一、提高龙心素活性测定的重复性（论文文献综述）
吴娅丽[1]（2020）在《基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究》文中认为研究背景:血栓性疾病是人类死亡的主要原因之一,临床常用具抗血小板、抗凝和溶栓等作用的药物对其进行治疗,但多数药物伴随出血副作用;中医认为血栓疾病与血瘀证密切相关,通常使用活血化瘀类药物治疗血瘀证,其中动物药（如水蛭、地龙等）为中医活血化瘀的常用药;地龙及含地龙的成方制剂作为抗凝剂和纤溶药物已应用了几个世纪,且被认为无出血副作用;口服蚓激酶制剂在许多国家用于保护心血管,且在我国已作为二类新药上市。中药动物药的研究一直是个难题,威廉环毛蚓作为《中国药典》:收录地龙品种,其抗血栓关键物质基础、作用靶点及机制均尚不明确,故缺乏科学依据指导其临床应用,因此,研究威廉环毛蚓的抗血栓物质基础及作用机制有重大意义。由于地龙的抗血栓成分主要为蛋白质,本研究借助转录组学-蛋白组学相结合的模式,阐释威廉环毛蚓的抗血栓物质基础,并初步探究其作用机制。研究目的:基于多组学模式鉴定威廉环毛蚓中所含蛋白质,通过分离纯化初步定位其抗血栓活性部位并鉴定分析该部位蛋白质成分的序列、结构和性质;利用动物模型评价该部位预防血栓形成的作用、溶栓作用及血管保护作用;通过分子对接和体外模型探讨其抗血栓作用靶点和机制,及血管保护作用机制;借助蛋白组学技术从整体分析其抗血栓及血管保护作用涉及的生物过程及信号通路。研究方法与研究结果:研究一威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析采用基于Illumina高通量测序平台的无参考基因RNA测序技术构建威廉环毛蚓的无参考基因转录组,进而构建其蛋白序列库,为后续研究提供支持。通过测序,共得到超过2000万的clean reads,其中高质量reads超过97%;Trinity拼接后,得到超过10万个转录本和unigenes;翻译所拼接的转录组数据,构建威廉环毛蚓蛋白序列库。ESTScan软件共预测11259个编码序列,可作为引物设计数据库使用。通过与公共数据库比对,共注释 38.21%的 unigenes。研究二威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究采用转录组学-蛋白组学-活性研究整合关联分析方法,以“研究一”所构建的蛋白序列库为数据库,鉴定威廉环毛蚓总提物的蛋白质成分;建立纤维蛋白原-凝血酶时间法（Fib-TT）用于抗凝血活性的体外评价,并基于该方法考察总提物在不同孵育体系中的抗凝活性变化,进而评价其抗血栓性质;研究总提物在不同体系中的蛋白质谱图变化,推测其抗血栓活性成分。从威廉环毛蚓总提物中鉴定到31种蛋白质成分;所建立的Fib-TT 法线性范围较宽,仪器精密度、重复性均良好,可用于威廉环毛蚓抗凝活性的体外评价;总提物的抗凝活性在近中性条件下较为稳定,在30-50℃下活性稳定;通过考察总提物经不同体系孵育后蛋白质图谱的变化,推测其抗血栓活性成分为分子量在26kDa附近的蛋白质。研究三威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定通过“研究二”发现威廉环毛蚓总提物具有较强的抗血栓活性,本实验基于Fib-TT法,采用离子交换色谱分离纯化威廉环毛蚓的抗血栓活性成分,命名为DPf3,采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定其分子量;通过转录组学-蛋白组学整合研究方式,鉴定DPf3主要成分DPf3 ID NO.1和DPf3 ID NO.2的蛋白质种类;采用从头测序技术确定DPf3主要成分的蛋白质序列,圆二色谱考察其二级结构,I-TASSER预测其三级结构,SAVES评价预测模型;并通过溶血实验考察DPf3的血液相容性。研究发现DPf3的主要成分DPf3 IDNO.1和NO.2的分子量分别为36121.745 Da和24485.004 Da,分别含有329和241个氨基酸;de novo测序获得二者的蛋白质全序列,通过与所构建的本地蛋白序列库比对,分别为>Ac44553g1i11和>Dc43026gli12,序列覆盖度达100%;DPf3的二级结构包含α-螺旋（19%）,β-折叠（30%）和无规则卷曲（51%）;DPf3的浓度低于4.21 mg·mL-1时具有较好的血液相容性。研究四DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究采用普纳替尼致血管损伤型斑马鱼血栓模型考察DPf3预防血栓形成的作用、溶栓作用和血管保护作用。发现DPf3（4.2-12.5 ng/尾）具较强的预防血栓形成的作用,其预防能力较阿司匹林（45 μg·mL-1）无显着差异。同时,DPf3（4.2ng/尾）具明显的溶栓作用,其溶栓能力较尿激酶（5ng/尾）无显着性差异。此外,DPf3具较强的血管保护作用。研究五DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究通过分子对接和体外实验相结合的方式考察DPf3的抗血栓作用及作用机制。首先采用分子对接评价DPf ID NO.1和NO.2与纤维蛋白（原）、纤溶酶原、凝血酶间的相互作用;继而通过酶谱法、光散射法、形态学研究、纤维蛋白平板法、体外血栓法及凝血四项评价研究DPf3的抗血栓活性及机制。通过分子对接发现DPf3 ID NO.1和NO.2对纤维蛋白（原）、纤溶酶原均有直接作用,体外实验发现DPf3对纤溶酶原作用很弱,对纤维蛋白（原）及体外血栓均有很强的水解作用;与生成的纤维蛋白栓块相比,纤维蛋白原可能是DPf3的初始作用靶点,且DPf3对纤维蛋白原的作用更强;通过凝血四项评价,发现DPf3能显着延长APTT、降低Fib的含量,且具有延长TT的作用趋势。研究六DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究选取HUVECs为研究对象,以（hi）ox-LDL为造模剂,通过研究经DPf3保护前后,损伤性HUVECs的细胞活力、细胞膜完整性、细胞内ROS水平、细胞迁移能力、粘附因子VCAM 1的表达及单核细胞的粘附、血管生成等的变化,来探讨DPf3的血管保护作用机制。研究发现,DPf3对血管具显着保护作用,DPf3能够提高损伤性HUVECs的细胞活力、保护其细胞膜的完整性,降低细胞内ROS的生成;降低粘附因子VCAM I的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;削弱损伤性细胞的迁移能力,并抑制其新生血管的生成。研究七基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响采用蛋白组学技术从整体水平研究DPf3抗血栓和血管保护作用所涉及的生物标志物、生物过程和信号通路。通过血栓模型组与正常对照组对比,共鉴定得到1149个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有582个和567个;通过DPf3给药组和模型组对比,共鉴定出66个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有46个和20个,具有显着回调作用的蛋白有23个。