在细胞及蛋白水平研究IL-22与受体互作,并进一步探究IL-22生物学功能。基于以上研究作为基础,利用免疫沉淀反应,在体外证明了草鱼IL-22RA1及IL-22BP是IL-22的受体;经q PCR分析,研究发现了IL-22BP可在体外抑制IL-22蛋白的生物活性;经Western blot检测,证实草鱼IL-22可通过IL-22RA1-10R2复合受体激活STAT3磷酸化,从而介导生物学功能;经免疫荧光技术发现,草鱼IL-22及IL-22BP在炎症条件下可共同由CD4+T细胞分泌。研究进一步明确了在硬骨鱼类中IL-22通过与受体互作介导炎症反应。5草鱼白细胞介素-26（IL-26）表达及功能鉴定IL-26是IL-10家族中的重要成员,是一种促炎症细胞因子,目前已在人类、两栖动物和硬骨鱼类中被鉴定,但在啮齿类动物中未发现。虽然IL-26在草鱼等硬骨鱼类中被鉴定出来,并进行了炎症相关功能研究,然而,IL-26在包括硬骨鱼类在内的低等脊椎动物炎症调节中的作用尚不十分明确。经q PCR分析,发现草鱼IL-26在皮肤及头肾中表达最高;病原微生物尤其是细菌刺激草鱼可明显上调IL-26表达;LPS、PHA及促炎细胞因子均可在不同细胞诱导IL-26表达;草鱼IL-26可上调炎症细胞因子、STAT3及一些抗菌肽。本研究还制备了草鱼IL-26原核重组蛋白,并制备了IL-26单克隆抗体;筛选了草鱼IL-26蛋白晶体生长条件;研究也发现草鱼IL-26具备一定的诱导细胞凋亡的生物学功能。本研究进一步丰富了硬骨鱼类IL-26的理论知识。6草鱼外胚叶发育不全蛋白基因（Ectodysplasin-A,EDA）及其受体克隆与表达分析EDA是膜上蛋白,隶属于TNF家族成员,其受体为EDAR。EDA及其受体EDAR一直被认为仅与动物毛发、牙齿及骨骼生长发育有关。最近在鱼类中发现了EDA及其受体EDAR同系物,开展了其与鱼类鳞片生长的关系及进化方面的研究。本研究基于基因同源性,克隆鉴定了草鱼EDA及EDAR基因全长,并进行了相关生物信息学分析,预测了其蛋白结构,发现草鱼EDA蛋白是一种典型的无信号肽和跨膜结构域的非分泌型蛋白,而EDAR是一种典型的有跨膜结构域和信号肽的膜蛋白;经q PCR检测发现,EDA在草鱼皮肤表达水平较高,而EDAR则在脾脏表达较高;病原微生物尤其是细菌能明显诱导草鱼EDA及EDAR表达,特别是在皮肤上;LPS、PHA及炎性细胞因子均在不同细胞上调EDA及EDAR的表达。本研究暗示EDA及其受体EDAR参与了硬骨鱼类炎症反应,但有待于进一步深入研究。
汪志文[3]（2020）在《罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究》文中研究指明哺乳动物中,CD6分子作为来自清道夫受体家族的一种淋巴细胞特异性表面受体,在抗炎症反应以及T细胞激活中具有重要作用,兼顾先天性免疫和适应性免疫调控。但是,CD6分子在以硬骨鱼类为代表的低等脊椎动物中的特性和功能尚不清楚。为探究鱼类CD6分子功能,本论文以尼罗罗非鱼为对象克隆鉴定了CD6分子（On CD6）及其配体CD166、Syntenin-1、LCP2和TARF6。由此展开了以下4个方面的工作:（1）通过原核表达获取了On CD6胞外段蛋白,制备单克隆抗体,探究了On CD6分子富含半胱氨酸结构域胞外段蛋白的生物学功能;（2）以罗非鱼头肾淋巴细胞和动物实验探究了On CD6分子参与炎症反应的作用机制;（3）通过GST Pull-Down确定了On CD6分子与其配体的互作及互作结构域（4）初步探究了On CD6分子及其配体参与的信号通路。取得的研究结果如下:1、On CD6分子作为清道夫受体具备模式识别受体的功能本研究成功克隆鉴定了罗非鱼CD6基因,该分子定位于淋巴细胞膜上。体外实验表明On CD6分子胞外段重组蛋白On CD6-ECD在Ca2+作用下能够广泛识别各种水产病原菌以及病原体相关分子模式（PAMPs）,具有体外抑菌功能并能够诱导细菌凝集,能够促进头肾淋巴细胞的呼吸爆发作用和吞噬反应,并促进HKLs促炎因子IL-1β和TNF-α和抑炎因子IL-10和TGF-β的表达。而其配体CD166则不需要在Ca2+的存在下就能够广泛识别病原体相关分子模式。这些结果表明CD6分子作为清道夫受体的功能保守存在从而具有模式识别受体分子（PRRs）的功能。2、On CD6分子参与无乳链球菌引起的罗非鱼急性炎症反应的作用机制On CD6-ECD重组蛋白联合无乳链球菌攻毒以及On CD6在体内过表达后攻毒实验都能有效提高罗非鱼对无乳链球菌感染的免疫保护率。进一步探究发现On CD6能够有效降低无乳链球菌在罗非鱼体内的定植,并增强鱼体总抗氧化能力、抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达、促进抑炎因子IL-10和TGF-β的表达。通过细胞信号通路抑制剂刺激HKLs,发现On CD6分子可能通过NF-κB、MAPK通路调节炎症因子的表达。结合体外研究结果,发现On CD6参与炎症反应的可能机制:广泛识别各种病原体相关分子模式从而结合各种病原引起细菌凝集,增大外源病菌颗粒大小,提高抗氧化物酶活性增强呼吸爆发作用,促进对细菌的清除作用（吞噬作用）。与此同时下调促炎因子IL-1β和TNF-α表达,促进抑炎因子IL-10和TGF-β的表达,降低由无乳链球菌感染造成的损伤等炎性反应症状,从而有效保护机体。3、On CD6分子胞内胞外相关配体表达特征及互作确定成功克隆获取CD6胞内胞外相关配体CD166、Syntenin-1、LCP2和TRAF6。相关定量实验结果表明On CD6分子及其配体组织表达特征具有一致性,都在免疫相关组织中高水平表达,且在LPS、LTA和无乳链球菌刺激下快速上调表达,表明On CD6分子及其配体参与了罗非鱼对无乳链球菌免疫应答;KLH刺激结果表明On CD6在KLH刺激之后,逐渐增加,并且在二次免疫后呈现表达更快,强度更高和持续时间更长的时序表达模式,我们推测On CD6可能参与了宿主对T细胞依赖性病原体感染的防御。GST Pull-Down和ELISA实验结果表明,On CD6与胞外配体On CD166能够结合,并且相互作用结构域为On CD6-SR2和On CD166-IG1;GST Pull-Down体外验证了罗非鱼CD6胞内段CD6-ICD与On Syntenin-1、On LCP2能够结合,而On CD6与On TRAF6的结合可能是通过On Syntenin-1间接作用。4、On CD6、On CD166和On TRAF6参与的信号通路本研究中On CD6和On CD166抑制NF-κB通路激活,On TRAF6显着激活该通路。将On CD6/On CD166和On TRAF6共转染后发现,On CD6/On CD166下调TRAF6引起的NF-κB激活,表明On CD6可能通过与TARF6的结合参与NF-κB的负调节;此外,On CD6/On CD166有效激活了STAT1和ISRE干扰素激活反应元件,并最终激活了IFN3的表达,对IFN1的影响没有显着性变化。我们推测On CD6与其配体的相互作用,可能在IFN3的激活过程中具有重要作用,从而在抗病毒反应中也具有一定作用。
王炜烨[4]（2020）在《细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析》文中指出目的:细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）作为包虫病（hydatidosis）的主要病原体,给我国及世界各国造成了不计其数的危害,给人民群众造成了巨大的生命威胁。自了解包虫病以来,各国均采取积极手段研究对其的防治,因此包虫病的免疫预防就成为了当前研究的热点。基于此,研制针对宿主的包虫病长效保护疫苗,将对我国包虫病的防治起到促进作用。而截至目前,四跨膜蛋白（Tetraspanin,TSP）在广泛的细胞活动过程中起到重要作用,并已发现可对寄生虫宿主免疫互作及逃避起到积极作用,已经被发现可作为多种寄生虫宿主疫苗的候选蛋白。本研究将首次对E.g四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因进行扩增及原核表达,并对其重组蛋白免疫小鼠体内的细胞因子及抗体水平进行检测,为研究四跨膜蛋白作为细粒棘球绦虫候选疫苗抗原奠定基础。方法:（1）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11全长基因的克隆及序列分析根据NCBI GeneBank中细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11的全长基因,分别对其设计特异性引物,以细粒棘球绦虫的原头蚴cDNA为PCR模板进行扩增,并将PCR产物克隆至pMD19-T载体,送至测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8、TSP11全长基因的结构与功能,并通过SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析TSP8、TSP11基因在E.g原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。（2）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11主要抗原基因的克隆及原核表达为成功编码表达细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因,针对其主要抗原区域序列进行了特异性引物设计,对主要抗原区域片段进行克隆并测序。在测序正确的基础上,将目的片段与表达质粒pET-32a分别进行酶切与连接以及转化,建立pET-32a-TSP重组表达载体,并使用亲和层析柱法对其进行纯化、SDS-PAGE电泳对其进行鉴定及检测、Western blot免疫印迹法对其抗原性进行检测、以及通过免疫定位分析TSP8、TSP11蛋白在虫体的具体定位。（3）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11免疫学特性分析试验分为4组,重组蛋白TSP8、TSP11组与PBS、佐剂对照组,每组共15只小鼠,分别对试验组进行免疫,以每只小鼠500μg蛋白含量与弗氏佐剂进行等体积混合免疫,每隔15天免疫一次,共免疫4次。第一次免疫为弗氏完全佐剂混合免疫,其余为弗氏不完全佐剂混合免疫。每次免疫后,各组取三只小鼠尾部采血并收集血清,以q-PCR方法测定Th1型（IFN-γ、TNF-β）、Th2型（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）两类免疫反应共6种细胞因子随免疫时间的变化、以及采用ELISA法测定其抗体水平的变化。结果:1、成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因全长序列,TSP8基因共含有669个核苷酸,编码蛋白含222个氨基酸,相对分子质量为24 KDa。预测TSP8基因共含有2个潜在的N端糖基化位点,包含2个蛋白激酶磷酸化位点。编码TSP8基因的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,推测含有4个优势B抗原表位,且qRT-PCR结果显示TSP8基因在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,但在成虫阶段的表达水平较高,具有统计学差异（p<0.05）。2、经克隆获得TSP11全长基因,TSP基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为29.02KDa,预测其含有3个潜在的N端糖基化位点、5个蛋白激酶磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位。qRT-PCR显示其在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,无统计学显着差异（P>0.05）。3、重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11在免疫小鼠2周时,就可在小鼠血清中检测出特异性IgG抗体,并发现在随后的加强免疫中,血清中的特异性IgG抗体水平逐次升高,表明该重组蛋白能诱导小鼠体内产生特异性的抗体,具有比较好的免疫原性。重组蛋白Eg-TSP8在首免2周后,检测到脾组织中IL-5、IL-10相对于佐剂组与PBS组有较高水平表达（P<0.01）。而重组蛋白Eg-TSP11在第三次加强免疫后,能在脾组织中检测到细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10水平,均比佐剂组与PBS有显着高水平表达（P<0.01）。可见,重组蛋白Eg-TSP11诱导小鼠产生了Th1/Th2免疫反应,而重组蛋白Eg-TSP8主要偏向于Th2免疫反应。结论:重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11均具有免疫原性,但Eg-TSP11蛋白相较于Eg-TSP8蛋白能刺激小鼠产生Th1型免疫应答,具有成为包虫病候选疫苗抗原的潜力。
