一、棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达（论文文献综述）
张林娜,陈文峰,尹新明,李文明,刘向阳,张忠信[1]（2016）在《杆状病毒增效因子及其增效机理》文中提出杆状病毒是一类双链环状DNA病毒,具有宿主特异性强和环境兼容性好等特点。作为微生物杀虫剂,杆状病毒在农业可持续发展中应将发挥更加重要的作用。但是,杆状病毒杀虫剂自身的不足,如杀虫活性低和杀虫速度慢等,严重制约了其推广应用。一些增效因子能够改善杆状病毒的杀虫活性或杀虫速度。本文综述了杆状病毒增效蛋白、昆虫痘病毒纺锤体蛋白和荧光增白剂等7种对杆状病毒具有增效活性的增效因子的特性,并对其增效机理进行了逐个分析,旨在为高效病毒杀虫剂的研发以及病毒杀虫剂的推广应用提供借鉴和帮助。
韩光杰,刘琴,徐贝贝,王建军,祁建杭,李传明,徐健[2]（2016）在《粘虫颗粒体病毒增效蛋白基因片段优化及功能》文中研究表明【目的】研究转宿主粘虫颗粒体病毒（Pseudaletia unipuncta granulovirus,Pu GV-Ps）增效蛋白基因截短片段优化及其增效作用,探索增效蛋白基因的合理利用途径。【方法】生物信息学分析增效蛋白结构域,构建增效蛋白基因截短片段原核表达载体,分析目的基因片段表达产物的表达水平、围食膜蛋白降解效能和增强活性,进一步明确Pu GV-Ps增效蛋白基因的功能区域。【结果】Pu GV-Ps增效蛋白含有M60-like结构域、锌离子催化域和糖蛋白结合域,并包含13个潜在的糖基化位点。以此为依据设计P69（短截M60-like结构域）和P77（短截糖蛋白结合域）2个截短片段,构建了表达载体p ET15b-P69和p ET15bP77,原核表达量明显高于全长基因P104。表达产物纯化蛋白围食膜降解活性表明,P69对斜纹夜蛾围食膜大分子蛋白降解程度高于P77,但两者均低于P104。病毒增强苏云金杆菌（Bt）实验表明,截短片段的表达产物提高了Bt对小菜蛾的毒力,但增强活性显着低于P104。【结论】研究结果表明,Pu GV-Ps增效蛋白基因N端M60-like结构域和C端糖蛋白结合域对其增效作用的发挥都具有一定功能,这些结构对维持增效蛋白的构象也发挥了一定的作用,截短片段P69有利于保持Pu GV-Ps增效蛋白的活性、提高表达水平。该研究结果对增效蛋白的工业化生产具有一定的指导意义。
徐健,赵松,刘琴,杨青,李传明[3]（2013）在《转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性》文中指出以东方粘虫为转宿主增殖的颗粒体病毒（PuGV Ps）DNA为模板通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段,纯化的PCR产物克隆到载体质粒pET 15b中,构建重组质粒pET 15b En,重组质粒外源基因测序证明PCR扩增产物是粘虫颗粒体病毒转宿主病毒PuGV Ps增效蛋白的全长基因。与原始美洲粘虫颗粒体病毒（PuGV）增效蛋白基因的序列比较,两者同源性达99.59%。11个突变碱基中有7个集中在5′端下游500 bp,而3′端上游500 bp仅1个碱基发生突变。PuGV Ps增效蛋白基因重组质粒pET 15b En转化到大肠杆菌中构建重组菌,在IPTG诱导下表达了108 kD的表达产物,Ni2+柱纯化证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Btδ内毒素对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性。
张小霞,梁振普,陈晓慧,宋小凤,王丽薇,邵新峰[4]（2012）在《黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究》文中提出增效蛋白（ENHANCIN）是一种主要在昆虫杆状病毒中存在的杀虫增效因子,黄地老虎颗粒体病毒（Agrotis segetum granulovirus,AgseGV）基因组中有一个ORF的编码产物为杆状病毒ENHANCIN同源物,命名为en-hancin-like。生物信息学分析结果表明,AgseGV的enhancin-like基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,在其C-末端拥有类似哺乳动物的脯氨酸富集区。为了确定AgseGV的EN-HANCIN-like蛋白是否具有增效功能,构建了AgseGV的enhancin-like全基因和5′端片段（1 017bp）的原核表达载体。利用层析技术纯化截短片段的原核表达产物,以其为抗原制备了抗体。利用自制抗体和His-tag抗体,Western blot检测了enhancin-like全基因的表达产物。结果表明,在融合蛋白预期大小处显示出阳性条带,证明目的基因得到了良好的表达。以棉铃虫为供试虫进行生物测定,证明在棉铃虫核多角体病毒（HaNPV）浓度为1.17×102 PIBS/mL时,AgseGV enhancin-like的全基因原核表达产物能使其感染3龄初幼虫的死亡率提高16.25%,增效作用显着。但是,5’端截短片段的原核表达产物对HaNPV没有增效作用。
唐平[5]（2011）在《一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析》文中认为杆状病毒具有闭合环状双链DNA基因组，是一类主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫的病原物，杆状病毒作为生物杀虫剂具有对人畜安全，不造成环境污染，宿主专一性强，能有效控制田间害虫种群密度等优点。本文对一株分离自棉铃虫的核型多角体病毒进行电镜观察，表明其为多粒包埋型的核型多角体病毒，昆虫感染实验表明其与棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HearSNPV）有不同的宿主域，细胞感染实验表明其与HearSNPV有不同的病理效应，因此对其基因组进行了分析，并与其它杆状病毒基因组进行了比较。对一株分离自棉铃虫的病毒纯化后进行电镜观察，发现其呈不规则多角体型，包涵体中有多个包含病毒核衣壳的囊膜，每个病毒囊膜内含有2个以上核衣壳，符合多粒包埋型核型多角体病毒特征，将其命名为棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera multinucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HearMNPV）。荧光定量PCR结果分析表明HearMNPV的DNA在棉铃虫体内复制经历了减少期、隐晦期、增长期及稳定期４个时相，表明其宿主体内复制良好。HearMNPV对其它昆虫的感染性实验表明它对东方粘虫有较好的感染性，但不能感染斜纹夜蛾及甜菜夜蛾，而HearSNPV不能感染东方粘虫，表明两者有着不同的宿主域。HearMNPV对Hz-AM1细胞系感染后没有多角体产生，也不显示明显的细胞病理效应；对棉铃虫胚胎细胞系QB-Ha-E-5细胞系感染后有大量多角体产生，呈现较好的感染性。Hz-AM1是HearSNPV的敏感细胞系,用源自HearSNPV的HaBacmid-egfp对QB-Ha-E-5细胞系感染，细胞感染后有明显的荧光产生，表明HearMNPV和HearSNPV对宿主细胞感染性存在不同。为进一步分析HearMNPV，将Sau3AⅠ部分酶切HearMNPV基因组DNA，SalⅠ完全酶切pUC19载体，以Klenow酶分别对回收的片断和载体进行半补齐反应，经连接、转化后,得到用半补齐法构建的覆盖率大于99.9％的HearMNPV基因组文库。对HearMNPV基因组全序列进行测定并分析表明基因组的大小为154,196bp，G+C含量为40.07%，推测含有162个与相邻的ORF有最小重叠且大于150bp的ORF，占基因组全序列的90.16%，4个同源重复区等非编码区序列占整个基因组的9.84%。基因对等图表明HearMNPV与HearSNPV共线性较低，HearMNPV基因组结构与披肩粘虫核型多角体病毒B株（Mamestraconfigurata nucleopolyhedrovirus-B，MacoNPV-B）有很好的共线性；系统进化分析表明HearMNPV与HearSNPV不在同一簇中，而与MacoNPV-B存在同一簇中。HearMNPV与HearSNPV在基因组的大小、内容，同源基因的排列、一致性上存在着显着的差别，结合昆虫宿主域实验确定HearMNPV是一株不同于棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（HearSNPV）的新病毒种。与MacoNPV-B基因组结构相比，HearMNPV缺失了包含ORF54、55、56、57、58的片断，长度约为5.4kb，其基因组中HearMNPV orf66、orf17、bro基因、hr序列与MacoNPV-B存在明显的不同，表明其与MacoNPV-B的亲缘关系然很近，但在基因组的结构上存在明显的差异。
