一、TTV感染的临床表现特征（论文文献综述）
王倩[1]（2021）在《云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究》文中研究说明[背景]蜱是最早被确认可将病原体传播给人类的媒介节肢动物,是世界上仅次于蚊子的第二大传染病媒介,可以感染、传播和贮存的病原体包括病毒、细菌和原虫等,且通常会同时携带多种病原体。病毒是蜱传病原体的重要组成部分。目前,已经从蜱中发现了至少160种病毒,其中25%左右与人类和/或动物的病毒感染性疾病有关,主要以各种硬蜱作为传播媒介。其中,正内罗病毒隶属于布尼亚病毒目、内罗病毒科,是有包膜且基因组不连续（由大、中和小三段单股负链组成）的RNA病毒,其中一些会引起人类和动物严重疾病。Tamdy正内罗病毒至少包括五种不同型别,其在多种蜱中广泛分布,且被报道与人类疾病以及脊椎动物感染有关。此外,还有近年来报道的与蜱咬病人发热疾病有关、属于黄病毒科荆门病毒群的荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）和Alongshan virus（ALSV）两种蜱传分节段RNA病毒,以及致病性尚未明确的新发蜱病毒 South Bay Virus（SBV）和 Black-legged tick phlebovirus（BTPV）等。目前,对这些新型蜱传病毒的研究相对较少,因此,有必要对其进行探索和研究。自1982年以来,我国大陆已经发现了由近30种不同蜱类传播的33种新发蜱传病原体,其中立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫等细菌和原虫最为常见,感染后可分别引起人和动物立克次体病、无形体病、埃立克体病、莱姆病、蜱传回归热、巴贝西虫病以及泰勒虫病。此外,一种蜱可以同时携带和传播多种病原体,几种蜱媒疾病往往共存于同一自然疫源地。被复合感染的蜱类叮咬的人和动物的症状会更加复杂,预后更差。因此,新发蜱传病原体的流行及其复合感染将对人类和动物健康构成严重威胁。宏转录组学具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等优势,同时结合生物信息学工具,可以有效获得病毒的全基因组信息,还可以在保守的宿主基因背景下,无偏倚的量化病毒丰度,为揭示病毒的遗传多样性、挖掘新病毒、以及防控新发传染病等提供重要技术支持。当前,融合病原学（病原体特征及其致病性）、生态学（生态环境、传播媒介和宿主动物）全面、系统的自然疫源地调查研究已成为蜱媒病研究的发展趋势。我国蜱种丰富,蜱媒传染病的自然疫源地复杂、流行形势严峻,因此需要对其深入调查研究。[目的]1.对我国南方地区七个省/直辖市的蜱进行病毒组筛查,获得其携带的病毒谱,识别新病毒。2.获得新发现的蜱病毒的分离株,进一步研究其遗传特性和生物学特性,评价其对人类的感染性和致病性。3.了解不同地域、不同蜱种中,成功分离的新的蜱病毒以及其他多种新发蜱传病原体的感染与复合感染情况。[方法]1.蜱标本采集、鉴定:在我国不同地区选择有代表性的地理景观作为采样点,于2017～2019年在蜱活跃的高峰季节进行蜱类标本的采集。游离蜱采用拖旗法采集,寄生蜱则通过控制或者捕获家畜或野生动物后采集,之后对其进行形态学鉴定。2.宏转录组测序、分析:提取蜱标本的RNA并检测其浓度、纯度和完整性,之后构建宏转录组测序文库并测序。使用生物信息学分析软件,对测序产生的数据分别进行病毒基因组的发现和组装以及相对转录本丰度量化等。3.病毒分离培养、鉴定:将蜱标本分别接种到HUVEC、Vero 81和IDE8细胞上进行病毒分离,盲传三代后提取细胞培养物RNA进行高通量测序筛查。待获得病毒分离株后,对其全基因组进行测序,并运用生物信息学分析软件进行进一步的结构和功能预测、同源性分析、系统发育分析和重组分析;建立病毒检测方法和生长复制曲线;采用超薄切片电镜观察病毒的形态特征;通过间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验观察病毒在不同细胞中的感染情况;同时通过间接免疫荧光实验对哨点医院收集的蜱咬病人双份血清标本进行病毒筛查。4.蜱携带病原体检测:将蜱标本研磨并提取其核酸;使用特异性引物,采用一步法荧光定量RT-PCR对蜱标本中的云南蜱病毒（Yunnan tick virus,YNTV）进行筛查,并通过一步法RT-PCR扩增YNTV的大、中和小三个片段;采用SYBRGreen荧光定量 RT-PCR 筛查蜱标本中的 Tacheng tick virus 1（TTV1）、Tamdy virus（TDYV）、JMTV、ALSV、SBV和BTPV 1～3;采用普通/半巢式/巢式PCR对蜱标本中的立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫进行检测;在Mega7.0软件中对测序产生的序列进行系统发育分析;采用卡方检验或Fisher确切检验比较不同地点以及不同蜱种中各种病原体的感染情况。[主要结果]1.宏转录组测序结果:本研究共构建了 93个测序文库,得到3473838929条原始reads,3362776236条高质量reads（cleanreads）以及28413469条平均长度为592 nt的contigs。其中有22930535条reads可以注释到病毒相关序列,且以未分类病毒为主,其余病毒共分为65个科。2.云南蜱病毒分离培养、鉴定结果:从云南剑川猛突血蜱幼蜱的HUVEC细胞培养物中分离到一株新的正内罗病毒,将其暂时命名为云南蜱病毒（YNTV）。①YNTV为负链RNA病毒,其基因组共分为大、中和小三个片段,其长度分别为12077nt、4489nt和2057nt,分别编码含有3255、1357和492个氨基酸的大蛋白、糖蛋白前体以及核衣壳蛋白·;②仅中片段具有信号肽和跨膜螺旋区,大、中和小片段中分别有6个、9个和1个潜在的糖基化位点,且大片段编码的氨基酸序列中存在Pre-Motif A以及Motif A～E 6个保守的motif;③同源性分析显示,YNTV与Tamdy正内罗病毒的核苷酸同源性（41.8%～68.0%）和氨基酸同源性（44.2%～63.2%）均高于其与其他正内罗病毒的核苷酸（29.3%～44.2%）和氨基酸（18.4%～32.2%）同源性,表明YNTV是一种新的Tamdy正内罗病毒型别;④YNTV与正内罗病毒代表株基于三个片段氨基酸全长序列的系统发育分析显示,其在进化上属于Tamdy正内罗病毒,且大片段和小片段均与2012年从我国豪猪血蜱中检测到的Wenzhou tick virus（WTV）处于同一进化分支,中片段则与我国西北地区蜱咬发热病人中分离的TTV1 QH1亲缘关系更近;⑤重组分析显示,YNTV大、中和小三个片段的全基因序列整体上均与WTV的同源性最高,但其大片段在6750～7000 bp以及8000～8250 bp的位置与TDYV和Songling virus（SGLV）的同源性更高,中片段在2700～3200 bp、小片段在625～850 bp的位置分别与TTV1和SGLV的同源性更高,表明YNTV分离株的三个片段均存在重组信号;⑥基于YNTV大片段和小片段建立的标准曲线分别为:x（大）=（39.99-y（大））/3.390和x（小）=38.48-y（小）)/3.152,其中y为Ct值,病毒载量为10x;⑦病毒生长复制曲线结果显示,YNTV在IDE8和C6/36两种细胞系中基本没有生长,在Vero 81细胞中生长缓慢并在接种后的第144 h即达到生长的平台期,但其可以在BHK-21和HUVEC两种细胞中迅速复制并在感染的第168 h达到生长的平台期,且YNTV的病毒载量变化趋势在五种受感染细胞的冻融物和培养上清中基本一致;⑧YNTV可引起HUVEC细胞产生致细胞病变效应,表现为细胞皱缩、变圆以及折光度增加,而在受感染的BHK-21和Vero 81细胞中则无CPE;⑨YNTV病毒颗粒为有包膜的球体,直径大约80～100 nm;⑩间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验结果显示,YNTV能够有效感染HUVEC、BHK-21和Vero 81三种细胞;（11）牡丹江林业中心医院93例蜱咬病人的急性期和恢复期双份血清标本YNTV筛查结果为阴性,说明其均未感染YNTV。3.蜱传病毒检测结果:YNTV的总阳性率为1.34%,仅在广西和云南的卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱中检出,且蜱标本中测得的YNTV片段与该病毒分离株在进化树上聚集在一起,形成不同于其他Tamdy正内罗病毒的独立分支;JMTV的总阳性率为3.23%,在广西、重庆、贵州和黑龙江4省/直辖市的龟形花蜱、豪猪血蜱、爪哇花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中检出;在吉林省的嗜群血蜱中检测到1份 BTPV 1 阳性样本;TTV1、TDYV、ALSV、SBV、BTPV2 和 BTPV 3 六种病毒的检测结果均为阴性。