一、鸽子血清非特异性凝集因子消除试验的研究（论文文献综述）
牛金中[1]（2021）在《罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究》文中研究表明鱼类非特异性细胞毒性细胞（NCC）是自然杀伤细胞（NK）进化上的前体细胞,与NK细胞功能相似,除了非特异性的细胞杀伤作用,还具有免疫调节功能,然而NCC类群及其活性调控机理尚不清楚。本文以我国南方重要的淡水养殖品种尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为研究对象开展了三方面的研究:一、通过单细胞测序构建了罗非鱼NCC的单细胞转录图谱,鉴定出4个NCC亚群;二、通过转录组数据筛选到系列差异表达的半乳糖凝集素（Galectin）基因家族,通过酵母双杂交及GST Pull-down技术对该类蛋白与NCC受体蛋白非特异性细胞毒性细胞受体Ⅰ型（NCCRP-1）的相互作用进行了鉴定;三、针对与NCC活性调控相关的Gal-2与Gal-8开展了功能研究。取得的主要研究结果如下:1、通过高通量10x单细胞测序获得硬骨鱼免疫细胞图谱及NCC亚群信息。在对罗非鱼进行Poly I:C免疫刺激24 h后,取对照组和处理组的罗非鱼头肾并分离淋巴白细胞,通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对24,062个淋巴细胞的转录本进行了分析,构建了罗非鱼淋巴细胞图谱。根据细胞异质性和已知标志物,将头肾淋巴细胞分为B细胞、T细胞、NCC和单核/巨噬细胞（Mo/MΦ）四种类型,WGCNA预测NCC群体的调控网络,鉴定出4个中枢基因（STBD1、VWF、PGP和GRN）和1个转录因子（Hvcn1）,并根据细胞异质性和细胞内功能基因的表达,进一步将NCC鉴定出memory-like NCC、mature NCC、immature NCC和pre-NCC4个亚群。2、与NCC互作的Gals蛋白鉴定。（1）从上述单细胞测序数据中筛选差异表达的Gal基因并进行克隆,获得5个Gal基因:Gal-2（OnGal-2）,Gal-3（OnGal-3）,Gal-4（OnGal-4）,Gal-8（OnGal-8）,Gal-9（OnGal-9）,序列特征分析显示基因均无信号肽,均含有至少一个碳水化合物识别域（CRD）以及碳水化合物识别位点（V-N,H-N-R以及W-E-R）,这一结构特征与其他物种的Gal蛋白序列特征一致。（2）分别构建Gal的酵母双杂交诱饵质粒,与NCCRP-1进行互作验证,发现Gal-2可与NCCRP-1相互作用;（3）构建OnGal原核表达载体（GST标签载体）,利用percoll密度梯度方法分离NCC,通过GST Pull-down技术从NCC裂解物中钓取互作蛋白,结果显示r OnGal-2和r OnGal-8筛选鉴定到共同的胞内互作蛋白为基质金属蛋白酶（MMP）;（4）亚细胞定位分析显示MMP与OnGal-2/OnGal-8在细胞内共定位。3、分析了依赖于NCCRP-1受体的OnGal-2的免疫调节功能及其对NCC的活性调控。（1）首先通过qRT-PCR分析OnGal-2的组织分布情况,该基因分布于健康罗非鱼的组织中,其中大脑表达水平最高,其次是脾脏、肝脏、肠道、心脏、胸腺、肌肉、皮肤、头肾和鳃。无乳链球菌刺激后,OnGal-2在胸腺、头肾、脾脏以及单核/巨噬细胞的表达量显着上调,表明OnGal-2参与了罗非鱼抗菌免疫应答。（2）随后制备重组蛋白r OnGal-2（His标签蛋白）对其功能开展系列研究。体外凝集实验发现r OnGal-2对G+（无乳链球菌,海豚链球菌,巴氏葡萄球菌和格氏乳球菌）和G-菌（大肠杆菌、哈维弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌）具有凝集和结合作用,多种糖类（LPS、LTA、Gal、Man以及Mal）能削弱r OnGal-2对细菌的结合,并且r OnGal-2能够促进单核/巨噬细胞对细菌的吞噬作用;r OnGal-2可以增强NCC效应基因（Fas L、NK-lysin、Perforin和Granzyme）表达及杀伤活性。（3）双荧光素酶报告系统检测结果表明OnGal-2能够激活NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路;表明OnGal-2可能通过与MMP的结合参与NCCRP-1介导的NCC活性调控。（4）进一步的体内实验发现r OnGal-2注射至罗非鱼体内后可显着提高血清的抗菌活性（ALKP、ACP、LZM）和抗氧化能力（CAT、POD、SOD）,还能减少无乳链球菌感染后头肾、脾脏和肝脏中的载菌量、减轻组织损伤,且能调控NCC效应基因的相对表达量,从而提高感染后罗非鱼的相对存活率。4、研究了不依赖于NCCRP-1受体的OnGal-8免疫调节作用。（1）q RT-PCR分析显示OnGal-8在所有检查的组织中广泛存在,其中在脾脏中具有最高表达水平。在无乳链球菌刺激后,脾脏、头肾和脑的OnGal-8转录水平显着上调。（2）体外实验结果表明,OnGal-8重组蛋白（r OnGal-8）可以凝集红细胞、无乳链球菌和嗜水气单胞菌,结合无乳链球菌、嗜水气单胞菌和各种PAMP（脂多糖、脂蛋白、Poly I:C、肽聚糖、半乳糖、甘露糖和麦芽糖）。此外,r OnGal-8还能调节单核/巨噬细胞炎症相关基因表达、促进吞噬和呼吸爆发作用以及增强NCC的杀伤作用。（3）双荧光素酶报告基因检测结果表明OnGal-8过表达抑制NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路活性,表明OnGal-8可以通过与MMP的互作参与对NCC的调控;（4）体内实验结果显示,OnGal-8过表达可通过调节血清抗菌活性（AKP、ACP和LZM）和抗氧化能力（CAT、POD和SOD）、降低感染组织中细菌的载量、减轻组织损伤以及增强NCC效应基因（CAS、FADD、Perforin1、Granzym和Fas L）表达来提高无乳链球菌感染后罗非鱼的存活率。
武奇[2]（2021）在《IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究》文中认为传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要表现为呼吸道与肾脏疾病。IBV目前仍是危害养禽业的重要病原体之一,给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在控制IB方面扮演着重要作用,IBV抗原的不断变异严重制约了现有的疫苗研发策略和血清学诊断。S蛋白是含有丰富中和抗原表位的表面蛋白,也是病毒进入宿主细胞的关键蛋白。但是目前对于S蛋白功能的认识及其与宿主细胞的互作还知之甚少。因此,本研究围绕IBV防控关键技术的开发,从S蛋白广谱中和表位鉴定及S蛋白与宿主细胞互作两个方面进行了研究。具体内容如下:1、传染性支气管炎病毒S蛋白新的关键抗原表位鉴定本研究首先利用软件对IBV S蛋白进行分析,根据S蛋白序列的抗原性、亲水性、表面抗原指数、保守性等指标,选取并人工合成五条抗原性和亲水性好、高度保守的多肽。通过多肽和血清交叉反应,证明五条多肽均与IBV血清有反应原性,其中Pep1的反应性最好,可以与检测的5个血清型中的4个血清型血清有很好的交叉反应性,仅仅不与New cluster型毒株CK/CH/2010/JT1的血清发生交叉反应。人工合成CK/CH/2010/JT1株的该段多肽序列,命名Pep6。通过对多肽序列比较分析,发现Pep1与Pep6序列存在5个氨基酸差异。多肽血清交叉反应结果显示Pep6不仅可以与CK/CH/2010/JT1血清反应,同时与所有检测血清均发生交叉反应。为了确定影响抗原性改变的关键氨基酸,对多肽进行截短和单个氨基酸突变,最后确定16R氨基酸是决定抗原表位广谱性的关键氨基酸。对NCBI数据库中所有的全基因毒株进行序列分析,发现传统的Mass型毒株均是16K毒株,而目前在中国流行的QX型,TW-1型等毒株均是16R突变株,进一步分析发现,16R突变株自20世纪90年代开始出现,随后发展成为流行优势株,目前在全球各大洲均有分布。本研究鉴定了一个广谱的抗原表位,并证明了 16R氨基酸是该抗原表位具有广谱性的关键。这为新型广谱疫苗的研发和检测方法的建立提供了一定理论指导。2、检测IBV抗体多肽ELISA方法的建立及初步应用本实验室在前期的IBV流行病学调查过程中发现,现有的商品化IBV抗体检测试剂盒,不能很好的检测出新型IBV变异株的血清抗体。利用Pep6抗原表位多肽作为包被抗原,建立检测IBV抗体的pELISA方法。本研究首先对检测条件进行优化,确定pELISA最佳反应条件为:最佳包被浓度0.63 μg/mL;血清最佳稀释度为1:200;血清最佳孵育时间为60 min;酶标抗体最佳孵育时间60 min;底物最佳反应时间20 min。确定pELISA的临界值为0.185。批间和批内重复性检测结果显示变异系数均小于10%,具有很好的重复性。特异性检测结果表明pELISA其他禽类病毒阳性血清均不发生非特异性反应。以IFA为参考方法,测定了 250份临床血清样品,结果显示,pELISA的敏感性、特异性和准确性分别为99.14%、94.12%和98.80%,显着高于商品化试剂盒。为评估pELISA在检测IBV疫苗引起的免疫应答中的适用性,本研究测定了 IBVH52、4/91疫苗免疫后不同时间点采集的血清,结果显示pELISA最早在疫苗接种后7 d就能检测出IBV特异性抗体,而商品化试剂盒在免疫后14 d才能检测出IBV特异性抗体。进一步分析发现,pELISA检测出的阳性率明显高于商品化的ELISA试剂盒,提示本研究建立的pELISA在检测IBV抗体和评价IBV疫苗方面具有一定的应用价值。3、应用pELISA替代中和实验评估IBV疫苗免疫应答的初步研究鸡群中血清的中和抗体是反映鸡群免疫状况的主要指标,也是评价疫苗免疫效果的关键指标之一。传统上用中和试验测定血清中和抗体,但中和实验操作复杂,技术程度较高,制约了疫苗应用后的效率评价。然而,目前还没有简单、快速的检测IBV中和抗体的替代方法。为此,探究了 pELISA作为一种潜在替代中和实验评价IBV疫苗的免疫应答的可能。首先制备Pep6的多抗血清,ELISA结果显示,多肽血清与多肽能发生特异性反应。病毒与血清的交叉中和实验结果显示Pep6的多抗血清能够中和IBV病毒,中和效价为1:8,表明Pep6含中和抗原表位。随后,应用pELISA与中和实验比较检测IBV 阳性血清,结果显示血清中和效价与pELISA效价具有很好的正相关性。进一步比较检测了 M41、H52、CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 毒株免疫/攻毒后不同时间点采集的血清,结果显示免疫/攻毒后血清的中和效价和ELISA效价均随免疫时间逐渐升高。各毒株血清的中和效价与pELISA效价的具有明显的正相关性,总相关系数达到0.83。该方法的建立为临床基层IBV疫苗免疫效果评价提供了技术条件。4、IBV S1蛋白与宿主细胞膜蛋白互作的研究IBV S蛋白在病毒感染复制过程起关键作用,通常S1与识别宿主受体并结合细胞相关,而S2促进病毒囊膜与细胞膜融合。