刘小民[6]（2011）在《华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定》文中研究表明华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）为鞘翅目鳃金龟科昆虫,是国内外公认的难防治的土栖性害虫。围食膜（peritrophic membrane, PM）是昆虫体内保护其中肠的第一道天然屏障,在昆虫中肠的消化过程及保护昆虫免受微生物和寄生虫侵害等方面发挥着重要作用。昆虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定能够为深入研究害虫的生防机制,寻找生物防治新靶标,以及进一步明确围食膜与病原微生物之间相互作用的分子机理等提供前提和基础。本研究在构建华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库的基础上,对其进行免疫筛选,并对筛选得到的围食膜靶标蛋白进行了分离与鉴定,所得的主要结果如下:1.提取华北大黑鳃金龟幼虫中肠总RNA,分离得到mRNA,利用Uni-ZAP XR载体,成功构建高质量的华北大黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库。经鉴定,该cDNA文库滴度为5.18×106pfu/mL,重组率为98.8%,扩增后文库滴度为2.36×109pfu/mL,插入cDNA片段的长度平均为1.85kb。其后,以棉铃虫（Helicoverpa armigera）围食膜蛋白血清为抗体,对该文库进行免疫筛选。经过筛选,共得到阳性克隆254个。其中包括4个全长基因HoCBP2、HoCBP76、HoSCP、HoChi,以及1个基因片段HoIIM。2. HoCBP2基因及HoCBP76基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫围食膜几丁质结合蛋白。其中HoCBP2基因全长2226bp,GenBank登录号为JF681185,开放阅读框长1947bp,编码649个氨基酸。HoCBP2蛋白N-端具有19个氨基酸的前导信号序列,预期蛋白分子量70.2kDa,等电点3.52。Blast比对结果显示,其序列与鞘翅目昆虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）围食膜蛋白PMP14（GenBank登录号GU128106）相似性最高,为35%。结构域分析表明HoCBP2蛋白包含8个具有peritrophin-A结构特征的几丁质蛋白结合功能域（CBD, chitin binding domain）。HoCBP76基因全长2019bp,GenBank登录号为JF681186,开放阅读框长1725 bp,编码575个氨基酸。HoCBP76蛋白N-端具有19个氨基酸的前导信号序列,预期蛋白分子量62.3kDa。等电点3.51。Blast比对结果表明,其序列与Tribolium castaneum围食膜蛋白PMP14相似性最高,为34%。结构域分析表明HoCBP76蛋白包含7个CBD。成功构建原核表达载体pET21b-HoCBP2和pET21b-HoCBP76,分别表达了约120 kDa及110 kDa的目的蛋白。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建了重组表达载体Bac-HoCBP2及Bac-HoCBP76,转染BTI-Tn-5B1-4细胞,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。Western blot检测表明,重组后的HoCBP2和HoCBP76蛋白表达的蛋白分子量约为120kDa和110kDa。几丁质结合活性试验结果表明,HoCBP2和HoCBP76重组蛋白均具有几丁质结合活性,重组蛋白经PBS及1M NaCl处理后,不能从几丁质/蛋白复合物中解离,而用强变性剂6M尿素及1% Calcoflour处理后,重组蛋白从几丁质/蛋白复合物中大量释放。成功分离得到HoCBP2及HoCBP76的特异抗体,Western blot检测发现HoCBP2和HoCBP76在华北大黑鳃金龟幼虫中肠前、中,后部均匀分布,围食膜、中肠、粪便及卵中均存在CBP蛋白,而在其体壁、消化液、脂肪体、蜕及马氏管中未见阳性信号。3. HoChi基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫几丁质酶,该基因全长1636bp,GenBank登录号为HM596340,开放阅读框长1458bp,编码486个氨基酸,预期蛋白分子量为51.8kDa,等电点为5.58。其5’端和3’端各有一个长27bp和145bp的非翻译区,在polyA末端上游39bp处有一个多聚腺甘酸终止信号序列AAGAAA。该蛋白具有典型的几丁质酶特性,即一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个C端苏氨酸富集区和一个几丁质结合域,属于几丁质酶18家族。其氨基酸序列与赤拟谷盗几丁质酶蛋白（GenBank登录号NM001044629）具有较高的相似性。将该基因与pET28b载体重组后,经IPTG诱导,Western blot鉴定,该蛋白在大肠杆菌中得到表达。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建重组表达载体pFastBac-HoChi,转染BTI-Tn-5B1-4细胞后,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。4. HoSCP基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫丝氨酸羧肽酶,GenBank登录号为JF681184。该基因全长1830bp,开放阅读框长1371 bp,编码457个氨基酸。推导的蛋白质分子量为51.2kDa,等电点为6.12。其5’端具有78bp的非翻译区及起始密码子ATG,3’端具有381bp的非翻译区,并且含有终止密码子TAA,在polyA末端上游14bp处有一个多聚腺甘酸终止信号序列AATAAA。N-末端具有15个氨基酸的前导信号序列,表明其是分泌型蛋白。序列分析表明,HoSCP含有一个保守的S10肽酶结构域、一个丝氨酸活性位点序列IAGESYAG、一个组氨酸活性位点序列FAFLkVYGAGHMVPMDQP以及两个N-联糖基化位点,并且含有丝氨酸羧肽酶保守催化三联体位点Ser-185,Asp-361,His-418。将该基因与pET28b载体重组后,经IPTG诱导,Western blot鉴定,该蛋白在大肠杆菌中得到表达。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建重组表达载体pFastBac-HoSCP,转染BTI-Tn-5B1-4细胞后,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。5. HoIIM基因,编码华北大黑鳃金龟肠幼虫围食膜粘蛋白,长1879bp,最长读码框长1707bp,编码569个氨基酸,GenBank登录号为JF681187。结构域分析表明,HoIIM蛋白5个具有peritrophin-A结构特征的几丁质结合功能域、5个粘蛋白结构域。其粘蛋白结构域富含苏氨酸（Thr,T）、脯氨酸（Pro,P）和丝氨酸（Ser,S）,分别占29.3%、15.5%及3.91%,并含有大量重复序列,其中PTTTPTT共重复15次,PTSTTTPTTITT及STTTT分别重复5次,TTPTTP重复4次。对华北大黑鳃金龟幼虫围食膜蛋白组分的银染分析表明,其围食膜蛋白种类较多。其中分子量大小大约为160kDa和80kDa的两条蛋白条带,与经PAS方法检测到的呈明显红色的两种糖蛋白大小相符。从粉纹夜蛾颗粒体病毒中分离得到增效蛋白Enhancin,离体处理华北大黑鳃金龟幼虫围食膜后,Western blot检测发现有一条分子量较大的围食膜蛋白条带明显消失,而相应的一些小分子量的围食膜蛋白条带有所增加。
赵丹[7]（2011）在《苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析》文中研究表明病毒增效蛋白是金属蛋白酶,能够特异性降解昆虫肠粘蛋白（IIM）,从而增强病毒或是Bt杀虫晶体蛋白对昆虫的感染。蜡状芽孢杆菌组发现了芽孢杆菌属的基因组中含有enhancin -like基因,它编码的肽段与病毒的增效蛋白相似性为20%30%,研究发现苏云金杆菌BMB171中的Enhancin-like蛋白能够降解棉铃虫幼虫的肠粘蛋白从而增强cry1Ac蛋白对棉铃虫的毒性,与病毒增效蛋白的作用相似。细菌中Enhancin-like蛋白的增效作用是否具有广谱性尚不明确。本研究从实验室保存的Bt菌株中筛选并成功克隆得到enhancin-like基因,提交GenBank登记,登录号为JF806504。该基因读码框为2202个碱基,编码733个氨基酸,预测的蛋白质的分子量为84kDa。Blastn结果发现其与病毒增效蛋白的相似性为22%25%,与细菌增效蛋白的相似性为96100%,并且具有保守锌结合结构域（HEIAH）,属于金属蛋白酶超家族成员。将重组表达质粒pET30a-enhancin-like转化E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测,enhancin-like基因在E.coli BL21（DE3）成功表达84 kDa的蛋白,再将enhancin-like基因连接到穿梭载体pSXY422b,电激转化HD73-（cry-）,构建工程菌,Western blot分析表明,enhancin-like基因能在HD73-（cry-）中稳定表达。利用亲和层析的方法得到纯化的Enhancin-like蛋白。纯化的Enhancin-like蛋白体外处理粉纹夜蛾和甜菜夜蛾围食膜,围食膜肠粘蛋白未降解。生物活性测定纯化的Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾幼虫,与单独用Cry9Ea蛋白饲喂粉纹夜蛾时,死亡率均为60%,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾时死亡率显着提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时无杀虫活性。用Cry9Ea蛋白单独饲喂甜菜夜蛾时,死亡率为5%,Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂后死亡率没有变化,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂甜菜夜蛾时死亡率显着提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时则无杀虫活性。生测结果表明Enhancin-like蛋白没有增加Cry9Ea蛋白的毒性。