4.蜱传细菌和原虫检测结果:共从8个省/直辖市的14种（豪猪血蜱和镰形扇头蜱除外）356只蜱（阳性率为47.85%）中检测到24种已知病原体（6种立克次体、4种无形体、4种埃立克体、3种螺旋体、3种巴贝西虫和4种泰勒虫）以及17种未定种病原体（4种立克次体、4种无形体、3种埃立克体、2种螺旋体和4种巴贝西虫）。立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫的平均感染率分别为33.87%、10.89%、2.15%、4.44%、1.75%和3.23%,且其在不同地点以及不同蜱种中的感染率差异均具有统计学意义。5.蜱标本中病原体的复合感染情况:采集的16种744只蜱中,共9种76只（10.22%）存在复合感染情况,龟形花蜱中的复合感染发生率最高,其次为嗜龟花蜱和猛突血蜱。有69只蜱同时携带两种病原体,另外7只蜱则同时携带三种病原体,以立克次体和无形体的复合感染最为常见。此外,在猛突血蜱中还存在YNTV与立克次体或/和无形体复合感染的情况,在龟形花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中存在JMTV与多种不同细菌/原虫复合感染的情况。[结论]1.我国南方地区蜱类携带的病毒种类多样,且以未分类病毒为主。2.从云南的猛突血蜱中分离到一株新的Tamdy正内罗病毒,将其命名为云南蜱病毒（YNTV）,其基因组结构和功能与典型的正内罗病毒相似,且在其三个片段的全基因序列中均有重组事件的发生。3.YNTV具有正内罗病毒的典型形态特征;可以感染多种哺乳动物细胞系并在其中生长复制,且引起HUVEC细胞产生CPE,提示其具有潜在致病性。4.YNTV主要在我国云南和广西的蜱类中分布,卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱为其可能的传播媒介,且其可以与立克次体和无形体发生复合感染。5.我国蜱类中存在多种病毒、细菌和原虫的感染与复合感染,此外,还有一些潜在的新病原,反映了我国蜱类携带病原体的高度多样性和复杂性。[创新点]1.本研究从云南的猛突血蜱中分离到一株新的正内罗病毒,在未发现其可以感染人之前即对其相关特性进行了初步研究,为后续评价其致病性等奠定了基础。2.本研究对我国南方约一半省/直辖市地区内近10种蜱携带的病毒组进行了全面调查,为后续蜱传病毒的深入研究及蜱媒病毒性疾病的防控提供理论依据。3.本研究对我国3种不同动物地理区划内近20种蜱携带的9种新发蜱传病毒以及6种新发蜱传细菌和原虫的感染与复合感染情况进行了广泛筛查,为了解蜱媒传染病风险地域及制定相应精准防控策略和措施提供科学依据。
陈柯[2]（2021）在《两株猪细环病毒的全基因组测序及分析》文中研究表明猪细环病毒（Torque teno sus virus,TTSuV）是一种小型环状单链负性DNA病毒,在猪群中广泛流行,目前有两种不同基因型感染猪群,两种基因型均可通过垂直和水平传播,且体内病毒含量随着年龄的增长有增加趋势。近年来,随着研究者对该病毒不断深入研究发现,TTSuV感染健康动物的比例逐渐增高,病毒自身感染后并不会立即引起疾病发生,但是该病毒会使猪只机体抵抗其他疾病的能力下降。尽管该病毒的致病性尚不能确定,但已有试验表明TTSuV对猪群高致病性病原体具有促进作用,给我国养殖行业造成重大的经济损失。为了解河南地区猪源TTSuV的遗传多样性,本研究对河南某养殖场采集的11份TTSuV组织病料进行PCR检测,将检测阳性的组织进行全基因组扩增,对扩增出的TTSuV全基因组序列进行遗传学分析,在线软件预测分析ORF1蛋白理化性质及基本结构;并将阳性样品进行病毒分离培养。结果发现TTSuV可在Marc145细胞上成功传代培养,为后续更好的了解TTSuV的遗传变异和生长特性提供数据支持,其致病性需进一步研究。使用PCR方法对10份阳性样品进行全基因组扩增,成功扩增出2株TTSuV1全基因组序列,使用生物信息学软件分析显示,2株分离株之间核苷酸相似性仅有86.2%,推导氨基酸相似性为77.7%;2株分离株与TTSuV1参考毒株核苷酸之间相似性在70.3%～96.0%之间,推导氨基酸相似性在56.2%～90.9%之间,与TTSuVk2参考毒株核苷酸之间相似性小于50%。与不同亚型参考毒株共同构建系统发育进化树,发现2株分离株均与TTSuV1c亚型毒株亲缘关系较近,处于同一分支,即2株分离株均为TTSuV1c亚型。基因重组软件分析发现,2株TTSuV1分离株均存在基因重组现象,且重组区域相似,西班牙株G21株为亲本毒株,中国LNJZ株提供重组片段。重组区域位于ORF1与ORF3部分重叠区域,He N1-A9重组位点位于2195～2530 bp,He N1-A11重组位点位于2147～2650 bp。使用Net NGlyc1.0、Net OGlyc3.1和Net Phos2.0等在线软件对2株TTSuV1分离株ORF1蛋白进行结构预测,结果显示,2株分离株ORF1均由648位氨基酸组成,不含有O糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲等组成,He N1-A9毒株含有4个糖基化位点和23个潜在的磷酸化位点,而He N1-A11含有1个N糖基化位点和35个潜在的磷酸化位点。对TTSuV1检测阳性的组织病料进行病毒分离,将10份阳性样品分别感染Marc145细胞进行病毒分离培养,He N1-A9毒株盲传至第5代观察到明显细胞病变（CPE）,进行半数组织细胞感染量(TCID50)的测定和动物致病性实验,结果表明,He N1-A9病毒株毒价约为105.0 TCID50,以2 m L 105.0TCID50/m L的TTSuV1病毒液对21 d仔猪进行攻毒,攻毒7 d后采血PCR检测TTSuV1阳性,进行序列测定,确定为He N1-A9毒株。饲养至28 d,未发现任何临床症状,剖检无明显病变。
窦安华[3]（2021）在《江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究》文中研究表明目的:为探讨HIV感染人群血液病毒群落组成,分析HIV感染人群血液病毒群落的特点,研究病毒载量对HIV感染人群血液病毒群落的影响,本研究对江苏某地区203份HIV感染人群的血浆样本进行了病毒宏基因组学研究,以期了解HIV感染人群的血浆病毒谱以及病毒载量对血浆病毒谱的影响。方法:1.样本采集后,通过样品组合设计、样品的核酸酶消化、病毒核酸提取、逆转录及合成双链DNA即转化为cDNA,使用文库构建试剂盒构建高通量测序文库,文库纯化及质量检测合格后进行Illumina MiSeq深度测序,最后用生物信息学方法对数据分析。2.通过生物信息学方法对获取目的病毒序列分析后,用套式引物对已知序列进行反向PCR扩增,填补gap,得到全基因组序列信息,随后对病毒全基因组结构进行研究并注释获得的信息,最后构建系统进化树。3.基于203个HIV感染患者和40个健康体检者的血浆样本对指环病毒TZ19进行PCR筛查。结果:1.基于高通量测序技术,本研究得到243824条基因序列注释为病毒,可注释到至少17个不同的病毒科（含未分类病毒）,包括12种哺乳动物类病毒（99.87%）,2种昆虫病毒（0.05%）,1种植物病毒（≤0.01%）,2种其他病毒（0.02%）及未分类病毒（0.06%）。2.检出HIV病毒载量组的病毒群落中占据主导地位的是细小病毒科,其次是黄病毒科和指环病毒科;未检出HIV病毒载量组的病毒群落中占主导地位的是黄病毒科,其次为指环病毒科和细小病毒科。3.本研究获得了一个指环病毒的全基因组序列（命名为TZ19,GenBank No.MW857571）和一支人细小病毒B19的完整编码序列。对TZ19的系统进化分析显示该指环病毒与GenBank中已有的指环病毒TTVydyzj-8180（MT783407）同源性最高（同源性为89.64%）,属于同一种病毒。基于203个HIV感染患者和40个健康体检者的血浆样本我们进行了指环病毒TZ19的PCR筛查,结果显示在203个血浆样本中有9个样本阳性,40个健康体检者中有1个阳性。结论:1.利用病毒宏基因组学方法对HIV感染人群血浆病毒群落的组成有了初步认识。2.检出HIV病毒载量组与未检出HIV病毒载量组的病毒群落构成类似,但是病毒序列数和优势病毒类型差别很大。3.从HIV感染患者血浆中发现了 1支指环病毒全基因组和1支人细小病毒B19的完整编码区序列。