尽管IBV是最早发现的冠状病毒,目前对IBV S1与宿主细胞互作的认识仍非常有限,还没有鉴定出IBV的蛋白受体,同时对于IBV入胞机制仍知之甚少。为此本研究构建了正确表达S1-IgGFc融合蛋白的真核质粒pCAGGS-S1-IgGFc,利用Protein G纯化柱纯化了 S1-IgGFc融合蛋白,然后应用细胞膜提取试剂盒提取CEK细胞的膜蛋白,将纯化的融合蛋白与CEK细胞膜蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）,SDS-PAGE银染结果显示,与对照相比发现了 3条差异条带。将差异条带送质谱测序,共鉴定出GRP78、ANXA2、HSPA9、Vimentin等4种宿主蛋白与IBV S1蛋白互作,提示这些蛋白可能在病毒感染细胞发挥某种作用,为进一步探究IBV与宿主细胞膜蛋白的互作机制研究提供一定的材料和理论基础。5、GRP78蛋白促进IBV在CEK细胞中的复制GRP78蛋白又称HSPA5蛋白,是热休克蛋白家族的成员之一。传统上认为GRP78是一种ER伴侣蛋白,目前GRP78蛋白因在多种病毒的感染过程中发挥重要作用而被人们所熟知。在上一部分研究的基础上,通过Co-IP实验,进一步确定了 IBV S1蛋白与GRP78蛋白确实存在相互作用。本研究用抗GRP78多克隆抗体封闭CEK细胞,抑制GRP78蛋白的表达,结果发现抗GRP78多克隆能够有效抑制IBV M41在CEK细胞中的复制。进一步用siRNA干扰实验证明,当CEK细胞表面的GRP78的表达被抑制时,IBVM41的感染也被显着抑制。非易感细胞重建实验结果提示,不同浓度的GRP78真核质粒（0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg）转染CEF细胞,随着转染质粒浓度不断升高,IBVM41感染CEF细胞的感染能力逐渐增强,成明显的正相关。综上所述,GRP78蛋白在IBV感染CEK细胞过程中扮演了重要角色,该GPR78可能促进IBV进入宿主细胞。
李金芝[3]（2021）在《鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定、核酸定性标准样品的制备及抗体间接ELISA方法的建立与初步应用》文中进行了进一步梳理鸡传染性贫血病病毒（Chicken infectious anaemia virus,CIAV）是鸡传染性贫血病的病原体。由于缺乏有效监测技术与防控措施,当前CIAV在世界各地的家禽养殖场普遍存在。CIAV感染可引起雏鸡再生障碍性贫血、免疫抑制和全身淋巴萎缩,继发感染,对全球养禽业造成了巨大的经济损失。为建立有效的CIAV检测技术,本研究在开展CIAV分离鉴定的基础上,制备了CIAV核酸定性标准样品,建立了基于多肽技术的检测CIAV抗体的间接ELISA方法,并对临床样品进行了初步应用。研究结果为分析CIAV流行变异和传播趋势提供了依据,为CIAV病毒核酸检测提供了定性标准样品以及为临床监测CIAV感染与免疫提供了自主产权的间接ELISA检测技术。1.鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定以及JSP1906株的序列分析本研究对江苏地区养殖场内送检的疑似鸡传染性贫血病病毒（CIAV）感染的6份病料,通过接种MDCC-MSB1细胞传代以及PCR检测进行了病原分离与鉴定。PCR结果表明6份病料以及由MDCC-MSB1细胞扩增传代样品均能扩增出CIAV特异性条带。对其中送检鸽子组织样品中分离到的CIAV病毒CIAV-JSP1906全基因测序发现,CIAV-JSP1906基因组大小为2298 bp。将其与GenBank上26株国内外不同地区的CIAV毒株进行对比发现,CIAV-JSP1906与吉林株（JL14023）的同源性最高,与巴西株（KY02457）和日本株（TR20）的同源性最低。与其他毒株比较,虽然CIAV-JSP1906的VP2和VP3蛋白高度保守,但是其VP1第394位点为谷氨酰胺（Q）,表明CIAV-JSP1906具有高致病性。进一步分析发现CIAV-JSP1906在非编码区150 bp～245 bp之间有4个21 bp的DR序列和12 bp的插入,具有典型的CIAV基因型。CIAV-JSP1906的成功分离鉴定与全基因测序为深入研究CIAV跨物种传播的分子流行情况提供了参考。2.鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备为获得可用的CIAV核酸定性标准样品,本研究将2019年10月20日从江苏省泰州兴化市送检病料中分离到的一株鸡传染性贫血病病毒CIAV-TZC1910,进行病毒纯粹性鉴定,然后在MDCC-MSB1细胞上大量扩增,CIAV-TZC1910全基因大小为2298 bp。根据《鸡传染性贫血诊断技术》（NY/T 1187-2019）行业标准的推荐,本研究采用实时荧光定量PCR方法,以pcDNA3.1-VP1真核质粒为标准曲线检测CIAV病毒DNA拷贝数,确定CIAV最佳稀释度和最佳灭活条件。最后对灭活后的病毒悬液进行分装保存,进行无支原体和无菌检验后,同时对CIAV核酸定性标准样品TZC1910进行均一性、稳定性以及保存时间等的标定,结果表明所制备的CIAV核酸定性标准样品TZC1910符合标准。CIAV核酸定性标准样品的获得,解决了该病在检测中缺乏核酸定性标准样品的实际问题,规范了CIAV核酸检测技术。3.鸡传染性贫血病抗体间接ELISA方法的建立与初步应用本研究通过软件分析CIAV经典毒株序列CUX-1,选择CIAV-VP1序列中高度保护的抗原性和亲水性较高的3段多肽序列作为包被抗原,同时在制备CIAV阳性鸡血清的基础上,建立了检测CIAV抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件优化确定了ELISA最佳反应条件及检测临界值,并开展了特异性、重复性测定以及与IDEXX的ELISA试剂盒对临床样品进行了比较检测。特异性试验表明该ELISA方法不与所检测的REV、AIV-H5/H9、ILTV、IBV、NDV以及ALV-A/J/K等多抗血清反应,仅与所检测的CIAV阳性多抗血清反应。重复性试验表明该ELISA方法批内重复变异系数以及批间重复变异系数CV值均小于10%。对临床CIAV免疫鸡群样品进行比对,检测结果发现该ELISA方法和IDEXX试剂盒的阳性检出率分别为94%和80.4%,该ELISA方法与IDEXX试剂盒的总符合率73.2%。以上基于多肽的检测CIAV抗体的ELISA方法的建立为CIAV免疫鸡群及感染鸡群提供了一种快速简便的监测CIAV抗体的血清学检测方法。
孔维光[4]（2021）在《B细胞和免疫球蛋白在虹鳟咽和眼睛结膜中的功能研究》文中提出鱼类生存环境特殊,水体中病原微生物种类复杂,且含量丰富。鱼类黏膜与水环境直接接触,极易受到各种病原的侵袭,威胁到机体健康。在长期演化过程中,鱼类为了应对外界病原的威胁已经演化出了一套有效的黏膜免疫系统,构成了一道严密的免疫防线。黏膜相关的淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）能够启动复杂而精密的先天性和适应性免疫反应,抵御病原微生物的入侵。咽腔和眼睛作为硬骨鱼类重要的生理器官,它们黏膜表面直接暴露在水环境中,面临大量病原的威胁。从组织学、细胞生物学和分子生物学等方面,我们发现在咽黏膜和眼结膜中存在大量弥散型MALT,并且其黏膜层和黏液中分别存在丰富的B细胞和免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）,但鱼类B细胞和Ig在咽黏膜（pharyngeal mucosa,PM）和眼结膜（ocular conjunctiva,OC）抵抗外来病原体感染过程中的作用和免疫应答机制还有待研究。为了探究鱼类PM中MALT的存在情况,以及局部B细胞和Igs的免疫功能,我们建立了寄生性小瓜虫（Ichthophthirius multifiliis,Ich）感染虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的模型。结果表明,硬骨鱼类的PM不同于哺乳动物,其不存在淋巴结,而是一种弥散型的MALT,但它局部可以产生强大的先天性和适应性免疫应答抵御Ich的感染。此外,我们首次证明相对于Ig M和Ig D,分泌型Ig T（secreted Ig T,s Ig T）在虹鳟PM免疫应答中扮演着主要的角色。重要的是,我们还发现Ig T+B细胞可以在虹鳟PM中发生局部增殖,并分泌特异性Ig T,这为探究早期脊椎动物PM局部免疫应答提供了重要依据。最后,我们发现,硬骨鱼类Ig T可包被PM处大量的微生物,暗示能抑制外来细菌,经Ig T的免疫排斥作用维持表面微生物群落的稳态在哺乳动物中,眼表面存在一种由专门的黏膜免疫系统来支持的黏膜组织,是各种病原体（原生动物、病毒、细菌和真菌）侵袭的主要位点。OC中B细胞和Igs在不同病原入侵时发挥重要的免疫功能。由于鱼类缺少眼睑,眼睛更容易受到水中病原的威胁,为了揭示鱼类OC适应性免疫机制,以及鱼类Ig在维持眼部健康中的免疫功能,我们对鱼类OC的组织结构进行了系统研究,发现鱼类缺乏泪腺,但其仍有眼结膜,其中含有杯状细胞,被认为是眼泪或眼黏液的主要生产车间。此外,我们还构建了Ich和柱状黄杆菌（F.columnare）感染虹鳟的两种模型,进而评估了B细胞和Igs在OC处的免疫功能。结果发现,Ich和F.columnare均可以诱导眼结膜局部产生强烈的先天性和适应性免疫反应。重要的是,我们还发现硬骨鱼类眼黏液中含有丰富的Igs,其中Ig T是鱼类OC在抵御寄生虫和细菌免疫反应过程中的主要参与者。我们还证实了虹鳟OC中的Ig T+B细胞能够局部增殖,并分泌大量针对寄生虫和细菌的特异性Ig T,由p Ig R转运至眼黏液中发挥免疫作用。因此,在脊椎动物长期演化过程中,哺乳动物和硬骨鱼类分化出了不同类型的免疫分子（s Ig A和s Ig T）和淋巴结构（组织型和弥散型）,但却通过类似的策略来维持OC免疫系统的稳态。