周洪旭[8]（2009）在《两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定》文中提出围食膜（peritrophic matrix,PM）是大多数昆虫中肠内壁的一层厚薄均匀的长管状薄膜,成圆桶状把肠腔和中肠壁细胞分开,自中肠前端一直延伸至后肠。它主要由几丁质和蛋白质组成,是昆虫中肠天然的防御体系,具有保护中肠上皮细胞、阻止有害物质侵入和帮助消化等多种功能,是害虫生物防治的潜在靶标。鳃金龟是我国重要的地下害虫,其幼虫（蛴螬）在土壤中生活,取食植物的地下部分,并把周围的土壤颗粒、病原微生物等物质一同带入消化道,因此围食膜对蛴螬的生长发育具有重要的作用。本文采用生化和分子生物学技术等手段,对华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）和暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）围食膜的形态结构和化学组成进行了研究,构建了华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库,分离鉴定新的PM靶标蛋白,明确其生理功能,并研究生物防治促进因子对围食膜的作用与影响,寻找生物防治新靶标,为发展新的高效生物杀虫剂和鳃金龟的生物防治提供理论依据。1.通过光学显微镜和电子显微镜观察发现,鳃金龟幼虫围食膜位于中肠两端的两个“液囊环”（sac-circles）之间,是一层厚薄均匀的长管状薄膜,表面平滑致密,无孔无缝,具有一定弹性,但与鳞翅目昆虫围食膜相比,韧性较差,解剖时其围食膜易破碎。应用Bradford法和苯酚-硫酸法,测定华北大黑鳃金龟围食膜蛋白含量为36.38%,糖含量为8.84%;暗黑鳃金龟围食膜蛋白含量为38.26%,糖含量为9.08%。2.SDS-PAGE分析发现华北大黑鳃金龟PM蛋白至少有28条多肽,暗黑鳃金龟比较清楚的PM蛋白带有15条,而鳞翅目昆虫粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫和粘虫PM蛋白分别有19、17、16和9条,与鳞翅目昆虫围食膜相比,华北大黑鳃金龟围食膜蛋白种类相对较多。肠粘蛋白（insect intestinal mucin, IIM）是昆虫围食膜中的重要蛋白,而应用TnPM-IIM特异性抗血清对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜蛋白做Western blot检测,未发现两种鳃金龟围食膜中有类似于鳞翅目昆虫的粘蛋白。3.应用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit、Oligotex mRNA Mini Kit以及Stratagene公司cDNA Synthesis Kit,成功构建了华北大黑鳃金龟3龄幼虫中肠cDNA表达文库,原始文库滴度为1.9×106 pfu/mL,扩增后滴度为1.4×109pfu/ml,文库重组率为99.97%,插入片段在0.8-2.3kb之间,平均长度为1.6kb。4.应用Western blot检测发现棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体、粉纹夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体与华北大黑鳃金龟围食膜蛋白之间有交叉反应,并用这两种抗体免疫筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库,得到122个阳性克隆,测序及序列比对后得到Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin3、Ho-Peritrophin4四个华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因,Genbank登录号分别是FJ393548、FJ393549、FJ393550和FJ573145,最长读码框（ORF）分别编码729、477、528和324个氨基酸,含有9、6、5和4个几丁质结合功能域（CBD）,不含粘蛋白功能域,含有1-4个N-连糖基化位点,N端不含有信号肽。Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin4的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点大部分位于CBD内部,受到保护,不会被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解。而Ho-Peritrophin3的第5个CBD下游区域富含大量的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点。通过构建重组表达质粒,Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2和Ho-Peritrophin3在大肠杆菌中分别表达出78、51和57KD的目的蛋白,几丁质结合实验表明Ho-Peritrophin1和Ho-Peritrophin3具有几丁质结合活性。5.从华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库中筛选得到了HoSP1和HoSP2两种华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶全长基因,在Genbank登录号分别为FJ573146和FJ573147,开放阅读框（ORF）长783和786bp,编码260和261个氨基酸,均含有3对半胱氨酸残基,与CzSP3相似性最高,分别为52.47%和51.52%,催化活性中心位于His80、Asp125、Ser215,His80、Asp125、Ser216。通过构建重组表达质粒,HoSP1和HoSP2在大肠杆菌中表达出26.7kDa和27.1kDa的蛋白。筛选得到了华北大黑鳃金龟羧酸酯酶基因HoCL,在Genbank登录号为FJ573148,开放阅读框（ORF）长1599bp,编码532个氨基酸,含有3个半胱氨酸残基,具有Ser207,Asp333和His422的催化活性中心,推导的蛋白质分子量为59.5kDa,属于B类羧酸酯酶。6.以棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白和荧光增白剂FB28为先导物,测定了其对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟围食膜的作用和影响,发现棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白在不同浓度和不同时间下均不能降解两种鳃金龟的围食膜;采用液滴法喂食华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟10uL 1%的FB28,2.5h时,PM前端破损,扫描电镜观察中后段围食膜,发现围食膜上出现一些分布均匀的空洞;喂食至6h时,PM完全崩解,喂食至12h,PM基本恢复。可见,荧光增白剂FB28能够破坏鳃金龟围食膜,但破坏作用是短暂的、可修复的。为进一步研究荧光增白剂与病原微生物联合使用防治鳃金龟提供了理论依据。
方尚玲[9]（2009）在《苏云金芽胞杆菌bel基因生物学功能》文中进行了进一步梳理以苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株YBT-1520的bel（Bacillusenhancin like）基因为研究对象,对苏云金芽胞杆菌的Bel蛋白的增效活性和增效机制做了深入研究,从而进一步认识bel基因的生物学功能。主要研究结果如下:1.BMB171中bel基因的敲除和生物活性的测定利用同源重组的方法敲除BMB171菌株中的bel蛋白基因,得到了突变株BMB1084。将表达杀虫晶体蛋白基因cry1Ac的重组质粒pBMB1086转入菌株BMB171和突变株BMB1084,分别构建重组菌BMB1087和BMB1088。用两个重组菌的胞晶混合物分别感染棉铃虫一龄幼虫,结果重组菌BMB1087和BMB1088的LC50分别为0.46mL/mL和2.73mL/mL,增效倍数为5.83,表明未敲除bel基因的Bt能提高Cry1Ac对棉铃虫幼虫的毒力。2.bel基因的大量表达和生物活性的测定从苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株中扩增出增效蛋白基因bel,以pGEX-6p-1为载体在大肠杆菌BL21中表达融合增效蛋白,通过亲和层析提纯到该融合增效蛋白,并测定其分子量为113KD。以棉铃虫为供试昆虫,测定Bel蛋白对杀虫晶体蛋白Cry1Ac杀虫的增效活性,结果显示当配比为Bel蛋白（0.8ug/mL）+Cry1Ac（3ug/mL）时,棉铃虫的死亡率为74.4%,比不添加Bel蛋白的34.2%增加120%,说明Bel蛋白能显着提高Cry1Ac对棉铃虫幼虫的毒力。同时以仅含Bel蛋白（1ug/mL）的饲料喂养棉铃虫,实验结果显示增效蛋白可以明显减缓棉铃虫幼虫体重的增长,说明该增效蛋白对棉铃虫生长有弱化作用。3.Bel蛋白增效机制的研究通过体内和体外Bel蛋白的增效机制的探讨,找出Bel蛋白增效机制。体内增效机制研究:将含Bel蛋白（1ug/mL）的饲料喂养5龄棉铃虫1.5天,提取棉铃虫围食膜（PM）,通过扫描电镜的观察,发现喂食Bel蛋白的棉铃虫PM较薄并且有穿孔现象。这样加大了Cry1Ac穿过PM的量,通过增加感染量来增加了Cry1Ac和肠上皮细胞受体结合的量。体外增效机制研究（此结果由河北农业大学提供）:用2ug/mL的Bel蛋白处理T.ni围食膜,SDS-PAGE后,以T.niⅡM抗体作为一抗,进行Western Blot检测。同时以T.ni的Enhancin蛋白处理T.ni围食膜作阳性对照,结果Bel蛋白可以体外降解T.ni的ⅡM。同样2ug/mL Bel蛋白体外处理HaⅡM86蛋白4小时后,SDS-PAGE后,以HaⅡM86抗体作为一抗,Western Blot检测。结果Bel蛋白可以体外降解棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86。4.高效杀虫的苏云金芽胞杆菌基因工程菌的构建利用了Bel蛋白的增效特性,构建出了一株高效杀虫的苏云金芽胞杆菌基因工程菌BMB171/pHT304/bel+cry1Ac。结果:导入了bel基因的工程菌BMB0187对棉铃虫的杀虫毒力明显比未导入bel基因的菌株BMB171/pHT304/cry1Ac强,而且相对增效倍数为3倍。