李欣霖[4]（2020）在《不明原因发热患者肺泡灌洗液病毒群落解析》文中指出不明原因发热（Fever of unknoen origin,FUO）是一种常见的临床综合征,以发热为主要临床表现,很多情况下难以辨别发热的病因,国内外有许多文献对不明原因发热的病因进行了统计分析,主要分为:感染性疾病、非感染性疾病、肿瘤性疾病及其他疾病,其中感染性疾病为主要病因,而感染性疾病中又以细菌感染为主,但近年来病毒感染呈现上升的趋势。目前对于病毒的检测,传统的免疫学方法以及分子生物学方法发挥了重要的作用,作为许多病毒核酸检测的金标准,PCR技术有着较高的准确性和灵敏度,但是只能够检测出已知序列的病毒。由于病毒分布广泛,种类繁多,目前人类已知的致病性病毒仅占所有病毒的0.1%,自然界中仍有大量未知的病毒,同时病毒本身还具有高度的变异性,这就使大多数传统方法无法快速准确的检测出病毒。面对许多传统方法难以检测的病毒,人类迫切需要一种简单可靠的方法对其作出准确的鉴定。随着高通量测序技术及生物信息学技术的飞速发展,病毒宏基因组学（viral metagenomics）逐渐成为了人类研究新型病毒的重要手段。病毒宏基因组学利用随机六聚体引物,可以对特定样本中的所有病毒核酸序列进行反转录及扩增,从而能够检测出样本中已知及未知病毒。为了探究不明原因发热患者肺泡灌洗液中病毒群落与不明原因发热之间的关系,本研究利用病毒宏基因组学方法对采集自江苏大学附属人民医院的肺泡灌洗液病毒群落进行分析。本课题主要研究内容与结果如下:（一）肺泡灌洗液病毒群落组成对采集的56份肺泡灌洗液进行分析后,发现肺泡灌洗液中的病毒群落主要包括:指环病毒科（Anelloviridae）19.4%,未分类科病毒（None）25.0%,藻去氧核糖核酸病毒科（Phycodnaviridae）11.2%,环状病毒科（Circoviridae）11.1%,人类内源性逆转录病毒科（Human endogenous retrovirus,HERV）10.3%,冠状病毒科（Coronaviridae）1.2%,帚状病毒科（Virgaviridae）2.4%,逆转录病毒科（Retroviridae）3.2%,杯状病毒科（Caliciviridae）1.8%,疱疹病毒科（Herpesviridae）0.9%,虹彩病毒科（Iridoviridae）1.8%,拟菌病毒科（Mimiviridae）2.4%,小DNA 病毒科（Parvoviridae）2.1%,小 RNA 病毒科（Picornaviridae）0.6%,痘病毒科（Poxviridae）5.0%,囊泡病毒科（Ascoviridae）0.3%,双生病毒科（Geminiviridae）0.3%,杆状病毒科（Baculoviridae）0.6%,非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）0.3%,Sphaerolipoviridae 0.3%,Marseilleviridae 0.3%。从文库中各病毒相关的序列数上看,指环病毒科的序列数最多,共2207条,占总体序列数的45.3%,环状病毒科占1.3%,藻去氧核糖核酸病毒科占1.9%,人类内源性逆转录病毒科占1.4%,痘病毒科占28.1%,帚状病毒科占13.5%,未分类科病毒6.9%（336条）,小RNA病毒0.1%（5条）。肺泡灌洗液病毒群落分析提示:①指环病毒科和痘病毒科、环状病毒、藻去氧核糖核酸病毒科、未分类科病毒等共同构成了肺泡灌洗液病毒群落;②指环病毒同时分布于4个文库中,病毒种类占总体病毒群落的19.4%,并且与其相关的序列数明显多于其他病毒;③环状病毒科及藻去氧核糖核酸病毒科病毒占比较多,但相关的序列数较少,相反比例较少的痘病毒科则具有较多序列数;④与帚状病毒科病毒相关的序列数较多,但仅存在于5号文库中;⑤文库中存在多种常见的呼吸道病毒。（二）文库中细环病毒的研究在肺泡灌洗液样本中分离出了 4株细环病毒,该病毒是人体内常见病毒之一,它的感染可能与某些疾病相关,但尚不明确细环病毒的具体致病机制。本研究仅获得了细环病毒的部分序列,其中最长的序列为2918 bp,主要包括ORF1（389-2593 bp）、ORF2（51-515 bp）、ORF3（2070-2540 bp）和 ORF4（2401-2784 bp）。根据该序列设计巢式PCR引物对80份肺泡灌洗液样本进行筛选后发现共有9份阳性样本,阳性率为11.3%,而作为阴性对照的40份咽拭子样本中阳性样本仅2份。根据病毒的ORF1氨基酸序列构建系统发育树,分析后显示这4株细环病毒与来自人类血浆的细环病毒聚集,同源性在89-94%之间。（三）文库中鼻病毒的研究鼻病毒作为呼吸道感染的重要病毒性病原体,可导致哮喘及支气管扩张等严重并发症。本研究通过巢式PCR共筛选出8份阳性样本,阳性率为10.0%,依据鼻病毒相对保守的VP4/VP2区核酸序列构建系统发育树,提示4株属于人鼻病毒A型,3株属于人鼻病毒B型,分别与来自人鼻咽拭子中的鼻病毒聚集,同源性皆在95%以上。（四）主要结论:①肺泡灌洗液样本中的病毒群落呈多态性,其中以指环病毒为主体;②细环病毒与不明原因发热有一定的联系,结合研究结果可以推断发热所造成的炎性环境及免疫功能低下可以促进TTV的增殖;③由于鼻病毒所占比例较少、与其相关的序列数少,其与发热之间的关联需要进一步研究。
吴悦[5]（2019）在《鼠源TTV基因组分析与呼吸道HRSV抗病毒药物筛选》文中认为研究目的:近年来新发病毒性传染病对人类的健康产生了巨大的威胁,对其进行及时的预防、诊断和有效的治疗是防治传染病的三个重要环节。本论文从预防诊断角度,通过对海南省重要的传染病动物储存宿主啮齿类动物携带的鼠源TTV病毒RoTTV（Rodent Torque teno virus,RoTTV）,进行测序及遗传进化分析溯源,并建立real-time PCR检测方法,为海南省啮齿类动物来源TTV的感染情况及潜在威胁的研究提供研究基础。与此同时通过建立呼吸道合胞体病毒（Human Respiratory syncytial virus,HRSV）的药物筛选平台,筛选天然商品化药品库,为HRSV的治疗提供新的天然药物。研究方法:1.RoTTV全基因组分析及检测方法的建立:基于本实验室前期在海南发现的啮齿类动物来源的TTV流行株（RoTTV 3）高通量宏病毒组测序分析结果用PCR方法进行RoTTV 3基因组序列拼接,并根据RoTTV 3保守序列以构建的含ddrp基因的重组质粒为标准品,优化实验条件,建立RoTTV的real-time PCR检测方法。2.HRSV-A的抗病毒药物体外筛选模型及抗病毒药物筛选:以Hep-2（人类喉上皮癌细胞）为敏感细胞系通过CCK-8方法和传统观察CPE方法建立了体外抗病毒药物细胞筛选模型,比较两种方法的异同,建立一种更加准确的体外筛选平台,并通过已建立的筛选平台从天然药品库中筛选出有效天然药物单体,通过测定有效药物的细胞毒性及药效评价药物的抗病毒效果。研究结果:1.根据已获得的啮齿类动物来源的TTV病毒高通量基因组测序结果,对获得TTV相关reads 19,863条经过拼接,共获得5条contig序列,其N50为361 bp,覆盖RoTTV 3-HMU 1基因组的68%,成功拼接获得一株海南省海口市褐家鼠携带的RoTTV的基因组序列,命名为RoTTV 3-HMU 1,遗传进化结果表明RoTTV 3-HMU 1属于RoTTV基因3型。并对已获得基因型RoTTV 3建立一种real-time PCR检测方法,线性范围为1×1021×108 copies/mL,其扩增系数为1.000,溶解曲线只出现1特异性峰,检测灵敏度达到102个拷贝。2.用CCK-8方法和传统CPE观察法评价已报道的抗HRSV-A病毒的药物Cyclopiazonic acid（CPA）,结果表明CCK-8法和传统CPE观察法在评价体外药物抗病毒药效果实验时结果具有相同性。但相对于传统观察CPE方法,CCK-8方法是通过OD值计算细胞存活率从而定量反映药效结果,所以更加客观、准确、直接,更适合在抗HRSV药物筛选时提供有效平台。用建立的CCK-8抗病毒药物筛选平台在天然药品库中395种药物中筛选出有效的药物单体7种,选定出药效最好的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）,测定出EGCG半数致死率(TD50)=39.93μg/m L,半数有效浓度(EC50)=2.039μg/mL,治疗指数为（TI）=19.6,经过统计学独立样本t检验分析,EGCG组与病毒组有明显统计学差异（P<0.05）,证明EGCG对HRSV-A病毒具有良好的抗病毒活性。结论:1.成功拼接获得一株海南省海口市褐家鼠携带的RoTTV的基因组序列,遗传进化分析表明该病毒属于RoTTV 3基因型。2.成功建立RoTTV3 real-time PCR检测方法,标准曲线在1×1021×108 copies/mL的浓度时呈现良好线性关系,其扩增系数为1.000,溶解曲线只出现1特异性峰,检测灵敏度达到102个拷贝。3.CCK-8法和传统CPE观察法检测药物对HRSV-A的抗病毒效果具有相同性。但CCK-8方法更加客观、准确、直接,而且操作简单,更适合在抗HRSV药物筛选时提供有效平台。4.EGCG在体外针对HRSV-A具有良好的抗病毒效果。
