一、应用CATS法分离和鉴定猪GFAP基因的研究（论文文献综述）
胡鹏飞[1]（2014）在《猪诱导型多能干细胞多能性维持的机理研究》文中提出诱导多能干细胞技术主要涉及两个方面,一方面是利用外源特定转录因子导入受体细胞,激活受体细胞的内源基因表达,改变相关的表观遗传印记,使细胞处于一种不稳定的中间活化状态；另一方面是通过特定的培养条件,将处于中间活化状态的细胞向特定方向进行诱导和筛选,根据所提供的多能干细胞特定培养条件,筛选出与胚胎干细胞相类似的诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。目前猪诱导型多能干细胞（piPSCs）不同细胞系之间差异较大,特征难以统一,所得到的大部分piPSCs细胞系均未能实现外源基因的沉默,虽然有报道piPSCs可以进行嵌合体实验,至今却没有得到其他实验室的重复,更令人奇怪的是piPSCs的核移植胚胎发育率远远低于正常的体细胞,并且克隆胚胎的体内发育率更是极低,不能达到小鼠iPSCs细胞的多能性水平,这也使piPSCs细胞在转基因猪生产和建立疾病模型方面的应用受到限制。此外,猪胚胎干细胞的研究进展缓慢,没有公认的猪胚胎干细胞及合适的培养系统作为参考,且猪发育生物学上研究的不充分,使得piPSCs在体外的多能性维持较为困难。基于诱导多能干细胞技术特点和piPSCs目前存在的问题,本研究在piPSCs的体外培养因素和多能性状态两个方面进行了研究,主要内容如下：1、两种来源piPSCs产生效率和体外增殖能力的影响因素研究（1）采用3因子、4因子和6因子组合的Tet-on诱导调控系统慢病毒对巴马小型猪成纤维细胞和骨髓间充质干细胞进行重编程,对诱导产生的两种piPSCs进行形态学、碱性磷酸酶染色、免疫荧光、基因表达、核型分析、体外和体内分化能力检测,结果表明,两种来源猪细胞产生piPSCs的效率相同,诱导产生的两种piPSCs均具有类似胚胎干细胞的特征。比较了3种方法对piPSCs产生效率的影响,三因子诱导产生的克隆经碱性磷酸酶检测为阴性,六因子比四因子诱导效率高,但差异不显着,经基因检测发现,获得的所有克隆外源基因没有沉默。（2）比较了不同饲养层下猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs生长情况,猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs在CF1上生长情况最好,可传20代以上,克隆形成能力最强,平均倍增时间最短,MEF和猪成纤维饲养层次之,二者差异不显着（P>0.05）,猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs在STO饲养层上生长情况最差,表明猪iPSCs不适宜用STO饲养层进行培养。（3）比较了单细胞传代、小克隆传代和中等大小克隆传代对piPSCs体外增殖的影响。结果发现猪成纤维细胞／骨髓间充质干细胞来源iPSCs均不适合单细胞传代,消化成单细胞传代的克隆形成率极低,很少有克隆形成。消化成小克隆和中等大小克隆的传代方式比较,二者克隆形成能力和平均倍增时间相近,克隆团紧凑,未出现分化现象,可传20代以上。（4）研究了ROCK信号通路抑制剂Y-27632对猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源iPSCs冻存后解冻复苏效果的影响,结果发现Y-27632能够有效地提高两种猪iPSCs细胞的冻存活率,减少复苏后细胞的死亡数量,并能促进猪iPSCs细胞在传代后的贴壁和克隆形成,但较高浓度的Y-27632会影响猪iPSCs细胞的克隆形态。（5）制备和纯化了细胞周期相关蛋白CDK2和CDC25b,比较CDK2和CDC25b重组蛋白对猪iPSCs克隆形成率和平均倍增时间的影响。结果表明,添加CDK2和（?）CDC25b重组蛋白提高了猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源iPSCs克隆形成率,缩短了iPSCs平均倍增时间,其中CDC25b重组蛋白效果最佳。2、两种状态piPSCs的生物学特性和分子调控机制研究（1）巴马小型猪骨髓间充质干细胞诱导产生的多能干细胞（piPB4-6h）按常规方式进行传代培养,piPB4-6h呈相对松散、扁平状集落,集落内细胞界限隐约可见。通过改变培养液和饲养层进行传代培养,得到小鼠ES细胞样猪iPSCs（piPB4-6m）细胞,可以稳定传代20以上。piPB4-6m集落与piPB4-6h的明显不同,细胞个体小,piPB4-6m在体外培养时呈集落状生长,细胞集落有明显的边界,细胞间紧密堆积,无明显的细胞界限。（2）撤除DOX后piPB4-6m仍可以进行正常的传代培养,仅有少量的piPB4-6m克隆出现分化现象,结果证明在转化培养条件下,DOX不是必须的。转化培养后单位面积piPB4-6m克隆显着增多,细胞活性明显高于常规方式培养的piPB4-6h。（3） piPB4-6m各项鉴定指标均达到多能干细胞的标准,但piPB4-6m细胞表达SSEA1,与piPB4-6h细胞不同。piPB4-6m和piPB4-6h的外源Oct4和Sox2基因表达都没有被沉默,而在外源Sox2的表达模式上差异很大,piPB4-6m细胞的外源Sox2的表达水平高于piPB4-6h。在内源基因启动方面,虽然内源Oct4、Sox2和Nanog的表达量都有所提高,但是相对外源基因的表达量来讲非常低,在内源Sox2和Nanog的表达上,piPB4-6h细胞的表达量更高。（4）对两种状态的piPSCs细胞进行X染色体状态的分析,荧光定量PCR检测Xist基因（Xist34和Xist45）和SSEA4基因在piPB4-6m和piPB4-6h细胞中的表达,结果表明,piPB4-6m的Xist基因和SSEA4基因表达量降低,证明转化培养的piPB4-6m细胞趋近于小鼠的ES细胞状态。（5）通过对两种状态的piPSCs细胞信号通路相关基因的表达分析表明,piPB4-6m细胞更倾向于LIF和BMP4的信号通路维持,但是也有FGF2的高表达,而piPB4-6h更倾向bFGF通路；检测了两种状态的piPSCs细胞DLK-DIO3印记区间三个基因DLK1、GTL2和D103的表达,结果表明piPB4-6m的DLK1、GTL2基因表达显着高于piPB4-6h,推测piPB4-6m可能具有更高的多能性水平。