徐健[10]（2008）在《粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌增效作用及应用》文中进行了进一步梳理苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是研究应用最为广泛的生物杀虫剂,实际使用中存在作用速度慢、防效低等弱点。美洲粘虫颗粒体病毒（Pseudaletia unipuncta granulosis virus , PuGV ）是含有增效蛋白（ enhancin）的杆状病毒（Baciluvirus）,能提高核型多角体病毒（nuclear polyhedrosis virus,NPV）的侵染能力及Bt的毒力。本文以Bt和东方粘虫P. separata转主增殖的美洲粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）为材料,明确了PuGV-Ps对Bt的增效作用和增效特性;并从PuGV-Ps对杀虫晶体蛋白的酶解活化、昆虫中肠酶活性的变化、昆虫中肠围食膜（peritrophic membrane,PM）结构的破坏等方面探索了增效机理;克隆和测序了PuGV-Ps增效蛋白基因并原核表达了增效蛋白;研制了PuGV-Ps对Bt的增效制剂,并明确了其应用效果。主要结果如下:1明确了PuGV-Ps对Bt的增效作用以小菜蛾Plutella xylostella、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、棉铃虫Helicoverpa armigera为试虫,采用生物测定方法测定了PuGV-Ps对Bt制剂的增效作用。结果表明Bt中加入PuGV-Ps对3种鳞翅目害虫都具有增效作用,共毒系数达127-146。高温灭活的PuGV-Ps对Bt同样具有增效作用,对小菜蛾的共毒系数达135.8,说明PuGV-Ps中含有对Bt毒力增强作用的增效因子。PuGV-Ps可以提高Bt对小菜蛾的杀虫速度,250μg/mL浓度的Bt中加入PuGV-Ps较单用Bt致死中时间LT50缩短了37.8%。转Bt基因的抗虫棉叶经PuGV-Ps处理后饲喂棉铃虫死亡率也得到相应提高。PuGV-Ps还能增强Bt对甜菜夜蛾生长发育的抑制作用,表现为幼虫生长量相对减少、蛹重下降、化蛹率降低和化蛹历期延长。2分离纯化了PuGV-Ps增效蛋白并测定其对Bt的增效活性用PuGV感染东方粘虫获得的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps的包涵体中含有分子量为108 kD的增效蛋白。PuGV-Ps经碱溶、Sephadex G-200凝胶过滤层析分离获得部分纯化的增效蛋白。以小菜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫等3种鳞翅目昆虫为试虫测定部分纯化的增效蛋白对Bt的增效作用,联合作用的共毒系数在116-155之间,表明PuGV-Ps增效蛋白是一种增效因子,可以增强Bt鳞翅目昆虫的毒力。3探明了PuGV-Ps对Bt增效作用的影响因子PuGV-Ps对Bt的增效程度随PuGV-Ps量的变化而不同,试验范围内不同配伍的PuGV-Ps和Bt间的共毒系数在105.3至195.0之间,其中以Bt∶PuGV-Ps为4∶1增效作用最明显,72 h LC50为0.039 mg/mL。不同温度和pH都影响PuGV-Ps对Bt的增效作用,16℃20℃增效程度明显高于24℃32℃,而碱性条件下（pH 8-9）增效作用更显着。PuGV-Ps对Bt的增效作用因小菜蛾龄期不同而变化,2、3龄幼虫试验,小菜蛾死亡率较Bt分别提高了50%和30.31%,而对低龄（1龄）和高龄（4龄）幼虫增效不显着。PuGV-Ps饲喂2 h后接毒Bt,小菜蛾死亡率明显提高,48 h死亡率达66.67%,较Bt+PuGV-Ps处理死亡率提高了53.87%,差异显着。4分析了PuGV-Ps对苏云金杆菌δ-内毒素的酶解活化作用用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定PuGV-Ps中总蛋白酶活力表明,PuGV-Ps在pH 7.38-10.38的碱性条件下均具有一定的蛋白酶活性,且蛋白酶活力随pH的升高而显着提高。4种蛋白酶抑制剂都能抑制PuGV-Ps的蛋白酶活力,以大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）的抑制作用最强,表明PuGV-Ps的蛋白酶活性是以胰蛋白酶为主要活力的多种蛋白酶的活性特征。通过SDS-PAGE研究了PuGV-Ps对苏云金杆菌δ-内毒素的降解活化作用,结果表明,碱性条件下Bt晶体蛋白和PuGV-Ps共同孵育,130 kD的δ-内毒素被进一步酶解成分子量为110 kD、87 kD、61 kD、47 kD等多种不同分子量的肽链,其酶解活化程度随缓冲液pH的升高而加深,在pH 10.7的0.1 mol Na2CO3缓冲液中,δ-内毒素被完全酶解,产生具有一定抗蛋白酶继续降解能力的分子量为47 kD、60 kD和61 kD的活性片段。同时PuGV-Ps量的多少和碱解时间都影响δ-内毒素的酶解活化程度,STI能一定程度抑制PuGV-Ps对δ-内毒素的酶解活化。5明确了PuGV-Ps抑制甜菜夜蛾中肠液对δ-内毒素的过度降解PuGV-Ps具有蛋白酶活性,对甜菜夜蛾中肠酶液离体蛋白酶活力及取食PuGV-Ps后总蛋白酶活力影响测定表明,在中肠酶液适宜pH范围（pH 9.38-10.38）内,PuGV-Ps都一定程度抑制了中肠酶液的总蛋白酶活力。SDS-PAGE试验显示,PuGV-Ps影响了甜菜夜蛾中肠酶液对苏云金杆菌δ-内毒素的降解活化作用,表现在对中肠酶液酶解130 kD的δ-内毒素成60 kD-87 kD的较大分子量的活性多肽无明显影响,但对活性多肽的进一步降解具有抑制作用,这种过度降解的抑制作用在25℃-30℃的温度和随酶解时间的延长更为显着。不同缓冲液同样影响甜菜夜蛾中肠酶液对δ-内毒素的降解,Na2CO3盐的存在是影响降解程度的重要因子。6证实了PuGV-Ps并发现Bt对甜菜夜蛾中肠PM结构的破坏作用利用环境扫描电镜和SDS-PAGE电泳技术研究了Bt、PuGV-Ps及其增效蛋白对甜菜夜蛾中肠PM的影响。电镜观察结果表明,正常的甜菜夜蛾PM外壁有韧性,表面较平滑,少皱褶,内壁表面较粗糙,有较厚质感,无孔洞和缝隙;取食PuGV-Ps或增效蛋白后的PM外壁皱缩,内壁平滑、质薄;Bt单独作用于PM同样改变了围食膜结构,但影响程度较小;但不同处理未发现对甜菜夜蛾PM造成穿孔或裂缝。中肠PM蛋白的SDS-PAGE试验表明,取食PuGV-Ps和增效蛋白后,PM上200 kD、150 kD、80 kD的大分子量的蛋白一定程度被降解成78 kD以下的小分子量蛋白带,小分子量27 kD的蛋白也被部分降解,而分子量为28 kD的小分子蛋白同时被完全降解;Bt也影响了PM蛋白的构成,取食Bt的PM蛋白电泳减少了28 kD的小分子蛋白,说明甜菜夜蛾PM上28 kD的蛋白是PuGV-Ps增效蛋白和Bt的共同靶蛋白。离体降解试验进一步证明Bt及增效蛋白对甜菜夜蛾PM上28 kD蛋白具有降解作用。7克隆和测序了PuGV-Ps增效蛋白的全长基因以PuGV-Ps的DNA为模板,参考粉纹夜蛾颗粒体病毒（TnGV）和棉铃虫颗粒体病毒（HaGV）的增效蛋白基因序列设计引物,通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段。纯化的PCR产物克隆到载体质粒pEASY-E2中,构建了重组质粒pEASY-En;用DNA双链测序法测定重组质粒pEASY-En中的外源基因序列,证明PCR扩增的产物是PuGV转宿主病毒PuGV-Ps增效蛋白的全长基因。与原始PuGV基因组增效蛋白的序列比较,两者同源性达99.59%,其中5’端500 nt相似性为98.60%,而3’端500 nt仅1个碱基发生突变。说明PuGV-Ps增效蛋白基因的3’端是基因的保守区域。8原核表达了PuGV-Ps增效蛋白并测定了表达蛋白的增效活性以大肠杆菌BL21（DE3）为感受态细胞,将插入PuGV-Ps增效蛋白基因的重组质粒pEASY-En转化到大肠杆菌中,构建了重组菌,于37℃下通过IPTG诱导表达了108 kD的表达产物。表达的目的蛋白带有6×His标签,能特异性吸附在Ni2+上并得到纯化,证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Bt对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性,600μg/g Bt浓度中加入300μg/g增效蛋白表达产物后甜菜夜蛾死亡率提高了10%,400μg/g Bt浓度中加入400μg/g增效蛋白表达产物后,棉铃虫死亡率由23.67%提高至38.67%,差异显着。随表达产物量的增加,增效作用更为显着。9研制了PuGV-Ps增强Bt制剂,并明确了其应用效果依据PuGV-Ps对Bt的增效作用,采用人工增PuGV-Ps、液体发酵Bt和喷雾干燥加工技术,研制了一种病毒增强Bt可湿性粉剂。该制剂主要成份为PuGV-Ps和Bt,含量为3.0×109OB/g PuGV-Ps·1.0×1010活芽孢/g Bt,共毒系数达162.57。该制剂毒性微毒,大白鼠经口LD50大于5000 mg/kg,无致敏和刺激性,无致病性,对鱼、鸟和蜜蜂均为低毒。田间应用结果表明,对小菜蛾、甜菜夜蛾、水稻纵卷叶螟Canphalocrocis medinalis等多种害虫都有较好防效。2000μg/mL浓度对小菜蛾2 d、7 d的防效达86.74%和79%,较Bt单剂的防效分别提高了23.5%和29.7%,差异显着;对甜菜夜蛾10 d防效达61.22%,与阿维菌素（Abamectin）1000μg/mL防效相当;水稻田使用病毒增强Bt 1500 g/ha对稻纵卷叶螟7 d防效达80.77%,高于Bt单剂71.15%的防效;使用病毒增强Bt对稻田蜘蛛无影响,药后7 d田间蜘蛛减少率为3.92%,而阿维菌素等对蜘蛛杀伤率达34.39%。