闫满[6]（2019）在《猪细环病毒2型与猪圆环病毒2型双重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用》文中研究说明为大力推进畜牧业生产方式的转变,国家生猪规范化生产技术日渐成熟。然而,由于生猪饲养环境未能得到根本性的改善,导致猪传染性疾病对养猪业,甚至人类的健康危害日趋严重。诊断、治疗及防控的难度越来越大,对于新发现的病原以及多种病原体混合感染的诊断需求尤为迫切。仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）,是近些年我国多地区猪场发生的一种慢性、进行性的疾病,其病因较为复杂,致死率极高,主要为猪圆环病毒感染。最近研究发现,PMWS存在猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV）与其他病原的混合感染。自发现PMWS以来,围绕着PMWS病原的研究不断深入。PCV与PMWS高度相关,PMWS病猪的病变组织中均发现大量的PCV2抗原,借助于细胞培养技术分离出PCV2病毒,但没有分离到其它病原。而在PMWS现场的病例中发现,其临床表现特定病变与PCV2严重程度一致。PMWS病例中经常检出PCV2而较少检出其它病原的结果,表明PCV2是PMWS的主要病原,单独感染能够引起PMWS。细环病毒（Transfusion Transmitted Virus或Torque teno virus,TTV）,为指环病毒科（Anelloviridae）细项环病毒属成员（Anellovirus）,是一种无囊膜DNA病毒,基因组呈单链、闭合环状。猪细环病毒（Torque Teno Sus,TTSuVs）能够感染很多外表健康的动物。TTSuVs病毒本身的感染不会立刻引发疾病。但是TTSuVs可以影响一些疾病的发生和发展,甚至影响它们的结果。目前还没有报道TTSuVs直接与猪某些疾病的发生有关。由于PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,而PCV2的遗传关系与TTSuVs最为接近,有学者认为PMWS等由猪圆环病毒引起的相关疾病（PCVD）可能是PCV2与TTSuV协同感染引起的。为此本研究构建PCV2与TTSuV2双重荧光定量PCR检测方法,为在临床上能够同时快速、准确检测PCV2与TTSuV2提供方案,为分析PCV2与TTSuV2的协同致病性提供途径。1.PCV2型实时荧光定量PCR检测方法的建立提取病料中病毒基因组,根据GenBank公布的PCV2序列保守区设计特异性引物进行PCR扩增。将PCR产物纯化后与克隆载体连接,构建标准质粒。以标准质粒为模板,进行引物浓度、退火温度、Taq酶用量的优化,绘制实时荧光定量PCR的标准曲线,建立PCV2实时荧光定量PCR检测方法。PCV2单重荧光定量PCR最佳反应体系为:Premix Ex Taq（2×）12.5μL,引物1.0μM,探针0.75μM,DNA模板3μL,水补至20μL。优化后反应条件为:95℃,30 s;95℃,10s;56.6℃,30 s;35个循环。2.TTSuV2型实时荧光定量PCR检测方法的建立提取病料中病毒基因组,根据GenBank公布的TTSuV2序列保守区设计特异性引物进行PCR扩增。将PCR产物纯化后与克隆载体连接,构建标准质粒。以标准质粒为模板,进行引物浓度、退火温度、Taq酶用量的优化,绘制实时荧光定量PCR的标准曲线,建立TTSuV2型实时荧光定量PCR检测方法。TTSuV2单重荧光定量PCR最佳反应体系为:Premix Ex Taq（2×）12.5μL,引物1.0μM,探针1.0μM,DNA模板3μL,水补至20μL。优化后反应条件为:95℃,30 s;95℃,10 s;55.6℃,30 s;35个循环。3.PCV2型与TTSuV2型双重荧光定量PCR检测方法的初步应用通过DNASTAR软件分析,确认两个探针,四个引物相互之间不会形成引物二聚体,寻找最佳的退火温度和引物及探针浓度。结果显示,TTSuV2及PCV2双重荧光定量PCR的最佳条件如下:引物浓度分别为PCV2 1.0μM、TTSuV2 1.0μM;探针浓度分别为PCV2 1.0μM、TTSuV2 1.0μM;反应条件为95℃、30 s,95℃、10 s,55.8℃、30 s,35个循环。在此条件下双重荧光定量PCR对两种标准品的最低拷贝数均为1×102 copies/μL,不存在非特异性扩增曲线,无交叉反。应用所建立的双重荧光定量PCR检测方法,对2017-2018年8月期间,送检至吉林农业科技学院猪生态养殖及疫病防控中心的300份血清样本进行检测,结果显示PCV2单独感染率检出率为36.0%,TTSuV2单独感染检出率为60.0%,两种病毒混合感染检出率为14.8%。本研究建立的2型猪细环病毒及2猪圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法比普通PCR方法更敏感、特异,且具有较好的临床实用性,可用于临床样品的检测。
王玲[7]（2018）在《猪细环病毒的序列分析及抗体检测方法的建立》文中研究指明猪细环病毒（Torque teno sus virus,TTSuV）是一种小的,无包膜的单链环状DNA病毒。首次发现于1997年,一名日本急性肝炎患者输血后,在病人血清中检测到一种非包膜单链环状病毒,将其命名为TTV（TT Virus）。这是第一个“人类圆环病毒”,具有单链环状DNA基因组（ssDNA）,属于指环病毒科。随后TTV也在家养的动物如猪、鸡、牛、羊、猫和狗身上发现。TTSuV可以分为两个型,分别是TTSuV1和TTSuV2,TTSuV1属于细环病毒属,TTSuV2属于Kappa细环病毒属,均可感染猪。近年来,不同国家在猪体内均发现有TTSuV。同时,在灵长类动物如猩猩、长臂猿等体内也发现存在有TTV。TTSu V主要通过动物粪口途径传播,也可通过垂直传播途径如胎盘、子宫方式传播。TTSuV单独感染无特异的临床症状,但TTSuV常与猪的其他病毒如猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等共感染,具有某种未知的协同效应,可加重动物病情。目前TTSuV在全世界的猪场中广泛存在,但现有的检测方法仅限于PCR法进行病毒病原学检测或ELISA法进行血清学检测。临床上还没有商品化试剂盒来专一性检测TTSuV抗体。因此,建立一种快速、高效、敏感的抗体检测方法十分重要。同时,目前对于TTSuV的致病机理的研究还很少。因此,开展TTSuV病毒的序列分析,建立其抗体检测方法将为该病毒的早期发现和治疗提供理论基础和技术支撑,同时将有助于对不同地区猪群中主流毒株的分型以及不同猪群中的病毒的感染情况进行深入了解。1.本研究采集20162017年河南省南阳市周边地区多个规模化养猪场发病猪的病料,并进行基因组DNA提取,根据GenBank内报道的参考序列,设计3对覆盖TTSuV基因组全长的特异性引物进行扩增和测序,最终成功获取21株TTSuV基因组序列,分别命名为HeN1-A1、HeN1-A2、HeN1-A6、HeN1-A7、HeN1-A8、HeN1-A9、HeN1-A10、HeN1-A11、HeN1-A12、HeN1-A31、HeN1-A32、HeN1-A51、HeN1-A52、HeN1-A132、HeN2-A2、HeN2-A4、HeN2-A5、HeN2-A9和HeN2-A11。通过与GenBank收录的120株TTSuV的参考序列进行序列同源性和进化树分析表明,HeN1-A2、HeN1-A6、HeN1-A8、HeN1-A9、HeN1-A11、HeN1-A31、HeN1-A52和HeN1-A132全基因序列的同源性为95.7%97.6%,差异较小;HeN1-A51、HeN1-A32、HeN1-A12、HeN1-A1和HeN1-A10序列基因的同源性为84.3%86.6%,差异较小;HeN2-A11、HeN2-A9、HeN2-A4和HeN2-A5序列基因的同源性为78.8%99%,差异也较小。而HeN1-A7和HeN2-A2与全基因组序列比较同源性分别为33.2%34.3%和27.629.6%左右,说明这两个基因序列和其他的基因序列的同源性差异较大,因此在进化树上单独分支。2.本研究参考GenBank中TTSuV1的Cap基因序列,设计特异性引物进行扩增,连接pcDNA3.1,构建重组表达载体pcDNA-TTSuV1,通过转染HEK293T细胞系,成功建立了TTSuV的间接免疫荧光抗体检测方法（Indirect Immunofluorescence,IFA）。对20162017年采集的河南省南阳市周边地区多个规模化养猪场血清进行检测,结果显示临床血清的阳性率为48.48%65.4%（65.4%、50%、48.48%、51.28%和55.36%）,均在50%左右。表明我们建立的TTSuV的间接免疫荧光抗体检测方法具有较好,可以用于临床检测。