储兰璐[5]（2021）在《EM菌对中华绒螯蟹非特异性免疫力和抗脂多糖毒性的研究》文中提出中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国主要的淡水养殖经济动物之一。然而,在集约化人工饲养模式发展的过程中,多次爆发由细菌、病毒、立克次体等引起的多种疾病,导致惨重的经济损失,制约着我国中华绒螯蟹养殖业的良性发展。因此如何在保护和胁迫产业生态健康养殖的基础上防止应激和减轻应激的危害是当前研究的热点。EM菌是一种以乳酸菌、酵母菌、光合细菌、放线菌等通过发酵工艺培养的复合菌剂,能够利用有益微生物之间的协同作用,通过竞争排斥使得有益菌占优势,改善养殖环境,降低中华绒螯蟹的发病率。目前,尽管EM菌在水产养殖中已有较多的应用,但是鲜有关于EM菌对中华绒螯蟹养殖影响效果的报道,而EM菌对中华绒螯蟹免疫力影响的研究仍是空白。因此本研究以中华绒螯蟹为试验对象,在养殖过程中定期使用EM菌,从酶活和基因表达层面评估EM菌对中华绒螯蟹非特异性免疫力的影响,检验“EM菌的使用可以提高中华绒螯蟹的免疫力”的假说,分析EM菌调控中华绒螯蟹免疫力潜在的作用机制,以期为EM菌在中华绒螯蟹生态养殖中的应用提供理论依据。本论文的主要研究内容和结果如下:1.EM菌对中华绒鳌蟹血清生化指标、抗氧化功能及非特异性免疫的影响本实验旨在分析EM菌对中华绒螯蟹各类血细胞数量、血清生化指标、抗氧化系统及免疫能力的影响。研究发现,半颗粒细胞（SGC）是中华绒螯蟹血细胞的主要类群,具有吞噬、包囊病原微生物的作用;EM菌诱导下,中华绒螯蟹SGC细胞略有升高,增强了其细胞免疫防御能力。EM菌能提高特定发育阶段中华绒螯蟹血清中过氧化氢酶（CAT）活力,降低丙二醛（MDA）的含量,增强中华绒螯蟹抵抗氧化应激的能力。EM菌组较低的血清谷丙转氨酶（ALT）的水平,表明较低的器官损伤;同时较高的碱性磷酸酶（ALP）活性意味着免疫解毒能力的提升。综上所述,水体中添加EM菌有助于提高中华绒螯蟹抵抗氧化应激的能力,并能通过改变血细胞的数目和相关酶活性,增强中华绒螯蟹的非特异性免疫力。2.EM菌对中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因表达的影响本研究以中华绒螯蟹为研究对象,在成蟹养殖过程中定期使用EM菌,利用荧光定量PCR技术测定中华绒螯蟹肝胰腺Toll样受体基因及HSP90 m RNA表达量,分析了水体中添加EM菌对中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因表达的影响。结果表明EM菌对中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因表达有一定的影响,EM菌能够诱导上调中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因Toll2、Tube、Dorsal的表达,表明EM菌在一定程度上能提高机体对异物的识别能力,进而实现免疫机能的提高。此外,雄蟹肝胰腺中Toll2、Tube、HSP90的表达量均高于雌蟹,并且雄蟹和雌蟹对于EM菌的敏感度不同,雄蟹对EM菌的添加做出更为积极的响应,这表明EM菌对雄蟹的免疫力的激活作用高于雌蟹。EM菌组雄蟹HSP90的表达量显着上升,与对照组之间差异显着,这与溶菌酶活性和丙二醛含量变化趋势一致,说明HSP90基因表达的变化可能是由于高温导致的氧化应激引起的,HSP90表达的上调进一步促进了中华绒螯蟹体内各种酶活发生变化,调节防御应激损伤的能力,进而实现免疫机能的提高。3.EM菌对中华绒螯蟹抗脂多糖毒性的影响为研究水体中添加EM菌对中华绒螯蟹抗脂多糖毒性的影响,在水体中添加0、1g/L EM菌,用浓度为500μg/kg的脂多糖进行攻毒,于3、6、12、24、48h进行采样,检测中华绒螯蟹肝胰腺的抗氧化酶活、免疫酶活和免疫相关基因的表达。结果表明在注射脂多糖后,EM菌能够提高中华绒螯蟹肝胰腺CAT、GPX活性,一定程度上提高机体抗氧化和清除氧自由基的能力,起到抗脂多糖毒性的作用。EM菌能够提高AKP、ACP活性,对注射的脂多糖具有解毒作用,保护中华绒螯蟹的肝胰腺组织,降低中华绒螯蟹患病的风险。在注射脂多糖后,中华绒螯蟹的免疫系统受到一定程度的损伤,通过上调中华绒螯蟹免疫识别基因、免疫传导基因、免疫效应基因的表达,EM菌的添加对Toll通路和酚氧化酶原系统起到了一定的保护作用,从而在一定程度上保护了中华绒螯蟹的肝胰腺组织。综上,本研究发现EM菌对中华绒螯蟹的先天免疫功能有一定的促进作用,在此过程中,通过提高CAT、GPX等抗氧化酶,ALP、ACP等免疫酶活性,以及上调Toll通路相关基因的表达,提高中华绒螯蟹抗应激抗氧化等非特异性免疫力。因此,本研究建议推广EM菌作为一种有益复合菌剂用于中华绒螯蟹养殖,以促进中华绒螯蟹养殖业的健康绿色发展。
郑谋凤[6]（2021）在《高羊毛氨酸硒对幼犬机体抗氧化功能和免疫应答的影响》文中研究指明高羊毛氨酸硒（Selenohomolanthionine,SeHLan）,是一种新型有机硒,因其适口性好,生物利用度高,环境污染少等特点,目前在家畜、家禽饲养中已推广应用。为了探讨其对幼犬机体的影响,本研究以SeHLan为研究对象,探讨不同水平SeHLan对幼犬机体抗氧化功能和免疫应答的影响,以期为SeHLan在犬上的临床应用提供理论依据。本研究选用7周龄比格犬30只,随机分为6组,每组5只,具体分组为:不接种疫苗且只饲喂基础日粮的空白组（-Se/-Vacc）;接种犬五联疫苗且只饲喂基础日粮的疫苗组（-Se/+Vacc）;亚硒酸钠（SS）组（SS/+Vacc,0.35 mg/kg DM）;SeHLan添加组（SeHLan-L/+Vacc,0.35 mg/kg DM）、SeHLan（SeHLan-M/+Vacc,1.0 mg/kg DM）、SeHLan（SeHLan-H/+Vacc,2.0 mg/kg DM）。接种疫苗后第0、7、14、21、28、35、42天采集血液样本,测定血清硒含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、外周血淋巴细胞增殖、血清细胞因子水平（IL-2,IL-4）、外周血中性粒细胞（PMN）吞噬率和CPV抗体滴度。1.SeHLan增强幼龄比格犬抗氧化功能结果显示,SeHLan可显着提高幼龄比格犬抗氧化能力,与同期空白组和-Se/+Vacc组相比,SeHLan添加组的GSH-Px、SOD活性显着升高MDA含量均极显着降低（P<0.01）。与添加同等剂量硒的SS/+Vacc组相比,SeHLan组幼犬体内血清硒含量更高,机体抗氧化功能更强。其中,血清硒含量和GSH-Px活力的提高与SeHLan存在剂量依赖关系。2.SeHLan增强幼龄比格犬机体免疫功能本研究中通过流式细胞术检测犬外周血PMN对金黄色葡萄球菌的吞噬能力,结果显示添加SeHLan可显着增强PMN的吞噬能力。除-Se/-Vacc组外,其余各组犬在免疫后PMN吞噬率均显着升高,其中,SeHLan-L/+Vacc组的PMN吞噬率在首免后第7天显着高于同期-Se/+Vacc组（P<0.05）,而SS/+Vacc组PMN的吞噬作用在首免后第21天才表现出显着增强（P<0.05）,且三个SeHLan添加组幼犬外周血PMN一直稳定在较高水平的吞噬率。同时我们进一步探索了SeHLan与外周血淋巴细胞增殖以及细胞因子（IL-2、IL-4）水平之间的关联,结果显示SeHLan可显着提高Con A诱导的淋巴细胞增殖指数、犬血清中IL-2和IL-4的水平（P<0.05）,但其影响并不存在剂量依赖关系,其中SeHLan-M/+Vacc组的效果最为显着。研究表明日粮中适当补充SeHLan可增强幼龄比格犬机体免疫功能。3.SeHLan增加幼龄比格犬体内CPV抗体滴度结果显示,与同期-Se/+Vacc组和SS/+Vacc组相比,SeHLan可有效提高免疫幼犬CPV抗体水平。首免后幼犬体内CPV抗体滴度缓慢增加,在免疫的第7天,仅SeHLan-H/+Vacc组CPV抗体水平达到保护性滴度26.3。在免疫的第14天,与-Se/-Vacc组相比,其他各组幼犬CPV抗体滴度均呈极显着升高（P<0.01）。其中,SeHLan-H/+Vacc组CPV平均抗体滴度高达29.3,并在整个研究过程中保持稳定的抗体水平。研究表明SeHLan可提高幼犬体内CPV抗体水平,其中,SeHLan-H/+Vacc组幼犬体内CPV抗体水平上升更为显着。综上,本研究探明SeHLan可显着提高幼龄比格犬抗氧化能力,也可显着增强幼龄比格犬机体免疫功能,临床应用中的最佳日粮添加剂量为1.0 mg/kg DM,为SeHLan在宠物临床的应用提供数据支撑。
闫彩虹[7]（2020）在《江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中研究指明免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡,也可损伤其免疫系统,导致机体抵抗力下降,并发或继发感染其他病原,造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒（CIAV）、马立克病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒,在我国养鸡场中检出率较高,且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区,而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊,而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主,因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法,用于病原检测和临床诊断,同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测,建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法,并应用于临床检测中,以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况,并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。1 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系,应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测,结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最为常见,检出率为7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见,检出率为3.94%,四重感染检出率为0.99%。不同日龄鸡检测结果显示,6月龄以上鸡CIAV的检出率显着降低,3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示,蛋鸡MDV、REV检出率显着高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示,江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行,且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势（P<0.01）。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96%、1.44%和3.35%,个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明,鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显着低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根据MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特异性引物和TaqMan探针,建立和优化反应体系和条件,建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件,操作方便,检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J,与鸡其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,敏感性较高,三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5%,重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测,两者的符合率为94.17%。