戴诗雨[5]（2020）在《病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究》文中提出病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）是由一个或多个病毒结构蛋白组装形成的颗粒状结构,与天然病毒粒子形态、抗原性相似。VLP缺失病毒的遗传物质,没有复制和感染能力。VLP的免疫原性良好,研制快速,制备成本较低并且安全,在应对新发、突发病毒疾病的疫苗研制中具有独特优势。杆状病毒表达系统是常用的真核表达系统之一,广泛应用于蛋白功能研究,抗原及疫苗制备。我们利用杆状病毒表达系统构建了几种危害人类健康的病毒VLPs,并初步探究了其作为候选疫苗的免疫原性。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是蚊传黄病毒,近年发现其感染与新生儿小头畸形有关,且能引起格林-巴利综合征等神经系统疾病。目前,对于ZIKV引起的疾病,尚无有效的疫苗和特异性治疗药物,ZIKV严重危害人类健康。我们利用杆状病毒表达系统,构建了表达ZIKV pr ME蛋白的重组病毒。经蔗糖密度梯度离心,从感染的昆虫细胞中纯化得到由ZIKV pr M蛋白和E蛋白自组装形成的ZIKV VLPs。以ZIKV pr ME VLPs免疫小鼠能够诱导小鼠产生中和抗体,及ZIKV特异的体液和细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为以VLP为基础的ZIKV疫苗研发奠定了基础。我们也构建了表达ZIKV囊膜蛋白E的重组病毒,结果显示在昆虫细胞中囊膜蛋白E可以不依赖于pr M蛋白共表达组装成与ZIKV病毒粒子形态类似的VLP,并且释放到胞外。E蛋白保留膜融合活性,可以诱导合胞体形成,这一现象同样适用于包括日本脑炎病毒、登革热病毒和蜱传脑炎病毒在内的黄病毒。基于杆状病毒表达黄病毒囊膜蛋白E诱导合胞体形成的现象,我们还建立了靶向黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）是脊髓灰质炎（简称脊灰）的病原体。目前脊灰没有特异治疗方法,只能通过接种疫苗来预防。目前世界上普遍使用的脊灰疫苗有两种,即口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。自从1988年世界卫生组织（WHO）发起全球消灭脊灰行动以来,世界各国大力推广OPV的使用,2015年和2019年,WHO先后宣布Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒的消灭。在根除脊灰的最后阶段,OPV和IPV都不可避免存在安全性问题,面临着免疫策略调整的挑战,在无PV的环境下生产疫苗更安全可靠。我们利用杆状病毒表达系统共表达PV的P1和3CD蛋白,P1前体可以被3CD蛋白酶成功剪切成衣壳蛋白VP0、VP1和VP3,经过蔗糖密度梯度离心结合氯化铯密度梯度离心可以纯化出PV VLPs,与天然PV病毒颗粒的形态、大小相似。克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,CCHFV）是一种高致病性病毒,可以导致克里米亚刚果出血热,一种以出血为典型特征的蜱媒自然疫源性疾病。CCHFV感染能引起人发热、出血以及多器官的功能衰竭,进而导致死亡,致死率高达30%-50%,没有有效的抗CCHFV的药物和疫苗,CCHFV是人类健康的潜在威胁。在我国病毒分类目录中,CCHFV属于第一类危害程度的病毒;在国外,CCHFV是生物安全4级的病毒。CCHFV在体外通过细胞培养进行病毒的分离和扩增较困难,极大限制了CCHFV的研究进展。我们构建重组病毒在昆虫细胞中共表达CCHFV的膜蛋白和核衣壳蛋白,或者单独表达膜蛋白。通过蔗糖密度梯度离心,成功从感染的细胞中制备出CCHFV VLPs。CCHFV病毒粒子表面是膜蛋白Gn和Gc,为了形成感染性病毒粒子,膜蛋白前体在细胞内经过复杂的剪切、加工和定位从而形成结构蛋白Gn和Gc,非结构蛋白GP160,GP85,GP38和NSm。在整个生命周期中CCHFV膜蛋白Gn和Gc在病毒入侵、膜融合、致病性、宿主选择和免疫逃逸等方面有重要作用。对CCHFV膜蛋白Gn和Gc宿主互作蛋白的研究,探索CCHFV与宿主的相互作用有利于了解CCHFV的分子生物学,找到病毒感染的关键宿主因子。为了研究CCHFV膜蛋白Gn/Gc与宿主的相互作用,我们首先制备了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的单克隆抗体。以原核表达的Gn/Gc胞外区作为免疫原免疫小鼠,通过有限稀释法,以真核表达的Gn/Gc蛋白作为检测抗原,经ELISA方法初筛融合上清,结合蛋白免疫印迹分析和细胞免疫荧光检测。经过综合评定和比较,筛选出8株Gn单克隆化的杂交瘤细胞和10株Gc单克隆化的杂交瘤细胞。分别以不同截短形式的Gn/Gc原核表达蛋白为抗原,对融合上清的识别区段进行鉴定,最终鉴定出2株Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体及其识别的抗原表位。为了探索膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,我们以带有Twin-strep标签的Gn或Gc作为诱饵蛋白,对样品进行细胞亲和纯化-质谱（AP-MS）鉴定。共鉴定出45个Gn或Gc相关宿主蛋白,结合生物信息学深入挖掘和分析,并通过免疫荧光等方法对质谱结果有效性进行验证。综上所述,我们利用杆状病毒表达系统成功构建了ZIKV VLPs,PV VLPs和CCHFV VLPs。对ZIKV VLPs免疫原性的初步探索表明其有良好的免疫原性,有希望成为ZIKV候选疫苗。基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体的现象,建立了针对黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。筛选出2株CCHFV Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体。并通过蛋白质组学和生物信息学鉴定分析了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,可以促进全面地了解膜蛋白Gn/Gc与宿主的关系,对认识CCHFV感染相关过程,后续功能分析及药物靶点设计具有重要指导意义。
范志新[6]（2020）在《猪圆环病毒2型编码蛋白7的鉴定和功能研究》文中指出猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒病（Porcine circovirus diseases,PCVDs）的病原,主要侵害感染猪的免疫细胞,导致严重的免疫抑制,使感染猪对其他病原的易感性增高,引起多种疾病的发生,严重危害生猪健康养殖和猪病防控。PCV2是目前发现的感染哺乳动物最小的DNA病毒,基因组由1766～1768个核苷酸组成,对病毒致病机理的阐明是防控疾病的基础,明确编码蛋白在病毒致病中的作用是揭示其致病机理的重要方面。PCV2基因组结构简单,生物信息学软件分析发现其基因组中存在11个潜在的开放读码框（Open reading frames,ORFs）,分别编码病毒的结构和非结构蛋白,在病毒致病中发挥作用,目前发现的只有6个ORFs（ORF1～6）。对新的ORF发现和鉴定将为PCV2病原学增加新成员,明确其在病毒致病中的作用,将为PCV2致病机理的揭示提供新的科学资料。我们发现PCV2基因组中存在一个保守的ORF,包含在ORF2基因中,在基因组的1524-1033核苷酸处（492 nt）,理论上可编码164个氨基酸,预测蛋白分子量约为18 kDa。为了与已经报道的PCV2 ORFs的命名相衔接,暂将其命名为“ORF7”（简称ORF7）。本研究对ORF7在PCV2感染细胞中的表达进行检测,在证实ORF7确实存在的基础上,开展了ORF7对宿主细胞周期、细胞凋亡、细胞天然免疫因子表达和对PCV2复制的影响研究。获得了以下结果:（1）鼠抗ORF7蛋白多克隆抗体的制备。构建pGEX-6p-1-ORF7重组质粒,通过原核表达系统进行诱导表达,发现在IPTG 0.8 mmol/L、37℃下诱导12 h蛋白表达量最高,且主要在菌体沉淀中表达,pGEX-6p-1-ORF7重组蛋白大小约为44 kDa。将pGEX-6p-1-ORF7重组蛋白以切胶的方式纯化后与佐剂混合,免疫Balb/c小鼠4次后,ELIS A方法检测小鼠阳性血清效价为1:10 000;通过IFA试验可以特异性检测到PCV2感染PK-15细胞后ORF7蛋白的表达;Western blot试验可特异性识别pGEX-6p-1-ORF7和pCDH-CMV-Flag-ORF7重组蛋白的表达。说明制备的多克隆抗体可用于ORF7蛋白的检测。（2）PCV2感染PK-15细胞中ORF7的检测和鉴定。通过RT-PCR和RT-qPCR检测发现PCV2感染PK-15细胞后不同时间点,都可以检测到ORF7 mRNA;Western blot检测发现PCV2感染细胞中存在ORF7蛋白的表达。结果证实在PCV2感细胞过程中存在ORF7基因转录和蛋白表达。（3）ORF7蛋白对PK-15细胞功能的影响。以pCDH-CMV-Flag-ORF7重组质粒转染PK-15细胞,RT-qPCR检测发现在转染后36 h和48 h后内质网应激标志蛋白GRP78基因转录极显着上调;CCK-8法检测发现转染后12 h～48 h细胞活性增强,流式细胞技术检测发现转染细胞处于S期的数量极显着降低、凋亡细胞百分数降低。RT-qPCR和Western blot检测发现转染后12 h～48 h,宿主细胞Bcl-2和Bax的表达均上调,Bcl-2/Bax值升高,Caspase-8/3的表达下调,提示ORF7蛋白具有抑制细胞凋亡的作用;RT-qPCR、Western blot和ELISA检测发现转染细胞的TNF-α、NF-κB、IL-10和IFN-α的表达上调,IL-2和IL-12的表达下调。以PCV2感染转染细胞后,荧光酶标仪检测发现与PCV2感染的对照细胞相比,转染细胞的ROS水平降低。以上研究结果表明,ORF7蛋白抑制宿主细胞凋亡、促进天然免疫因子的分泌、降低了由PCV2引起的细胞ROS。（4）表达ORF7蛋白的PK-15细胞感染PCV2后病毒复制的检测。将pCDH-CMV-Flag-ORF7质粒转染PK-15细胞后感染PCV2,RT-qPCR检测发现感染后12 h～48 h,与对照细胞相比,转染细胞中PCV2 Cap基因mRNA降低。结果提示,细胞表达ORF7蛋白后接种PCV2会下调Cap基因转录。本研究从基因转录水平和蛋白翻译水平鉴定了 PCV2感染细胞中ORF7的表达;体外研究发现,ORF7蛋白能够促进PK-15细胞内质网应激反应、缩短细胞周期、抑制细胞凋亡、促进天然免疫应答,对PCV2复制产生影响,研究结果为PCV2致病机理的阐明提供了新的视角和科学资料。