施研进[8]（2014）在《石河子及北屯地区猪TTV及PCV2的基因检测及基因型分析》文中指出猪源输血传播病毒（Torque Teno virus，TTV）在世界大部分猪场都有较高的感染率。人源TTV感染人后，会发生重型肝炎等症状；圆环病毒2型（Circovirus type2，PCV2）是影响和诱发猪死亡和发病的重要病原之一。为了解石河子及北屯地区猪源TTV及PCV2的感染情况，并进一步研究猪源TTV与圆环病毒2型间是否存在协同影响的作用，本研究对在石河子地区及北屯地区猪源样品进行了TTV和PCV2的基因检测，并对流行毒株的基因型进行了分析。研究中采用康为世纪公司的血液基因组小量提取试剂盒，对石河子屠宰场随机采集的206份猪抗凝血液、北屯地区屠宰场采集的72猪抗凝血液，及石河子周边猪场采集的不同日龄仔猪抗凝血液50份、母猪的抗凝血液10份进行DNA提取。根据相关数据合成了三对引物，建立了用于检测TTV1、TTV2及PCV2的聚合酶链反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）检测方法，在此基础上，对反应条件进行了优化，建立了检测TTV1和PCV2的双重PCR检测方法。利用本研究建立的PCR检测方法，对采集样品进行检查，同时选取部分阳性样品，对PCR产物采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，对纯化的PCR产物进行TA克隆，经PCR鉴定后进行序列测定。主要结果如下：1、石河子和北屯地区猪TTV1感染率为41.4%（140/338）；TTV2的感染率为21.3%（72/338）；TTV1和TTV2混合感染率为8.9%（30/338）；PCV2的感染率为4.3%（12/278）。2、在石河子地区检测的8例PCV2阳性样品中有5例为TTV1与PCV2混合感染，有1例为TTV2与PCV2混合感染，有1例为TTV1、TTV2与PCV2混合感染，一例为PCV2阳性。在石河子周边养猪场采集5份外观为PCV2发病猪，进行解剖，并进行PCR检测，发现5份病猪全部为PCV2及TTV混合感染。3、选取部分阳性样品进行序列测定，将分离株的基因序列与Genbank登录的已知猪TTV1、TTV2、PCV2序列进行比对。结果显示本研究获得的TTV1序列与已报道序列的同源性为82.34%-95.59%；TTV2序列与已报道序列的同源性为83.75%-96.17%；所获PCV2序列与PCV2a参照序列之间的同源性为86.4%-87.4%，与PCV2b参照序列之间的同源性为92.9%-96.4%，表明所获PCV2序列为2b型。4、建立了检测TTV1和PCV2的双重PCR方法。采用双重PCR方法检测检测临床样品与相应的TTV1PCR检测结果和PCV2PCR检测结果无明显差异。
张洪兵[9]（2014）在《昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究》文中进行了进一步梳理输血传播病毒（Torque teno virus, TTV）是一种无囊膜的单股负链DNA病毒,关于其病毒分类尚有争议,目前该病毒归于圆环病毒科（Circoviridae）指环病毒属（Anellovirus）。该病毒发现于1997年,一位日本学者采用差异显示分析法（representational difference analysis, RDA）在一例心脏手术输血后发生急性感染的非甲-庚型肝炎病人进行血清分析时发现的,被称为输血传播病毒。研究发现TTV可感染人和多种动物,且在人群中的感染率很高。输血传播病毒呈世界性分布,它的基因组有高度的变异性,在人与动物中的流行状况也不尽相同,而目前国内的研究尚缺乏对更多不同地区的人类输血传播病毒流行病学的研究数据,这就包括病毒的基因型别和感染率。此外,无论是体内实验还是体外实验,输血传播病毒的研究进展都较为缓慢,尤其是病毒在健康人群的流行病学。因此,为了了解该病毒的分子流行病学特点,和全基因组特征,以及为输血传播病毒所可能带来的疾病提供科学的防控依据,本实验对昆明市体检人群血清样品开展了输血传播病毒感染的分子流行病学研究。本研究中,提取昆明市体检人群血清中的病毒基因组,根据GenBank上发表的TTV标准株序列（AB008394）,并参考相关文献,设计合成针对TTV核苷酸序列较为保守的非编码区（Untranslated Region, UTR）的引物,建立了用于检测人TTV的巢式PCR方法。对昆明市某高校体检人群的224份血液样品进行了检测,检测到了151份,结果表明体检人群中TTV的感染率达到了67.41%。依据国外已经发表的研究,针对输血传播病毒核苷酸序列变异率比较大的开放阅读框1（Open Reading Frame one, ORF1）设计并合成了N22区引物,同时合成了输血传播病毒第四基因群（Group4,G4）和第五基因群（Group5,G5）的分型引物,对上一步扩增较好的样品120份进行分型实验。以PCR方法对鉴定引物筛选为阳性的血清样品进行基因分型。对其中PCR扩增效果较好的样品进行序列测定与分析,建立系统进化树。分型结果表明,N22区引物扩增出了21份,占实验样品的17.5%,以G4引物扩增了50份样品,检测出了13份阳性,比例为26%,G5引物扩增了50份,检出24份,阳性率为48%。大部分毒株与TTV Gla型相符合,而进化关系稍远的有可能是基因变异造成成的。设计并合成了五对引物,对TTV全基因组进行克隆与序列测定,并进行了序列拼接,建立了此株病毒的系统进化树,分析了氨基酸的同源性。系统进化分析表明此毒株属于TTV1a型。核苷酸同源性与氨基酸同源性分析表明与TTV1a型的相似度最高。以上研究结果表明,输血传播病毒在昆明市体检人群中的检出率为67.41%,由此推断此病毒在昆明还是有着较高的流行率：基因分型和系统进化分析表明,昆明的优势流行株还是TTV的G1a型。本实验对昆明市体检人群输血传播病毒的分子流行病学作了较为系统的调查研究,以上研究结果为输血传播病毒在体检人群中的流行状况和基因型别提供了参考依据,为输血传播病毒的进一步研究打下了坚实基础。
张娜,刘学芳,赵君玫,张振强[10]（2013）在《TTV病毒感染与人类疾病》文中研究表明TTV病毒是人类非甲-非庚型肝炎的重要致病因素,在各种类型的肝炎以及肝癌患者中具有较高的检出率。近期,有报道显示,TTV病毒在传染性胃肠炎、女性生殖系统疾病、输血性传播疾病以及结肠癌等多种疾病患者中均有高于正常对照人群的高感染率。本文就近年来TTV病毒感染和人类多种疾病的关系进行综述,以期提高人们对TTV病毒潜在致病性的认识。
二、TTV感染的临床表现特征（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TTV感染的临床表现特征（论文提纲范文）
（1）云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 基于宏转录组学的新的蜱传病毒的发现 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 生物信息学分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 蜱标本鉴定 |
| 3.2 蜱标本核糖核酸(RNA)提取与检测 |
| 3.3 蜱标本测序文库构建与测序 |
| 3.4 测序数据处理与分析 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 蜱标本采集情况 |
| 5.2 蜱标本RNA提取与检测结果 |
| 5.3 宏转录组测序结果 |
| 6 讨论 |
| 第二部分 云南蜱病毒的分离鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 生物信息学分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 病毒分离培养 |
| 3.3 病毒全基因组测序 |
| 3.4 病毒全基因组序列分析 |
| 3.5 病毒检测方法建立 |
| 3.6 病毒生长复制曲线绘制 |
| 3.7 病毒形态观察 |
| 3.8 病毒多克隆抗体制备 |
| 3.9 病毒抗原片制备及间接免疫荧光实验 |
| 3.10 RNA荧光原位杂交实验 |
| 3.11 蜱咬病人血清标本IFA筛查 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 病毒分离培养结果 |
| 5.2 YNTV全基因组序列特征 |
| 5.3 YNTV结构和功能预测 |
| 5.4 YNTV基因组同源性分析 |
| 5.5 YNTV系统发育分析 |
| 5.6 YNTV重组分析 |
| 5.7 YNTV实时荧光定量RT-PCR标准曲线 |
| 5.8 细胞敏感性分析 |
| 5.9 YNTV的形态特征 |
| 5.10 YNTV在不同细胞中的感染情况 |
| 5.11 蜱咬病人血清标本IFA筛查结果 |
| 6 讨论 |
| 第三部分 云南蜱病毒与其他多种新发蜱传病原体复合感染情况的流行病学调查 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 蜱标本鉴定 |
| 3.2 蜱标本核酸提取 |
| 3.3 蜱标本YNTV检测 |
| 3.4 蜱标本中其他新发蜱传病毒检测 |
| 3.5 蜱标本中细菌和原虫检测 |
| 3.6 系统发育分析 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 蜱标本采集结果 |