二、棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达（论文提纲范文）
（1）杆状病毒增效因子及其增效机理（论文提纲范文）
| 1 增效因子的种类 |
| 1.1 蛋白类增效因子 |
| (1)杆状病毒增效蛋白(Enhancin) |
| (2)昆虫痘病毒纺锤体蛋白(Fusolin) |
| (3)杆状病毒GP37蛋白 |
| 1.2 酶类增效因子 |
| (1)几丁质酶(Chitinase) |
| (2)组织蛋白酶(Cathepsin) |
| 1.3 其他增效因子 |
| (1)荧光增白剂(Calcofluor) |
| (2)几丁质合成抑制剂 |
| 2 增效因子的增效机理 |
| 2.1 影响昆虫围食膜的完整性和渗透性 |
| (1)通过作用于几丁质破坏昆虫围食膜的完整性 |
| (2)通过降解围食膜蛋白增大围食膜的渗透性 |
| (3)通过自身尖端结构刺穿围食膜形成穿孔 |
| 2.2 促进病毒粒子与中肠微绒毛吸附并介导其与中肠上皮细胞融合 |
| 2.3 其他 |
| 3 展望 |
（3）转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 Pu GV-Ps基因组DNA及质粒DNA提取 |
| 1.2.2 Pu GV-Ps增效蛋白基因的PCR扩增 |
| 1.2.3 Pu GV-Ps增效蛋白基因重组质粒的构建和测序 |
| 1.2.4 大肠杆菌转化菌株的诱导表达和纯化 |
| 1.2.5 增效蛋白表达产物对Btδ-内毒素的增效活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Pu GV-Ps增效蛋白基因的PCR扩增 |
| 2.2 Pu GV-Ps增效蛋白基因的克隆和测序 |
| 2.3 重组增效蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.4 重组增效基因表达产物对Btδ-内毒素的增效活性 |
| 3 讨论 |
（4）黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 病毒纯化及其DNA的制备 |
| 3 引物设计 |
| 5 目的基因扩增、克隆及测序 |
| 6 表达质粒的构建 |
| 7 EnN-As蛋白的表达、纯化和抗体制备 |
| 8 En-As蛋白的表达及Western blot鉴定 |
| 9 En-As与EnN-As对HaNPV的增效作用研究 |
| 9.1 蛋白处理液的制备 |
| 9.2 生物测定 |
| 10 生物信息学分析 |
| 结 果 |
| 1 En-As和EnN-As编码序列的克隆 |
| 2 序列分析 |
| 3 表达载体的构建与鉴定 |
| 4 抗体的制备及检测 |
| 5 En-As蛋白的表达及Western blot鉴定 |
| 6 表达蛋白的功能研究 |
| 讨 论 |
（5）一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒分类学 |
| 1.1.2 杆状病毒对宿主的侵染过程 |
| 1.1.3 杆状病毒基因组研究 |
| 1.1.4 影响宿主功能的杆状病毒基因 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 第二章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒株和多角体病毒纯化 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 扫描电镜样品的制备 |
| 2.2.2 透射电镜样品的制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 扫描电镜观察 |
| 2.3.2 透射电镜观察 |
| 第三章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒和菌种 |
| 3.1.2 昆虫细胞及病毒 |
| 3.1.3 试验昆虫 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 细菌培养基 |
| 3.1.6 昆虫细胞培养基 |
| 3.1.7 常用溶液及缓冲液 |
| 3.1.8 实验仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的传代 |
| 3.2.2 细胞的冻存 |
| 3.2.3 细胞的复苏 |
| 3.2.4 病毒感染细胞 |
| 3.2.5 昆虫添食病毒 |
| 3.2.6 碱法少量快速抽提质粒 DNA |
| 3.2.7 限制性内切酶反应 |
| 3.2.8 玻璃奶法纯化回收 DNA 片段 |
| 3.2.9 DNA 的连接 |
| 3.2.10 感受态细胞的小量制备 |
| 3.2.11 感受态细胞的大量制备 |
| 3.2.12 质粒 DNA 的转化 |
| 3.2.13 快速细胞破碎法鉴定重组质粒 |
| 3.2.14 绝对定量 PCR |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HearMNPV 对宿主细胞的感染（体外复制） |
| 3.3.2 HearMNPV 在棉铃虫体内的复制 |
| 3.3.3 HearMNPV 对其它昆虫的感染 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 半补齐法构建棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组文库 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HearMNPV 的扩增 |
| 4.2.2 多角体病毒 DNA 的提取 |
| 4.2.3 用 Sau3AⅠ酶对 HearMNPV 基因组 DNA 随机切割 |
| 4.2.4 半补齐反应 |
| 4.2.5 连接与转化 |
| 4.2.6 插入片断大小鉴定及文库覆盖率 |
| 4.2.7 DNA 测序 |
| 4.2.8 基因组序列组装 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 ORF 的确定 |
| 5.1.2 启动子基序搜索 |
| 5.1.3 同源重复区（hrs）的寻找 |
| 5.1.4 基因组内容、组织及排列分析 |
| 5.1.5 系统进化分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 HearMNPV 基因组核苷酸序列分析 |
| 5.2.2 基因对等图分析 |
| 5.2.3 系统进化分析 |
| 5.2.4 HearMNPV 与 MacoNPV-B 基因组结构的比较 |
| 5.2.5 HearMNPV ORF6644 |
| 5.2.6 HearMNPV ORF1746 |
| 5.2.7 HearMNPV unique ORF |
| 5.2.8 bro genes |
| 5.2.9 hrs |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 6.2 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 6.3 半补齐法构建 HearMNPV 基因组文库 |
| 6.4 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 围食膜的分类、形成及组分 |
| 1.1.1 围食膜的种类 |
| 1.1.2 围食膜的形成机制 |
| 1.1.3 围食膜的组分 |
| 1.2 围食膜的结构及功能 |
| 1.2.1 围食膜的结构模型 |
| 1.2.2 围食膜的功能 |
| 1.3 围食膜内潜在的害虫防治靶标位点 |
| 1.4 昆虫杆状病毒表达系统 |
| 1.4.1 昆虫杆状病毒表达系统的特点 |
| 1.4.2 昆虫杆状病毒表达系统的应用 |
| 1.4.3 影响杆状病毒表达系统表达外源蛋白的因素 |
| 1.4.4 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 |
| 1.5 选题依据及目的意义 |
| 第2章 华北大黑鳃金龟幼虫中肠cDNA 表达文库的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试菌株及试剂盒 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂及溶液 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 华北大黑鳃金龟中肠组织的收集 |
| 2.2.2 总 RNA 的提取 |
| 2.2.3 mRNA 分离纯化 |
| 2.2.4 cDNA 的合成 |
| 2.2.5 cDNA 的分级、纯化及定量 |
| 2.2.6 cDNA 与载体λZAP 的连接与包装 |
| 2.2.7 cDNA 文库重组率、库容量检测 |
| 2.2.8 cDNA 文库的扩增 |
| 2.2.9 cDNA 文库质量鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总RNA 的提取 |