王小洪[2]（2013）在《黄芩苷对多巴胺神经元的保护作用及机制》文中指出帕金森病（Parkinson’s disease, PD）又名震颤麻痹,是继阿尔茨海默病（Alzheirmer’s disease, AD）之后第二大神经系统慢性退行性疾病,主要症状为震颤、肌肉强直、运动减少和姿势平衡障碍。随着中国老龄化的进展,PD的发病率逐年升高。目前,PD的治疗药物和策略只能对症治疗,不能阻止多巴胺能（Dopamine, DA）神经元的进行性变性和缺失。因此,寻找有效的抗帕金森病药物弥补当前治疗的不足已成为PD研究的当务之急。动物模型是研究帕金森病的发病机理、筛选药物和治疗策略的重要工具。MPTP诱导的小鼠模型无论在病理改变还是在行为学方面与PD患者有类似的变化特点,是目前公认较为理想的PD动物模型。基于动物模型上建立敏感稳定的行为学检测方法是构建PD药物筛选平台的重要组成部分。黄芩苷（Baicalin）是唇形科植物黄芩中提取的黄酮类单体化合物,具有抑菌抗炎、降压、利尿及抗变态反应的作用。近年来大量体内外研究证实黄芩苷也具有对抗缺血性脑损伤、减轻感染性脑水肿及抗脑内炎症的作用。本研究通过腹腔注射MPTP制作亚急性帕金森病小鼠模型,并应用计算机控制的CatWalk步态分析系统与Western Blotting、免疫组化和Open field test相结合的方法,首次分析MPTP诱导的PD亚急性模型小鼠的步态及姿势变化,并将各步态和姿势指标与黑质区TH蛋白水平做相关性分析,筛选出步幅、对角双足支撑模式、三足支撑模式、速度变异率、两后足间距、双后足的支撑率、双前足的初次接触时间等敏感稳定的步态指标,以期为PD的治疗研究建立一套有效可靠的评估体系。基于以上的评估平台我们进行了大量的药物筛选,发现黄芩苷可有效地改善PD模型小鼠的运动功能障碍和DA神经元的变性损伤。基于以上的发现,我们提出以下问题：1.黄芩苷是通过哪条信号通路发挥DA神经元保护作用?2.黄芩苷发挥DA神经元保护作用的关键性蛋白是什么?本研究应用双向凝胶电泳和质谱技术检测黄芩苷处理前后差异表达的蛋白谱,并采用基于复杂网络理论的生物信息学方法,进一步阐明黄芩苷的生物学活性及其对DA神经元的保护作用的关键性蛋白,以期为PD的治疗提供新的治疗方向和靶标。本研究共分为4部分,摘要如下：第一部分MPTP诱导的帕金森病小鼠模型及评估平台的建立目的：建立PD亚急性小鼠模型,利用CatWalk步态分析系统定量分析PD小鼠的步态和姿势的变化,并与黑质区TH蛋白水平做相关性分析,筛选出敏感稳定的步态和姿势指标。方法：1. MPTP粉末配制成4mg/ml注射液,每天注射一次,连续注射5天,正常对照组注射同体积生理盐水。2.最后一次MPTP注射后第21天,取小鼠全脑,行TH免疫组织化学染色,检测各组小鼠黑质区TH阳性神经元的形态和数量,及纹状体区TH阳性神经末梢的含量。3.最后一次MPTP注射后第4,7,12,16,21天,各组小鼠进行Open filed test,检测小鼠的自发活动性。4.最后一次MPTP注射前2天,及注射后第2,4,7,12,16,21天,冰上迅速取小鼠中脑黑质区和纹状体区新鲜脑组织,以Western Blotting检测黑质和纹状体区TH蛋白水平。5.以计算机控制的CatWalk步态分析系统分析模型小鼠的步态和姿势的变化,并与黑质区TH蛋白做相关性分析,筛选出敏感稳定的步态和姿势指标。结果：1.最后一次MPTP注射后第21天,TH免疫组织化学染色显示,PD小鼠黑质致密区DA神经元约减至正常组的35%,证明PD小鼠模型制作成功。2. Open field test结果显示,造模后第4天,PD小鼠的自发活动性明显降低；而第7天,PD小鼠的活动性高于正常组小鼠：造模后第12和16天,PD小鼠的活动性与正常对照组无差别；造模后第21天,PD小鼠的活动性明显低于正常组小鼠。3. Western Blotting结果显示,最后一次MPTP注射前2天,PD小鼠黑质和纹状体区TH蛋白水平开始下降,至造模结束后第4天达到最低点,造模后第7,12,16天,TH的表达表现为上升趋势,至造模后第21天,PD小鼠黑质和纹状体区TH的蛋白水平达最低。黑质和纹状体区TH蛋白表达的趋势一致。4. CatWalk test结果显示,PD小鼠穿过玻璃板的时间、速度变异率、步频、摇摆速度、步幅、静止时间、接触率、步伐周期、初次双足接触时间、末次双足接触时间、两后足间距、对角双足支撑模式、三足支撑模式、四足支撑模式发生明显的变化。步态与姿势指标与TH做相关性分析发现,步幅、对角双足支撑模式、三足支撑模式、速度变异率、两后足间距、双后足的支撑率和双前足的初次双足接触时间等指标敏感稳定,以上指标可以客观有效地评估PD模型小鼠的运动功能。结论：应用MPTP腹腔注射诱导的亚急性PD小鼠模型,能模拟人类PD的病理和行为学特征。计算机控制的CatWalk自动化步态分析系统可快速客观地评价模型小鼠的运动功能,操作简单,为PD的治疗研究建立了稳定敏感的筛选评估平台。第二部分黄芩苷对MPTP帕金森病小鼠的保护作用及机制目的：应用第一部分建立的PD小鼠模型及评估体系评价黄芩苷的抗帕金森病效果。方法：1.随机将小鼠分为正常对照组、模型组、模型+黄芩苷组及黄芩苷处理组。模型组和模型+黄芩苷组小鼠,腹腔注射MPTP制作PD模型；MPTP注射后第7天,治疗组和黄芩苷处理组小鼠腹腔注射黄芩苷,连续注射20天；正常对照组小鼠全程注射生理盐水。2.各组小鼠于MPTP注射完毕后第7天,进行Open field test.3.各组小鼠于MPTP注射完毕后第8天,进行CatWalk test。4.各组小鼠行心脏灌注固定后,取脑,O.C.T包埋后,制作冰冻切片,行TH免疫组织化学染色,观察各组小鼠黑质区DA神经元的形态,采用立体细胞计数法计算各组小鼠黑质区DA神经元的数量,并观察各组小鼠纹状体区TH阳性纤维末端的含量。5.各组小鼠冰上快速取中脑黑质和纹状体区脑组织,裂解后,以Western Blotting的方法检测各组小鼠黑质区TH、Bax、cleaved-Caspase-3和iNOS的水平。结果：1.黄芩苷治疗后,能明显升高PD小鼠的自发性活动,10分钟内行走的距离及运动时间比PD组小鼠明显升高,而休息时间显着降低。2. CatWalk检测结果显示,MPTP注射后第8天,步幅、对角双足支撑模式、双后足的支撑率及摇摆速度明显降低,三足支撑模式、速度变异率、两后足爪间距、双前足的初次接触时间明显增大。给予黄芩苷治疗后,上述运动功能障碍情况均得到明显的改善。3.免疫组织化学染色结果显示,MPTP注射可导致小鼠中脑黑质致密区TH阳性细胞明显减少,纹状体区TH阳性纤维末端明显减少。黄芩苷干预后,可明显缓解DA神经元的损伤情况。4. Western Blotting结果显示,MPTP注射后,小鼠黑质致密区TH蛋白水平较正常组小鼠明显降低,而Bax、cleaved-Caspase-3和NOS表达显着升高。黄芩苷可以明显逆转上述蛋白变化情况。结论：黄芩苷可明显缓解MPTP诱导的DA神经元的损伤,改善PD小鼠的步态紊乱等运动功能障碍。黄芩苷可能涉及抗凋亡和抗炎症的生物活性发挥神经保护作用。第三部分黄芩苷对多巴胺能神经元保护作用的蛋白组学研究目的：应用双向凝胶电泳和质谱技术,对比分析黄芩苷处理前后PD小鼠黑质区差异表达的蛋白质谱,并以RT-PCR的方法进一步检测其基因的表达变化,进一步探讨黄芩苷发挥DA神经元保护作用的机制及生物活性。方法：1.PD及黄芩苷处理的PD组小鼠,于黄芩苷注射完毕后,断头,冰上取新鲜脑组织。2.脑组织裂解后,以双向凝胶电泳法分离蛋白,银染后人工找出差异蛋白,将差异蛋白从凝胶中挖出,行质谱分析,以MASCOT软件检索肽质量指纹图谱鉴定蛋白质。3.脑组织裂解后,以RT-PCR的方法,检测PD及黄芩苷处理的PD组小鼠黑质区中差异表达蛋白的mRNA的表达差异。结果：1.黄芩苷治疗后,PD小鼠黑质区蛋白表达发生变化。经软件和质谱分析鉴定出36个差异表达蛋白,初步鉴定差异表达的蛋白涉及能量代谢、细胞增殖、细胞骨架、凋亡、炎症及信号转导等多种生理活动。2. RT-PCR检测结果显示,差异蛋白的基因表达趋势与蛋白表达的趋势基本一致。