| 5.2 蜱标本YNTV检测结果 |
| 5.3 蜱标本中其他新发蜱传病毒检测结果 |
| 5.4 蜱标本中细菌和原虫检测结果 |
| 5.5 蜱标本中各种病原体的复合感染情况 |
| 6 讨论 |
| 结论与建议 |
| 本研究的主要创新点与不足 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（2）两株猪细环病毒的全基因组测序及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪细环病毒的研究进展 |
| 1.2 猪细环病毒病原学特点 |
| 1.3 猪细环病毒的基因组结构功能 |
| 1.4 猪细环病毒流行病学特点 |
| 1.5 猪细环病毒的理化特性 |
| 1.6 猪细环病毒致病特性 |
| 1.7 猪细环病毒含量分布 |
| 1.8 猪细环病毒的潜在应用价值 |
| 1.9 猪细环病毒细胞培养特性 |
| 1.10 生物学诊断 |
| 1.10.1 病原学检测 |
| 1.10.2 血清学检测 |
| 1.11 全基因组研究 |
| 1.12 研究目的及意义 |
| 第二章 猪细环病毒全基因组克隆测序及分析 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验室常用溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 临床病料与处理 |
| 2.3.2 病毒总基因组提取 |
| 2.3.3 引物设计及合成 |
| 2.3.4 猪细环病毒RT-PCR检测 |
| 2.4 猪细环病毒全基因组序列扩增 |
| 2.4.1 全基因组引物设计与合成 |
| 2.4.2 猪细环病毒阳性样品基因组提取 |
| 2.4.3 猪细环病毒全基因组序列扩增 |
| 2.4.4 阳性PCR产物回收纯化 |
| 2.4.5 目的片段的连接 |
| 2.4.6 目的基因转化 |
| 2.4.7 重组菌株PCR鉴定 |
| 2.4.8 猪细环病毒全基因组序列分析 |
| 2.4.9 ORF1 序列生物信息学分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 样品检测结果 |
| 2.5.2 TTSuV全基因组扩增结果 |
| 2.5.3 优化克隆转化过程 |
| 2.5.4 TTSuV全基因组序列拼接 |
| 2.5.5 TTSuV全基因组相似性分析 |
| 2.5.6 基因重组分析 |
| 2.5.7 ORF1 蛋白理化性质预测分析 |
| 2.5.8 ORF1 蛋白二级结构预测 |
| 2.6 结论与讨论 |
| 第三章 猪细环病毒分离及仔猪致病性试验 |
| 3.1 主要实验试剂 |
| 3.2 主要试验仪器 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.4 猪细环病毒分离培养 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 细胞复苏 |
| 3.4.3 细胞传代培养 |
| 3.4.4 细胞冻存 |
| 3.4.5 6 孔板培养细胞 |
| 3.4.6 病毒分离 |
| 3.4.7 96 孔板培养细胞 |
| 3.4.8 半数组织感染量(TCID_(50))的测定 |
| 3.4.9 动物致病性试验 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 病毒分离培养 |
| 3.5.2 分离株毒价测定 |
| 3.5.3 动物致病性试验 |
| 3.6 结论与讨论 |
| 第四章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 本研究涉及所有参考毒株信息 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 病毒宏基因组学的概念 |
| 1.2 病毒宏基因组学的研究过程 |
| 1.2.1 样品处理和病毒浓缩 |
| 1.2.2 核酸提取和扩增 |
| 1.2.3 高通量测序 |
| 1.2.4 生物信息学分析 |
| 1.3 病毒宏基因组学的应用 |
| 1.4 病毒宏基因组学的研究现状和发展趋势 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 本研究的总体技术路线 |
| 第二章 江苏某地区HIV感染患者血浆病毒群落分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 样品前处理 |
| 2.1.4 样品组合设计 |
| 2.1.5 样品的核酸酶消化 |
| 2.1.6 病毒核酸提取 |
| 2.1.7 逆转录及合成双链DNA |
| 2.1.8 高通量测序文库的构建 |
| 2.1.9 文库的扩增 |
| 2.1.10 文库的纯化 |
| 2.1.11 病毒文库质量检测 |
| 2.1.12 文库的Miseq深度测序 |
| 2.1.13 文库测序结果的生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 病毒宏基因组DNA文库的质量检测 |
| 2.2.2 Miseq测序质量 |
| 2.2.3 HIV感染人群血浆的病毒宏基因组学分析结果 |
| 2.2.4 HIV感染人群血浆的病毒群落组成 |
| 2.2.5 HIV感染人群血浆病毒群落按宿主分类 |
| 2.2.6 检出病载组与未检出病载组的比较 |
| 2.2.7 主要潜在致病性病毒比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 未知病毒的鉴定和遗传特征分析 |
| 3.1 HIV感染人群血浆样本中指环病毒的研究 |
| 3.1.1 材料和方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 HIV感染人群血浆样本中细小病毒的研究 |
| 3.2.1 材料和方法 |
| 3.2.2 实验结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 第四章 主要结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）不明原因发热患者肺泡灌洗液病毒群落解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 病毒宏基因组学定义 |
| 1.2 病毒宏基因组学的应用 |
| 1.3 病毒宏基因组学的研究方法 |
| 1.3.1 样本的制备 |
| 1.3.2 DNA文库的构建 |
| 1.3.3 DNA文库的测序 |
| 1.3.4 文库测序结果分析 |
| 1.4 病毒宏基因组学的研究现状及进展 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 第二章 不明原因发热患者肺泡灌洗液病毒群落组成 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 肺泡灌洗液样本的采集 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 肺泡灌洗液样本前处理: |
| 2.1.4 实验设计 |
| 2.1.5 肺泡灌洗液样本的核酸酶消化 |
| 2.1.6 病毒核酸的提取 |
| 2.1.7 逆转录及合成双链DNA |
| 2.1.8 病毒宏基因组文库构建 |
| 2.1.9 文库的扩增 |
| 2.1.10 文库的纯化 |
| 2.1.11 DNA文库片段筛选 |
| 2.1.12 文库质量检测分析 |
| 2.1.13 文库测序结果分析 |
| 2.2 肺泡灌洗液病毒宏基因组文库结果分析 |
| 2.2.1 各肺泡灌洗液文库病毒群落组成 |
| 2.2.2 各文库病毒群落组成及各科病毒序列数比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 肺泡灌洗液中细环病毒的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样本的采集 |
| 3.1.2 核酸的提取 |
| 3.1.3 引物的设计与扩增 |
| 3.1.4 巢式PCR产物检测 |
| 3.1.5 PCR产物的胶回收 |
| 3.1.6 目的片段的连接转化 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 阳性样本筛选结果 |
| 3.2.2 病毒基因结构分析及系统进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 肺泡灌洗液中鼻病毒的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样本的采集 |