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性,应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测,并同时进行病毒分离,然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性,REV和ALV-J核酸均呈阴性,病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示,JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近,而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV强毒分离株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外,还与Js201801存在相同的突变（Q93R）,该突变其余参考毒株均未发生,这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外,JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变（L981,F240S）和（W67G,V210A）。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致,发病鸡均感染了马立克病毒,且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此,所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
辛凌翔,王秀丽,张一帜,李建,张媛[8]（2020）在《微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清的研制》文中研究说明为进一步完善中国大肠杆菌菌体微量凝集试验定型血清库,改良微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺,本试验选取大肠杆菌O50、O60、O117、O131血清型进行定型血清制备方法的探究。首先用大肠杆菌不同血清型的参考菌株制备灭活抗原,而后多次免疫家兔以采血获得粗血清,用微量凝集试验的方法确定不同粗血清的交叉凝集素及凝集效价,再通过交叉凝集素吸收法结合血清稀释法消除非特异性凝集,最终研制出特异性良好的微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清。本研究确定了大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型粗血清的主要交叉凝集素,最终成功研制出特异性良好的微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清共4种,凝集效价在1∶256至1∶2 048之间,其中微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60定型血清无交叉凝集素,为单因子定型血清,微量凝集试验用大肠杆菌O117、O131定型血清存在1～2种非特异性的交叉凝集素O14和O107。本研究作为大肠杆菌O抗原定型血清制备工艺摸索过程中的重要部分,为完善中国大肠杆菌菌体微量凝集试验定型血清库,进一步改良微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法提供了重要理论依据。
张远琴[9]（2020）在《基因Ⅵj亚型鸽源NDV的分离鉴定和不同基因型NDV对鸽的致病性与转录组学的研究》文中认为新城疫病毒（Newcastle disease viruses,NDV）是危害家禽业的重要病原之一,可引起鸽发生新城疫（Newcastle disease,ND）,也称鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1）病。近十年,该病常在我国肉鸽群发生和流行,给养鸽业造成巨大的经济损失。为了探究广西鸽新城疫的流行情况及不同基因型NDV对鸽的致病性和NDV感染鸽的转录组学的差异,本研究进行了鸽NDV流行毒株的分离鉴定,并用三株不同基因型NDV毒株进行鸽的致病性试验及感染鸽的转录组测序并验证。主要研究内容和结果如下:1、本研究采集最近冬季发生的鸽新城疫病例临床样品,进行样品检测和NDV的分离鉴定,结果分离到一株鸽源NDV毒株,命名为Pi/CH/GX1220/2019株。对分离株的F基因进行克隆和基因序列分析,结果表明,分离株F蛋白裂解位点氨基酸基序为112RRQKRF117,符合NDV强毒株裂解位点的特征;Pi/CH/GX1220/2019属于基因VI.2.1.1.2.1（VIj）NDV;遗传进化分析发现该分离株与近年广西地区流行的PPMV-1毒株亲缘关系较近;分子钟结果表明本分离株可能来源于广东。2、基因Ⅵ型NDV为感染宿主鸽的优势基因型,基因Ⅶ型NDV仍是我国鸡群中主要流行株,基因Ⅷ型NDV在近10年再次在国内分离到,但目前尚未见基因Ⅷ型NDV对鸽的致病性研究。为了探索这三个不同基因型的NDV毒株对宿主鸽的致病性强弱,本研究使用基因Ⅵ型鸽源pi/CH/GXP22/2000株、基因Ⅶ型鸽源pi/CH/GXP40/2001株和基因Ⅷ型斗鸡源game-fowl/CH/GXGB2011/2011株进行人工感染鸽试验,结果表明,感染后三个感染组均出现发病,发病鸽组织病理学结果表现脾脏出血坏死、胰腺和盲肠扁桃体炎性细胞浸润、坏死。三个毒株感染鸽子后第3天和7天的鸽脾脏均能检测到病毒载量;pi/CH/GXP22/2000感染组的发病症状和病理变化最轻,无死亡,脾脏组织病毒载量也较低;而pi/CH/GXP40/2001感染组发病症状和病变最严重。结果表明,这三株NDV对鸽的致病性存在差异。3、目前,由于不同基因型NDV感染鸽的转录组学比较研究较少,更缺乏基因Ⅷ型感染鸽的转录组分析资料。因此,本研究利用RNA-Seq技术对上述三株不同基因型NDV感染鸽在感染0天、感染后3天和7天的脾脏组织进行转录组分析。结果发现,与同一日龄对照组相比,三个感染组脾组织在7 dpi富集到的差异基因均比3 dpi多。三个病毒感染组引起差异显着上调的基因主要有炎症反应因子IL1B、IL18、SOCS1等;白介素家族相关基因如IL1R2、IL22R2、I17EL、IL7RA、IL2RA等;干扰素及其诱导的相关蛋白基因如IFI6、IFIT5、MX、ISG15、OASL等;趋化因子CCL3、CCL19、CCL21等;以及其他免疫应答、细胞凋亡相关基因如RIG-I、TLR22、BIRC1、RSAD2、β防御素7等。下调表达的基因主要与代谢相关,如GLR、GLUL、PLA2G、PA21B、CBPB1等。GO富集分析发现大多数与分子功能有关,KEGG通路分析发现NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。基因Ⅵ型NDV最早激活鸽免疫应答,而基因Ⅶ型和基因Ⅷ型NDV激活鸽免疫应答虽然较晚,但是应答比基因Ⅵ型NDV强。本研究还成功建立了鸽RIG-I样信号通路和细胞凋亡通路相关因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,包括鸽子RIG-I、TRIM25、MITA、IKK?、IκBα、Apaf1、BIRC2和GADD45B8个基因。该方法验证转录组学结果,两者趋势基本一致。综上所述,本研究分离鉴定了一株基因VI.2.1.1.2.1（VIj）亚型鸽源NDV,分析了该毒株遗传进化关系及来源。对三株不同基因型NDV毒株pi/CH/GXP22/2000、pi/CH/GXP40/2001和game-fowl/CH/GXGB2011/2011感染鸽进行致病性比较研究,发现pi/CH/GXP40/2001的致病性最强。对NDV感染鸽脾脏的转录组学分析获得了主要差异基因,这些病毒感染相关的差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。为探索NDV分子流行病学研究、致病机理和免疫应答提供资料,并为NDV的防控提供参考依据。
辛凌翔,魏财文,张媛,李建,王秀丽,彭国瑞,张一帜,彭小兵,蒋玉文[10]（2019）在《5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备》文中研究指明本研究以大肠杆菌参考菌株CVCC1369（O26）、CVCC3800（O153）、CVCC1489（O157）、CVCC3739（O159）、CVCC3807（O163）为菌种制备免疫抗原并免疫家兔,获得5种大肠杆菌O抗原定型原血清,而后制备多种吸收抗原以消除5种原血清的非特异性凝集素。通过微量凝集试验的方法,确定各血清的凝集价。最终确定了5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法,为进一步改进大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺提供了思路和依据。
二、鸽子血清非特异性凝集因子消除试验的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸽子血清非特异性凝集因子消除试验的研究（论文提纲范文）
（1）罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鱼类的免疫系统 |
| 1.1.1 免疫器官 |
| 1.1.2 免疫细胞 |
| 1.1.3 免疫分子 |
| 1.2 NCC的研究现状 |
| 1.3 Galectin家族研究进展 |
| 1.3.1 Galectin家族的分类 |
| 1.3.2 Galectin家族基因的结构 |
| 1.3.3 Galectin基因的免疫调节功能 |
| 1.3.3.1 Galectin与 T细胞 |
| 1.3.3.2 Galectin与炎症反应 |
| 1.3.3.3 Galectin与 NK细胞 |
| 1.3.4 硬骨鱼Galectin的研究概述 |
| 1.4 单细胞转录组测序研究进展 |
| 1.4.1 scRNA-Seq的实验原理 |
| 1.4.2 scRNA-Seq的局限 |
| 1.4.3 scRNA-Seq的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 罗非鱼淋巴细胞的单细胞转录组分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 罗非鱼及细胞处理 |
| 2.2.2 单细胞RNA测序 |
| 2.2.3 RNA-seq数据处理 |