结论：黄芩苷可能通过正性调节PD小鼠黑质区的蛋白异常折叠和聚集、能量代谢及氧化应激等过程,增强神经元内环境的稳态,发挥神经元保护的作用。第四部分黄芩苷多巴胺能神经保护作用中蛋白质组生物信息学分析目的：应用String、KEGG、Panthwaylinker等软件,分析差异表达蛋白之间的相互作用及参与的生物通路。综合蛋白组学和生物信息学的分析,预测出关键的蛋白和信号通路并以Western Blotting的方法检测关键性蛋白和信号通路中的蛋白的表达。方法：1.应用String在线软件,检测差异表达蛋白之间的相互作用。2.应用KEGG和Pathwaylinker等软件,预测黄芩苷发生作用的信号通路。3.综合蛋白组学和生物信息学分析,预测参与黄芩苷的神经保护作用的关键性蛋白和信号通路。4.应用Western Blotting的方法,检测关键性蛋白和信号通路中蛋白的表达。结果：1. String在线软件分析发现,一共有22个蛋白之间发生相互作用,所有蛋白可以分成5个亚组,主要涉及骨架相关蛋白、CRMP/DPYL家族蛋白和Septin家族蛋白。2.通过Pathwayliner和KEGG软件分析发现,差异表达的基因主要涉及帕金森病通路、阿尔茨海默病通路、actin骨架蛋白调节通路、轴突导向通路、大肠杆菌感染通路和溶酶体通路等14个生物通路。3.综合蛋白组学和生物信息学,我们预测GFAP、GAPDH和Stip1等关键性蛋白及MAPK/ERK信号通路参与了黄芩苷的神经保护作用。4. Western Blotting结果显示,PD小鼠黑质区LC3-Ⅱ和HSP70表达下降,黄芩苷处理后,LC-Ⅱ和HSP70表达升高。PD小鼠黑质区ERK1/2表达显着升高,黄芩苷处理后,ERK1/2表达明显降低。结论：在本研究中,我们利用生物信息学的方法分析了差异表达蛋白之间的相互作用关系和参与的生物学通路。我们对差异蛋白所处的分子功能和生物学过程进行了分析,预测GAPDH GFPA和Stip1等关键性蛋白和MAPK/ERK通路可能参与黄芩苷的DA神经元保护作用。小结：本课题研究发现,基于CatWalk步态分析系统的步态检测是一种稳定可靠的运动功能障碍的检测方法。我们应用已建立的PD小鼠模型和相关的评估体系,发现黄芩苷能有效地缓解由MPTP引起的C57/BL6小鼠黑质纹状体通路中的多巴胺能神经元的变性丢失,并明显改善了MPTP诱导的C57/BL6小鼠步态紊乱和自发性活动减少等运动功能障碍。进一步,蛋白组学和生物信息学方法结合分析,我们预测到关键性蛋白GFAP、GAPDH和Stip1,及MAPK/ERK信号通路在黄芩苷的DA神经元保护作用中起到重要的调节作用。
雷蕾[3]（2013）在《山羊体细胞重编程及其转分化研究》文中提出山羊多能性干细胞包括：山羊胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell, ESCs）,山羊胚胎生殖细胞（Embryonic Germ Cell, EGCs）和山羊诱导性多能干细胞（Induced Pluripotent Stem cells, iPSc）。由于对山羊体外的培养体系和表观调控因素仍然不清楚,导致山羊ESCs和EGCs的研究仍没有成功建系的报道。而iPS细胞技术的出现,为家畜多能性细胞研究提供了新的途径和可替代的细胞来源。本实验以关中奶山羊为实验模型,通过从体内受精和发育的囊胚中分离出多能性细胞,尝试筛选适合山羊多能性细胞在体外培养的条件；另外,本实验采用山羊胎儿成纤维细胞（Goat Embryonic Fibroblasts, GEF）为供体细胞,通过逆转录病毒携带的Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc四个转录因子,对山羊体细胞进行诱导重编程,并且将诱导重编程细胞定向转分化为神经样细胞和卵母细胞样细胞。主要获得以下结论：1.山羊多能性细胞培养体系的优化本实验共超排处理了25只关中奶山羊,总共获得胚胎253枚,其中发育到2-16细胞的胚胎39枚、桑椹胚113枚、囊胚94枚和孵化胚7枚。通过超排处理的每只山羊平均获得10.1枚胚胎。实验分别以HDMEM、DMEM/F12和Knockout DMEM为基础培养基,在添加血清（FBS）或血清替代品（KSR）条件下,探索山羊内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）在体外培养的贴壁和增殖情况。另外,本实验还尝试在培养基中添加小分子化合物,如维生素C （Vitamin C, Vc）,丙戊酸（Valproic Acid, VPA）和5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-2’-Deoxycytidine,5-AzadC）等,探索小分子化合物对山羊多能性细胞在体外培养的影响。结果表明,含有15%血清的Knockout DMEM培养基可以促进ICM的贴壁和增殖效率,并且有利于山羊多能性细胞的体外传代。但是,血清中的部分成分同时又促进了多能性细胞的自发分化。在添加小分子化合物的实验中,添加小分子化合物实验组在原代分离培养的过程中与对照组无明显差异,而在传代过程中实验组的细胞细胞生长缓慢,但自发分化现象明显减少。在对山羊多能性细胞进行传代时,采用机械法与酶消化法相结合的传代方法,将山羊多能性细胞在体外培养最高传至18代。2.山羊成纤维细胞诱导重编程本实验使用携带转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的逆转录病毒载体系统,对山羊成纤维细胞（GEF）进行诱导,在体外诱导培养17天左右,获得了山羊诱导重编程细胞（giPSc）。实验中获得的重编程细胞具有两种状态,一种克隆形态与人ESCs相似,细胞集落扁平,边缘整齐,细胞的核质比较大,细胞核内含一个或多个核仁；另一种克隆形态与小鼠ESCs相似,细胞团间紧密,呈鸟巢状,集落突起,边缘清晰,核质比大,折光性强。获得的山羊iPS细胞的能在体外进行长期培养,稳定传代,并且碱性磷酸酶（AP）的检测呈阳性。免疫荧光检测实验结果表明,获得的山羊iPS细胞表达多能性因子和干细胞表面多能性标记蛋白Oct4、Sox2、SSEA-1和Tra-1-60,而SSEA-4和Tra-1-81表达呈阴性。山羊iPS细胞在体外可形成类胚体,具有发育分化为三胚层的潜能,但鉴于这些iPS细胞在裸鼠体内不能形成畸胎瘤,我们认为其尚处在不完全重编程阶段。3.山羊重编程细胞的定向转分化本实验在山羊成纤维细胞去分化后,分别向培养基中添加特定的诱导因子视黄酸（Retinoic Acid, RA）或牛卵泡液,作为定向转分化的诱导培养基。对重编程的细胞分别经过7天和18天的诱导,重编程过程中处于不稳定状态的去分化细胞转分化为神经样细胞和卵母细胞样细胞。实验结果表明,在逆转录病毒感染第6天后,成纤维细胞的特异性标记基因表达量逐渐下降,细胞进入去分化状态。分别对获得的神经样细胞和卵母细胞样细胞进行RNA和蛋白水平的检测。结果显示,对神经样细胞进行免疫荧光检测,细胞表达Ⅲ型β-微管蛋白（β-tublin Ⅲ, TUJ1）,部分卵母细胞样细胞特异性基因表达上调。通过转分化获得的卵母细胞样细胞可通过显微操作仪进行固定操作,表明细胞具有卵母细胞的形态和结构。