通过对差异蛋白标志物所涉及的生物过程和信号通路进行归纳与分析,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护活性的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。研究结论:本研究以“转录组学-蛋白组学”多组学结合的模式为基础,初步构建中药地龙威廉环毛蚓的本地蛋白序列库,通过分离纯化得到其抗血栓活性成分（DPf3）,对DPf3进行鉴定及机制研究。研究发现威廉环毛蚓总提物具良好的抗血栓活性,从中鉴定到31个蛋白质成分,其中分离所得DPf3具良好的预防血栓、溶栓及血管保护作用,且具较好的血液相容性,为威廉环毛蚓抗血栓的物质基础。DPf3的抗血栓机制为:（1）具有很强的纤维蛋白和纤维蛋白原水解活性,且能够激活纤溶酶原形成纤溶酶;（2）具有较强的直接溶栓作用;（3）通过影响内源性或/和共同凝血途径及第三种凝血途径产生抗血栓作用。DPf3对血管内皮的保护作用机制为:（1）提高损伤性血管内皮细胞的细胞活力,保护细胞膜的完整性,降低损伤性细胞内ROS的生成;（2）降低粘附因子VCAM 1的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;（3）削弱损伤性细胞的迁移能力,从而降低炎症细胞的扩散;（4）抑制新生血管的生成,进而抑制血管新生内膜的形成。通过蛋白组学技术从整体水平研究,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护作用的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。综上,本研究基本证实了中药地龙威廉环毛蚓的抗血栓关键物质基础,明确其作用靶点并初步确定其作用机制,为威廉环毛蚓的临床使用提供科学依据,为进一步研究其抗血栓活性成分的分子机制提供基础和依据,并为中药动物药的研究提供思路和方法。
吴娅丽,马韫楠,张琦,喻祥龙,杜守颖[2]（2019）在《地龙抗凝血活性体外评价方法的建立》文中研究表明目的建立一种基于全自动血凝分析仪测定纤维蛋白原-凝血酶时间的地龙及其相关制剂的抗凝血活性的体外评价方法。方法以威廉环毛蚓提取物为研究对象,采用BCA蛋白测定法测定可溶性蛋白含量,以抗凝血活性为指标,建立纤维蛋白原-凝血酶时间法测定活性,以活性浓度与可溶性蛋白浓度的比值（比活）作为活性评价指标。结果 10批地龙提取物可溶性蛋白含量为（26.56±3.57）%,比活为（34.64±3.98）U·μg-1。其比活大小与蚓激酶标准品(43.60U·μg-1)相当,且是市售蚯蚓酶(22.17 U·μg-1)比活的1.5倍。结论采用BCA蛋白测定法测定地龙提取物可溶性蛋白,方法简便、可靠;所建立的纤维蛋白原-凝血酶时间法,操作简便,人为影响因素小,结果客观准确,可用于实时测定,重复性和仪器精密度良好,线性范围较广,具有可行性,可用于地龙及其制剂活性的评价。
刘娟[3]（2015）在《猕猴桃溃疡病抗性材料评价及其亲缘关系的ISSR聚类分析》文中研究指明近年来,猕猴桃的细菌性溃疡病（PSA）在全世界范围内大面积爆炸性发生并迅速扩展,对猕猴桃产业产生了极其严重的影响。为调查四川境内常见猕猴桃品种对细菌性溃疡病的抗性以及抗性与遗传多样性的关系,本试验以四川省自然资源科学研究院提供的41种猕猴桃品种（品系）为试材,对猕猴桃种质资源进行了溃疡病的田间抗性调查和室内抗性试验,分析猕猴桃品种在田间和室内对溃疡病的抗病能力并按照抗病程度对其排序;利用ISSR标记对25个雌性猕猴桃品种和16个雄性猕猴桃品种进行遗传多样性分析,探讨ISSR分子标记与其对猕猴桃溃疡病抗性之间的关系。主要研究结果如下:1、田间抗性调查研究中发现,春秋季节为溃疡病的高发期,夏冬季节为低频期。溃疡病的发病时期、发病品种和发病区域均较为集中,红什2号、79-1、04270、04137均为易感品种。2、室内抗性试验发现,不同种类、品种和不同性别的猕猴桃对溃疡病的抗病能力存在较大差异,相对抗病指数范围在0.35-0.82之间。从种来看,京梨、美味、四鄂、软枣和葛枣较抗病,中华、阔叶、毛花较感病;从品种看,中华猕猴桃中79-1（雄株）、SF0808（雌株）和金什1号（雄株）为中抗品种,其余均为中感或感病品种。3、从100条ISSR引物中筛选出10条带清晰、数量较多的引物用于猕猴桃样品DNA的ISSR扩增。共扩增出172条带,其中多态性条带为172条,多态性达到100%。雌性品种的遗传相似系数值在0.51至0.87之间,雄性品种的遗传相似系数值在0.60至0.90之间。4、聚类分析结果显示,雌性品种分成两类,第1类由星果组与斑果组组成,第2类由净果组里的片髓系和实髓系组成。第1类分成四组,A组为京梨猕猴桃;B组为美味二倍体;C组包括毛花猕猴桃、‘soreli’和阔叶猕猴桃;D组包含了中华猕猴桃和美味猕猴桃两个品种群。雄性猕猴桃聚类形成三类,第1类为星毛组品种,第2类为魁绿,第3类为四萼。第1类分为四组,A组为阔叶和毛花;B组为‘红阳’、’红什 2 号’、’金什 1 号’、‘金什 2 号’、‘Soreli’、‘04137’、’金艳’和‘Hort16A’;C 组为‘79-1’和’秦美’、’红美’;D组为‘海沃德’。试验结果表明,猕猴桃品种对溃疡病的抗病能力与遗传有关,京梨、美味、四鄂、软枣和葛枣较抗病,中华、阔叶、毛花较易感病。溃疡病在春秋季爆发并大面积扩散,其爆发扩散与季节有关。抗性试验与ISSR分子标记的关联研究表明,各品种猕猴桃溃疡病抗性的强弱分组与ISSR聚类组有明显的相关性,表明ISSR分子标记技术可用于辅助选育猕猴桃溃疡病抗病品种。
张利,赵军,赵钐妤[4]（2012）在《龙心素胶囊质量标准提高研究》文中进行了进一步梳理目的研究提高龙心素胶囊的质量标准。方法用蚓激酶活性测定替代原标准第1项化学显色鉴别。引入蚓激酶标准品,采用生物统计的量反应平行线法统计计算效价,并对效价测定的琼脂糖纤维蛋白平板法进行了方法学研究。结果新的鉴别方法能反应蚓激酶的活性特征。效价测定的线性范围为8 250～33 000 U/mL（r=0.998 6）,精密度RSD为4.71%;重复性RSD为6.54%;平均回收率（n=9）94.63%,RSD为7.69%;不同的溶剂对效价测定影响较小,阴性对照无干扰;供试品溶液在4℃下72 h内稳定。结论提高后的质量标准专属性强,准确性高,可控制测定方法的误差,能更有效地控制龙心素胶囊的质量。
褚襄萍[5]（2008）在《药对麻黄-地龙抗哮喘药效物质基础与作用机制研究》文中研究说明为了研究药对麻黄-地龙抗哮喘药效物质基础与作用机制,首先对麻黄-地龙不同配比在体外模型上进行了活性考察。方法:观察麻黄、地龙3种用量配比（1:1,1:3,1:9）的水煎液对10μmol /L卡巴胆碱（carbachol,CCh）、10μmol/L组胺（histamine, His）引起离体气管平滑肌张力增加的松弛作用,以及对10μmol/L CCh引起的离体气管上皮短路电流增加的抑制作用。结论:麻黄、地龙药对具有对抗CCh和His引起离体气管平滑肌收缩的作用,并有对抗CCh引起气管上皮离子分泌的作用。1:3的配比组合是麻黄、地龙药对的较优组成。对药对单煎合用、合煎两种配伍方式进行了比较。方法:测定指纹图谱,并结合定量考察指标化学成分。结果:两种配伍方式所得提取液的色谱图匹配度较高,全图谱的相似度大于0.9,有22个共有峰,峰面积相似度<0.9;合煎有利于麻黄生物碱溶出,单煎有利于地龙氨基酸溶出。运用“整体法”对麻黄-地龙药对进行平喘活性研究,即将麻黄-地龙（质量比1:3）单煎合用的混合水提液作为一个整体,通过AB-8大孔吸附树脂划分成水、50%乙醇、95%乙醇三个洗脱部位,然后对三个极性部分进行平喘作用的考察。