| 2.3.2 mRNA 的分离纯化 |
| 2.3.3 cDNA 第一链和第二链的合成 |
| 2.3.4 cDNA 分级分离及定量 |
| 2.3.5 cDNA 文库的滴度及重组率检测 |
| 2.3.6 cDNA 文库插入片断大小的PCR 鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 cDNA 文库的构建方法 |
| 2.4.2 影响cDNA 文库构建质量的因素 |
| 2.4.3 cDNA 文库的应用 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 华北大黑鳃金龟cDNA 表达文库的免疫筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 文库、抗体及宿主菌 |
| 3.1.2 主要工具酶及试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 XL1-Blue 大肠杆菌感受态的制备 |
| 3.2.2 cDNA 文库单克隆的制备 |
| 3.2.3 转膜 |
| 3.2.4 免疫和显色反应 |
| 3.2.5 阳性克隆的第二轮筛选 |
| 3.2.6 阳性克隆的鉴定 |
| 3.2.7 cDNA 的序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 阳性克隆的筛选 |
| 3.3.2 阳性克隆的鉴定 |
| 3.3.3 阳性克隆基因的序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 cDNA 文库的免疫筛选 |
| 3.4.2 影响免疫筛选的因素 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 华北大黑鳃金龟围食膜几丁质结合蛋白 HoCBP2 及HoCBP76 的克隆、表达及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株、细胞及载体 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 CBP 基因的克隆与测序分析 |
| 4.1.4 CBP 基因的原核表达 |
| 4.1.5 CBP 基因的真核表达 |
| 4.1.6 CBP 蛋白功能检测 |
| 4.1.7 CBP 蛋白在H.oblita 幼虫组织中的免疫定位 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HoCBP2 及HoCBP76 的序列分析 |
| 4.2.2 HoCBP2 及HoCBP76 的原核表达 |
| 4.2.3 HoCBP2 和HoCBP76 在Bac-to-Bac 系统中的表达 |
| 4.2.4 HoCBP2 和HoCBP76 重组蛋白的几丁质活性检测 |
| 4.2.5 CBP 蛋白在H.oblita 幼虫组织中的免疫定位 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 华北大黑鳃金龟几丁质酶HoChi 的分离鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株、细胞及载体 |
| 5.1.2 主要试剂及工具酶 |
| 5.1.2 几丁质酶HoChi 基因的鉴定与测序分析 |
| 5.1.3 几丁质酶HoChi 基因的原核表达 |
| 5.1.4 几丁质酶HoChi 基因的真核表达 |
| 5.1.5 重组杆状病毒DNA 的提取及PCR 鉴定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 HoChi 基因的序列分析 |
| 5.2.2 华北大黑鳃金龟HoChi 与几种其他昆虫几丁质酶氨基酸序列的比较分析 |
| 5.2.3 华北大黑鳃金龟HoChi 重组载体的构建和表达 |
| 5.2.4 几丁质酶HoChi 基因的真核表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 HoChi 基因属于典型的昆虫18 家族Ⅰ亚族几丁质酶 |
| 5.3.2 HoChi 基因序列保守性分析 |
| 5.3.3 华北大黑鳃金龟幼虫中肠HoChi 基因的应用前景 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶HoSCP 的分离鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 H.oblita 中肠cDNA 文库的筛选及序列分析 |
| 6.1.3 HoSCP 基因的原核表达 |
| 6.1.4 HoSCP 基因的真核表达 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 HoSCP 基因序列分析 |
| 6.2.2 丝氨酸羧肽酶的原核表达 |
| 6.2.3 丝氨酸羧肽酶的真核表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 华北大黑鳃金龟围食膜肠粘蛋白HoIIM 的分离鉴定 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 供试昆虫及试剂 |
| 7.1.2 H.oblita 幼虫围食膜的提取 |
| 7.1.3 PAS 染色所需试剂的配制 |
| 7.1.4 H.oblita 幼虫围食膜蛋白组分分析 |
| 7.1.5 病毒增效蛋白Enhancin 对H.oblita 幼虫围食膜的影响 |
| 7.1.6 H.oblita 中肠cDNA 表达文库的筛选及HoIIM 的测序分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 H.oblita 幼虫围食膜蛋白组分分析 |
| 7.2.2 Enhancin 对H.oblita 幼虫围食膜的影响 |
| 7.2.3 HoIIM 基因的序列分析 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 颗粒体病毒增效蛋白对昆虫围食膜的影响 |
| 7.3.2 IIM 的结构特征 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（7）苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 苏云金杆菌概述 |
| 1.1.1 苏云金杆菌的毒力因子 |
| 1.1.2 杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白的杀虫机理 |
| 1.1.4 杀虫晶体蛋白的应用 |
| 1.1.5 杀虫晶体蛋白与其它物质间的增效 |
| 1.1.6 苏云金杆菌存在的问题及解决方法 |
| 1.2 昆虫杆状病毒增效蛋白 |
| 1.2.1 昆虫杆状病毒增效蛋白的发现及其增效活性 |
| 1.2.2 增效蛋白的生化特性 |
| 1.2.3 增效蛋白的作用机理 |
| 1.2.4 昆虫病毒增效蛋白的应用 |
| 1.3 细菌中增效蛋白类似基因的发现及研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试昆虫与颗粒体病毒 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 常用仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 E. coli 质粒DNA 的提取 |
| 2.2.2 Bt 菌株质粒DNA 的提取 |
| 2.2.3 enhancin-like 基因的克隆 |
| 2.2.4 基因的序列的测定与分析 |
| 2.2.5 enhancin-like 基因在E. coli 中的诱导表达 |
| 2.2.6 目的蛋白的纯化 |
| 2.2.7 目的蛋白的定量及抗体制备 |
| 2.2.8 工程菌的构建 |
| 2.2.9 Western blot 检测外源蛋白的表达 |
| 2.2.10 Cry9Ea 蛋白的制备及蛋白浓度测定 |
| 2.2.11 粉纹夜蛾颗粒体病毒TnGV 的活体增殖与纯化 |
| 2.2.12 Enhancin-like 蛋白体外处理围食膜 |
| 2.2.13 Enhancin-like 蛋白对Cry9Ea6 蛋白的增效作用分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 enhancin-like 基因的PCR 鉴定 |
| 3.2 enhancin-like 基因的克隆 |
| 3.3 enhancin-like 基因的序列测定与分析 |
| 3.4 enhancin-like 基因在E. coli 中的诱导表达 |
| 3.5 enhancin-like 蛋白的纯化及定量 |
| 3.6 Bt 工程菌的构建和分子检测 |
| 3.7 工程菌HDenhancin-like 的western bolt 分析 |
| 3.8 Enhancin-like 蛋白对围食膜的作用 |
| 3.9 Enhancin-like 蛋白与Cry9Ea 蛋白的协同作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 缩略词 |
| 附录 2 GenBank 登记资料 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（8）两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 昆虫中肠防御体系-围食膜 |
| 1.1.1 围食膜的结构组成 |
| 1.1.2 围食膜的功能 |
| 1.1.3 围食膜的形成及机理 |
| 1.2 生物防治促进因子 |
| 1.2.1 病毒增效蛋白 |
| 1.2.2 荧光增白剂 |