| 4.1.2 样本核酸的提取 |
| 4.1.3 样本核酸逆转录 |
| 4.1.4 引物设计及PCR扩增 |
| 4.1.5 PCR反应产物的检测及胶回收 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 肺泡灌洗液中鼻病毒阳性样本筛选结果 |
| 4.2.2 人鼻病毒系统进化分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 主要结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文、参与课题及参加会议 |
（5）鼠源TTV基因组分析与呼吸道HRSV抗病毒药物筛选（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 鼠源TTV基因组分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 主要技术路线 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 病毒基因组的提取 |
| 1.3.2 非序列依赖单引物PCR(SISPA-PCR) |
| 1.3.3 PCR产物的纯化及电泳 |
| 1.3.4 高通量基因组测序及生物信息学分析 |
| 1.3.5 全长扩增引物设计与合成 |
| 1.3.6 RoTTV病毒基因组验证及RoTTV病毒全基因组扩增 |
| 1.3.7 PCR扩增产物纯化、克隆及Sanger测序 |
| 1.3.8 病毒基因组注释及遗传进化分析 |
| 1.3.9 检测方法建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 核酸SISPA扩增结果 |
| 2.2 高通量基因组测序及RoTTV3-HMU1 病毒基因组全长扩增 |
| 2.3 基因组结构分析及遗传进化分析 |
| 2.4 RoTTV3 病毒real-time PCR检测方法建立 |
| 2.4.1 标准品的制备 |
| 2.4.2 引物灵敏度检测 |
| 2.4.3 Real-time PCR标准曲线的建立及溶解曲线分析 |
| 2.5 RoTTV3 病毒感染的家鼠肝组织中病毒的定量检测 |
| 3 讨论 |
| 4.小结 |
| 第二章 呼吸道HRSV抗病毒药物筛选 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 细胞与病毒株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 主要技术路线 |
| 1.4 细胞培养基及药物配制 |
| 1.5 HRSV-A的扩增、PCR验证及病毒TCID_(50)的测定 |
| 1.5.1 病毒扩增 |
| 1.5.2 HRSV-A PCR验证 |
| 1.5.3 病毒TCID_(50)的测定 |
| 1.6 药物细胞毒性评价 |
| 1.6.1 CPE观察法测定药物细胞毒性 |
| 1.6.2 CCK-8 法测定药物细胞毒性 |
| 1.7 药物抗病毒效果评价 |
| 1.7.1 CPE法测定药物半数有效浓度(EC_(50))及药物的治疗指数(TI) |
| 1.7.2 CCK-8 法测定药物半数有效浓度(EC_(50))及药物的治疗指数(TI) |
| 1.7.3 药物抗病毒实验 |
| 1.8 天然药品库的初筛 |
| 1.9 EGCG药物半数致死率(TC_(50))测定 |
| 1.10 EGCG药物半数有效率(EC_(50))测定及抗病毒实验 |
| 1.11 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗病毒实验 |
| 1.12 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 HRSV-A病毒扩增、PCR验证及病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.1.1 HRSV-A扩增: |
| 2.1.2 HRSV-A PCR验证 |
| 2.1.3 病毒TCID50的测定 |
| 2.2 药物的细胞毒性测定 |
| 2.2.1 CPE法测定药物的细胞毒性 |
| 2.2.2 CCK-8 法测定药物的细胞毒性 |
| 2.3 药物抗HRSV-A病毒药效实验 |
| 2.3.1 CPE法 |
| 2.3.2 CCK-8法 |
| 2.3.3 药物的细胞上清病毒滴度测定 |
| 2.4 CPE和 CCK-8 两种方法实验结果比较 |
| 2.5 EGCG药物半数致死率(TC_(50))测定结果 |
| 2.6 EGCG药物半数有效率(EC_(50))测定及抗病毒实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）猪细环病毒2型与猪圆环病毒2型双重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1.1 PCV2 编码的相关蛋白 |
| 1.2 PCV2 与细胞蛋白质的相互作用 |
| 1.3 PCV2 与细胞信号转导的相互作用 |
| 1.4 PCV2 与细胞氧化应激 |
| 1.5 PCV2 诱导的细胞凋亡 |
| 1.6 PCV2 诱导的细胞自噬 |
| 1.7 PCV2 与宿主免疫系统的相互作用 |
| 第二章 猪细环病毒的研究进展 |
| 2.1 猪细环病毒的形态结构和理化特性 |
| 2.2 TTSuV的遗传变异性 |
| 2.3 猪TTSuV病毒的感染 |
| 第三章 猪圆环病毒与猪细环病毒的诊断 |
| 3.1 PCV2 的诊断 |
| 3.2 TTSuV病毒的检测 |
| 第二篇 研究内容 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）猪细环病毒的序列分析及抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 猪细环病毒 |
| 1.1.1 TTV的分类 |
| 1.1.2 TTSuV的病原学特点 |
| 1.1.3 TTSuV的流行病学特点 |
| 1.1.4 TTSuV的感染方式 |
| 1.1.5 TTSuV的致病性特点 |
| 1.2 病毒检测的生物学诊断 |
| 1.2.1 病原学诊断方法 |
| 1.2.2 血清免疫学法 |
| 1.2.3 原位杂交法 |
| 1.3 TTV与人类的关系 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器及材料 |
| 2.1.2 载体、病毒和细胞 |
| 2.1.3 主要商品化试剂盒 |
| 2.1.4 常用试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 TTSuV病毒基因组的提取 |
| 2.2.2 TTSuV基因的克隆 |
| 2.2.3 酶切和连接 |
| 2.2.4 Top10感受态的制备 |
| 2.2.5 转化连接产物 |
| 2.2.6 质粒的小量提取 |
| 2.2.7 重组质粒的酶切检测及测序鉴定 |
| 2.2.8 细胞培养及细胞转染技术 |
| 2.2.9 细胞涂片（以一孔为例） |
| 2.2.10 间接免疫荧光处理流程 |
| 2.2.11 序列测序 |
| 2.2.12 进化树分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 TTSuV进化树分析 |
| 3.2 TTSuV间接免疫荧光检测方法的建立 |
| 3.2.1 TTSuV1 Cap基因的PCR扩增 |
| 3.2.2 TTSuV基因载体的构建 |
| 3.2.3 间接免疫荧光抗体检测方法的建立 |
| 3.2.4 间接免疫荧光抗体检测方法的临床应用 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）石河子及北屯地区猪TTV及PCV2的基因检测及基因型分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英语字母缩写和中英文全称对照表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 TTV 研究进展 |
| 1.1 TTV 的分类及病原特点 |
| 1.1.2 TTV 的病原特点 |
| 1.2 TTV 的检测方法 |
| 1.2.1 TTV 的 PCR 检测 |
| 1.2.2 TTV 的基因分型 |
| 1.2.3 TTV 的原位杂交检测法 |
| 1.3 TTV 致病性 |
| 1.4 TTV 传播途径 |
| 1.5 TTV 流行情况研究 |
| 1.6 TTV 病毒的治疗 |
| 2 猪圆环病毒 2 型 |
| 2.1 猪圆环病毒 2 型分类及病原特点 |