结果:三种极性部位均有对抗CCh和His引起的豚鼠气管平滑肌张力增加的作用,且水洗脱部位对抗CCh引起的大鼠气管上皮短路电流增加的作用较强,而含乙醇（50%乙醇和95%乙醇）洗脱部位均没有明显的作用。结论:药对中不同极性大小的物质可能通过不同的作用机制都有抗哮喘效果,但综合起来考虑,水洗脱高极性部位的平喘效果要优于其它部位。运用“组合法”对麻黄-地龙药对的平喘活性进行研究,即分别筛选出两个药材的有效部位,再进行组合部位的药效考察。首先优化了麻黄总生物碱的提取分离工艺,结果用酸水提取、乙酸乙酯萃取方法得到含量大于50%的麻黄总碱（M）。接着优化了地龙的提取分离工艺,将地龙水提醇沉后的提取液通过离子交换树脂划分成地龙酸性部位（S）、地龙碱性部位物（J）、地龙醇沉部分（D）,在解痉和抑制上皮离子分泌两种体外模型,筛选出地龙平喘有效部位为S。体内药效实验进一步显示S具有对抗乙酰胆碱和His混合液引起豚鼠平滑肌痉挛作用,并在氨水引咳的小鼠模型上具有镇咳作用。接着试图将S通过大孔吸附树脂进一步划分成高极性（S30）和低极性（S95）两个部位,并用两部位对卵蛋白诱发哮喘小鼠的抗炎和免疫调节作用进行考察,结果在降低支气管肺泡灌洗液（BALF）中EOS细胞数量方面,S优于S30和S95;在降低IGE,IL-4,IL-5,IL-13水平方面,S和S30、S95相比没有显着性差异。以上结果提示:划段分离后并不能得到活性比划分前更有效的部位。筛选出地龙的有效部位后,再对M与S、J、D分别组合的组合物,以及单用M或单用S的活性进行考察比较。体外实验结果表明对于CCh和His引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的舒张作用,以及CCh引起大鼠气管黏膜短路电流上升的抑制作用,MS的组合均优于MJ和MD组合。体内实验结果进一步显示MS组合对于乙酰胆碱和His混合液致豚鼠哮喘的平喘作用优于单用M;MS对于氨水引咳的小鼠镇咳作用优于单用S。以上研究结果表明麻黄与地龙组合优于单独使用一种,且两种药的最佳组合部位为MS,即麻黄总碱与地龙的酸性部位组合。可能的平喘作用机制为解痉、抑制上皮离子分泌以及镇咳作用。对于麻黄和地龙的有效部位中的化学成分进行了测定。利用酸性染料比色法测定了麻黄总碱中生物碱含量大于80%;用HPLC法测定了其中2个主要成分麻黄碱和伪麻黄碱的含量,在总碱中占80%。用茚三酮比色法测得地龙酸性部位总氨基酸含量在80%左右;利用HPLC、GC-MS、UPLC-MS等定性定量了该部位中的42个化学成分,包括氨基酸类（16个）,嘌呤嘧啶类（5个）,多羟基类（4个）,脂肪酸类（17个）。即在麻黄、地龙中的最佳有效组合物中共有44个化学成分得到了确认。
杨柏云[6]（2007）在《龙牙百合脱毒种球培育及休眠生理的研究》文中研究表明龙牙百合（Lilium brownii var.viridulum Baker）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本植物,其食用部分是地下鳞茎,药食同源,有较高的营养价值和保健作用。百合病毒病是造成品种退化、产量降低、品质下降的主要原因之一,目前尚无有效药剂防治病毒病,最方便可靠的措施是通过茎尖培养,生产脱毒种球。龙牙百合具有休眠的特性,在以鳞茎作种球进行大田生产时,休眠程度影响着田间出苗的早晚、出苗率、整齐度、植株的长势和产量等;在以鳞茎作加工原料时,休眠的解除又会造成水分和养分的大量消耗,以至于丧失应用价值。因此,开展本项目的研究,对鳞茎的储藏保鲜、加工和脱毒种球的生产、推广应用等均具有十分重要的意义。以龙牙百合鳞茎为材料,采用植物组织培养技术研究了高温、病毒化学抑制剂等预处理对其茎尖存活率和脱毒效果的影响以及脱毒鳞茎快速繁殖的途径。采用分光光度法、高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、IEF-SDS双向电泳、细胞化学和透射电子显微镜等技术,研究了低温贮藏解除休眠过程中碳水化合物、蛋白质、核酸、内源激素等含量和同工酶、蛋白质组分、Ca2+-ATPase分布以及茎尖超微结构的动态变化。结果表明:茎尖分生组织的大小与脱毒率呈负相关,高温对病毒的抑制作用依次为CMV、LRV、TBV、LSV;一定浓度的病毒唑可有效的使病毒钝化,提高脱毒率,小苗的茎尖较小鳞茎的茎尖容易去除病毒,2种或3种脱毒技术的组合是生产龙牙百合脱毒种球的首选方法。龙牙百合体细胞胚发生的重要调节因素是2,4-D,其形态学发育过程与合子胚相似,依次经过球形胚,心形胚,鱼雷胚,成熟胚等阶段,形成再生植株。在低温贮藏过程中,鳞茎的淀粉含量呈逐渐下降的变化,而可溶性糖和可溶性蛋白含量则呈明显上升趋势,淀粉分解产生的糖类为鳞茎解除休眠及萌发后茎尖的生长发育提供了物质和能量基础;RNA含量呈抛物线的变化趋势,而DNA含量变化不明显。GA3与IAA含量以及GA3/ABA、IAA/ABA的比值呈明显上升趋势,ABA含量总体呈下降趋势,内源激素的变化和平衡与休眠解除有关,休眠的解除可能为GA3类促进物质和ABA类抑制物质相互作用所致。鳞叶中过氧化物酶（POD）同工酶酶带较多,且在40d后陆续有新的条带出现;淀粉磷酸化酶（PHO）同工酶条带较少,只在第60d有一新条带的出现;酯酶（EST）同工酶在第30d后有新的条带出现,且活性也逐渐增强,表明休眠的解除过程一直伴随着新同工酶的出现和活性强弱的变化。鳞茎低分子量蛋白含量丰富,21kD和23kD两个蛋白组分表达优势明显,是其主要的蛋白组分,检测到3类低温贮藏过程中变化的蛋白（多肽）,其中有一类是新出现的多肽,说明休眠的解除不但有蛋白质表达丰度强弱的变化,更有新蛋白的参与。生长点线粒体膜和质膜上的Ca2+-ATPaSe活性分别在第30d时和第40d时达最高,而液泡膜上的只在第50d时才出现,核仁和染色质部位的Ca2+-ATPase活性在细胞分裂时最高;30d时可观察到细胞核体积增大,线粒体数量及内部的管泡状嵴以及脂体和内质网增多,液泡由大逐渐裂解成数量较多的小液泡,造粉质体向前质体逐渐转变,这些Ca2+-ATPase时空分布和超微结构规律性的变化,可作为形态学上解除休眠开始的指标。
李小玲[7]（2007）在《农杆菌介导的ACO ihpRNAi载体转化亚洲百合的研究》文中研究说明百合是世界着名的切花,在花卉市场中占有重要的地位,但是,百合与其它鲜切花一样随着花朵的开放迅速衰老,如何延长百合花朵的寿命已成为生产与消费上急需解决的实际问题,也是近20年来科学家研究的主要课题之一。由于常规杂交育种的局限性和化学保鲜剂的毒副作用。近年来,生物技术的发展,为克服传统育种的缺陷和化学保鲜剂使用的毒副作用提供了新观念、新方法和新手段。本研究是以亚洲百合‘精粹’（Lilium cv‘elite’）的无菌苗为材料,利用根癌农杆菌介导法将从百合中克隆到的ACC氧化酶基因片段采用RNA干扰（RNA interference）技术导入百合外植体,通过PCR检测获得了阳性表达植株。研究取得的主要结果为:1.鳞片离体再生体系的建立经不同培养基筛选,鳞片分化最佳培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。2.