卢智娟[4]（2010）在《猪羊水干细胞生物学特性检测及其特异性诱导分化研究》文中研究表明羊水来源干细胞（amniotic fluid stem cells,AFScs）是一种存在于胎儿羊水中Oct4阳性的多能性干细胞。该细胞具有增殖能力强、分化潜能高和免疫原性低等优点,在生物学和医学研究领域具有广泛的应用前景。本实验从不同怀孕期长白二元杂交母猪的羊水标本中分离猪羊水干细胞,探讨了猪胎龄对细胞贴壁率和细胞活性的影响,并筛选优化了猪AFS细胞的培养体系。同时,通过RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光及体内外诱导分化等技术对猪AFS细胞进行生物学特性检测,并在体外特异性诱导猪AFS细胞向心肌细胞分化。上述研究为大动物羊水干细胞的基础研究和临床应用提供了可借鉴的材料。一、猪AFS细胞培养方法的建立收集长白二元杂交怀孕母猪的羊水标本,离心收集细胞,加入猪AFS细胞培养液培养。对血清浓度及基础培养液进行筛选,以期获得最佳的培养体系,并且探讨了胎龄对细胞贴壁率和细胞活性的影响。结果表明:基础培养液α-MEM+10%胎牛血清为猪AFS细胞的最佳培养体系;胎龄对细胞贴壁率和细胞活性均有明显影响,综合分析,从胎龄为40-70d的猪胎儿羊水中分离出的羊水干细胞贴壁率高,增殖能力强且细胞活性好。二、猪AFS细胞的生物学特性研究对分离培养的猪AFS细胞进行生长曲线和细胞周期检测,并通过RT-PCR、免疫荧光、流式细胞仪等技术对其生物学特性进行研究。结果表明:猪羊水干细胞在体外培养过程中,3天后达到对数增长期,6天后细胞增殖达到顶峰,表现出了极强的增殖能力;流式细胞周期检测显示处于G1期和S期的细胞比例较高,且在体外多次传代后仍保持正常的二倍体核型;猪AFS细胞表达胚胎干细胞标志基因Oct4、Nanog、SSEA-4、Tra-60、Tra-81、CD117和主要组织相容性抗原HLA-ABC,不表达SSEA-1,表达间充质特异标志基因CD44、CD90、CD166,不表达造血干细胞标志基因CD45、CD34。三、猪AFS细胞体内外诱导分化研究在体外将猪AFS细胞形成类胚体,并通过AP染色和RT-PCR对形成的类胚体进行检测;特异性诱导猪AFS细胞向脂肪细胞、神经细胞、精原细胞和心肌细胞分化,以检测其体外分化潜能;通过裸鼠注射实验检测猪AFS细胞的体内分化潜能;结果表明:猪AFS细胞在体外能形成类胚体,AP染色阳性,且表达三胚层特异标志基因;在体外猪AFS细胞可诱导为脂肪细胞、神经细胞、精原细胞和心肌细胞,经检测有目的细胞基因的表达;将猪AFS细胞注射到裸鼠皮下6-8周后,注射部位未发现肿瘤结节的形成,说明猪AFS细胞在体内无致瘤性。
马海明,柳小春,何俊,贺长青,黄生强,蒋隽[5]（2010）在《利用杂种细胞克隆板将猪CDC16基因定位于11号染色体》文中研究表明运用比较基因组学的方法,根据人的CDC16基因序列设计引物,从大围子猪和宁乡猪基因组DNA分离了CDC16基因内含子4和内含子8（GenBank收录号为AY880670和DQ206823）,通过扩增体细胞杂种克隆板上27个样品和辐射杂种克隆板上118个样品,确定了CDC16基因在猪染色体上的物理位置,首次将CDC16基因物理定位于猪SSC11 q11-17。该基因与微卫星SW1452标记紧密连锁,LOD值为16.08,存留率为22%,在放射杂交图谱上的图距为62 cR。CDC16基因区间定位结果与精细定位结果相一致,也与比较定位结果相一致,进一步验证了猪11号染色体和人13号染色体大部分片段存在同源性,这为该基因的克隆及和功能研究打下坚实基础。
王从彦[6]（2008）在《SRAP分子标记分析西瓜杂交种种子纯度》文中提出本试验通过3个西瓜杂交组合对64个引物对进行多态性引物对筛选,用相关序列扩增多态性（SRAP）标记对5份西瓜杂交种进行种子纯度鉴定分析,并且对SRAP鉴定方法的相关技术进行了优化。本试验研究结果如下:（1）优化了适用于西瓜DNA分析的SRAP技术体系1)优化了适用于西瓜SRAP分析的DNA提取方法。通过对不同DNA提取方法对比,结果表明:以西瓜真叶为材料且当EDTA浓度为20 mmol·L-1时,CTAB法提取效果较优。2)优化了适合于西瓜的SRAP-PCR优化反应体系和程序。本试验以西瓜基因组DNA为模板,通过从Mg2+、dNTPs、primer、DNA与Taq polymerase 5因素7水平进行梯度试验,对西瓜SRAP反应体系进行优化,建立了适合于西瓜的SRAP-PCR优化反应体系,该体系总体积为15μL:Mg2+2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.2 mmol·L-1,primer 60 ng,DNA 80 ng,Taq polymerase0.5 U。SRAP-PCR优化反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。结果表明该体系和程序可满足西瓜基因组SRAP扩增的需求。3)优化了PCR扩增产物检测技术。梯度试验结果表明:基于节约试剂成本、节约试验时间及增强染色效果等原则,固定时间为15 min、染色液浓度为0.133%、显色液浓度为1.2%时谱带显示效果较好。胶板显色后再进行固影处理,不易发生枯缩和脱落现象,利于保存及以后的研究分析。（2）多态性引物对筛选首先选用3个引物对对亲本进行纯度鉴定,结果表明亲本种子纯度很高。然后利用优化后的SRAP-PCR扩增反应,用西瓜品种HR-F、HR-M、HR-H-1、DF-12-F、DF-12-M、DF-12-H、my-1-F、my-1-M及my-1-H 3个西瓜杂交组合对64个引物对进行筛选。结果表现出多态性的引物对共32个,每个引物对产生谱带37～129条,共计2 184条,平均为68.25条。其中每个引物对产生多态性谱带1～14条,共计132条,平均为4.13条。每个引物对的多态性比率在1.37～18.18%之间,平均为6.04%。（3） SRAP标记可应用于西瓜杂交种种子纯度鉴定本试验用优化后的SRAP-PCR扩增反应,对5份西瓜杂交种进行SRAP种子纯度鉴定。5份西瓜杂交种种子纯度分别为94.92%、98.18%、94.92%、94.92%和94.64%,与田间种植鉴定结果相似率分别为95.87%、99.17%、97.85%、97.85%和98.59%。由于SRAP纯度鉴定结果低于田间种植鉴定结果,表明SRAP标记的检杂能力优于田间种植鉴定;同时,SRAP纯度鉴定结果与田间种植鉴定结果有较好的相似率和相关性,所以,可用SRAP标记鉴定替代田间种植鉴定。从而克服田间种植鉴定周期长、易受环境条件影响等缺点。
马海明,柳小春,施启顺[7]（2008）在《用杂种克隆板将猪GAS6基因物理定位于SSC11》文中研究表明【目的】确定GAS6（growt harrested-special 6）基因在染色体的物理位置,为该基因的克隆及功能研究打下基础。【方法】运用比较基因学的方法,根据人的该基因序列设计引物,从大围子猪基因组分离猪该基因的内含子9的片段,通过扩增体细胞杂种克隆板上27个样品和辐射克隆板上118个样品。【结果】分离了猪该基因包括内含子9的片段（GenBank收录号为AY880668）,首次将GAS6基因物理定位于猪SSC11q11-17,与微卫星SW1452标记紧密连锁,LOD值为16.88,存留率为22%,在放射杂交图谱上的图距为56cR。【结论】GAS6基因区间定位结果与精细定位结果相一致,也与比较定位结果相一致,并进一步验证了猪11号染色体（SSC11）和人大部分13号染色体（HSA13）存在同源性。