阳瑞雪[7]（2019）在《鲤疱疹病毒3型vIL-10基因的克隆表达及其对免疫相关因子调节作用的研究》文中研究指明白介素10（Interleukin-10,IL-10）是一种多功能的细胞因子,同时具有免疫增强和免疫抑制作用,但其主要作用是免疫抑制。有些病毒在感染宿主时,通过上调宿主IL-10的表达或编码IL-10类似物,即病毒IL-10（Viral interleukin-10,vIL-10）,逃避宿主的免疫监视和清除,以建立持续性感染。鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3）是目前已知能编码vIL-10的少数低等脊椎动物病毒之一。本论文对CyHV-3 vIL-10基因进行了克隆表达,随后用获得的重组vIL-10（Recombinant viral interleukin-10,rvIL-10）蛋白刺激鲤鱼头肾巨噬细胞和鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini,EPC）,利用荧光定量PCR、Tunel染色和流式细胞术,检测免疫相关因子的表达、凋亡相关因子的表达和细胞凋亡率,探讨CyHV-3 vIL-10对免疫相关因子表达的影响和对EPC细胞凋亡的影响。生物信息学分析结果显示,CyHV-3 vIL-10由179个氨基酸组成,含有一个名为IL-10 superfamily的保守结构域,且含有信号肽,但不含跨膜区;CyHV-3 vIL-10含有1个潜在的磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;CyHV-3 vIL-10的二级结构仅由α-螺旋和无规卷曲组成;CyHV-3 vIL-10与人IL-10、鱼类IL-10或其他vIL-10s具有较低的氨基酸序列相似性和同源性,但具有非常相似的三级结构。通过原核表达获得大小约为38 kDa的rvIL-10蛋白。为了研究rvIL-10蛋白对免疫相关因子表达的影响,本实验用rvIL-10蛋白刺激鲤鱼头肾巨噬细胞,通过荧光定量PCR检测免疫相关因子的表达。结果显示,rvIL-10蛋白单独刺激鲤鱼头肾巨噬细胞后,rvIL-10蛋白不能显着影响白介素1β（Interleukin-1beta,IL-1β）、肿瘤坏死因子α1（Tumor necrosis factor alpha 1,TNF-α1）、干扰素γ1（Interferon-gama1,IFN-γ1）、CXC趋化因子a（CXC chemokine a,CXCa）、诱导型一氧化氮合成酶（Induced nitric oxide synthase,iNOS）、白介素12（Interleukin-12,IL-12）、IL-10、主要组织相容性复合体Ⅰ（Major histocompatibility complex I,MHC I）、白介素8（Interleukin-8,IL-8）和白介素6（Interleukin-6,IL-6）基因的表达,但10μg/mL rvIL-10蛋白能显着促进IL-10基因的表达;rvIL-10蛋白和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）共同刺激鲤鱼头肾巨噬细胞后,rvIL-10蛋白能抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-α1、iNOS、CXCa、IL-12和MHCⅠ基因的表达,其中对TNF-α1和iNOS基因表达的抑制差异性显着,而rvIL-10蛋白不能影响LPS诱导的IL-10、IL-8和IL-6基因的表达,但rvIL-10蛋白对IFN-γ1基因表达的调节是双重的,0.1μg/mL rvIL-10蛋白能显着抑制LPS诱导的IFN-γ1基因的表达,10μg/mL rvIL-10蛋白却能显着促进LPS诱导的IFN-γ1基因的表达。为了研究rvIL-10蛋白对EPC细胞凋亡的拮抗作用,本实验用LPS刺激预先用rvIL-10蛋白孵育后的EPC细胞,通过Tunel染色、流式细胞术和荧光定量PCR检测细胞凋亡率和凋亡相关因子的表达。结果显示,rvIL-10蛋白预处理EPC细胞后,凋亡阳性细胞数减少,凋亡率显着下降;rvIL-10蛋白能抑制LPS诱导的Bax、caspase-9和caspase-3基因的表达,显着促进LPS诱导的Bcl-2基因的表达,但不影响Apaf-1基因的表达。本实验成功克隆表达了CyHV-3 vIL-10基因,获得纯化的rvIL-10蛋白,并证实CyHV-3 vIL-10能抑制LPS诱导的炎性因子的表达,能拮抗EPC细胞的凋亡,为研究CyHV-3逃避宿主的免疫监视提供了理论和实验基础。
黄鑫[8]（2019）在《捻转血矛线虫诱导山羊Th9型免疫反应特点的研究》文中指出Th9型免疫反应是近年来发现的一种新的免疫反应类型,Th9细胞是CD4+T细胞中的一个亚类,一定条件下可由白细胞介素2（IL-2）、IL-4、转化生长因子β（TGF-β）等细胞因子刺激分化而来,主要通过分泌IL-9发挥其生物学功能。人和小鼠研究表明,Th9型免疫在机体自身免疫、抗肿瘤和抗寄生虫感染等过程中发挥重要作用。目前,针对捻转血矛线虫的免疫机理研究,主要集中于Th1和Th2型免疫反应,未见山羊Th9型免疫反应的报道。然而,尚无商品化的抗山羊IL-9抗体,限制了相关研究。本文在克隆、表达了山羊IL-9的基础上,制备了抗山羊IL-9单克隆抗体;将捻转血矛线虫排泄分泌抗原（ESP）与山羊外周血单个核细胞（PBMCs）共孵育,分析虫体ESP诱导山羊产生Th9型免疫反应特点（体外实验）;用捻转血矛线虫第三期幼虫（L3s）人工感染山羊,研究虫体诱导山羊Th9型免疫反应特点（体内实验）。1山羊IL-9基因的克隆与表达静脉采血并分离山羊PBMCs,TRIzol法提取总RNA,用RT-PCR方法获得IL-9基因。序列分析发现山羊IL-9基因大小为481bp,与绵羊IL-9同源性为99%,切除信号肽后理论大小为15.6 Kda。将IL-9成熟肽基因序列亚克隆到载体pET30a,构建了原核表达载体pET30a/IL-9,转化至E.coli BL21后,IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE分析可见融合蛋白大小约16 Kda,与预期大小一致,重组蛋白主要分布于包涵体中,用Ni2+柱纯化后得到目的重组蛋白。2抗山羊IL-9单克隆抗体的制备与特性分析以重组IL-9蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测第二次免疫后小鼠的血清效价,分离高效价小鼠的脾脏B淋巴细胞,与同源骨髓瘤细胞SP2/0融合,经多次有限稀释法、亚克隆筛选以及ELISA检测,最终得到能够稳定分泌抗山羊IL-9的单克隆抗体细胞株10株。进一步用Western-blot技术从中筛选出特异性高的细胞株6A11A8,该细胞株细胞上清效价为1:2430、抗体亚型为IgG2b K。将该细胞株接种小鼠腹腔,层析柱纯化腹水,获得效价高达1:512000的单克隆抗体。初步应用表明该单克隆抗体可识别山羊PBMCs中分泌IL-9的细胞亚类,为研究山羊Th9型免疫反应特点奠定了基础。3捻转血矛线虫ESP体外诱导山羊Th9型免疫反应特点分离山羊PBMCs,与不同浓度的捻转血矛线虫ESP（0、5、10、20、40、80μg/mL）共孵育,48h后提取总RNA,反转录为cDNA,用实时荧光定量PCR检测IL-9的转录情况。结果发现捻转血矛线虫ESP可促进山羊PBMCs IL-9基因的转录,其中20μg/mL ESP可显着提高IL-9的转录,其相对表达量是对照组的4.24倍。将不同浓度的ESP（0、5、10、20、40、80μg/mL）与PBMCs共孵育,流式细胞术检测前4-6h加入蛋白转运抑制剂brefeldin A,经过胞外和胞内染色,对CD2、CD4、IL-9和IL-10均为阳性的细胞（Th9细胞）进行计数,结果发现浓度为10 μg/mL以上的ESP均可极显着（p<0.01）刺激山羊PBMCs中Th9细胞的增殖。与对照组相比,10、20、40、和80μg/mL的ESP刺激后,Th9细胞占T细胞数量的比例由1.23%分别上升为2.61%、3.67%、2.59%和 2.84%。4捻转血矛线虫感染山羊后机体Th9型免疫反应特点以不同数量（0、800、2400、8000）的第三期幼虫（L3s）感染山羊,共设4个组,每组5只山羊,分别为健康组N（不攻虫）、攻虫a组（800 L3s）、攻虫A组（2400 L3s）和攻虫P组（8000L3s）。攻虫后第18、20、22、24、26、28、30天采集各组山羊粪便进行虫卵计数。攻虫后第0、7、14、21、28、35天采集各组山羊抗凝血进行血常规测定。攻虫后第3、7、10、14、18、21、28天采集各组山羊抗凝血进行荧光定量PCR检测和流式细胞术检验,分析不同感染量、不同感染时间宿主IL-9表达量的变化和Th9细胞的动态变化。结果显示,攻虫18天后,攻虫各组EPG值逐渐升高,且P组EPG显着高于A与a组,攻虫26天后P组EPG数值达到顶峰,每克粪便虫卵数为4000。血常规分析显示P和A组嗜酸性粒细胞变化显着外,其余各组白细胞、红细胞、中性粒细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞与N组相比变化不显着。攻虫后,各组IL-9转录水平相比于N组增加;攻虫后10天,A组、P组IL-9转录水平到达顶值,IL-9相对表达量分别为303.6和415.6,a组IL-9转录水平于14天达到峰值269.5,与N组相比差异极显着（P<0.05）;攻虫后14天,各组IL-9水平下降并在驱虫后35天IL-9转录水平与N组差异不显着。攻虫后各组Th9细胞数相比于N组增多,且在18天时,各组Th9细胞数均达到峰值,与N组相比差异显着（P<0.05）;a组、A组和P组的Th9细胞数占T细胞数量的比例分别为5.84%、7.00%和10.03%;攻虫18天后各组Th9细胞量下降但仍显着高于N组;驱虫10天后各组Th9细胞数量与N组差异不显着。