遗传转化受体系统的建立1)诱导叶片分化率最高的激素组合为MS+TDZ 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1,再生率达90.6%;2)诱导离体小鳞片分化率最高的激素组合为MS+6-BA 2.0 mg·L-1 +2,4-D 0.1 mg·L-1,再生率为100%;3)转化植株生根培养基为MS+NAA 0.2 mg·L-1+0.2%活性炭;4)卡那霉素筛选压力的确定:叶片作为转基因的受体材料时,卡那霉素的亚致死浓度为80 mg·L-1;小鳞片作为转基因的受体材料时,卡那霉素的亚致死浓度为115 mg·L-1。3.遗传转化用农杆菌介导法对亚洲百合转化过程中,对预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度等转化条件进行了探索。将百合受体材料在分化培养基上预培养3 d,于根癌农杆菌菌液浓度（OD=0.8）侵染8～10 min,在含有25 mg·L-1的乙酰丁香酮的培养基上共培养3 d,转移到选择培养基中培养（其中卡那霉素浓度:叶片为80 mg·L-1,小鳞片为115 mg·L-1;抑菌所用羧苄青霉素浓度为300 mg·L-1）。此期间抗性芽长至1cm时切下转移到含抗生素的生根培养基（MS+NAA 0.2 mg·L-1+0.2%活性炭）中生根培养。4转基因植株的获得及检测研究共得到卡那霉素抗性植株200株,对其中50株进行PCR检测,现有7株扩增出目标条带,PCR检测初步证明外源基因已经整合到这7株基因组中。
刘菊华[8]（2006）在《麝香百合T-DNA插入突变群体的构建与分析》文中研究说明百合是世界三大鳞茎类花卉之一,具有重要的商品价值。年产18亿个种球,创汇约12亿美元（荷兰）。虽然传统育种在百合的遗传育种中具有重要作用,但由于远缘杂交的不亲和性以及育种年限过长等缺点,远不能满足生产需要。我国百合生产严重缺乏具有自主知识产权的新品种,用于百合生产的种球几乎完全依赖进口。进口种球存在成本高、品种杂乱、品质下降等严重问题。虽然目前可以采用鳞茎等组织培养技术进行百合脱毒和扩繁,但组织培养过程中存在污染严重、繁殖系数低、繁殖速度慢、组培苗移栽成活率低等问题,极大地限制了百合商品种球的生产。为此,本研究从解决百合离体快繁中的关键技术问题入手,采用农杆菌介导的T-DNA插入技术,构建百合T-DNA插入突变群体,通过对突变群体的筛选,获得了一些具用异常表型的突变体,并克隆了一些与突变性状有关的基因,具有重要的理论和实际意义。采用两步外植体法即以低温预处理过的百合鳞片切块为初始外植体,以从初始外植体上分化的丛生芽切段为次级外植体,结合直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统,成功地实现了麝香百合的高频离体再生。我们的结果是:一个中等大小的百合鳞茎,经过低温预处理后,通过直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统1代就可以分别扩繁出54,000和67,500个独立完整的带小鳞茎的新植株,且从鳞茎到新植株的开花仅需8-9个月左右,它不仅解决了百合离体快繁中的污染严重问题、还大大提高了繁殖系数和繁殖速度。这一结果是国内外已见报导的技术方法所不能达到的。与此同时我们还研究了不同激素配比的培养基以及次级外植体的不同部位对芽和愈伤组织分化的影响效果,研究了不同培养基质对组培苗移栽成活的影响,研究了不同的低温处理时间对组培苗开花的影响,发现MS+1.0mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是芽的诱导及伸长的最佳培养基;MS+2.0 mg/L 2,4-D+ 0.1mg/L 6-BA是诱导愈伤组织的最适宜培养基;无论是诱导芽还是诱导愈伤组织,以短缩茎为次级外植体效果最好;沙:园土:椰糠=1:1:1的培养基质是最好最经济的组培苗驯化移栽培养基质,这大大提高了组培苗的移栽成活率;不同的低温处理时间对组培苗开花期的影响不大。在此高频离体再生系统的基础上,采用农杆菌介导的T-DNA插入突变技术,从2400块左右的次级外植体中,通过直接分化再生系统和愈伤组织分化再生系统分别得到了4500和500株左右的NPTII抗性植株,抗性植株比率分别为187%和21%,
刘伟[9]（2006）在《亚洲百合‘布耐罗’抗病和抗衰老基因转化的研究》文中研究指明本文以亚洲百合‘布耐罗’（‘Brunello’）为研究对象，通过对鳞片再生条件、抗生素筛选条件及农杆菌介导百合遗传转化条件的优化，建立了高效的再生及转化体系，并将IPT基因和NPR1基因导入百合，对转化再生植株进行了分子检测及生理指标分析，主要研究结果如下： 1、含NPR1基因的植物表达载体pB35SNPR1的构建。将来自拟南芥的NPR1基因插入到质粒载体pGreen0229中，构建含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体pB35SNPR1（pGreen0229-35S-NPR1-GFP），并通过液氮冻融法将其导入农杆菌EHA105，用于百合的遗传转化试验。 2、运用正交试验设计，建立亚洲百合‘布耐罗’（‘Brunello’）鳞茎外植体高效再生体系。外植体以1‰（W／V）升汞溶液作为主要灭菌试剂时，内部鳞片其最适处理时间为9min，存活率为55％；中部和外部鳞片的最适处理时间均为15min，存活率分别为50％和45％。运用正交试验设计，筛选鳞茎最佳分化培养基为MS+6-BA2+NAA0.2mg／L，再生率达86.1％以上；筛选出小鳞茎叶的最佳分化培养基为MS+6-BA1+NAA0.2+2,4D0.1mg／L，再生率达78.9％； 3、以鳞片分化的小鳞茎叶基部作为遗传转化体系的受体材料，通过卡那霉素敏感性试验，确定了小鳞茎叶诱导不定芽卡那霉素临界致死浓度为100mg／L。对影响农杆菌转化效率几个主要因素进行的研究发现：选取分化15-20d的小鳞茎叶作为受体材料，在OD值为0.5的农杆菌菌液中侵染15min，侵染后共培养2d可获得较好的转化效果，转化率在16％左右；进一步研究发现，在菌液中添加50μmol／L乙酰丁香酮，在共培养基中添加100μmol／L乙酰丁香酮浓度时，转化率较不添加乙酰丁香酮高。 4、将含质粒pB35SNPR1的农杆菌EHA105与百合小鳞茎叶共培养，通过筛选培养，获得卡那霉素抗性植株，对22株转NPR1再生植株进行GFP荧光检测和PCR检测，其中12株为阳性，经GFP荧光检测和PCR检测表明，NPR1基因已经整合到百合基因组中。对20株转IPT再生植株进行PCR检测，其中11株为阳性。 5、对PCR检测呈阳性的转基因植株进行了生理指标检测，试验结果表明：转基因植株的抗病性和抗衰老性都较阴性对照高。
黄飞,周慧[10]（2001）在《提高龙心素活性测定的重复性》文中认为
二、提高龙心素活性测定的重复性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、提高龙心素活性测定的重复性（论文提纲范文）
（1）基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 血栓的研究进展概述 |
| 1 概述 |
| 2 血栓的形成过程 |
| 3 血栓性疾病的临床治疗用药 |
| 4 血栓性疾病研究模型的构建 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药地龙抗血栓活性成分研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 地龙抗血栓活性物质 |
| 3 地龙抗血栓活性蛋白的研究 |
| 4 作用机制与毒副作用 |
| 5 临床应用 |