| 2.2.4 质量控制和数据量化 |
| 2.2.5 细胞聚类 |
| 2.2.6 差异表达基因(DEG)分析 |
| 2.2.7 NCC亚群的WGCNA分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 测序数据质控和表达定量 |
| 2.3.2 单细胞亚群分类 |
| 2.3.3 基于标记分子细胞类群的鉴定 |
| 2.3.4 NCC的 DEGs分析 |
| 2.3.5 WGCNA分析结果 |
| 2.3.6 细胞亚聚类和NCC亚群鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 头肾白细胞中鉴定出四种免疫细胞群 |
| 2.4.2 WGCNA分析揭示NCC的基因调控网络 |
| 2.4.3 四个NCC亚群的确定 |
| 3 与NCCRP-1 互作的Gals蛋白鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用鱼 |
| 3.1.2 实验用细胞 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 实验引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 罗非鱼Galectin基因的克隆与分析 |
| 3.2.1.1 Gals基因的ORF克隆 |
| 3.2.1.2 Gals的序列分析 |
| 3.2.2 酵母双杂交验证与NCCRP-1 的互作蛋白 |
| 3.2.2.1 载体构建 |
| 3.2.2.2 准备酵母感受态细胞(LiAc Method) |
| 3.2.2.3 pGBKT7和pGADT7 共转化酵母菌株AH109 |
| 3.2.2.4 x-gal检测实验 |
| 3.2.3 GST Pull-down验证与NCC互作蛋白 |
| 3.2.3.1 原核表达载体的构建及诱饵蛋白准备 |
| 3.2.3.2 诱饵蛋白固定化 |
| 3.2.3.3 目的蛋白(NCC裂解液蛋白)的准备 |
| 3.2.3.4 目的蛋白质捕获 |
| 3.2.3.5 诱饵-目的蛋白洗脱 |
| 3.2.3.6 目的蛋白的收集 |
| 3.2.3.7 MS质谱鉴定及分析 |
| 3.2.4 亚细胞定位分析显示MMP与 OnGal-2/OnGal-8 在细胞内定位 |
| 3.2.4.1 MMP的克隆及真核表达载体的构建 |
| 3.2.4.2 OnGal-2/OnGal-8 绿色荧光真核表达载体构建 |
| 3.2.4.3 细胞复苏及传代。 |
| 3.2.4.4 细胞共转染 |
| 3.2.4.5 细胞爬片、固定及DAPI染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 NCC中 Gals的表达情况 |
| 3.3.2 OnGals基因克隆与分析 |
| 3.3.2.1 OnGals的基因克隆 |
| 3.3.2.2 OnGals基因结构分析 |
| 3.3.2.3 OnGals多序列比对 |
| 3.3.2.4 OnGals进化树分析 |
| 3.3.3 OnGals与 NCCRP-1 互作结果 |
| 3.3.4 OnGals与 NCC蛋白互作结果 |
| 3.3.4.1 OnGals蛋白表达 |
| 3.3.4.2 Pull-down及质谱分析结果 |
| 3.3.5 亚细胞共定位结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 依赖于NCCRP-1 受体的OnGal-2 的免疫调节功能及对NCC活性调控的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验用鱼 |
| 4.1.2 实验用细菌 |
| 4.1.3 实验用细胞 |
| 4.1.4 实验试剂 |
| 4.1.5 实验仪器 |
| 4.1.6 实验引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 OnGal-2 的表达模式分析 |
| 4.2.1.1 实验用鱼的处理及样品收集 |
| 4.2.1.2 qRT-PCR检测基因表达 |
| 4.2.2 OnGal-2 体外过表达研究 |
| 4.2.2.1 过表达载体的构建 |
| 4.2.2.2 细胞转染 |
| 4.2.2.3 双荧光素酶报告系统分析 |
| 4.2.3 OnGal-2 体外蛋白功能研究 |
| 4.2.3.1 His标签原核表达载体构建 |
| 4.2.3.2 细菌凝集试验 |
| 4.2.3.3 细菌结合实验 |
| 4.2.3.4 多糖结合实验 |
| 4.2.3.5 单核/巨噬细胞吞噬实验 |
| 4.2.3.6 OnGal-2对NCC效应基因表达研究 |
| 4.2.3.7 OnGal-2对NCC杀伤活性研究 |
| 4.2.4 OnGal-2 体内蛋白功能研究 |
| 4.2.4.1 罗非鱼注射及样品采集 |
| 4.2.4.2 NCC效应基因表达情况 |
| 4.2.4.3 血清酶活测定 |
| 4.2.4.4 组织载菌量测定 |
| 4.2.4.5 组织切片 |
| 4.2.4.6 罗非鱼存活率 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 OnGal-2 的表达模式 |
| 4.3.1.1 OnGal-2 的组织分布 |
| 4.3.1.2 OnGal-2 的时序表达结果 |
| 4.3.2 双荧光素表达结果 |
| 4.3.3 OnGal-2 蛋白体外功能研究 |
| 4.3.3.1 rOnGal-2 蛋白表达 |
| 4.3.3.2 rOnGal-2 对细菌的凝集作用 |
| 4.3.3.3 rOnGal-2 对细菌的结合作用 |
| 4.3.3.4 rOnGal-2 与多糖对细菌的竞争结合作用 |
| 4.3.3.5 rOnGal-2 对单核/巨噬细胞的吞噬促进作用 |
| 4.3.3.6 rOnGal-2对NCC效应基因表达分析 |
| 4.3.3.7 rOnGal-2对NCC杀伤活性分析 |
| 4.3.4 OnGal-2 蛋白体内功能研究 |
| 4.3.4.1 rOnGal-2 对罗非鱼血清酶活的作用 |
| 4.3.4.2 rOnGal-2 对罗非鱼组织载菌量的作用 |
| 4.3.4.3 rOnGal-2 对罗非鱼组织损伤的作用 |
| 4.3.4.4 rOnGal-2对NCC效应基因表达的作用 |
| 4.3.4.5 rOnGal-2 对罗非鱼存活率的作用 |
| 4.4 讨论 |
| 5 不依赖于NCCRP-1 受体的OnGal-8 的免疫调节功能及对NCC活性调控的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验用鱼 |
| 5.1.2 实验用细菌 |
| 5.1.3 实验用细胞 |
| 5.1.4 实验试剂 |
| 5.1.5 实验仪器 |
| 5.1.6 实验引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 OnGal-8 的表达模式 |
| 5.2.1.1 实验用鱼处理及组织取样 |
| 5.2.1.2 罗非鱼单核/巨噬细胞的处理及样品收集 |
| 5.2.1.3 qRT-PCR检测基因表达模式 |
| 5.2.2 OnGal-8 体外蛋白功能研究 |
| 5.2.2.1 rOnGal-8 的血凝作用研究 |
| 5.2.2.2 rOnGal-8 对细菌凝集作用研究 |
| 5.2.2.3 rOnGal-8 对细菌结合作用研究 |
| 5.2.2.4 rOnGal-8 对多糖的结合研究 |
| 5.2.2.5 rOnGal-8 对细菌生长抑制作用研究 |
| 5.2.2.6 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞炎症因子作用研究 |
| 5.2.2.7 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞吞噬作用研究 |
| 5.2.2.8 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞呼吸爆发作用研究 |
| 5.2.2.9 rOnGal-8对NCC杀伤活性研究 |
| 5.2.3 OnGal-8 体外过表达研究 |
| 5.2.4 OnGal-8 体内过表达研究 |
| 5.2.4.1 罗非鱼注射及检测 |
| 5.2.4.2 血清酶活检测 |
| 5.2.4.3 组织载菌量检测 |
| 5.2.4.4 组织切片检测 |
| 5.2.4.5 NCC效应基因表达检测 |
| 5.2.4.6 罗非鱼存活率检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 OnGal-8 的表达模式分析 |
| 5.3.1.1 OnGal-8 的组织表达分析 |
| 5.3.1.2 OnGal-8 的时序表达分析 |
| 5.3.2 OnGal-8 体外蛋白功能分析 |
| 5.3.2.1 rOnGal-8 对血细胞及细菌的凝集作用 |
| 5.3.2.2 rOnGal-8 对细菌的结合作用 |
| 5.3.2.3 rOnGal-8 对多糖的竞争结合作用 |
| 5.3.2.4 rOnGal-8 对细菌生长的抑制作用 |
| 5.3.2.5 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞炎症因子表达的作用 |
| 5.3.2.6 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞的促吞噬作用 |
| 5.3.2.7 rOnGal-8 对单核/巨噬细胞呼吸爆发作用 |
| 5.3.2.8 rOnGal-8对NCC杀伤活性分析 |
| 5.3.3 OnGal-8 体外过表达分析 |
| 5.3.4 OnGal-8 体内过表达分析 |
| 5.3.4.1 OnGal-8 对罗非鱼血清酶活的作用 |
| 5.3.4.2 OnGal-8 对罗非鱼组织载菌量的作用 |
| 5.3.4.3 OnGal-8 对罗非鱼组织损伤的作用 |
| 5.3.4.4 OnGal-8对NCC效应基因表达的作用 |
| 5.3.4.5 OnGal-8 对罗非鱼存活率的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 OnGal-8 的基因表达分析 |
| 5.4.2 OnGal-8 体外蛋白功能分析 |
| 5.4.3 OnGal-8 体外过表达分析 |
| 5.4.4 OnGal-8 体内过表达分析 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现和分类 |
| 1.2 IBV的形态 |
| 1.3 IBV的理化特征 |
| 1.4 IBV培养特性 |
| 1.5 IBV致病性 |
| 1.6 IBV生活周期 |
| 2 IBV分子生物学特性 |
| 2.1 IBV基因组 |
| 2.2 IBV主要编码蛋白及功能 |
| 2.3 IBV毒株分型 |