马海明,柳小春,施启顺[8]（2006）在《猪EFNB2基因的分离与鉴定》文中指出根据人与小鼠的EFNB2基因DNA序列,采用PCR方法从湖南宁乡猪中成功分离出了该基因2个片段,将该DNA序列与GenBank的数据库进行序列同源性比较,鉴定为猪的EFNB2基因3′-UTR和内含子3,长度分别为390 bp和732 bp,GenBank收录号分别为AY880671和DQ206822.
马海明,柳小春,施启顺[9]（2006）在《猪EFNB2基因的分离与鉴定》文中指出人EFNB2基因DNA全长45240 bp,包括5个外显子,4个内含子,5’-UTR长为3290 bp,3’-UTR 25bp。EFNB2基因对于动物神经、血管形成及正常生长发育等都有重要作用。本文根据人与小鼠的EFNB2基因DNA序列,首次通过PCR方法从宁乡猪中成功分离出了该基因2个片段,将该DNA序列与GenBank的数据库进行序列同源性比较,鉴定为猪的EFNB2基因3’-UTR 和内含子3,长度分别为390 bp和732 bp,GenBank收录号分别为AY880671和DQ206822。
李明堂[10]（2006）在《猪白血病抑制因子（LIF）的分子生物学研究 ——猪LIF的cDNA克隆，原核、真核表达，特性，免疫定位》文中进行了进一步梳理LIF（白血病抑制因子）是一种多功能的细胞因子,属于白介素-6（IL-6）家族中成员,与IL-11﹑OSM（onconstatin-M）﹑CNTF（ciliary neurotrophic factor）和CT-1（cardiotrophin）共享gp130受体亚基。LIF的天然形式是38-67kDa的糖基化蛋白,在哺乳动物的成年个体和胚胎中广泛表达。体内外研究表明, LIF具有多种生物功能,包括诱导骨髓白细胞分化,促进原始生殖细胞的增殖,维持胚胎干细胞的多潜能性,促进子宫内膜蜕膜化及胚泡着床﹑海马-垂体-肾上腺素轴的活化及垂体发育等。LIF在体外能够抑制小鼠胚胎干细胞的分化,维持干细胞处于多潜能状态。这种能力导致一种新的生物技术——基因打靶的诞生,从而使得人们在胚胎干细胞水平上进行基因的改造和敲出成为可能,并且通过胚胎操作可获得能稳定遗传的突变小鼠个体,从而能够在动物体内进行基因功能的研究。然而这种操作除了小鼠之外,其他动物至今没有获得将新的遗传性状转进生殖系的嵌合个体。究其原因有多种,其中之一可能是采用小鼠LIF和鼠源的滋养层细胞来培养胚胎干细胞。尽管LIF蛋白及其基因在哺乳动物之间是高度保守的,其对不同种系胚胎干细胞的作用仍可能存在差别。猪的许多器官在形态和生理方面与人相似,因此是研究人体生理和人类疾病比较理想的模式动物。然而,稳定的多潜能猪胚胎干细胞系至今没有培养成功。没有使用猪LIF可能是其中的原因之一。因此我们推测猪LIF在培养猪ES或EG细胞方面可能比其它物种的LIF更有效,值得探索应用重组猪LIF协助培养稳定的多潜能猪胚胎干细胞。但是,编码猪LIF的cDNA基因序列还没有克隆。本文的研究目的是克隆和表达猪LIFcDNA基因,获得有活性的重组猪LIF蛋白,为进一步培养猪胚胎干细胞做好准备。在本研究中,我们采用分子生物学技术和基因工程技术克隆了猪LIF的cDNA序列,并进行了原核﹑真核表达以及功能研究。首先,采用异硫氰酸胍法从仔猪脾脏中提取总RNA,然后提取mRNA并进行RT-PCR扩增,得到606bp编码全长猪LIF蛋白（202个氨基酸）和567bp编码成熟猪LIF蛋白（189个氨基酸）的cDNA序列。通过序列比对,猪全长LIF蛋白与人LIF有86%的同源性,而与小鼠LIF有84%的同源性,三者之间6个N-连接糖基化位点和6个能形成二硫键的半胱氨酸完全保守。获得的606bp全长猪LIF编码序列（pLIF）亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1-myc-HisA,使表达的pLIF蛋白C-末端带有c-myc和6 His标签,可用c-myc或6 His标签抗体对重组蛋白进行检测;将567bp的成熟猪LIF编码序列（pmLIF）克隆进原核表达载体pET31b中,构建了表达质粒pcDNA3.1-pLIF-MycHis和pET31b-pmLIF。同时以pcDNA3.1-pLIF-MycHis为模板扩增出带c-myc和His6编码序列的基因片断,构建出另外一个原核表达质粒pET31b-pmLIF-MycHis。将质粒pET31b-pmLIF和pET31b-pmLIF-MycHis转化进宿主菌
二、应用CATS法分离和鉴定猪GFAP基因的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用CATS法分离和鉴定猪GFAP基因的研究（论文提纲范文）
（1）猪诱导型多能干细胞多能性维持的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物多能性干细胞研究概况 |
| 1.2 诱导多能性干细胞技术的研究进展 |
| 1.2.1 核移植技术 |
| 1.2.2 诱导多能性干细胞技术 |
| 1.3 小鼠诱导型多能干细胞 |
| 1.4 人诱导型多能干细胞 |
| 1.5 猪诱导型多能干细胞 |
| 1.6 不同实验室诱导的猪多能干细胞比较 |
| 1.7 猪诱导型多能干细胞存在的问题 |
| 1.8 本研究在猪遗传育种中的重要意义 |
| 1.8.1 猪ESC建立 |
| 1.8.2 转基因猪生产 |
| 1.8.3 猪遗传资源保存与利用 |
| 第二章 两种来源piPSCs产生效率和体外增殖能力的影响因素研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 药品与试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 巴马小型猪耳缘组织成纤维细胞培养 |
| 2.1.5 巴马小型猪骨髓间充质干细胞分离培养 |
| 2.1.6 慢病毒包装和滴度测定 |
| 2.1.7 慢病毒诱导巴马小型猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源多能性干细胞 |
| 2.1.8 巴马小型猪iPSCs鉴定 |
| 2.1.9 不同饲养层对巴马小型猪iPSCs体外增殖能力的影响 |
| 2.1.10 传代方式对巴马小型猪iPSCs增殖能力的影响 |
| 2.1.11 ROCK抑制剂对巴马小型猪iPSCs冻存复苏率的影响 |
| 2.1.12 细胞周期蛋白对巴马小型猪iPSCs增殖的影响 |
| 2.1.13 克隆形成率计算 |
| 2.1.14 克隆倍增时间的计算 |
| 2.1.15 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 巴马小型猪耳缘组织成纤维细胞和骨髓间充质干细胞分离培养 |