| 6 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 RNA提取、测序及转录本拼接 |
| 3 基因序列分析 |
| 4 基因功能注释和表达水平分析 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓总提物的鉴定 |
| 3 威廉环毛蚓总提物的蛋白含量测定及抗血栓活性体外评价 |
| 4 威廉环毛蚓总提物的抗血栓性质研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓抗血栓活性成分的分离纯化 |
| 3 抗血栓活性成分(DPf3)的鉴定 |
| 4 DPf3 ID NO.1和N0.2的结构预测及模型评价 |
| 5 DPf3的血液相容性评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 普纳替尼诱导斑马鱼血栓模型的建立及DPf3最大检测剂量的确定 |
| 3 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓形成的预防作用评价 |
| 4 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓的治疗作用评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 DPf3 ID NO.1和N0.2的分子对接研究 |
| 3 DPf3的纤维蛋白(原)水解活性评价 |
| 4 DPf3的纤溶酶原激活作用研究 |
| 5 DPf3血栓溶解活性的体外研究 |
| 6 DPf3对凝血四项影响的体外研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 HUVECs细胞培养方法的建立及DPf3对细胞活力/毒性的影响 |
| 3 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs的保护作用研究 |
| 4 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs活性氧产生的影响 |
| 5 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs粘附作用的影响 |
| 6 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs迁移能力和血管生成的影响 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 斑马鱼样本的质量控制及评估 |
| 3 普纳替尼所致血管损伤型血栓形成的蛋白标志物分析 |
| 4 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型影响的蛋白质组学研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）地龙抗凝血活性体外评价方法的建立（论文提纲范文）
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 地龙提取物浸提液(地龙提取液)的制备 |
| 2.2 地龙提取液可溶性蛋白含量的测定 |
| 2.3 地龙提取物的抗凝血活性测定及方法学考察 |
| 2.3.1 |
| 2.3.2 纤维蛋白原和凝血酶溶液的制备 |
| 2.3.3 测定方法 |
| 2.3.4 Fib-TT法的方法学考察 |
| 2.3.4. 1 线性范围 |
| 2.3.4. 2 仪器精密度试验 |
| 2.3.4. 3 重复性试验 |
| 2.3.5 不同批次地龙提取液的比活测定 |
| 2.4 结果统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 Fib-TT法方法学考察结果 |
| 3.1.1 线性范围考察 |
| 3.1.2 仪器精密度试验 |
| 3.1.3 重复性试验 |
| 3.2 不同批次地龙提取液中可溶性蛋白含量及比活测定结果 |
| 4 讨论 |
（3）猕猴桃溃疡病抗性材料评价及其亲缘关系的ISSR聚类分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 猕猴桃溃疡病的研究概况 |
| 2.1.1 称猴桃溃疡病的病原研究 |
| 2.1.2 猕猴桃溃疡病的分布与危害 |
| 2.1.3 称猴桃溃疡病的症状描述 |
| 2.1.4 称猴桃溃疡病的防治措施 |
| 2.1.5 猕猴桃溃疡病的病原细菌对植物的致病性研究 |
| 2.2 称猴桃溃疡病抗性研究概况 |
| 2.2.1 抗病性鉴定方法 |
| 2.2.2 猕猴桃溃疡病抗性评价方法及指标 |
| 2.3 ISSR在植物抗性筛选和鉴定中的作用 |
| 2.3.1 ISSR简介 |
| 2.3.2 植物抗病性的ISSR研究 |
| 2.3.3 ISSR在猕猴桃上的应用 |
| 3 研究目的及意义 |
| 4 材料与方法 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 猕猴桃溃疡病病原菌的分离纯化与分子鉴定 |
| 4.2.2 猕猴桃溃疡病室内枝条抗性鉴定 |
| 4.2.3 猕猴桃溃疡病田间抗性鉴定 |
| 4.2.4 猕猴桃品种(品系)ISSR分子标记 |
| 4.2.5 相对抗病指数分析方法 |
| 4.2.6 遗传多样性分析方法 |
| 5 结果与分析 |
| 5.1 猕猴桃溃疡病抗性材料的室内筛选 |
| 5.1.1 猕猴桃材相对抗病指数 |
| 5.1.2 称猴桃材料对溃疡病室内抗性排序 |
| 5.2 猕猴桃溃疡病抗性材料田间调查 |
| 5.3 猕猴桃ISSR分子标记研究 |
| 5.3.1 DNA检测结果 |
| 5.3.2 猕猴桃ISSR分子标记多态性分析 |
| 5.3.3 猕猴桃遗传相似系数分析 |
| 5.3.4 聚类分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 利用ISSR分子标记研究猕猴桃遗传多样性的优势和可行性 |
| 6.2 猕猴桃属植物ISSR遗传多样性分析 |
| 6.3 猕猴桃品种群和品种的划分 |
| 6.4 田间抗性与室内抗性筛选及其比较 |
| 6.5 遗传多样性与抗性 |
| 7 小结与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文 |
（5）药对麻黄-地龙抗哮喘药效物质基础与作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 课题背景介绍 |
| 1.1.1 药对 |
| 1.1.2 麻黄的研究进展 |
| 1.1.3 地龙的研究进展 |
| 1.1.4 麻黄-地龙药对的研究进展 |
| 1.1.5 哮喘的研究进展 |
| 1.2 本课题研究的意义以及研究内容 |
| 1.2.1 经济建设和社会发展需求 |
| 1.2.2 课题研究的主要内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 麻黄-地龙药对用量配比及平喘作用机制的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 短路电流原理 |
| 2.2.1 Isc测定装置 |