| 3 IBV流行病学 |
| 3.1 自然宿主 |
| 3.2 实验室宿主 |
| 3.3 传播方式 |
| 3.4 IBV流行现状 |
| 4 IBV变异机制 |
| 4.1 点突变 |
| 4.2 基因缺失或插入 |
| 4.3 同源重组 |
| 5 诊断技术 |
| 5.1 分离鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学检测 |
| 综述二 IBV疫苗研究进展 |
| 1 疫苗接种 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 接种时间 |
| 1.3 疫苗接种程序 |
| 2 疫苗的应用 |
| 2.1 喷雾疫苗接种 |
| 2.2 凝胶疫苗接种 |
| 3 疫苗接种后的保护评价 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 纤毛停滞 |
| 3.3 qRT-PCR |
| 3.4 血清中和抗体水平评价 |
| 综述三 IBV S蛋白研究进展及与宿主细胞互作研究进展 |
| 1 IBV S蛋白研究进展 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 IBV S蛋白功能 |
| 1.4 影响病毒吸附的宿主因素 |
| 2 IBV与宿主互作的研究进展 |
| 2.1 病毒感染对细胞凋亡的影响 |
| 2.2 病毒感染过程中自噬的激活 |
| 2.3 冠状病毒感染与天然免疫反应 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 IBV S蛋白关键抗原表位的鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒、多肽和血清样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 主要试剂配方 |
| 1.4 多肽库合成 |
| 1.5 IBV毒株EID_(50)测定 |
| 1.6 IBV S蛋白序列保守性和抗原性比较分析 |
| 1.7 pELISA实验步骤 |
| 1.8 IDEXX检测试剂盒实验步骤 |
| 1.9 IBV S2蛋序列比较分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 IBV S蛋白抗原性和保守性分析 |
| 2.2 多肽与IBV阳性血清的交叉反应 |
| 2.3 多肽抗原性关键氨基酸的确定 |
| 2.4 16R变异株的流行情况 |
| 3 讨论 |
| 第二章 检测IBV抗体多肽酶联免疫吸附试验(pELISA)方法建立及应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 pELISA方法步骤 |
| 1.5 pELISA方法条件的优化 |
| 1.6 pELISA方法性能的评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 Pep6与不同基因型毒株的血清具有很好的反应性 |
| 2.2 pELISA抗体检测方法条件的优化 |
| 2.3 pELISA临界值、重复性和特异性测定 |
| 2.4 pELISA性能的评价 |
| 3 讨论 |
| 第三章 pELISA评价疫苗免疫效力的潜在作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 ELISA方法实验步骤 |
| 1.4 多肽血清的制备 |
| 1.5 血清中和滴度的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 多肽血清中和效果 |
| 2.2 pELISA与中和实验比较测定血清抗体滴度 |
| 2.3 免疫血清pELISA滴度与中和滴度的相关性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 IBV S1蛋白互作蛋白的宿主蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒总RNA提取 |
| 1.5 真核表达载体的构建 |
| 1.6 CEK细胞的制备 |
| 1.7 质粒转染 |
| 1.8 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.9 Western-blot |
| 1.10 S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 1.11 CEK细胞膜蛋白提取 |
| 1.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 1.13 SDS-PAGE(银染) |
| 1.14 质谱 |
| 2 结果 |
| 2.1 sp-S1-IgGFc片段PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒转染IFA鉴定FJ14S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.4 激光共聚焦鉴定重组S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.5 Western blot鉴定重组融合蛋白S1-IgGFc的表达 |
| 2.6 重组S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 2.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.8 质谱鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 GRP78蛋白协助IBV感染宿主细胞 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 真核质粒构建 |
| 1.7 CEKC的制备 |
| 1.8 质粒转染 |
| 1.9 共聚焦鉴定真核蛋白表达 |
| 1.10 免疫沉淀(IP) |
| 1.11 抗体封闭实验 |
| 1.12 siRNA干扰 |
| 1.13 GRP78转染293T重建实验 |
| 1.14 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶切鉴定构建的真核表达载体 |
| 2.2 共聚焦鉴定蛋白表达 |
| 2.3 GRP78蛋白与IBV S1蛋白的互作 |
| 2.4 多克隆抗体封闭CEK细胞膜表面GRP78蛋白抑制IBV复制 |
| 2.5 siRNA干扰GRP78的表达能抑制IBV的复制 |
| 2.6 非易感细胞感染实验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定、核酸定性标准样品的制备及抗体间接ELISA方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究内容一 鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定以及JSP1906株的序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 鸽源CIAV的全基因测序 |
| 3 结果 |
| 3.1 疑似CIAV感染病料汇总 |
| 3.2 PCR检测结果 |
| 3.3 细胞病毒分离结果 |
| 3.4 CIAV-JSP1906全基因扩增结果 |
| 3.5 酶切鉴定结果 |
| 3.6 全基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备 |
| 2.2 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的标定 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备 |
| 3.2 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的标定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 鸡传染性贫血病抗体间接ELISA方法的建立与初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 计算软件分析 |
| 2.2 鸡传染性贫血病病毒阳性血清的制备 |
| 2.3 最佳多肽的筛选与确定 |
| 2.4 间接ELISA条件的优化 |
| 3 鸡传染性贫血病抗体间接ELISA方法的初步应用 |
| 3.1 送检血清样品ELISA检测 |
| 3.2 IDEXX试剂盒检测血清样品 |
| 3.3 两种检测方法比较 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 多肽序列选择结果 |
| 4.2 鸡传染性贫血病病毒阳性血清的制备 |
| 4.3 最佳多肽的确定 |
| 4.4 间接ELISA方法的建立及反应条件的优化 |
| 4.5 特异性试验 |
| 4.6 批间及批内重复性试验 |
| 4.7 送检血清样品检测结果 |
| 5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）B细胞和免疫球蛋白在虹鳟咽和眼睛结膜中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 鱼类免疫系统的组成 |
| 2.1 免疫器官和组织 |
| 2.1.1 胸腺 |
| 2.1.2 头肾 |
| 2.1.3 脾脏 |
| 2.1.4 免疫相关器官:肝脏 |
| 2.1.5 黏膜相关淋巴组织 |
| 2.2 鱼类免疫反应要素 |
| 2.2.1 非特异性免疫元件 |
| 2.2.2 特异性免疫元件 |
| 3.硬骨鱼类黏膜组织中的适应性免疫反应 |
| 3.1 硬骨鱼类黏膜组织中T细胞介导的细胞免疫应答 |
| 3.2 硬骨鱼类黏膜组织中B细胞介导的体液免疫应答 |
| 4.本研究问题的由来、目的和意义 |
| 第二章 虹鳟B细胞和免疫球蛋白在咽黏膜抵抗寄生虫感染过程中的功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 试验所需溶液配制 |
| 2.1.4 试验对象 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小瓜虫的收集和培养 |
| 2.2.2 构建小瓜虫感染模型 |
| 2.2.3 总RNA提取 |
| 2.2.4 反转录 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 转录组测序及生物信息学分析 |
| 2.2.7 虹鳟血清和咽黏液的收集 |
| 2.2.8 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.9 凝胶过滤层析 |