王乐[9]（2019）在《基于C9orf72基因细胞模型的建立及体外实验研究》文中进行了进一步梳理肌萎缩侧索硬化（ALS）与额颞叶痴呆（FTD）是严重危害人类健康的神经性退行疾病,但它们的发病机制并不十分清楚。已有研究发现,C9orf72基因第一个内含子区的GGGGCC六核苷酸重复扩增是导致C9orf72相关的ALS与FTD的主要遗传因素。该类ALS与FTD（C9orf72相关的ALS与FTD）患者的C9orf72基因中通常携带一个GGGGCC重复次数为3～30次的正常的等位基因及一个GGGGCC重复次数为几百甚至上千次的致病等位基因。目前,关于C9orf72基因GGGGCC六核苷酸重复扩增导致疾病发生的可能分子机制主要有三种:第一,GGGGCC重复扩增导致C9orf72蛋白单倍剂量不足,使其正常功能丧失而致病;第二,GGGGCC重复扩增序列转录后会聚集在一起形成RNA灶,其招募RNA结合蛋白,通过影响RNA结合蛋白的正常功能而致病;第三,GGGGCC的重复扩增序列通过重复相关无起始密码子翻译（repeat-associated non ATG-dependent translation）机制形成具有毒性的重复二肽而致病。然而,究竟上述哪一种机制是导致C9orf72相关的ALS与FTD的主要原因,还未有定论。为了便于本实验室研究C9orf72相关的ALS与FTD发生的分子机制以及开发C9orf72相关的ALS与FTD的治疗药物,本课题主要从以下四个方面进行了初步探索。1.制备针对人源C9orf72蛋白的单克隆抗体:利用纯化的C9orf72原核蛋白及表达C9orf72蛋白的DNA疫苗,对BALB/c小鼠进行交叉免疫,制备了针对人源C9orf72蛋白的单克隆抗体。最终通过Western blot实验证实,所获得的46A8株抗体可特异性识别外源表达的原核及真核C9orf72蛋白。为后续C9orf72蛋白功能的研究提供了重要的实验工具。2.建立 C9orf72-T2A-Luciferase KI 的 HEK293 细胞模型:首先,构建在 C9orf72基因最后一个编码外显子之后可产生双链断裂的sgRNA与Cas9共表达的打靶载体。然后,构建由上下游同源臂介导的可将T2A-Luciferase外源基因定点整合至C9orf72基因编码框之后的供体载体。将打靶载体与供体载体共同转染至HEK293细胞,经过抗性药物筛选与细胞克隆化之后,通过PCR及测序实验证实成功获得了C9orf72单等位基因插入外源Luciferase报告基因的单克隆C9orf72-T2A-Luciferase KI HEK293 细胞模型;最后,利用 Real-Time PCR 实验证实该细胞系中Luciferase的表达量与C9orf72基因mRNA的表达量呈正相关,因此通过检测Luciferase活性的变化,便可以初步确定C9orf72基因表达的变化。该细胞系的建立为高通量筛选针对C9orf72单倍剂量不足的小分子药物奠定了实验基础,在该领域具有重要的应用价值。3.利用C9orf72基因敲除的细胞模型研究C9orf72基因在调节细胞炎症方面的作用:设计靶向C9orf72基因第一个编码外显子的sgRNA,构建可共表达sgRNA与Cas9的慢病毒载体,成功包装慢病毒后感染U937细胞,经过抗性药物筛选与细胞克隆后,通过PCR及测序实验证实成功获得了 C9orf72基因中单等位基因敲除的U937细胞模型（C9orf72+/-U937）。用终浓度为1μg/mL的脂多糖体外刺激 C0orf72+/-U937 细胞,然后通过 Real-Time PCR 检测了 IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α细胞因子mRNA水平的变化,结果显示,与正常U937细胞相比,C9orf72基因敲除的U937细胞模型中IL-6,IL-8,TNF-α及IL-10细胞因子mRNA的表达量显着升高,表明C9orf72基因在调节U937细胞炎症方面具有重要的作用。该细胞模型的建立为研究C9orf72基因功能及探索C9orf72单倍剂量不足的致病机制奠定了重要基础。4.建立C9orf72 GGGGCC六核苷酸重复KI的HEK293细胞模型:首先通过合成两端带有限制性酶切位点的（GGGGCC）6 DNA引物,利用同尾酶连接的方式,获得了 GGGGCC重复次数约为200次的间隔重复序列。然后构建在C9orf72基因第一个内含子区可产生双链断裂的sgRNA与Cas9共表达的打靶载体。同时构建由上下游同源臂介导的可将（GGGGCC）150的重复序列定点整合至C9orf72基因第一个内含子区的供体载体。将打靶载体与供体载体共同转染至HEK293细胞,经抗性药物筛选后,初步通过PCR及测序实验证实获得了在C9orf72基因第一内含子区插入含有（GGGGCC）10～70间隔重复序列的细胞模型。该细胞模型的建立为后续研究GGGGCC重复序列参与疾病的发病机制以及通过CRISPR/Cas9技术建立C9orf72 GGGGCC六核苷酸重复扩增的动物模型奠定了基础。综上所述,本课题成功构建了可用于C9orf72功能研究的三种不同的细胞模型,为本实验室后续阐明GGGGCC六核苷酸重复扩增导致C9orf72相关的ALS与FTD的分子机制奠定了重要基础,具有重要的研究意义及应用价值。
郭淞宁[10]（2019）在《以C5-Ⅰ/Ⅱ为分子佐剂的维氏气单胞菌OmpAⅠ基因重组乳酸菌的构建及免疫效果分析》文中认为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种人鱼共患病原菌,给水产养殖业带来巨大损失的同时也给公共卫生带来了巨大威胁,鱼用疫苗因其条件限制,口服疫苗的开发具有重要意义。外膜蛋白A是一种粘附性蛋白,可加强机体杀菌效率,具有良好的免疫原性,具有作为DNA疫苗抗原基因的潜力,但因DNA疫苗蛋白表达量过低,无法刺激机体产生足够强的免疫应答,利用分子佐剂可提高其免疫效果,分子佐剂主要通过激活先天性免疫系统来增强抗原效果,包括干扰素、补体分子及白介素等,具有良好前景。本实验克隆了A.veronii TH0426株OmpAⅠ基因,鲤鱼补体C5-Ⅰ与C5-Ⅱ基因,通过SOE-PCR将OmpAⅠ分别与C5-Ⅰ与C5-Ⅱ基因重叠扩增。结果显示,均可扩增出1500 bp左右的融合基因,对融合基因进行原核表达后构建了锚定表达型（Lc-pPG-1-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ）和分泌表达型（Lc-pPG-2-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ）四种重组干酪乳杆菌。Western boltting结果显示,两种重组乳杆菌均可表达出58 kDa的融合蛋白,间接免疫荧光可在菌体表面检测到荧光信号;为分析重组乳杆菌的免疫应答能力,将重组乳杆菌通过口服饲喂方式对鲫鱼进行免疫,并对免疫0 d、7 d、16 d、25 d、34 d的免疫鲫鱼进行血液及组织采集,通过ELISA对血清中的IgM、AKP、ACP、SOD、LZM指标进行检测,结果表明重组乳酸菌可使免疫鲫鱼血清中IgM抗体水平保持较高水平,且使AKP、ACP、SOD、LZM活性显着上调,说明重组乳酸菌对鲫鱼的体液免疫具有增强作用;同时白细胞吞噬活性较其对照组有明显加强;通过qRT-PCR对免疫鲫鱼各个组织的免疫基因表达量进行测定,结果表明各个组织的IL-10、IL-1β、TNF-α、IFN-γ转录水平均呈明显上升趋势,说明重组乳酸菌可使细胞因子转录水平升高,增强细胞免疫应答;空腹处理7 d后对免疫鲫鱼进行肠道采集,对其前、中、后肠进行平板菌落计数,结果表明重组乳酸菌可在肠道内进行良好定植,随后对免疫鲫鱼腹腔接种A.veronii TH0426,所有免疫组均在一定程度上起到保护作用。分子佐剂C5-Ⅰ与C5-Ⅱ的添加,使之与单独OmpAⅠ基因重组乳酸菌相比其各项免疫指标均有所提高,说明补体C5作为分子佐剂可有效提高重组乳酸菌的免疫效果,在其激活固有免疫的同时有效地促进细胞免疫应答。综上所述,本实验构建的OmpAⅠ基因C5-Ⅰ与C5-Ⅱ为分子佐剂的重组乳酸菌Lc-pPG-1-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ与Lc-pPG-2-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ,口服免疫后均可使IgM保持较高水平,同时可使血清中酶活性与细胞因子水平呈上升趋势,增强白细胞的分化与吞噬能力,分子佐剂的添加可刺激机体产生更强的免疫应答,提升疫苗的免疫效果。本研究为口服乳酸菌疫苗的开发与利用提供理论基础,为分子佐剂的应用提供依据。
二、IL-10基因克隆化与原核重组IL-10蛋白制备的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IL-10基因克隆化与原核重组IL-10蛋白制备的实验研究（论文提纲范文）
（1）基于IFN-γ分子佐剂的重组Cathepsin L免疫抗蜱效果分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究目的及意义 |
| 1.2 亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱的流行病学现状及其危害 |
| 1.3 抗蜱候选保护性抗原研究现状 |
| 1.4 抗蜱疫苗的保护机制 |
| 1.5 半胱氨酸蛋白酶家族 |
| 1.6 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫(包括硬蜱)体内分布和功能 |
| 1.7 半胱氨酸蛋白酶在蜱血液消化中的作用 |
| 1.8 半胱氨酸蛋白酶在蜱胚胎发育中的作用 |
| 1.9 抗蜱疫苗佐剂研究进展与临床应用 |
| 1.10 研究思路及主要内容 |
| 1.11 拟解决关键问题 |
| 1.12 技术路线 |
| 第2章 亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱生物学特性研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 亚洲璃眼蜱组织蛋白酶L(Has CPL)基因的克隆、表达及鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 BALB/c小鼠γ干扰素(Mus-IFN-γ)基因的克隆、表达及鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 重组Has CPL免疫效应及其抗亚洲璃眼蜱的效果评价 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 重组Has CPL诱导交叉保护性免疫抗小亚璃眼蜱的效果评价 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 基于IFN-γ佐剂免疫重组Has CPL的抗蜱效果评价 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）草鱼细胞因子IL-22、IL-26和EDA的表达及功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 IL-22 及其受体研究进展 |
| 2 IL-26 研究进展 |
| 3 EDA及其受体研究进展 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第一章 草鱼白细胞介素-22 表达及功能分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要的试剂及仪器设备 |
| 1.1.2 试验用鱼 |
| 1.1.3 CiIL-22 的克隆与鉴定 |
| 1.1.4 CiIL-22 的序列分析 |
| 1.1.5 CiIL-22 的组织表达分析 |
| 1.1.6 细菌刺激实验 |
| 1.1.7 病毒感染实验 |
| 1.1.8 CiIL-22 及其突变体原核重组蛋白的制备及纯化 |
| 1.1.9 rCiIL-22 结构解析 |
| 1.1.10 CiIL-22 在多种细胞中表达的调控 |
| 1.1.11 rCiIL-22 单克隆抗体的制备及共聚焦显微镜观察 |
| 1.1.12 rCiIL-22对CCCP诱导细胞凋亡的影响 |
| 1.1.13 CiIL-22 突变体重组蛋白的生物活性研究 |
| 1.1.14 数据统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 CiIL-22 的序列鉴定 |
| 1.2.2 CiIL-22 在鱼类中的表达分析 |
| 1.2.3 原代细胞中CiIL-22 表达的调控 |
| 1.2.4 rCiIL-22 及其突变体蛋白的生物活性研究 |
| 1.2.5 IL-22 产生细胞的定位 |
| 1.2.6 rCiIL-22 结构 |
| 1.2.7 rCiIL-22对CCCP诱导细胞凋亡的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 草鱼白细胞介素-22 受体1 表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要的试剂及仪器设备 |
| 2.1.2 试验用鱼 |
| 2.1.3 CiIL-22RA1 的克隆与鉴定 |
| 2.1.4 CiIL-22RA1 的序列分析 |
| 2.1.5 CiIL-22RA1 的组织表达分析 |
| 2.1.6 细菌刺激实验 |
| 2.1.7 病毒感染实验 |
| 2.1.8 His-rCiIL-22RA1 的制备及纯化 |