| 2.2.2 工作原理 |
| 2.3 离子转运与离子通道 |
| 2.4 仪器与材料 |
| 2.5 方法 |
| 2.5.1 气管平滑肌张力测定 |
| 2.5.2 上皮跨膜电压、电阻和短路电流测定 |
| 2.5.3 统计分析 |
| 2.6 结果 |
| 2.6.1 三种配比水提物对卡巴胆碱和组胺引起气管张力增加的松弛作用 |
| 2.6.2 三种配比水提物对卡巴胆碱引起气管上皮短路电流上升的抑制作用 |
| 2.7 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 麻黄-地龙药对配伍方式考察 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与实验材料 |
| 3.3 HPLC法测定麻黄－地龙单煎合用与合煎溶液中麻黄生物碱的含量 |
| 3.3.1 HPLC色谱条件 |
| 3.3.2 标准曲线的绘制 |
| 3.3.3 精密度试验 |
| 3.3.4 加样回收率试验 |
| 3.3.5 HPLC法测定黄碱、伪麻黄碱含量 |
| 3.4 酸性染料比色法测定麻黄－地龙单煎合用与合煎溶液麻黄总生物碱含量 |
| 3.4.1 波长的选择 |
| 3.4.2 标准曲线的绘制 |
| 3.4.3 精密度试验 |
| 3.4.4 稳定性试验 |
| 3.4.5 回收率试验 |
| 3.4.6 样品含量的测定 |
| 3.5 茚三酮比色法测定麻黄－地龙单煎合用与合煎溶液中总氨基酸的含量 |
| 3.5.1 最大吸收波长的选择 |
| 3.5.2 线性关系的考察 |
| 3.5.3 精密度试验 |
| 3.5.4 稳定性试验 |
| 3.5.5 重复性实验 |
| 3.5.6 加样回收率试验 |
| 3.5.7 样品测定 |
| 3.6 比较麻黄地龙合煎液和单煎合用混合液的HPLC图谱 |
| 3.7 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 麻黄-地龙单煎合用水提液不同极性部位平喘作用的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与实验材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 气管平滑肌张力测定 |
| 4.3.2 上皮跨膜电压、电阻和短路电流测定 |
| 4.3.3 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 三种极性部位对CCh和His引起豚鼠气管张力增加的松弛作用 |
| 4.4.2 三种提取物对气管上皮短路电流的影响 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 麻黄与地龙不同部位组合的平喘作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器与实验材料 |
| 5.3 麻黄的提取分离研究 |
| 5.3 1 树脂法考察麻黄总生物碱提取分离工艺 |
| 5.3.2 溶剂法考察麻黄总生物碱提取分离工艺 |
| 5.3.3 结果 |
| 5.3.4 结论与讨论 |
| 5.4 地龙的提取分离研究 |
| 5.4.1 离子交换树脂分离的原理及应用 |
| 5.4.2 单因素考察地龙酸性部位提取工艺 |
| 5.4.3 阴离子树脂分离地龙酸性部位工艺考察 |
| 5.5 地龙平喘有效部位的筛选及部位组合物平喘作用考察 |
| 5.5.1 方法 |
| 5.5.2 结果 |
| 5.5.3 结论 |
| 5.5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 地龙抗哮喘有效部位化学成分分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 仪器和实验材料 |
| 6.3 HPLC分析地龙酸性部位中次黄嘌呤的含量 |
| 6.3.1 HPLC 色谱条件 |
| 6.3.2 分析方法考察 |
| 6.3.3 样品测定及结果 |
| 6.3.4 讨论 |
| 6.4 氯甲酸乙酯衍生GC-MS法对地龙酸性部位的分析 |
| 6.4.1 衍生方法 |
| 6.4.2 GC/MS分析条件 |
| 6.4.3 地龙酸性部位中化学成分的定性分析 |
| 6.4.5 GC-MS方法学考察 |
| 6.4.6 样品测定及结果 |
| 6.4.7 讨论 |
| 6.5 三甲基硅烷衍生GC－MS法对地龙酸性部位的分析 |
| 6.5.1 衍生方法 |
| 6.5.2 气相色谱质谱条件 |
| 6.5.3 实验结果 |
| 6.5.4 结论与讨论 |
| 6.6 UPLC－MS测定地龙酸性部位中脂肪酸的含量 |
| 6.6.1 质谱条件的优化 |
| 6.6.2 色谱条件的优化 |
| 6.6.3 地龙酸性部位中脂肪酸化学成分的确认 |
| 6.6.4 分析方法考察 |
| 6.6.5 样品含量测定 |
| 6.6.6 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 研究总结与展望 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.1.1 利用药效学指标考察药对麻黄、地龙用量配比及可能的平喘作用机制. |
| 7.1.2 利用化学分析指标比较了麻黄与地龙单煎合用、合煎的提取工艺 |
| 7.1.3 整体法:考察麻黄-地龙单煎合用水提液不同极性部分 |
| 7.1.4 组合法:考察麻黄生物碱部位与地龙各个部位的组合物 |
| 7.1.5 地龙酸性部位化学成分定性定量分析 |
| 7.2 全文结论 |
| 7.3 论文创新点 |
| 7.4 展望 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
| 缩略名词 |
| 致谢 |
| 上海交通大学学位论文答辩决议书 |
（6）龙牙百合脱毒种球培育及休眠生理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 国内外研究背景 |
| 1.3 研究方法和实验设计 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 百合病害及脱毒技术研究 |
| 2.1.1 百合病害类型 |
| 2.1.2 百合脱毒技术研究 |
| 2.1.3 百合病毒检测技术 |
| 2.2 百合组织培养 |
| 2.2.1 外植体 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 继代培养与植株再生 |
| 2.3 有关植物休眠与萌发机理的几种假说 |
| 2.3.1 激素调控学说 |
| 2.3.2 代谢途径调控学说 |
| 2.3.3 代谢物的调控 |
| 2.3.4 基因表达的调节 |
| 2.4 百合休眠的原因 |
| 2.5 休眠的解除方法 |
| 2.6 解除百合鳞茎休眠过程中的变化 |
| 2.6.1 茎尖的形态变化 |
| 2.6.2 茎尖超微结构的变化 |
| 2.6.3 Ca~(2+)和Ca~(2+)-ATPase的变化 |
| 2.6.4 碳水化合物代谢的变化 |
| 2.6.5 蛋白质代谢的变化 |
| 2.6.6 核酸代谢的变化 |
| 2.6.7 内源激素的变化 |