| 2.2.10 咽黏膜表面共生菌的收集和流式分析Igs对共生菌的包被 |
| 2.2.11 免疫荧光法检测Igs对咽黏膜表面共生菌的包被 |
| 2.2.12 虹鳟头肾和咽黏膜组织中白细胞的分离 |
| 2.2.13 流式细胞术分析IgT~+和IgM~+B细胞的含量 |
| 2.2.14 石蜡切片及组织学观察 |
| 2.2.15 免疫荧光检测 |
| 2.2.16 B细胞在咽黏膜和头肾组织的增殖 |
| 2.2.17 体外组织培养 |
| 2.2.18 Pull-down试验 |
| 2.2.19 免疫共沉淀试验(Co-IP) |
| 2.2.20 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 硬骨鱼类的咽黏膜具有MALT的普遍特征 |
| 3.2 咽黏膜表面的共生菌可以被Igs所识别 |
| 3.3 寄生虫感染后,虹鳟咽黏膜产生强烈的免疫应答反应 |
| 3.4 虹鳟咽黏膜组织中B细胞和黏液中Igs对小瓜虫的反应 |
| 3.5 虹鳟咽黏液中Igs对小瓜虫的特异性结合 |
| 3.6 小瓜虫感染后虹鳟咽黏膜B细胞的局部增殖和Igs反应 |
| 3.7 咽黏膜的多聚Ig受体(pIgR) |
| 4 讨论 |
| 第三章 虹鳟眼结膜中适应性免疫反应的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建柱状黄杆菌感染模型 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 虹鳟眼结膜具有与哺乳动物EALT相似的特征 |
| 3.2 虹鳟眼结膜的共生细菌主要被IgT识别 |
| 3.3 构建小瓜虫和柱状黄杆菌两种感染模型 |
| 3.4 小瓜虫和柱状黄杆菌可以诱导虹鳟眼结膜产生局部免疫反应 |
| 3.5 感染寄生虫和柱状黄杆菌后虹鳟眼结膜处B细胞的反应 |
| 3.6 病原感染后,虹鳟眼黏液和血清中Ig的响应 |
| 3.7 病原感染后,虹鳟眼结膜局部B细胞的增殖 |
| 3.8 病原感染后,虹鳟眼结膜局部特异性Igs的反应 |
| 3.9 虹鳟眼结膜中pIgR的反应 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 本论文的创新点和不足之处 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（5）EM菌对中华绒螯蟹非特异性免疫力和抗脂多糖毒性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1.1 中华绒螯蟹的概况 |
| 1.1.1 生物学特征 |
| 1.1.2 我国河蟹养殖现状 |
| 1.1.3 影响中华绒螯蟹生长的主要因素 |
| 1.1.4 养殖中存在的问题 |
| 1.2 中华绒螯蟹的免疫系统研究进展 |
| 1.2.1 免疫防御系统 |
| 1.2.2 免疫系统的分子机制 |
| 1.3 微生态制剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂定义与分类 |
| 1.3.2 常见微生态制剂的功能 |
| 1.3.3 微生态制剂的作用机制 |
| 1.3.4 微生态制剂在水产养殖中的应用及存在的问题 |
| 1.4 EM菌的研究进展 |
| 1.4.1 定义 |
| 1.4.2 应用及存在的问题 |
| 1.5 本论文研究的目的和意义 |
| 第2章 EM菌对中华绒鳌蟹血清生化指标、抗氧化功能及非特异性免疫力的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验分组 |
| 2.1.3 样品采集与处理 |
| 2.1.4 指标检测 |
| 2.1.5 数据统计与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 EM菌对中华绒螯蟹血细胞组成的影响 |
| 2.2.2 EM菌对中华绒螯蟹血清生化指标的影响 |
| 2.2.3 EM菌对中华绒螯蟹血清抗氧化性能的影响 |
| 2.2.4 EM菌对中华绒螯蟹血清免疫指标的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 EM菌对中华绒螯蟹血细胞组成的影响 |
| 2.3.2 EM菌对中华绒螯蟹生化指标的影响 |
| 2.3.3 EM菌对中华绒螯蟹血清抗氧化性能的影响 |
| 2.3.4 EM菌对中华绒螯蟹血清免疫指标的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 水体中添加EM菌对中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验分组 |
| 3.1.3 样品采集与处理 |
| 3.1.4 免疫相关基因的表达量分析 |
| 3.1.5 数据处理 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 EM菌对中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因表达的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 EM菌对中华绒螯蟹肝胰腺免疫相关基因表达的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 水体中添加EM菌对中华绒螯蟹抗脂多糖毒性的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用蟹 |
| 4.1.2 实验设计及样品采集 |
| 4.1.3 酶活测定 |
| 4.1.4 肝胰腺基因表达分析 |
| 4.1.5 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 EM菌对脂多糖注射后中华绒螯蟹抗氧化酶活的影响 |
| 4.2.2 EM菌对脂多糖注射后中华绒螯蟹免疫酶活的影响 |
| 4.2.3 EM菌对脂多糖注射后中华绒螯蟹免疫相关基因表达的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 EM菌对脂多糖注射后中华绒螯蟹抗氧化酶活的影响 |
| 4.3.2 EM菌对脂多糖注射后中华绒螯蟹免疫酶活的影响 |
| 4.3.3 EM菌对脂多糖注射后中华绒螯蟹免疫相关基因表达的影响 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）高羊毛氨酸硒对幼犬机体抗氧化功能和免疫应答的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 硒概述 |
| 1.1 硒的历史 |
| 1.2 硒的存在形式 |
| 1.3 高羊毛氨酸硒的概述 |
| 2 硒的抗氧化功能 |
| 3 硒对动物免疫功能的影响 |
| 3.1 硒与细胞免疫 |
| 3.2 硒与体液免疫 |
| 3.3 硒与非特异性免疫 |
| 3.4 硒与免疫佐剂 |
| 4 硒与病毒感染 |
| 5 硒与细菌感染 |
| 6 硒与寄生虫感染 |
| 7 硒与癌症 |
| 8 研究目的及意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 SeHLan增强幼龄比格犬抗氧化功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验日粮与饲养管理 |
| 1.3 本试验所需试剂 |
| 1.4 仪器及耗材 |
| 1.5 试验分组与设计 |
| 1.6 血液样品采集 |
| 1.7 犬血清硒含量的测定 |
| 1.8 犬血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定 |
| 1.9 犬血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 |
| 1.10 犬血清中丙二醛(MDA)含量的测定 |
| 1.11 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 SeHLan提高犬血清硒含量 |
| 2.2 SeHLan提高幼犬血清中抗氧化指标 |
| 3 讨论 |
| 第二章 SeHLan增强幼龄比格犬机体免疫功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验日粮与饲养管理 |
| 1.3 试剂及耗材订购 |
| 1.4 仪器及耗材 |
| 1.5 试验分组与设计 |
| 1.6 常用溶液和培养基的配制 |
| 1.7 血液样品采集 |
| 1.8 犬外周血淋巴细胞增殖试验 |
| 1.9 犬血清中细胞因子(IL-2、IL-4)含量测定 |
| 1.10 犬外周血中性粒细胞(PMN)吞噬试验 |
| 1.11 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 SeHLan增强幼龄比格犬外周血淋巴细胞增殖 |
| 2.2 SeHLan提高犬血清中细胞因子(IL-2、IL-4)水平 |
| 2.3 SeHLan增强犬外周血中性粒细胞(PMN)吞噬功能 |
| 3 讨论 |
| 第三章 SeHLan增加幼龄比格犬体内CPV抗体滴度 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验毒株 |
| 1.3 试验日粮与饲养管理 |
| 1.4 试剂及耗材订购 |
| 1.5 仪器及耗材 |
| 1.6 常用溶液的配制 |
| 1.7 试验分组与设计 |
| 1.8 血液样品采集 |
| 1.9 1%猪红细胞悬液处理 |
| 1.10 CPV红细胞凝集试验(HA) |
| 1.11 CPV红细胞凝集抑制试验(HI) |
| 1.12 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 SeHLan增加幼龄比格犬CPV抗体滴度 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 中英文对照表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 鸡传染性贫血 |
| 1.2 马立克病 |
| 1.3 网状内皮组织增生症 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我国家禽免疫抑制病病原感染现状 |
| 2 免疫抑制病病原检测方法的研究概况 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血清学检测技术 |
| 2.3 分子生物学检测技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 毒株来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 样品RNA的提取和反转录 |
| 2.5 样品PCR检测 |
| 2.6 数据整理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原的PCR检测结果 |