| 2.2.2 多能性基因比对分析及其慢病毒载体鉴定 |
| 2.2.3 慢病毒的包装及滴度测定 |
| 2.2.4 慢病毒感染复数的确定 |
| 2.2.5 慢病毒诱导巴马小型猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源多能性干细胞 |
| 2.2.6 猪成纤维细胞和骨髓间充质干细胞诱导多能干细胞的形态学观察 |
| 2.2.7 碱性磷酸酶活性检测 |
| 2.2.8 干细胞表面标记的免疫荧光检测 |
| 2.2.9 干细胞内外源基因的表达分析 |
| 2.2.10 核型分析 |
| 2.2.11 类胚体形成实验 |
| 2.2.12 巴马小型猪iPSCs体外分化能力检测 |
| 2.2.13 巴马小型猪iPSCs畸胎瘤形成实验 |
| 2.2.14 不同饲养层对猪诱导型多能干细胞体外增殖能力的影响 |
| 2.2.15 传代方式对猪诱导型多能性干细胞增殖能力的影响 |
| 2.2.16 ROCK抑制剂对猪诱导型多能性干细胞复苏率的影响 |
| 2.2.17 细胞周期蛋白对猪诱导型多能性干细胞增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 两种状态piPSCs的生物学特性和分子调控机制研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 试剂的配制 |
| 3.1.4 主要仪器及耗材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 piPB4-6细胞的培养 |
| 3.2.2 小鼠ES细胞样猪iPS细胞的获得及培养 |
| 3.2.3 单位面积克隆数的统计 |
| 3.2.4 细胞活性分析 |
| 3.2.5 单克隆形成率 |
| 3.2.6 piPB4-6_m细胞的鉴定分析 |
| 3.2.7 X染色体状态的检测 |
| 3.2.8 piPB4-6_h和piPB4-6_m细胞信号通路相关基因表达模式 |
| 3.2.9 piPB4-6_h和piPB4-6_m的DLK-DIO3印记区间检测 |
| 3.2.10 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 小鼠ES细胞样猪iPSCs的培养 |
| 3.3.2 单位面积克隆数的统计 |
| 3.3.3 细胞活性分析 |
| 3.3.4 单细胞克隆形成率 |
| 3.3.5 piPB4-6_m细胞的鉴定分析 |
| 3.3.7 piPB4-6_m和piPB4-6_h X染色体状态的检测 |
| 3.3.8 piPB4-6_m和piPB4-6_h细胞信号通路相关基因表达模式 |
| 3.3.9 piPB4-6_m和piPB4-6_h的DLK-D103印记区间检测 |
| 3.4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士、博士后期间发表论文 |
| 个人简介 |
（2）黄芩苷对多巴胺神经元的保护作用及机制（论文提纲范文）
| 目录 |
| CONTENTS |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 第一部分 MPTP诱导的帕金森病小鼠模型及其评估体系的建立 |
| 前言 |
| 第一节：MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二节：基于Catwalk分析系统蹄选MPTP模型小鼠的步态和姿势指标 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表附图 |
| 第二部分 黄芩苷对多巴胺能神经元的保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表附图 |
| 第三部分 黄芩苷对多巴胺能神经元的保护作用的蛋白组学研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表附图 |
| 第四部分 黄芩苷多巴胺能神经保护作用中蛋白质组生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及出版的着作 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Appendix 1 |
| Appendix 2 |
（3）山羊体细胞重编程及其转分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 动物多能干细胞的研究 |
| 1.1 动物胚胎干细胞研究 |
| 1.1.1 小鼠胚胎干细胞的研究 |
| 1.1.2 人类胚胎干细胞的研究 |
| 1.1.3 家畜胚胎干细胞的研究 |
| 1.2 诱导多能性干细胞的研究 |
| 1.2.1 多能性转录调控因子 |
| 1.2.2 受体细胞的选择 |
| 1.2.3 诱导细胞重编程的方法 |
| 1.2.4 多能性细胞的鉴定 |
| 1.3 多能干细胞应用前景 |
| 1.3.1 再生医学与药物筛选 |
| 1.3.2 发育与基因表观遗传调控 |
| 1.3.3 动物转基因克隆与育种 |
| 第二章 体细胞的转分化研究 |
| 2.1 转分化的研究进展 |
| 2.2 转分化的分类 |
| 2.2.1 成体干细胞转分化 |
| 2.2.2 体细胞转分化 |
| 2.3 体细胞转分化的应用前景 |
| 试验研究 |
| 第三章 山羊多能干细胞培养条件的筛选与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 山羊体内胚胎的获取 |
| 3.2.2 山羊多能干细胞的分离 |
| 3.2.3 培养条件对山羊ICM贴壁和多能性细胞培养的影响 |
| 3.2.4 培养基对山羊多能性细胞分离的影响 |
| 3.2.5 小分子化合物对山羊多能性细胞分离和培养的影响 |
| 3.2.6 传代方法对山羊多能性细胞培养的影响 |
| 3.2.7 山羊多能性细胞的鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 诱导山羊体细胞重编程及其鉴定 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 山羊体细胞的分离与培养 |
| 4.2.2 山羊成纤维细胞(GEF)生长曲线 |
| 4.2.3 山羊GEF细胞的诱导重编程 |
| 4.2.4 逆转录病毒感染效率的测定 |
| 4.2.5 对山羊诱导多能性细胞进行鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 山羊体细胞定向转分化研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 对重编程不同时间成纤维细胞特异基因表达的检测 |
| 5.2.2 体细胞转分化为神经样细胞 |