| 2.7 前景与展望 |
| 第3章 龙牙百合脱毒技术的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同外植体的茎尖大小对成活率的影响 |
| 3.2.2 高温预处理对脱毒效果的影响 |
| 3.2.3 化学预处理对脱毒效果的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 茎尖大小来源与成活率、脱毒率之间的关系 |
| 3.3.2 热处理对脱毒效果的影响 |
| 3.3.3 病毒化学抑制剂对脱毒效果的影响 |
| 3.3.4 病毒检测方法 |
| 第4章 脱毒小鳞茎增殖培养技术 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 鳞叶直接诱导次级小鳞茎 |
| 4.2.2 小鳞茎的增殖 |
| 4.2.3 小鳞茎诱导丛生芽 |
| 4.2.4 脱毒小鳞茎生根试验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 鳞叶诱导次级小鳞茎 |
| 4.3.2 小鳞茎的增殖 |
| 4.3.3 丛生芽的诱导 |
| 第5章 脱毒龙牙百合体细胞胚的诱导及植株再生 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 体细胞胚的诱导条件 |
| 5.2.2 形态学观察结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 2,4-D浓度对诱导体细胞胚的影响 |
| 5.3.2 体细胞胚的发生途径和发育过程 |
| 第6章 低温贮藏解除休眠过程中生理生化指标的变化 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 供试材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 淀粉含量的变化 |
| 6.2.2 可溶性糖含量的变化 |
| 6.2.3 可溶性蛋白含量的变化 |
| 6.2.4 过氧化物酶(POD)同工酶电泳 |
| 6.2.5 淀粉磷酸化酶(PHO)同工酶电泳 |
| 6.2.6 酯酶(EST)同工酶 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 碳水化合物的变化和休眠解除的关系 |
| 6.3.2 可溶性蛋白质的变化和休眠解除的关系 |
| 6.3.3 同工酶的变化和休眠解除的关系 |
| 第7章 龙牙百合贮藏期间内源激素的变化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 仪器和试剂 |
| 7.1.3 激素的提取、纯化和测定 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 ABA |
| 7.2.2 GA_3 |
| 7.2.3 IAA |
| 7.2.4 商品鳞茎GA_3/ABA、IAA/ABA比值的变化 |
| 7.2.5 试管鳞茎GA_3/ABA、IAA/ABA比值的变化 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 内源激素的动态变化与休眠解除的关系 |
| 7.3.2 激素平衡与休眠解除的关系 |
| 第8章 低温解除休眠茎尖结构及Ca2+-ATPase分布的变化 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 显微结构的变化 |
| 8.2.2 超微结构的变化 |
| 8.2.3 低温贮藏过程小鳞茎生长点Ca~(2+)-ATPase的分布 |
| 8.2.4 不同温度贮藏下试管鳞茎的萌发率 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 茎尖显微结构的变化与休眠解除的关系 |
| 8.3.2 茎尖细胞中线粒体的变化与休眠解除的关系 |
| 8.3.3 茎尖细胞中液泡的变化与休眠解除的关系 |
| 8.3.4 茎尖细胞中质体的变化与休眠解除的关系 |
| 8.3.5 茎尖细胞中脂体的变化与休眠解除的关系 |
| 8.3.6 茎尖细胞中内质网、高尔基体的变化与休眠解除的关系 |
| 8.3.7 生长点Ca~(2+)-ATPase的时空分布与休眠解除的关系 |
| 第9章 低温解除休眠过程中蛋白质组分和核酸含量的变化 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果与分析 |
| 9.2.1 SDS-PAGE单向电泳分析 |
| 9.2.2 IEF-SDS-PAGE双向电泳分析 |
| 9.2.3 核酸含量的动态变化 |
| 9.3 讨论 |
| 9.3.1 双向电泳方法的优化 |
| 9.3.2 电泳图谱的软件分析 |
| 9.3.3 蛋白的质谱鉴定 |
| 9.3.4 蛋白质组分与休眠解除的关系 |
| 9.3.5 核酸含量与休眠解除的关系 |
| 第10章 结论与展望 |
| 10.1 结论 |
| 10.2 创新点 |
| 10.3 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:图版 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（7）农杆菌介导的ACO ihpRNAi载体转化亚洲百合的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 我国百合概况 |
| 1.2 花卉基因工程研究进展 |
| 1.2.1 花色基因工程 |
| 1.2.2 花卉保鲜基因工程 |
| 1.2.3 花卉株形基因工程 |
| 1.2.4 香味基因工程 |
| 1.2.5 花卉抗性基因工程 |
| 1.2.6 花卉基因工程中存在问题及展望 |
| 1.3 百合花卉采后衰老生理 |
| 1.3.1 乙烯的生物合成 |
| 1.3.2 乙烯与百合切花衰老的关系 |
| 1.4 ACC 氧化酶基因与RNA 干扰技术应用现状 |
| 1.4.1 ACC 氧化酶基因研究进展 |
| 1.4.2 RNA 干扰技术研究进展 |
| 1.5 百合转基因研究进展 |
| 1.5.1 百合组织培养研究进展 |
| 1.5.2 百合转基因体系的建立 |
| 1.5.3 遗传转化技术 |
| 1.5.4 展望 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 百合农杆菌介导的遗传转化受体系统的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 外植体的表面消毒 |
| 2.2.2 鳞片上不定芽的诱导 |
| 2.2.3 试管苗小鳞茎诱导 |
| 2.2.4 亚洲百合壮苗及生根 |
| 2.2.5 筛选诱导叶片和小鳞片分化的最佳培养基 |
| 2.2.6 卡那霉素抗性筛选 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 鳞片不定芽的分化 |
| 2.3.2 亚洲百合小鳞茎的诱导 |
| 2.3.3 亚洲百合壮苗及生根诱导 |
| 2.3.4 筛选诱导叶片和小鳞片分化的最佳培养基 |