| 2.1.9 CiIL-22RA1 在多种细胞中表达的调控 |
| 2.1.10 数据统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CiIL-22RA1 的序列鉴定 |
| 2.2.2 CiIL-22RA1 在鱼类中的表达分析 |
| 2.2.3 原代细胞中CiIL-22RA1 表达的调控 |
| 2.2.4 重组His-CiIL-22RA1 原核重组蛋白的制备及纯化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 草鱼白细胞介素-22 胞外结合蛋白表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要的试剂及仪器设备 |
| 3.1.2 试验用鱼 |
| 3.1.3 CiIL-22BP的克隆与鉴定 |
| 3.1.4 CiIL-22BP的序列分析 |
| 3.1.5 CiIL-22BP的组织表达分析 |
| 3.1.6 细菌刺激实验 |
| 3.1.7 病毒感染实验 |
| 3.1.8 CiIL-22BP原核重组蛋白的制备及纯化 |
| 3.1.9 rCiIL-22BP结构解析 |
| 3.1.10 CiIL-22BP在多种细胞中表达的调控 |
| 3.1.11 rCiIL-22BP单克隆抗体的制备及共聚焦显微镜观察 |
| 3.1.12 数据统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CiIL-22BP的序列鉴定 |
| 3.2.2 CiIL-22BP在鱼类中的表达分析 |
| 3.2.3 原代细胞中CiIL-22BP表达的调控 |
| 3.2.4 rCiIL-22BP蛋白纯化 |
| 3.2.5 IL-22BP产生细胞的定位 |
| 3.2.6 rCiIL-22BP结构 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 草鱼IL-22 与其受体互作研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要的试剂及仪器设备 |
| 4.1.2 试验用鱼 |
| 4.1.3 rCiIL-22 及其受体体外结合研究 |
| 4.1.4 rCiIL-22BP对 rCiIL-22 生物活性的影响 |
| 4.1.5 rCiIL-22 磷酸化信号通路鉴定 |
| 4.1.6 rCiIL-22BP与 rCiIL-22 共定位研究 |
| 4.1.7 数据统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CiIL-22 受体鉴定 |
| 4.2.2 rCiIL-22BP对 rCiIL-22 生物活性的影响 |
| 4.2.3 rCiIL-22 磷酸化信号通路鉴定 |
| 4.2.4 rCiIL-22BP与 rCiIL-22 共分泌细胞研究 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 草鱼白细胞介素-26 表达及功能鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要的试剂及仪器设备 |
| 5.1.2 试验用鱼 |
| 5.1.3 CiIL-26 的组织表达分析 |
| 5.1.4 细菌刺激实验 |
| 5.1.5 病毒感染实验 |
| 5.1.6 CiIL-26 原核重组蛋白的制备及纯化 |
| 5.1.7 CiIL-26 在多种细胞中表达的调控 |
| 5.1.8 rCiIL-26 单克隆抗体的制备 |
| 5.1.9 rCiIL-26 晶体结构研究 |
| 5.1.10 rCiIL-26 对细胞凋亡的影响 |
| 5.1.11 数据统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CiIL-26 在鱼类中的表达分析 |
| 5.2.2 原代细胞中CiIL-26 表达的调控 |
| 5.2.3 rCiIL-26 的生物活性研究 |
| 5.2.4 rCiIL-26 结构 |
| 5.2.5 rCiIL-26 诱导细胞凋亡的作用 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 草鱼外胚叶发育不全蛋白基因及其受体克隆与表达分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要的试剂及仪器设备 |
| 6.1.2 试验用鱼 |
| 6.1.3 CiEDA和 CiEDAR基因的克隆与鉴定 |
| 6.1.4 CiEDA和CiEDAR的序列分析 |
| 6.1.5 CiEDA和CiEDAR的组织表达分析 |
| 6.1.6 细菌刺激实验 |
| 6.1.7 病毒感染实验 |
| 6.1.8 CiEDA and CiEDAR在多种细胞中表达的调控 |
| 6.1.9 数据统计分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 草鱼CiEDA和 CiEDAR的序列特征 |
| 6.2.2 CiEDA和 CiEDAR在鱼类中的表达分析 |
| 6.2.3 原代细胞中CiEDA和 CiEDAR表达调控 |
| 6.3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 免疫应答机制概述 |
| 1.1.1 先天性免疫 |
| 1.1.2 适应性免疫 |
| 1.1.3 T细胞激活机制 |
| 1.2 清道夫受体概述 |
| 1.2.1 清道夫受体家族分类 |
| 1.2.2 清道夫受体家族功能 |
| 1.3 CD6的研究进展 |
| 1.3.1 CD6分子结构特征 |
| 1.3.2 CD6分子生理功能 |
| 1.3.3 CD6分子配体概述 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 OnCD6分子的克隆和表达特征分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验用鱼 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验用鱼及预处理 |
| 2.3.2 总RNA提取和c DNA合成 |
| 2.3.3 OnCD6基因克隆 |
| 2.3.4 OnCD6生物信息学分析 |
| 2.3.5 OnCD6实时荧光定量 |
| 2.3.6 OnCD6胞外段原核表达 |
| 2.3.7 OnCD6单克隆抗体制备方法 |
| 2.3.8 OnCD6亚细胞定位实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 OnCD6的基因克隆和生物信息学分析 |
| 2.4.2 OnCD6的组织分布 |
| 2.4.3 OnCD6在无乳链球菌刺激后的表达模式 |
| 2.4.4 OnCD6 在不同刺激物刺激HKLs后的表达模式 |
| 2.4.5 OnCD6在KLH刺激后的表达模式 |
| 2.4.6 OnCD6胞外段的原核表达及纯化 |
| 2.4.7 OnCD6的单克隆抗体制备 |
| 2.4.8 OnCD6的亚细胞定位 |
| 2.5 实验讨论 |
| 3 OnCD6体外功能验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细菌 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 OnCD6-ECD与细菌结合检测 |
| 3.3.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合检测 |
| 3.3.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集检测 |
| 3.3.4 OnCD6-ECD体外抑菌实验 |
| 3.3.5 OnCD6-ECD参与吞噬反应检测 |
| 3.3.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发影响的实验 |
| 3.3.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达影响的实验 |
| 3.3.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖影响的实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 OnCD6-ECD参与结合细菌 |
| 3.4.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合 |
| 3.4.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集反应 |
| 3.4.4 OnCD6-ECD具有体外抑菌活性 |
| 3.4.5 OnCD6-ECD促进HKLs对细菌吞噬 |
| 3.4.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发的影响 |
| 3.4.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达的影响 |
| 3.4.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖的影响 |
| 3.5 实验讨论 |
| 4 OnCD6体内功能探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用鱼 |
| 4.2.2 实验病菌 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验设备 |
| 4.2.5 实验引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼存活率影响实验 |
| 4.3.2 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼载菌量的检测 |
| 4.3.3 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼病理生化指标的影响实验 |
| 4.3.4 CD6体内过表达的生物学效应探究实验 |
| 4.3.5 HE染色 |
| 4.3.6 生化指标检测 |
| 4.3.7 通路抑制剂孵育HKLs检测信号通路 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼生存率的影响 |
| 4.4.2 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼载菌量影响 |
| 4.4.3 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼病理变化的影响 |
| 4.4.4 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼外周血生化指标的影响 |
| 4.4.5 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼炎症因子表达的影响 |
| 4.4.6 OnCD6体内过表达验证结果 |
| 4.4.7 OnCD6体内过表达对无乳链球菌感染罗非鱼存活率的影响 |
| 4.4.8 OnCD6体内过表达对炎症因子表达的影响 |
| 4.4.9 OnCD6在HKLs中信号通路检测 |
| 4.5 实验讨论 |
| 5 CD6与胞外配体CD166的相互作用探究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验用鱼 |