| 5.2.3 对转分化的神经样细胞进行免疫荧光检测 |
| 5.2.4 体细胞转分化为卵母细胞样细胞 |
| 5.2.5 对转分化的卵母细胞样细胞进行核染色 |
| 5.2.6 对获得的卵母细胞样细胞进行显微操作 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点与进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）猪羊水干细胞生物学特性检测及其特异性诱导分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一章 羊水干细胞的研究进展 |
| 1.1 羊水干细胞的概念 |
| 1.2 AFS 细胞的来源及细胞的种类 |
| 1.2.1 上皮样细胞(E-type cells, E 细胞) |
| 1.2.2 羊水细胞(AF-type cells, AF 细胞) |
| 1.2.3 成纤维样细胞(F-type cells, F 细胞) |
| 1.3 AFS 细胞的分离培养和纯化方法 |
| 1.3.1 AFS 细胞的分离培养 |
| 1.3.2 AFS 细胞的纯化方法 |
| 1.4 AFS 细胞的生物学特性 |
| 1.4.1 AFS 细胞的形态及增殖特性 |
| 1.4.2 AFS 细胞的表面标志及干细胞基因 |
| 1.5 AFS 细胞的体外诱导分化（见第二章） |
| 1.6 AFS 细胞的体内诱导分化 |
| 1.7 AFS 细胞的应用前景 |
| 1.7.1 组织工程 |
| 1.7.2 细胞治疗 |
| 1.7.3 基因治疗 |
| 1.7.4 药物筛选及发育模型的建立 |
| 1.7.5 生产克隆和转基因动物 |
| 1.8 AFS 细胞研究存在的问题 |
| 1.8.1 建立高效快速大规模扩增体系 |
| 1.8.2 AFS 细胞向特定功能细胞分化的问题 |
| 1.8.3 AFS 细胞的筛选纯化问题 |
| 1.8.4 AFS 细胞移植治疗的免疫排斥问题 |
| 1.9 小结 |
| 第二章 羊水干细胞的体外诱导分化研究 |
| 2.1 AFS 细胞体外诱导分化的基本原理 |
| 2.2 AFS 细胞体外诱导分化的方法 |
| 2.2.1 化学试剂诱导法 |
| 2.2.2 细胞因子诱导法 |
| 2.2.3 外源基因导入法 |
| 2.2.4 条件培养液诱导或与目的细胞共培养 |
| 2.3 AFS 细胞体外诱导的细胞类型 |
| 2.3.1 肌细胞 |
| 2.3.2 脂肪细胞 |
| 2.3.3 神经细胞 |
| 2.3.4 成骨细胞 |
| 2.3.5 肝细胞 |
| 2.3.6 肾脏细胞 |
| 2.3.7 内皮细胞 |
| 2.3.8 诱导多能干细胞（ips） |
| 2.4 AFS 细胞诱导分化展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪AFS 细胞的分离培养 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pAFS 细胞的形态 |
| 3.2.2 培养基筛选结果 |
| 3.2.3 胎龄对细胞贴壁率和细胞活性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 猪AFS 细胞的生物学特性检测 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 猪AFS 细胞的增殖动力学 |
| 4.2.2 细胞周期分析结果 |
| 4.2.3 RT-PCR 检测结果 |
| 4.2.4 流式细胞学检测结果 |
| 4.2.5 Oct4 和Nanog 启动子检测结果 |
| 4.2.6 免疫荧光结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 猪AFS 细胞的分化潜能研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验标本 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要设备和器材 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 猪AFS 细胞体外诱导分化 |
| 5.2.2 猪AFS 细胞体内诱导分化 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 体外诱导分化结果 |
| 5.3.2 体内诱导分化结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点及进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）SRAP分子标记分析西瓜杂交种种子纯度（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 遗传标记的定义及其类型 |
| 1.1.1 形态标记 |
| 1.1.2 细胞学标记 |
| 1.1.3 生化标记 |
| 1.1.4 分子标记 |
| 1.2 SRAP标记的基本原理及研究现状 |
| 1.2.1 SRAP标记的基本原理 |
| 1.2.2 SRAP标记的研究现状 |
| 1.3 分子标记在西瓜上的应用 |
| 1.3.1 种质资源遗传多态性与亲缘关系 |
| 1.3.2 目标性状的连锁分子标记与分子标记辅助育种 |
| 1.3.3 遗传图谱构建 |
| 1.3.4 品种及杂交种纯度鉴定 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 供试材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 室内SRAP鉴定 |
| 3.2.1.1 西瓜DNA提取 |
| 3.2.1.2 西瓜DNA提取质量检测 |
| 3.2.1.3 SRAP-PCR扩增反应程序和体系优化 |
| 3.2.1.4 PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.2.1.5 扩增产物检测技术优化 |
| 3.2.1.6 引物设计及多态性引物筛选 |
| 3.2.1.7 SRAP-PCR扩增图谱数据分析 |
| 3.2.2 田间种植鉴定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 西瓜DNA提取 |
| 4.2 西瓜SRAP反应程序和体系的建立 |
| 4.2.1 西瓜SRAP反应程序优化 |
| 4.2.2 西瓜SRAP反应体系优化 |
| 4.2.2.1 Mg~(2+)浓度确定 |
| 4.2.2.2 dNTPs浓度确定 |
| 4.2.2.3 primer浓度确定 |
| 4.2.2.4 DNA浓度确定 |
| 4.2.2.5 Taq polymerase浓度确定 |
| 4.2.2.6 SRAP-PCR扩增反应体系的确立 |
| 4.3 扩增产物检测技术的优化 |
| 4.3.1 固定时间确定 |