| 2.3.5 卡那霉素抗性筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 亚洲百合遗传转化体系的建立与优化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 根癌农杆菌的活化与培养 |
| 3.2.2 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.2.3 影响百合遗传转化的主要因素 |
| 3.2.4 转基因植株的PCR 检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 影响农杆菌介导百合遗传转化效率的因素 |
| 3.3.2 转化植株的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 进一步开展的工作 |
| 4.2.1 转化植株的Southern blotting 检测工作 |
| 4.2.2 转化植株的生理检测 |
| 4.2.3 转化植株的大田验证 |
| 参考文献 |
| 缩写表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）麝香百合T-DNA插入突变群体的构建与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 百合产业在经济发展中的作用 |
| 1.2 百合的遗传育种研究进展 |
| 1.3 T-DNA 在植物功能基因组学上的应用 |
| 1.4 本研究目的、意义 |
| 1.5 本研究的技术路线 |
| 2 百合高频离体再生体系的建立 |
| 2.1 植物材料与处理 |
| 2.2 培养方法及培养条件 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 3 百合T-DNA 插入突变群体的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 4 百合T-DNA 插入突变群体的筛选 |
| 4.1 基因捕捉系统检测 |
| 4.2 T0 代转基因植株的分子检测 |
| 4.3 T0 突变植株的插入拷贝数分析及其侧翼序列的扩增 |
| 4.4 T1 代转基因植株的分子生物学检测 |
| 4.5 结论与讨论 |
| 5 本研究的特色与创新之处 |
| 5.1 本研究特色 |
| 5.2 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 缩写词表(ABBREVIATION) |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
（9）亚洲百合‘布耐罗’抗病和抗衰老基因转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文缩略词(ABBREVIATION) |
| 1 引言 |
| 1.1 百合的育种目标 |
| 1.2 转基因技术研究进展 |
| 1.2.1 百合组织培养的研究进展 |
| 1.2.2 百合基因转化体系的建立 |
| 1.2.3 百合遗传转化技术 |
| 1.2.4 展望 |
| 1.3 IPT及 NPR1基因的应用现状 |
| 1.3.1 IPT |
| 1.3.2 NPR1 |
| 1.4 研究的技术路线 |
| 2 植物表达载体 PB35SNPR1的构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 克隆基因 |
| 2.2.2 植物表达载体pB35SNPR1的构建 |
| 2.2.3 植物表达载体向农杆菌的转化及鉴定 |
| 3 百合再生体系的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同灭菌时间对外植体存活率的影响 |
| 3.2.2 筛选诱导鳞片分化的最佳培养基 |
| 3.2.3 筛选诱导小鳞茎叶分化的最佳培养基 |
| 4 百合遗传转化体系的建立与优化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 转化方法和转化条件的优化 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 卡那霉素对小鳞茎叶基部分化不定芽的影响 |
| 4.2.2 转化方法与转化条件的优化 |
| 4.2.3 转NPR1、IPT基因卡那抗性植株的获得 |
| 5 转基因植株的 GFP检测 |
| 5.1 GFP基因 |
| 5.1.1 GFP的发现和结构 |
| 5.1.2 GFP作为标记物的优点 |
| 5.1.3 GFP作为报告基因用于转基因植物研究 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 转 NPR1基因植株的GFP检测结果 |
| 6 转基因植株的 PCR检测 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 转 NPR1基因植株的 PCR检测结果 |
| 6.2.2 转 IPT基因植株的 PCR检测结果 |
| 7 转基因植株的生理指标检测 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 抗病性检测方法 |
| 7.1.3 抗衰老性检测方法-HPLC法(液相色谱) |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 转 NPR1基因植株的抗病性检测 |
| 7.2.2 转 IPT基因植株的抗衰老性检测 |
| 8 结论 |
| 参考文献 |
| 附1 |
| 附2:常用溶液配制及反应体系 |
| 附3:图版 |
| 导师简介 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、提高龙心素活性测定的重复性（论文参考文献）
- [1]基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究[D]. 吴娅丽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [2]地龙抗凝血活性体外评价方法的建立[J]. 吴娅丽,马韫楠,张琦,喻祥龙,杜守颖. 中国现代应用药学, 2019(20)
- [3]猕猴桃溃疡病抗性材料评价及其亲缘关系的ISSR聚类分析[D]. 刘娟. 四川农业大学, 2015(07)
- [4]龙心素胶囊质量标准提高研究[J]. 张利,赵军,赵钐妤. 中国生化药物杂志, 2012(04)
- [5]药对麻黄-地龙抗哮喘药效物质基础与作用机制研究[D]. 褚襄萍. 上海交通大学, 2008(04)
- [6]龙牙百合脱毒种球培育及休眠生理的研究[D]. 杨柏云. 南昌大学, 2007(07)
- [7]农杆菌介导的ACO ihpRNAi载体转化亚洲百合的研究[D]. 李小玲. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [8]麝香百合T-DNA插入突变群体的构建与分析[D]. 刘菊华. 华南热带农业大学, 2006(06)
- [9]亚洲百合‘布耐罗’抗病和抗衰老基因转化的研究[D]. 刘伟. 北京林业大学, 2006(02)
- [10]提高龙心素活性测定的重复性[J]. 黄飞,周慧. 华西药学杂志, 2001(06)