| 5.2.2 实验细菌 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.2.5 实验引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实验用鱼及预处理 |
| 5.3.2 总RNA提取和c DNA合成 |
| 5.3.3 OnCD166基因克隆和生信分析 |
| 5.3.4 OnCD166荧光定量 |
| 5.3.5 OnCD166胞外段原核表达 |
| 5.3.6 OnCD166多克隆抗体的制备实验 |
| 5.3.7 OnCD166-ECD与细菌结合检测 |
| 5.3.8 OnCD166-ECD与 PAMPs结合检测 |
| 5.3.9 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应检测 |
| 5.3.10 GST Pull-Down验证OnCD166和OnCD6 相互作用 |
| 5.3.11 OnCD166亚细胞定位及共定位实验 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 OnCD166基因克隆与生信分析 |
| 5.4.2 OnCD166 m RNA表达特征 |
| 5.4.3 OnCD166-ECD原核表达 |
| 5.4.4 OnCD166-ECD多克隆抗体制备 |
| 5.4.5 OnCD166-ECD参与细菌结合 |
| 5.4.6 OnCD166-ECD与 PAMPs结合 |
| 5.4.7 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应 |
| 5.4.8 OnCD166-OnCD6 互作及相互作用结构域确定 |
| 5.4.9 OnCD166 亚细胞定位及与OnCD6 共定位 |
| 5.5 实验讨论 |
| 6 CD6与胞内配体的互作及信号通路初探 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验用鱼 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.2.4 实验引物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 基因克隆及生信分析 |
| 6.3.2 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 荧光定量 |
| 6.3.3 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 原核表达 |
| 6.3.4 抗体封闭实验 |
| 6.3.5 GSTPull-Down验证OnCD6与Syntenin-1、LCP2和TRAF6 互作 |
| 6.3.6 双荧光素酶报告基因检测实验 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 罗非鱼Syntenin-1 基因克隆及生信分析 |
| 6.4.2 罗非鱼LCP2基因克隆和生信分析 |
| 6.4.3 罗非鱼TRAF6基因克隆和生信分析 |
| 6.4.4 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 m RNA表达特征 |
| 6.4.5 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6原核表达及纯化 |
| 6.4.6 抗体封闭实验结果 |
| 6.4.7 OnCD6-ICD与 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 互作 |
| 6.4.8 OnCD6、OnCD166和On TRAF6 参与的信号通路 |
| 6.5 实验讨论 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 后续展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ GST标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性 |
| 附录Ⅱ His标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 细粒棘球蚴病概述 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 诊断方法 |
| 2 细粒棘球蚴病疫苗研制研究进展 |
| 2.1 细粒棘球绦虫中间宿主疫苗研究进展 |
| 2.2 细粒棘球绦虫终末宿主疫苗研究进展 |
| 3 四跨膜蛋白的研究进展 |
| 3.1 四跨膜蛋白的功能 |
| 3.2 寄生虫四跨膜蛋白研究进展 |
| 4 细粒棘球绦虫免疫学概述 |
| 4.1 细粒棘球绦虫的免疫逃避机制 |
| 4.2 包虫病中不同Th类型细胞因子的作用 |
| 5 展望 |
| 6 结语 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的克隆及序列测序 |
| 1.材料 |
| 1.1 虫株、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 原头蚴总RNA的提取 |
| 2.3 反转录及目的基因的PCR扩增 |
| 2.4 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.5 TSP基因的生物信息学分析 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 总RNA质量检测 |
| 3.2 TSP基因的克隆 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 4.讨论 |
| 试验二 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的原核表达 |
| 1.材料 |
| 1.1 质粒和菌株、血清 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.4 重组表达载体的构建 |
| 2.5 重组蛋白的表达 |
| 2.6 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.9 鼠抗rEg-TSP-IgG的制备 |
| 2.10 免疫印迹分析 |
| 2.11 免疫荧光鉴定 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 TSP基因主要抗原区域的扩增 |
| 3.2 重组p ET32a-TSP质粒的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与抗原性分析 |
| 4.讨论 |
| 试验三 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 制备特异性抗血清 |
| 2.2 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 qPCR法检测TSP免疫小鼠体内细胞因子变化 |
| 3.2 ELISA法检测TSP免疫小鼠体内抗体水平变化 |
| 4.讨论 |
| 第三章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 病毒样颗粒疫苗的简介 |
| 1.1.2 病毒样颗粒疫苗的表达系统 |
| 1.1.3 病毒样颗粒疫苗发展面临的挑战和解决方案 |
| 1.2 寨卡病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 寨卡病毒的流行病学 |
| 1.2.2 寨卡病毒的分类 |
| 1.2.3 寨卡病毒结构和基因组结构 |
| 1.2.4 寨卡病毒的生命周期 |
| 1.2.5 寨卡病毒E蛋白的结构和功能研究 |
| 1.2.6 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3 脊髓灰质炎病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 脊髓灰质炎的流行现状 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒的生物学 |
| 1.3.3 脊髓灰质炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 克里米亚刚果出血热病毒的研究进展 |
| 1.4.1 CCHFV的生物学 |
| 1.4.2 CCHFV的临床流行病学 |
| 1.4.3 CCHF的预防 |
| 1.4.4 CCHFV疫苗的研究进展 |
| 1.4.5 CCHFV单克隆抗体的研究进展 |
| 1.5 本论文的研究内容和意义 |
| 第2章 寨卡病毒样颗粒的构建和免疫原性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒与菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 抗体与抗体制备 |
| 2.1.4 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.1.5 ZIKV病毒蛋白的表达和鉴定 |
| 2.1.6 ZIKV病毒样颗粒和病毒粒子的纯化与检测 |
| 2.1.7 ZIKV VLPs的免疫原性评价 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.2.2 ZIKV pr M和 E蛋白形成VLPs |
| 2.2.3 ZIKV VLPs的免疫原性研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于杆状病毒表达的VLP诱导合胞体现象的抗黄病毒药物筛选方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 抗体与抗体纯化 |
| 3.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.1.5 质粒的构建及转染实验 |
| 3.1.6 序列比对和进化分析 |
| 3.1.7 免疫荧光分析 |
| 3.1.8 ZIKV滴度测定(空斑实验) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导Sf9细胞形成合胞体 |
| 3.2.2 黄病毒E蛋白在Sf9细胞中的细胞定位研究 |
| 3.2.3 ZIKV prME和E蛋白形成VLPs |
| 3.2.4 基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体现象的抗病毒筛选 |
| 3.2.5 AMS通过影响病毒入侵抑制黄病毒感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 脊髓灰质炎病毒样颗粒的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 抗体与抗体制备 |
| 4.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 4.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PVⅡP1多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 4.2.2 重组杆状病毒的构建 |