| 4.3.2 染色液浓度确定 |
| 4.3.3 显色液浓度确定 |
| 4.3.4 固影的确定 |
| 4.4 亲本纯度分析 |
| 4.5 多态性引物筛选 |
| 4.6 五份西瓜杂交种种子纯度鉴定 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 5.2.1 SRAP标记鉴定西瓜杂交种种子纯度的的可行性与引物选用 |
| 5.2.2 SRAP扩增谱带的取舍标准 |
| 5.2.3 SRAP标记鉴定西瓜杂交种种子纯度的准确性与真实性的影响因素 |
| 5.2.4 采取样本的大小对纯度鉴定的影响 |
| 5.2.5 室内鉴定与室外鉴定对比 |
| 5.2.6 利用SRAP标记鉴定种子纯度和品种的优缺点 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 附录(一): 英文缩略语表 |
| 附录(二): 药品的配制 |
| 附录(三): 田间种植鉴定图片 |
（7）用杂种克隆板将猪GAS6基因物理定位于SSC11（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR引物设计 |
| 1.2.2 PCR扩增条件 |
| 1.2.3 产物的回收纯化与克隆测序 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 扩增片段的鉴定 |
| 2.2 染色体区间定位分析 |
| 2.3 染色体的精细定位 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（8）猪EFNB2基因的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1 方法 |
| 1.1.1 PCR引物设计 |
| 1.1.2 PCR扩增条件 |
| 1.1.3 产物的回收纯化与克隆测序 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪EFNB2扩增结果 |
| 2.2 猪EFNB2基因3′-UTR序列分析与鉴定 |
| 2.3 猪EFNB2基因内含子3序列分析与鉴定 |
| 3 讨论 |
（10）猪白血病抑制因子（LIF）的分子生物学研究 ——猪LIF的cDNA克隆，原核、真核表达，特性，免疫定位（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引 言 |
| 一、白血病抑制因子(LIF)的基因结构与调控 |
| (一) LIF 的基因及其一级结构 |
| (二) LIF 基因表达 |
| (三) LIF 蛋白的三级结构 |
| 二、 白血病抑制因子受体(LIFR)的基因及调控 |
| (一) LIFR 受体基因及结构 |
| (二) 膜结合形式的 LIFR |
| (三) 可溶形式 LIFR |
| (四) gp130 基因及其产物 |
| (五) LIFR-gp130 受体亚基复合体 |
| 三、LIF 的信号途径 |
| (一) Jak-STAT 途径 |
| (二) 胞质受体结构域 |
| (三) Jak-STAT 信号的负反馈调节因子 |
| (四) 有丝分裂原激活激活蛋白激酶途径 |
| 四、 白血病抑制因子(LIF)的功能 |
| (一) LIF 是造血和神经生发因子 |
| (二) LIF 与生殖及内分泌系统的关系 |
| (三) LIF 对胚胎干细胞的作用 |
| (四) LIF 在炎症中的作用 |
| (五) LIF 对骨代谢的作用 |
| (六) LIF 对能量代谢的作用 |
| (七) LIF 对肿瘤的内分泌应答作用 |
| 五、猪 LIF 及猪胚干细胞(ES 和 EG)的国内外研究进展 |
| 六、本文的选题依据及研究目的和意义 |
| 第一章 材料与方法 |
| 一、 实验材料 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验仪器 |
| (三) 主要试剂 |
| 二、实验方法 |
| (一) 猪脾总 RNA 的提取 |
| (二) 质粒构建 |
| (三) 重组pLIF 蛋白的原核表达 |
| (四) 重组蛋白的纯化和复性 |
| (五) 重组pLIF 蛋白的真核表达 |
| (六) Western Blotting |
| (七) 重组pLIF 蛋白的活性鉴定 |
| (八) 猪 LIF 多克隆抗体的制备 |
| (九) LIF 蛋白在猪体内的免疫定位 |
| 第二章 结果与分析 |
| 一、猪 LIFcDNA 的克隆 |
| (一) 猪脾脏总 RNA 的提取 |
| (二) RT-PCR |
| (三) 表达质粒的构建 |
| (四) 质粒测序 |
| (五) 猪﹑人和小鼠LIF 蛋白氨基酸序列比较 |
| 二、重组猪 LIF 蛋白的表达 |
| (一) 重组猪 LIF 蛋白在大肠杆菌中的表达﹑纯化和复性 |
| (二) 重组猪 LIF 蛋白在 CHO 细胞中的表达 |
| 三、重组猪LIF 蛋白的活性鉴定 |
| 四、LIF 蛋白在猪体内的免疫定位 |
| 第三章 讨论 |
| 一、猪LIFcDNA的克隆 |
| 二、重组猪 LIF 蛋白的表达 |
| 三、重组猪 LIF 蛋白的活性分析 |
| 四、 猪LIF蛋白多克隆抗体的制备与免疫定位 |
| 五、 克隆﹑表达重组猪 LIF 蛋白的意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表的论文 |
四、应用CATS法分离和鉴定猪GFAP基因的研究（论文参考文献）
- [1]猪诱导型多能干细胞多能性维持的机理研究[D]. 胡鹏飞. 中国农业科学院, 2014(01)
- [2]黄芩苷对多巴胺神经元的保护作用及机制[D]. 王小洪. 山东大学, 2013(10)
- [3]山羊体细胞重编程及其转分化研究[D]. 雷蕾. 西北农林科技大学, 2013(01)
- [4]猪羊水干细胞生物学特性检测及其特异性诱导分化研究[D]. 卢智娟. 西北农林科技大学, 2010(11)
- [5]利用杂种细胞克隆板将猪CDC16基因定位于11号染色体[J]. 马海明,柳小春,何俊,贺长青,黄生强,蒋隽. 激光生物学报, 2010(02)
- [6]SRAP分子标记分析西瓜杂交种种子纯度[D]. 王从彦. 河南农业大学, 2008(04)
- [7]用杂种克隆板将猪GAS6基因物理定位于SSC11[J]. 马海明,柳小春,施启顺. 中国农业科学, 2008(03)
- [8]猪EFNB2基因的分离与鉴定[J]. 马海明,柳小春,施启顺. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2006(06)
- [9]猪EFNB2基因的分离与鉴定[A]. 马海明,柳小春,施启顺. 第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集, 2006
- [10]猪白血病抑制因子（LIF）的分子生物学研究 ——猪LIF的cDNA克隆，原核、真核表达，特性，免疫定位[D]. 李明堂. 东北师范大学, 2006(09)