| 1.2.3 几丁质酶及几丁质合成抑制剂对围食膜的作用 |
| 1.2.4 外源凝集素对围食膜的作用 |
| 1.3 cDNA 文库—研究新基因的有效工具 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试昆虫病原微生物 |
| 2.1.3 供试菌株及试剂盒 |
| 2.1.4 供试抗体 |
| 2.1.5 常用培养基 |
| 2.1.6 常用试剂及溶液 |
| 2.1.7 常用蛋白与DNA Marker |
| 2.1.8 常用仪器设备 |
| 2.2 方法步骤 |
| 2.2.1 围食膜的形态观察 |
| 2.2.2 围食膜组分含量测定 |
| 2.2.3 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的构建 |
| 2.2.4 围食膜蛋白的筛选 |
| 2.2.5 围食膜蛋白基因的原核表达及特性鉴定 |
| 2.2.6 丝氨酸蛋白酶的原核表达 |
| 2.2.7 增效蛋白对PM 的作用 |
| 2.2.8 荧光增白剂FB28对PM的作用与影响 |
| 2.2.9 低温对鳃金龟围食膜的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鳃金龟围食膜结构与组成 |
| 3.1.1 PM 的生理位置 |
| 3.1.2 PM 的结构组成 |
| 3.2 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的构建 |
| 3.2.1 总RNA 的提取 |
| 3.2.2 cDNA 第一链、第二链的合成 |
| 3.2.3 cDNA 分级分离及定量 |
| 3.2.4 文库的容量及重组率 |
| 3.2.5 PCR 鉴定文库插入片段大小 |
| 3.3 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的筛选 |
| 3.3.1 利用棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库 |
| 3.3.2 利用粉纹夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库 |
| 3.3.3 华北大黑鳃金龟PM 蛋白基因序列分析 |
| 3.4 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因的原核表达及特性鉴定 |
| 3.4.1 重组表达质粒 PET-21b-Ho-Peritrophin 的构建 |
| 3.4.2 重组子的鉴定 |
| 3.4.3 围食膜蛋白在原核系统的表达 |
| 3.4.4 重组围食膜蛋白的几丁质结合活性 |
| 3.5 丝氨酸蛋白酶与羧酸酯酶的筛选与鉴定 |
| 3.5.1 丝氨酸蛋白酶的筛选与鉴定 |
| 3.5.2 羧酸酯酶的筛选与序列分析 |
| 3.6 生物防治促进因子对鳃金龟围食膜的影响 |
| 3.6.1 增效蛋白对PM 的影响 |
| 3.6.2 荧光增白剂 FB28 对 PM 的作用与影响 |
| 3.7 低温对PM 的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鳃金龟围食膜结构与组成 |
| 4.1.1 PM 的形态与结构分析 |
| 4.1.2 PM 蛋白及糖含量分析 |
| 4.2 cDNA 文库的构建 |
| 4.2.1 高质量的RNA 和载体 |
| 4.2.2 cDNA 文库质量 |
| 4.3 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的分离及鉴定 |
| 4.3.1 华北大黑鳃金龟中肠cDNA 文库的筛选 |
| 4.3.2 华北大黑鳃金龟围食膜蛋白基因克隆及鉴定 |
| 4.4 丝氨酸蛋白酶与羧酸酯酶 |
| 4.4.1 丝氨酸蛋白酶 |
| 4.4.2 羧酸酯酶 |
| 4.5 增效蛋白及荧光增白剂对PM 的作用 |
| 4.5.1 增效蛋白对PM 的作用 |
| 4.5.2 荧光增白剂对PM 的作用与影响 |
| 4.6 问题与展望 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）苏云金芽胞杆菌bel基因生物学功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫活性和杀虫机理 |
| 1.1.3 昆虫体内可能对Bt杀虫晶体蛋白产生抗性的环节 |
| 1.1.4 苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌群的系统学关系 |
| 1.1.5 苏云金芽胞杆菌与昆虫的关系 |
| 1.2 昆虫围食膜 |
| 1.2.1 围食膜的种类 |
| 1.2.2 围食膜组成成分及理化特性 |
| 1.2.3 围食膜的功能 |
| 1.2.4 昆虫肠粘蛋白 |
| 1.3 昆虫杆状病毒增效蛋白 |
| 1.3.1 增效蛋白及其杀虫增效作用 |
| 1.3.2 昆虫病毒增效蛋白的功能域和氨基酸特征 |
| 1.3.3 昆虫病毒增效蛋白对昆虫的弱化作用 |
| 1.4 Bt中的增效蛋白类似基因 |
| 1.5 科学问题 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 本研究的学术思想、理论根据及创新之处 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 供试昆虫及饲料 |
| 2.1.3 试剂,培养基,仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA常规操作 |
| 2.2.1.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.1.2 DNA的体外重组操作 |
| 2.2.1.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.1.4 PCR扩增 |
| 2.2.2 SDS-PAGE蛋白质电泳 |
| 2.2.2.1 菌体蛋白样品的制备 |
| 2.2.2.2 SDS-PAGE凝胶的制备 |
| 2.2.2.3 电泳、染色及脱色 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌菌株BMB171中bel基因的敲除 |
| 2.2.3.1 同源重组 |
| 2.2.3.2 复红简单染色 |
| 2.2.3.3 伴胞晶体的培养 |
| 2.2.3.4 生物测定 |
| 2.2.3.5 菌体生长时间与菌体OD_(600)值对应曲线 |
| 2.2.4 Cry1Ac晶体蛋白的表达 |
| 2.2.5 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯和定量 |
| 2.2.6 苏云金芽胞杆菌bel的表达 |
| 2.2.7 苏云金芽胞杆菌Bel的提纯,定量和分子量的测定 |
| 2.2.8 苏云金芽胞杆菌Bel的增效活性测定 |
| 2.2.8.1 感染液的配制 |
| 2.2.8.2 感染饲料的配制 |
| 2.2.8.3 接虫感染 |
| 2.2.8.4 结果统计及数据分析处理 |
| 2.2.9 苏云金芽胞杆菌增效蛋白对棉铃虫生长的弱化作用 |
| 2.2.9.1 感染液的配制 |
| 2.2.9.2 接虫感染 |
| 2.2.9.3 数据处理 |
| 2.2.10 PM and IIM的制作 |
| 2.2.11 石蜡切片制作 |
| 2.2.12 扫描电镜样品的制作 |
| 2.2.13 Western blot |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 bel基因的克隆及序列分析 |
| 3.2 BMB171突变体的构建 |
| 3.2.1 整合载体的构建 |
| 3.2.2 突变体的筛选及验证 |
| 3.2.3 BMB171和突变株BMB1084比较 |
| 3.2.3.1 BMB171与突变株BMB1084生长情况的比较 |
| 3.2.3.2 BMB171与突变株BMB1084芽胞形成的比较 |
| 3.2.4 Bel蛋白基因对Bt杀棉铃虫幼虫的增效杀虫活性 |
| 3.2.4.1 晶体蛋白基因cry1Ac在BMB171和突变株BMB1084表达 |
| 3.2.4.2 生物测定 |
| 3.3 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的表达、提纯和检测 |
| 3.4 增效蛋白Bel的原核表达,提纯及定量检测 |
| 3.4.1 Bel蛋白的表达 |
| 3.4.2 增效蛋白Bel的提纯 |
| 3.4.3 增效蛋白Bel的定量检测 |
| 3.5 生物活性测定 |
| 3.5.1 增效蛋白对Cry1Ac杀虫的增效活性的测定 |
| 3.6 增效蛋白Bel对棉铃虫幼虫生长的弱化作用 |
| 3.7 Bel蛋白的增效机制研究 |
| 3.7.1 体内Bel蛋白增效机制研究实验 |
| 3.7.2 体外Bel蛋白体外降解肠粘蛋白活性 |
| 3.7.2.1 Bel对粉纹夜蛾肠粘蛋白PM的作用 |
| 3.7.2.2 Bel对棉铃虫肠粘蛋白HaIIM86的作用 |
| 3.8 利用增效蛋白bel基因构建苏云金芽胞杆菌高效杀虫基因工程菌 |
| 3.8.1 含bel基因的大肠杆菌-苏云金芽胞杆菌穿梭表达载体的构建 |
| 3.8.2 增效蛋白Bel和杀虫晶体蛋白Cry1Ac共表达载体的构建 |
| 3.8.3 增效蛋白基因bel在苏云金芽胞杆菌BMB171中的表达 |
| 3.8.4 苏云金芽胞杆菌高效杀虫工程菌BMB0187对棉铃虫的生物测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Bel蛋白与病毒Enhancin蛋白的氨基酸序列比较 |
| 4.2 Bel蛋白的表达和增效作用 |