| 2.1.1 猪圆环病毒 2 型分类 |
| 2.1.2 猪圆环病毒 2 型病原特点 |
| 2.2 PCV2 检测技术 |
| 2.2.1 PCV2 的 PCR 检测 |
| 2.2.2 PCV2 的原位杂交技术 |
| 2.2.3 PCV2 的 ELISA 检测 |
| 2.3 PCV2 的致病性 |
| 2.4 猪圆环病毒病的临床表现 |
| 2.5 PCV2 传播途径 |
| 2.6 PCV2 流行情况 |
| 2.7 PCV2 防治方法 |
| 3 TTV 与 PCV2 混合感染研究 |
| 第一章 石河子及北屯地区 TTV 的 PCR 检测及不同日龄 TTV 的感染情况对比 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 血液样品 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总 DNA 提取 |
| 1.2.3 PCR 扩增 |
| 1.2.4 PCR 产物鉴定 |
| 1.2.5 回收纯化 DNA 片段 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 感受态细胞制备 |
| 1.2.8 连接产物的转化 |
| 1.2.9 序列测定分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 检测结果 |
| 2.2 阳性克隆 PCR 检测结果 |
| 2.3 序列分析结果 |
| 2.4 不同日龄仔猪及母猪感染率调查 |
| 3 分析与讨论 |
| 第二章 石河子及北屯地区 PCV2 型 PCR 检测及基因型分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品采集 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总 DNA 提取 |
| 1.2.3 PCR 扩增 |
| 1.2.4 PCR 产物鉴定 |
| 1.2.5 回收纯化 DNA 片段 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 连接产物的转化 |
| 1.2.9 序列测定 |
| 1.2.10 临床剖检 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 检测结果 |
| 2.2 测序结果 |
| 2.3 同源性分析结果 |
| 2.4 进化树分析结果 |
| 2.5 临床剖检猪场中发现的突然死亡的仔猪 |
| 3 讨论与结论 |
| 第三章 TTV1 与 PCV2 双重 PCR 检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 血液样品 |
| 1.1.2 实验室使用器材 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总 DNA 提取 |
| 1.2.3 PCR 扩增 |
| 1.2.4 双重 PCR 检测方法的建立 |
| 1.2.5 PCR 产物鉴定 |
| 1.2.6 回收纯化 DNA 片段 |
| 1.2.7 感受态细胞制备 |
| 1.2.8 连接反应 |
| 1.2.9 连接产物的转化 |
| 1.2.10 序列测定 |
| 1.2.11 敏感性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 检测结果 |
| 2.1.2 双重 PCR 反应条件的优化结果 |
| 2.1.3 双重 PCR 的灵敏度试验 |
| 2.1.4 双重 PCR 的重复性试验 |
| 2.1.5 临床应用 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图和附表清单 |
| 英文缩略词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 输血传播病毒概述 |
| 1.1.1 TTV病毒理化及生物学特性 |
| 1.1.2 TTV所属科属 |
| 1.2 输血传播病毒基因组及其重要蛋白研究进展 |
| 1.2.1 TTV基因组特点 |
| 1.2.2 TTV的蛋白质 |
| 1.2.3 TTV基因群 |
| 1.3 输血传播病毒可能的致病性 |
| 1.3.1 肝损伤 |
| 1.3.2 肺部疾病 |
| 1.3.3 血液学疾病 |
| 1.3.4 特发性炎症性肌病 |
| 1.3.5 免疫学状况 |
| 1.3.6 系统性红斑狼疮 |
| 1.4 输血传播病毒在人体组织的分布 |
| 1.5 输血传播病毒传播途径 |
| 1.5.1 血液传播 |
| 1.5.2 粪-口途径传播 |
| 1.5.3 母婴垂直传播 |
| 1.5.4 飞沫传播 |
| 1.5.5 性传播 |
| 1.6 输血传播病毒流行状况 |
| 1.7 输血传播病毒检测方法 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 昆明体检人群TTV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 血清样品PCR检测 |
| 2.2.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒序列测定与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 检测体系的评价 |
| 2.3.2 对检测结果的分析 |
| 2.3.3 由输血传播病毒感染所引发的思考 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 输血传播病毒变异分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 分型引物PCR检测 |
| 3.2.2 序列测定及分析 |
| 3.2.3 同源性及遗传进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 分型引物的设计 |
| 3.3.2 TTV基因型的特点 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 输血传播病毒全基因组序列分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 TTV全基因组分段扩增结果 |
| 4.2.2 各片段重组质粒双酶切鉴定 |
| 4.2.3 序列拼接 |
| 4.2.4 系统进化树分析 |
| 4.2.5 同源性分析 |
| 4.2.6 重组事件分析 |
| 4.2.7 TTV结构蛋白疏水性及抗原表位分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（10）TTV病毒感染与人类疾病（论文提纲范文）
| 1 TTV病毒病原学 |
| 2 TTV感染与人类疾病 |
| 2.1 TTV感染与肝炎 |
| 2.2 TTV感染与肝癌 |
| 2.3 TTV感染与传染性胃肠炎 |
| 2.4 TTV感染与女性宫颈疾病 |
| 2.5 TTV感染与输血性疾病 |
| 2.6 TTV感染与结肠癌 |
| 3 问题与展望 |
四、TTV感染的临床表现特征（论文参考文献）
- [1]云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究[D]. 王倩. 山东大学, 2021(10)
- [2]两株猪细环病毒的全基因组测序及分析[D]. 陈柯. 南阳师范学院, 2021(11)
- [3]江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究[D]. 窦安华. 扬州大学, 2021(08)
- [4]不明原因发热患者肺泡灌洗液病毒群落解析[D]. 李欣霖. 江苏大学, 2020(02)
- [5]鼠源TTV基因组分析与呼吸道HRSV抗病毒药物筛选[D]. 吴悦. 海南医学院, 2019(02)
- [6]猪细环病毒2型与猪圆环病毒2型双重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 闫满. 吉林农业大学, 2019(03)
- [7]猪细环病毒的序列分析及抗体检测方法的建立[D]. 王玲. 南阳师范学院, 2018(08)
- [8]石河子及北屯地区猪TTV及PCV2的基因检测及基因型分析[D]. 施研进. 石河子大学, 2014(03)
- [9]昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究[D]. 张洪兵. 昆明理工大学, 2014(01)
- [10]TTV病毒感染与人类疾病[J]. 张娜,刘学芳,赵君玫,张振强. 现代预防医学, 2013(17)