| 4.2.3 PVⅡVP0,VP1和VP3 蛋白形成VLPs |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 克里米亚刚果出血热病毒样颗粒的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 抗体 |
| 5.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 5.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 重组杆状病毒v Ac-Gn Gc NP和 v Ac-Gn Gc的构建 |
| 5.2.2 CCHFV VLPs的纯化和鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株、质粒与细胞系 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc胞外区的诱导表达 |
| 6.1.4 单克隆抗体制备的流程 |
| 6.1.5 小鼠血清和杂交瘤细胞上清识别能力的检测 |
| 6.1.6 单克隆抗体线性识别位点的鉴定 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 小鼠血清的检测 |
| 6.2.2 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的筛选 |
| 6.2.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体识别表位的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc宿主相互作用组的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 抗体 |
| 7.1.4 细胞转染 |
| 7.1.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) |
| 7.1.6 非标定量质谱分析 |
| 7.1.7 生物信息学分析 |
| 7.1.8 免疫荧光和共聚焦实验 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 诱饵蛋白Gn/Gc及其宿主互作蛋白的SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 7.2.2 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的非标定量质谱分析 |
| 7.2.3 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 7.2.4 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的相互作用网络分析 |
| 7.2.5 间接免疫荧光验证质谱结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 线粒体 |
| 7.3.2 内质网 |
| 7.3.3 细胞骨架 |
| 7.3.4 外泌体和囊泡 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）猪圆环病毒2型编码蛋白7的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒2型研究进展 |
| 1.1 猪圆环病毒的发现及疾病 |
| 1.1.1 猪圆环病毒的发现与特性 |
| 1.1.2 猪圆环病毒病 |
| 1.2 PCV2病原学研究进展 |
| 1.2.1 编码蛋白的研究进展 |
| 1.2.2 猪圆环病毒2型与宿主细胞的相互作用 |
| 1.3 研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪圆环病毒2型感染细胞中ORF7的检测鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒、质粒与实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、菌株及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组载体的构建 |
| 2.2.2 抗ORF7蛋白的多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 多克隆抗体(血清抗体)的应用 |
| 2.2.4 PCV2感染PK-15细胞中ORF7的检测 |
| 2.2.5 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 ORF7和Cap基因的克隆 |
| 2.3.2 重组表达质粒的构建 |
| 2.3.3 重组菌的鉴定和诱导表达 |
| 2.3.4 重组菌诱导条件的优化及表达鉴定 |
| 2.3.5 重组蛋白纯化和浓度测定 |
| 2.3.6 小鼠免疫和多克隆抗体血清效价的测定 |
| 2.3.7 多克隆抗体(血清抗体)的应用 |
| 2.3.8 PCV2感染PK-15细胞中ORF7的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪圆环病毒2型ORF7蛋白对宿主细胞功能和病毒复制的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ORF7蛋白对PK-15细胞功能的影响 |
| 3.2.2 表达ORF7蛋白的PK-15细胞感染PCV2后病毒复制的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ORF7蛋白对PK-15细胞功能的影响 |
| 3.3.2 表达ORF7蛋白的PK-15细胞感染PCV2后病毒复制的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）鲤疱疹病毒3型vIL-10基因的克隆表达及其对免疫相关因子调节作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 白介素10的研究进展 |
| 1.1 IL-10 来源 |
| 1.2 IL-10 家族 |
| 1.3 IL-10 受体 |
| 1.4 IL-10 的生物学活性 |
| 1.5 IL-10 抑制细胞凋亡 |
| 1.6 鲤鱼IL-10 |
| 2 病毒白细胞介素10的研究进展 |
| 2.1 vIL-10 基因结构 |
| 2.2 vIL-10 的蛋白结构 |
| 2.3 vIL-10 的转录表达 |
| 2.4 vIL-10 在体外的生物学活性 |
| 2.5 vIL-10 在体内的生物学活性 |
| 2.6 vIL-10 的应用研究 |
| 3 鲤疱疹病毒3型的研究进展 |
| 3.1 病毒的基因组及蛋白质组特征 |
| 3.2 KHVD的流行病学 |
| 3.3 CyHV-3 编码的细胞因子及细胞因子受体 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鲤疱疹病毒3型vIL-10 基因的克隆表达及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞及病毒株 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CyHV-3 vIL-10 基因的克隆 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 CyHV-3 vIL-10 去信号肽基因的克隆 |
| 2.4 CyHV-3 vIL-10 去信号肽基因的表达 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CyHV-3 vIL-10 基因的扩增、克隆及鉴定 |
| 3.2 CyHV-3 vIL-10 的生物信息学分析 |
| 3.3 CyHV-3 vIL-10 去信号肽基因的扩增、克隆及鉴定 |
| 3.4 CyHV-3 vIL-10 原核表达载体构建及鉴定 |
| 3.5 rvIL-10 蛋白的诱导表达 |
| 3.6 rvIL-10 蛋白诱导表达的条件优化 |
| 3.7 rvIL-10 蛋白的纯化及特异性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 rvIL-10 蛋白对宿主免疫相关因子的调节作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验的重组蛋白 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要实验设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鲤鱼头肾巨噬细胞的分离 |
| 2.2 rvIL-10 蛋白对鲤鱼头肾巨噬细胞的刺激 |
| 2.3 细胞总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2.4 荧光定量PCR检测免疫相关因子的表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 rvIL-10 蛋白对免疫相关因子表达的影响 |
| 3.2 rvIL-10 蛋白对LPS诱导的免疫相关因子表达的影响 |
| 3.3 rvIL-10 蛋白在不同时间对免疫相关因子表达的影响 |
| 3.4 rvIL-10 蛋白在不同时间对LPS诱导的免疫相关因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 rvIL-10 蛋白拮抗鲤鱼上皮瘤细胞凋亡的初步研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验的重组蛋白 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要实验设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 rvIL-10 蛋白对EPC细胞的刺激 |
| 2.2 Tunel染色检测EPC细胞凋亡 |
| 2.3 流式细胞术检测EPC细胞凋亡 |
| 2.4 荧光定量PCR检测细胞中凋亡相关基因的表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Tunel染色检测rvIL-10 蛋白对EPC细胞凋亡的影响 |
| 3.2 流式细胞术检测rvIL-10 蛋白对EPC细胞凋亡的影响 |
| 3.3 rvIL-10 蛋白对凋亡相关基因表达的调节 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）捻转血矛线虫诱导山羊Th9型免疫反应特点的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病 |
| 1 病原学 |
| 1.1 虫体形态特征 |
| 1.2 生活史 |
| 2 捻转血矛线虫病 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 诊断与治疗 |
| 2.3 防控 |
| 参考文献 |
| 第二章 捻转血矛线虫免疫机理及Th9型免疫 |
| 1 抗捻转血矛线虫的免疫反应 |
| 1.1 三期幼虫、四期幼虫与宿主免疫应答 |
| 1.2 捻转血矛线虫成虫与宿主免疫应答 |
| 2 排泄分泌抗原与免疫 |
| 3 Th9型免疫反应 |
| 3.1 Th9型免疫反应与IL-9生物特性 |
| 3.2 Th9型免疫在抗线虫感染中的作用 |