| 4.3 蜡状芽胞杆菌群的系统学关系 |
| 4.4 bel基因的来源 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 待发表论文和专利 |
| 附录 YBT1520的bel基因序列 |
（10）粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌增效作用及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照词 |
| 第1章 研究背景和思路 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 苏云金杆菌的杀虫作用 |
| 1.2.1 苏云金杆菌的致病因子 |
| 1.2.2 δ-内毒素的作用机理 |
| 1.3 苏云金杆菌的增效途径 |
| 1.3.1 苏云金杆菌杀虫毒素间的增效作用 |
| 1.3.2 苏云金杆菌与其他病原微生物的增效作用 |
| 1.3.3 苏云金杆菌与化学农药间的增效作用 |
| 1.3.4 苏云金杆菌与化学添加剂和植物次生物质的增效作用 |
| 1.4 昆虫杆状病毒的增效作用 |
| 1.4.1 杆状病毒的增效作用及增效蛋白 |
| 1.4.2 增效蛋白的性质 |
| 1.4.3 增效蛋白的基因定位、测序和克隆 |
| 1.4.4 增效蛋白的作用机理 |
| 1.5 存在的问题和本研究的目的意义 |
| 1.6 研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 1.6.3 主要研究方法 |
| 参考文献 |
| 第2章 PuGV-Ps 对Bt 的增效作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PuGV-Ps 和 Bt 对不同昆虫的增效活性测定 |
| 2.3.2 灭活 PuGV-Ps 对 Bt 毒力的增效作用 |
| 2.3.3 PuGV-Ps 对 Bt 杀虫速度的影响 |
| 2.3.4 PuGV-Ps 对转 Bt 抗虫棉的增效作用 |
| 2.3.5 PuGV-Ps 与 Bt 共同作用对甜菜夜蛾幼虫生长发育的抑制作用 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 PuGV-Ps 增效蛋白的纯化及对Bt 增效作用测定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PuGV-Ps 的转主增殖及病毒形态 |
| 3.3.2 PuGV-Ps 增效蛋白的SDS-PAGE 电泳结果 |
| 3.3.3 凝胶柱层析分离纯化 PuGV-Ps 增效蛋白 |
| 3.3.4 分离纯化增效蛋白的增效活性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 PuGV-Ps 对Bt 的增效作用的影响因子 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PuGV-Ps 与 Bt 不同配比的增效作用 |
| 4.3.2 不同温度、pH 对PuGV-Ps 提高Bt 毒力的影响 |
| 4.3.3 PuGV-Ps 与 Bt 对不同龄期小菜蛾幼虫的增效作用 |
| 4.3.4 PuGV-Ps 取食时间对 Bt 毒力的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第5章 PuGV-Ps 对苏云金杆菌δ-内毒素的酶解活化作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PuGV-Ps 的蛋白酶活性检测 |
| 5.3.2 PuGV-Ps 对δ-内毒素的酶解活化作用测定 |
| 5.3.3 不同碱解时间和 pH 对 PuGV 酶解活化 δ-内毒素的影响 |
| 5.3.4 蛋白酶抑制剂对 PuGV-Ps 酶解作用的抑制作用 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第6章 PuGV-Ps 对甜菜夜蛾中肠液过度降解δ-内毒素的抑制作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PuGV-Ps 对甜菜夜蛾中肠酶活性的抑制作用 |
| 6.3.2 PuGV-Ps 抑制中肠酶液过度降解 δ-内毒素的测定 |
| 6.3.3 不同温度和 pH 条件下 PuGV-Ps 抑制中肠液过度降解δ-内毒素作用 |
| 6.3.4 甜菜夜蛾中肠液在不同缓冲液降解δ-内毒素的变化 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第7章 PuGV-Ps 和Bt 对甜菜夜蛾中肠围食膜的破坏作用 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 试验材料 |
| 7.2.2 试验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 PuGV-Ps 和 Bt 破坏甜菜夜蛾围食膜外壁的电镜观察 |
| 7.3.2 PuGV-Ps 和Bt 破坏甜菜夜蛾围食膜内壁电镜观察 |
| 7.3.3 PuGV-Ps 及Bt 对甜菜夜蛾围食膜蛋白的降解作用 |
| 7.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第8章 PuGV-Ps 增效蛋白基因的克隆和测序 |
| 8.1 前言 |
| 8.2 材料与方法 |
| 8.2.1 试验材料 |
| 8.2.2 试验方法 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 PuGV-Ps 增效蛋白基因的PCR 扩增 |
| 8.3.2 PuGV-Ps 增效蛋白基因PCR 产物的克隆及鉴定 |
| 8.3.3 增效蛋白基因重组质粒pEASY-En 的序列测定 |
| 8.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第9章 PuGV-Ps 增效蛋白的表达和活性测定 |
| 9.1 前言 |
| 9.2 材料和方法 |
| 9.2.1 试验材料 |
| 9.2.2 试验方法 |
| 9.3 结果和分析 |
| 9.3.1 重组增效蛋白表达质粒的转化和检测 |
| 9.3.2 重组增效蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 鉴定 |
| 9.3.3 重组增效蛋白表达产物的粗提和纯化 |
| 9.3.4 重组增效蛋白基因表达产物对 Bt 的增效活性测定 |
| 9.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第10章 PuGV-Ps 增强Bt 制剂的研制和应用效果 |
| 10.1 前言 |
| 10.2 材料与方法 |
| 10.2.1 试验材料 |
| 10.2.2 试验方法 |
| 10.3 结果与分析 |
| 10.3.1 病毒增强 Bt 的研制 |
| 10.3.2 病毒增强 Bt 的田间应用效果 |
| 10.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第11章 结语 |
| 11.1 本研究的主要结论 |
| 11.1.1 PuGV-Ps 对 Bt 的增效作用及其影响因子 |
| 11.1.2 PuGV-Ps 对 Bt 的增效作用机理 |
| 11.1.3 PuGV-Ps 增强 Bt 制剂的研制和应用 |
| 11.2 本研究的创新点 |
| 11.3 进一步研究的建议 |
| 11.3.1 PuGV-Ps 增效作用的调控途径 |
| 11.3.2 PuGV-Ps 对 Bt 抗性治理的作用 |
| 11.3.3 杆状病毒和 Bt 增效作用的研究 |
| 11.3.4 昆虫病毒和 Bt 增效作用的评价标准 |
| 攻读学位期间发表的论文及科研工作 |
| 致谢 |
四、棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达（论文参考文献）
- [1]杆状病毒增效因子及其增效机理[J]. 张林娜,陈文峰,尹新明,李文明,刘向阳,张忠信. 病毒学报, 2016(05)
- [2]粘虫颗粒体病毒增效蛋白基因片段优化及功能[J]. 韩光杰,刘琴,徐贝贝,王建军,祁建杭,李传明,徐健. 微生物学报, 2016(09)
- [3]转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性[J]. 徐健,赵松,刘琴,杨青,李传明. 中国生物防治学报, 2013(03)
- [4]黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究[J]. 张小霞,梁振普,陈晓慧,宋小凤,王丽薇,邵新峰. 病毒学报, 2012(03)
- [5]一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析[D]. 唐平. 中国农业科学院, 2011(03)
- [6]华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定[D]. 刘小民. 河北农业大学, 2011(07)
- [7]苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析[D]. 赵丹. 河北农业大学, 2011(08)
- [8]两种鳃金龟围食膜及其结构蛋白的分离鉴定[D]. 周洪旭. 山东农业大学, 2009(03)
- [9]苏云金芽胞杆菌bel基因生物学功能[D]. 方尚玲. 华中农业大学, 2009(09)
- [10]粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌增效作用及应用[D]. 徐健. 扬州大学, 2008(01)