| 3.2 感染类型分析 |
| 3.3 不同日龄鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.4 不同品种鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.5 江苏地区鸡2016-2019年免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.6 4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株来源 |
| 1.2 临床样品来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 荧光定量PCR质粒标准品的制备与鉴定 |
| 2.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.6 临床样品的检测和验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.3 质粒标准品的制备 |
| 3.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 发病鸡背景资料及流行病学调查 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测 |
| 2.2 MDV分离培养 |
| 2.3 REV和ALV分离培养 |
| 2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5 致病相关基因的PCR扩增、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病鸡的组织病变 |
| 3.2 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 REV和ALV分离结果 |
| 3.4 MDV分离结果 |
| 3.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.6 致病相关基因的PCR扩增及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 本文第二章120份临床病鸡样品的流行病学背景资料 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清的研制（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 培养基及试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌种的制备 |
| 1.2.2 免疫抗原的制备 |
| 1.2.3 定型粗血清的制备 |
| 1.2.4 定型粗血清交叉凝集素的测定 |
| 1.2.5 定型粗血清交叉凝集效价的测定 |
| 1.2.6 吸收抗原的制备 |
| 1.2.7 定型粗血清的吸收 |
| 1.2.8 定型血清凝集效价测定及效果评价 |
| 2 结 果 |
| 2.1 定型粗血清的微量凝集试验 |
| 2.2 吸收后血清的微量凝集试验 |
| 2.3 定型血清的效果评价 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（9）基因Ⅵj亚型鸽源NDV的分离鉴定和不同基因型NDV对鸽的致病性与转录组学的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要中英文简写对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.2 鸽源新城疫的流行病学 |
| 1.3 NDV对鸽的致病性 |
| 1.3.1 NDV对鸽的致病特点 |
| 1.3.2 鸽源NDV致病的分子机制 |
| 1.4 NDV感染宿主鸽的免疫应答 |
| 1.4.1 RIG-I样信号通路 |
| 1.4.2 细胞凋亡 |
| 1.5 RNA-Seq技术 |
| 1.5.1 RNA-Seq概述 |
| 1.5.2 RNA-Seq测序的应用 |
| 1.6 实时荧光定量RT-PCR |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 第二章 一株基因Ⅵ .2.1.1.2.1(Ⅵj)亚型鸽源NDV分离鉴定及遗传进化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源及背景 |
| 2.1.2 实验主要动物、试剂和仪器 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 序列收集 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的分离 |
| 2.2.2 血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HI) |
| 2.2.3 RT-PCR扩增鉴定及强弱毒分型 |
| 2.2.4 其他病毒的排除试验 |
| 2.2.5 分离株F基因的克隆测序 |
| 2.2.6 遗传进化分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定结果 |
| 2.3.2 RT-PCR鉴定及强弱毒分型结果 |
| 2.3.3 其他病毒的排除试验结果 |
| 2.3.4 分离株F基因测序与分析结果 |
| 2.3.5 遗传进化分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 三株不同基因型NDV对鸽致病性及宿主应答差异研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物试验 |
| 3.2.2 抗体检测 |
| 3.2.3 检测感染鸽脾脏病毒载量 |
| 3.2.4 制备病理切片 |
| 3.2.5 转录组测序 |
| 3.2.6 测序结果分析 |
| 3.2.7 差异表达分析 |
| 3.3 不同基因型NDV感染鸽子试验结果 |
| 3.3.1 发病情况与剖检病变结果 |
| 3.3.2 不同基因型NDV感染鸽子抗体效价结果 |
| 3.3.3 感染鸽脾脏的病毒载量 |
| 3.3.4 病理组织切片结果 |
| 3.3.5 转录组数据分析结果 |
| 3.3.6 转录组差异表达基因筛选结果 |
| 3.3.7 转录组GO数据库注释及显着性富集分析 |
| 3.3.8 转录组KEGG数据库注释及显着性富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸽RIG-I样信号通路和细胞凋亡通路相关因子RT-q PCR方法的建立及其在NDV感染鸽表达差异验证 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2. 试验方法 |
| 4.2.1 引物设计及合成 |
| 4.2.2 获得鸽淋巴细胞c DNA |
| 4.2.3 PCR扩增目的基因 |
| 4.2.4 目的基因克隆及测序鉴定 |
| 4.2.5 质粒标准品的提取与制备 |
| 4.2.6 RT-q PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.7 敏感性和重复性检验 |
| 4.2.8 应用建立的好RT-q PCR方法验证基因表达差异 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 PCR结果 |
| 4.3.2 质粒浓度及拷贝数结果 |
| 4.3.3 RT-q PCR标准曲线的建立 |
| 4.3.4 融解曲线分析结果 |
| 4.3.5 敏感性及重复性试验结果 |
| 4.3.6 RT-q PCR验证部分免疫相关的差异表达基因结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（10）5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 方法 |
| 1.5.1 免疫抗原的制备 |
| 1.5.2 动物的免疫及定型原血清的制备 |
| 1.5.3 血清凝集素的测定 |
| 1.5.4 血清凝集价的测定 |
| 1.5.5 血清吸收抗原的制备 |
| 1.5.6 定型血清的吸收与制备 |
| 1.5.7 定型血清质量评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 定型原血清的制备 |
| 2.2 定型原血清吸收抗原的选取 |
| 2.3 定型原血清第一次吸收后的凝集情况 |
| 2.4 定型血清的制备 |
| 2.4.1 O26定型血清制备方法的确定 |
| 2.4.2 O153定型血清制备方法的确定 |
| 2.4.3 O157定型血清制备方法的确定 |
| 2.4.4 O159定型血清制备方法的确定 |
| 2.4.5 O163定型血清制备方法的确定 |
| 2.5 定型血清质量评价 |
| 3 讨论 |
四、鸽子血清非特异性凝集因子消除试验的研究（论文参考文献）
- [1]罗非鱼NCC亚群的构成解析及其活性调控因子半乳糖凝集素（Galectins）的功能研究[D]. 牛金中. 广东海洋大学, 2021(02)
- [2]IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究[D]. 武奇. 扬州大学, 2021
- [3]鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定、核酸定性标准样品的制备及抗体间接ELISA方法的建立与初步应用[D]. 李金芝. 扬州大学, 2021
- [4]B细胞和免疫球蛋白在虹鳟咽和眼睛结膜中的功能研究[D]. 孔维光. 华中农业大学, 2021(02)
- [5]EM菌对中华绒螯蟹非特异性免疫力和抗脂多糖毒性的研究[D]. 储兰璐. 上海海洋大学, 2021(01)
- [6]高羊毛氨酸硒对幼犬机体抗氧化功能和免疫应答的影响[D]. 郑谋凤. 浙江农林大学, 2021(07)
- [7]江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 闫彩虹. 扬州大学, 2020(04)
- [8]微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清的研制[J]. 辛凌翔,王秀丽,张一帜,李建,张媛. 中国畜牧兽医, 2020(08)
- [9]基因Ⅵj亚型鸽源NDV的分离鉴定和不同基因型NDV对鸽的致病性与转录组学的研究[D]. 张远琴. 广西大学, 2020(02)
- [10]5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备[J]. 辛凌翔,魏财文,张媛,李建,王秀丽,彭国瑞,张一帜,彭小兵,蒋玉文. 中国兽医杂志, 2019(05)