| 3.3 捻转血矛线虫感染与Th9型免疫 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第三章 山羊IL-9基因的克隆与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 山羊IL-9序列分析 |
| 2.2 山羊IL-9基因的克隆 |
| 2.3 山羊IL-9基因的酶切鉴定 |
| 2.4 山羊IL-9基因的表达纯化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 抗山羊IL-9单克隆抗体的制备与特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2 小鼠免疫血清的效价 |
| 2.3 阳性克隆株的筛选 |
| 2.4 细胞上清效价及抗体亚型鉴定 |
| 2.5 单抗的纯化与效价测定 |
| 2.6 生物素标记抗体的应用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 捻转血矛线虫ESP体外诱导山羊Th9型免疫反应特点 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫ESP的获取 |
| 2.2 荧光定量引物扩增效率评价 |
| 2.3 ESP对IL-9基因转录的影响 |
| 2.4 ESP对Th9细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 捻转血矛线虫感染山羊后机体Th9型免疫反应 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 虫卵排出情况 |
| 2.2 血常规检测 |
| 2.3 IL-9转录情况检测 |
| 2.4 攻虫后各组Th9细胞量变化 |
| 2.5 驱虫后各组IL-9转录与Th9细胞数变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）基于C9orf72基因细胞模型的建立及体外实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 C9orf72基因的结构 |
| 1.2 C9orf72基因的功能 |
| 1.3 C9orf72相关的ASL与FTD的研究进展 |
| 1.3.1 C9orf72相关的ALS与FTD的病理特征 |
| 1.3.2 C9orf72相关的ALS与FTD致病机制研究进展 |
| 1.3.3 C9orf72相关ALS与FTD的治疗策略 |
| 1.4 基因编辑技术——CRISPR/Cas9原理及其应用 |
| 1.5 自切割肽(2A)及其应用 |
| 1.6 课题研究意义 |
| 1.7 课题研究技术路线 |
| 1.7.1 针对C9orf72蛋白的单克隆抗体的制备 |
| 1.7.2 C9orf72-T2A-luciferase KI细胞模型的建立及其体外实验研究 |
| 1.7.3 C9orf72敲除的U937细胞模型的建立及其体外实验研究 |
| 1.7.4 C9orf72六核苷酸重复扩增的HEK293细胞模型的建立 |
| 第2章 针对人C9orf72蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 载体与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 主要配制试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 C9orf72基因编码区的克隆 |
| 2.2.2 C9orf72基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 C9orf72S DNA疫苗及真核表达载体构建 |
| 2.2.4 人源C9-S蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.2.5 针对C9orf72蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.2.6 抗体的纯化及亚型鉴定 |
| 2.2.7 Western blot检测抗体 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 C9orf72基因的克隆 |
| 2.3.2 带His标签的C9orf72原核表达载体的构建 |
| 2.3.3 带His标签的C9-S原核蛋白的大量纯化 |
| 2.3.4 C9orf72S DNA疫苗载体的构建 |
| 2.3.5 C9orf72蛋白单克隆抗体的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 C9orf72-T2A-luciferase KI HEK293细胞模型的建立及其体外实验研究 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 载体与细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 sgRNA与PCR引物设计 |
| 3.2.2 sgRNA的切割效率的检测 |
| 3.2.3 同源重组的供体载体及打靶载体的构建 |
| 3.2.4 C9orf72-T2A-Luciferase knock-in HEK293细胞系的建立 |
| 3.2.5 PCR鉴定C9orf72-T2A-Luciferase KI细胞的基因型 |
| 3.2.6 C9orf72-T2A-Luciferase KI HEK293细胞系可靠性测试 |
| 3.2.7 数据处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 sgRNA的筛选结果 |
| 3.3.2 Donor载体及打靶载体的构建结果 |
| 3.3.3 C9orf72-T2A-Luciferase KI HEK293细胞模型的建立 |
| 3.3.4 C9orf72-T2A-Luciferase KI 细胞基因型的鉴定 |
| 3.3.5 C9orf72-T2A-Luciferase KI HEK293细胞系可靠性测试 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 C9orf72基因敲除U937细胞模型的建立及其体外实验研究 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 载体与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 sgRNA的设计及筛选 |
| 4.2.2 C9orf72敲除的sgRNA与Cas9共表达的慢病毒载体的构建 |
| 4.2.3 C9orf72基因敲除的U937细胞的建立 |
| 4.2.4 LPS诱导U937细胞浓度的筛选 |
| 4.2.5 探索C9orf72基因在调节U937细胞炎症方面的作用 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 sgRNA的筛选结果 |
| 4.3.2 C9orf72敲除的sgRNA与Cas9共表达的慢病毒载体的构建 |
| 4.3.3 C9orf72单基因敲除的细胞系的建立 |
| 4.3.4 确定LPS的最佳诱导浓度 |
| 4.3.5 C9orf72敲除对细胞炎症因子表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 C9orf72 GGGGCC六核苷酸重复KI HEK293细胞模型的建立 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 载体 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 sgRNA及引物设计 |
| 5.2.2 GGGGCC KI sgRNA的筛选 |
| 5.2.3 GGGGCC KI 打靶载体的构建 |
| 5.2.4 GGGGCC间隔重复序列的构建 |
| 5.2.5 GGGGCC KI Donor载体的构建 |
| 5.2.6 C9orf72 GGGGCC重复序列KI细胞模型的建立 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 sgRNA的筛选结果 |
| 5.3.2 GGGGCC间隔重复序列的构建结果 |
| 5.3.3 Donor载体与打靶载体的构建结果 |
| 5.3.4 C9orf72 GGGGCC重复序列KI细胞模型的建立结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 致攻读学位期间科研成果 |
（10）以C5-Ⅰ/Ⅱ为分子佐剂的维氏气单胞菌OmpAⅠ基因重组乳酸菌的构建及免疫效果分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 维氏气单胞菌的研究进展 |
| 1.1 维氏气单胞菌 |
| 1.2 外膜蛋白 |
| 第二章 补体C5的研究进展 |
| 2.1 补体C5的结构特征及分类 |
| 2.2 补体C5的分子佐剂作用 |
| 第三章 鱼用DNA疫苗的研究进展 |
| 3.1 鱼用DNA疫苗的免疫途径 |
| 3.2 鱼用DNA疫苗分子佐剂的研究进展 |
| 第四章 乳酸菌递呈载体的研究进展 |
| 4.1 乳酸菌的调节作用 |
| 4.2 乳酸菌在疫苗上的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 以C5-Ⅰ为分子佐剂的重组乳酸菌的构建及免疫效果分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 以C5-Ⅱ为分子佐剂的重组乳酸菌的构建及免疫效果分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、IL-10基因克隆化与原核重组IL-10蛋白制备的实验研究（论文参考文献）
- [1]基于IFN-γ分子佐剂的重组Cathepsin L免疫抗蜱效果分析研究[D]. 宋瑞其. 新疆农业大学, 2021(02)
- [2]草鱼细胞因子IL-22、IL-26和EDA的表达及功能分析[D]. 杨移斌. 上海海洋大学, 2021(01)
- [3]罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究[D]. 汪志文. 广东海洋大学, 2020(02)
- [4]细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析[D]. 王炜烨. 石河子大学, 2020(08)
- [5]病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究[D]. 戴诗雨. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [6]猪圆环病毒2型编码蛋白7的鉴定和功能研究[D]. 范志新. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [7]鲤疱疹病毒3型vIL-10基因的克隆表达及其对免疫相关因子调节作用的研究[D]. 阳瑞雪. 四川农业大学, 2019
- [8]捻转血矛线虫诱导山羊Th9型免疫反应特点的研究[D]. 黄鑫. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]基于C9orf72基因细胞模型的建立及体外实验研究[D]. 王乐. 陕西师范大学, 2019(06)
- [10]以C5-Ⅰ/Ⅱ为分子佐剂的维氏气单胞菌OmpAⅠ基因重组乳酸菌的构建及免疫效果分析[D]. 郭淞宁. 吉林农业大学, 2019(03)