一、利用软件Primer Premier 5.0进行PCR引物设计的研究（论文文献综述）
王玲[1]（2021）在《GGT1不同剪接体鉴定及其对哺乳动物卵泡发育和排卵的功能研究》文中指出卵泡发育和卵子发生是动物成功繁殖的关键,也是养猪业中产仔数的决定因素。卵泡的发育和卵母细胞的成熟受到卵巢内外多种因素共同调控作用。选择性剪接是最重要的转录后调控之一,单个基因通过不同的剪接方式产生大量的mRNA和蛋白异构体,从而增加了基因表达的复杂性,促进了蛋白质的多样性。选择性剪接在动物卵泡发育和排卵等生理过程中发挥重要的调控作用。本研究筛选并验证了在梅山猪和大白猪中差异表达的基因γ-谷氨酰转移酶1（γ-glutamyltransferase 1,GGT1）的两个剪接体:全长剪接体（GGT1-01）和11号外显子发生外显子跳跃事件的剪接体（GGT1-02）,并在猪卵巢颗粒细胞中进行功能研究;并成功构建GGT1基因（对应猪GGT1-02转录本）敲除小鼠,研究其在卵泡发育和排卵过程中的分子功能。研究内容与结果如下:1、GGT1基因不同剪接体调控猪卵巢颗粒细胞的生长和前列腺素合成的研究（1）利用MISO软件筛选出差异表达的GGT1基因不同剪接体（|ΔPSI|≥10%）。通过对GGT1基因不同剪接体进行验证,发现GGT1-02剪接体在梅山猪卵巢组织中高表达。GGT1-02剪接体促进猪卵巢颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡,而GGT1-01剪接体不参与颗粒细胞的增殖和凋亡的调控作用。（2）GGT1-02与跨膜转运蛋白1（transmembrane and coiled-coil domains 1,TMCO1）存在互作,上调细胞内钙离子浓度,激活细胞质磷脂酶A2（cytoplasmic phospholipase A2,cPLA2）,促进花生四烯酸（arachidonic acid,AA）的合成,并通过AA-PTGS2-PGE2通路促进前列腺素的合成。GGT1-01不参与前列腺素合成的生物学过程。（3）qRT-PCR和Western blotting试验结果表明富含丝氨酸和精氨酸剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1,SRSF1）通过其第二个RNA识别结构域（RNA recognition motif,RRM）和富含丝氨酸/精氨酸结构域（arginine-and serine-rich domain,RS）结构域调控GGT1基因选择性剪接,进而上调GGT1-02剪接体的表达。构建不同剪接因子突变片段的GGT1-minigene真核表达载体,将其与SRSF1超表达载体共转至猪胚胎肾细胞,发现在GGT1外显子11上存在异质核核糖核蛋白H1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein family H1,hn RNPH1）的结合位点对SRSF1调控GGT1选择性剪接十分重要,通过Co-IP证明了SRSF1与hn RNPH1相互作用共同调控GGT1的选择性剪接。（4）SRSF1可以促进卵巢颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡。在猪卵巢颗粒细胞中,通过ELISA等试验,表明SRSF1可以促进猪卵巢颗粒细胞中前列腺素的合成。通过质粒共转试验表明SRSF1介导GGT1基因的选择性剪接,从而调控卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡及促进颗粒细胞中前列腺素合成。2、利用基因敲除小鼠模型研究Ggt1基因在卵泡发育和排卵过程中功能（1）通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Ggt1基因敲除小鼠模型。相较于野生型小鼠,Ggt1-/-小鼠在出生10 d后出现生长缓慢、卵巢重量显着下降（P<0.01）、不孕并且无法成功排卵。通过ELISA试验检测血清中激素水平,与野生型小鼠相比,Ggt1-/-小鼠血清中睾酮水平以及LH/FSH水平显着上升（P<0.05）、前列腺素水平显着下降（P<0.01）、雌激素水平不存在差异。通过3周龄、5周龄和8周龄的野生型小鼠和Ggt1-/-小鼠卵巢组织切片的H&E染色发现:3周龄Ggt1-/-小鼠卵巢切片中的初级卵泡、次级卵泡以及有腔卵泡数目并无显着差异,但观察到显着增加的闭锁卵泡数目（P<0.01）。5周龄Ggt1-/-小鼠卵巢切片中的初级卵泡、次级卵泡并无显着差异,但有腔卵泡数目显着降低,闭锁卵泡数目显着增加（P<0.05）。在8周龄Ggt1-/-小鼠卵巢切片中发现显着增加的次级卵泡（P<0.05）,而未见排卵前有腔卵泡。以上结果表明,Ggt1-/-小鼠卵泡发育受损、排卵障碍、激素水平紊乱,出现类似于人多囊卵巢综合征的临床表型。（2）采用EdU、TUNEL和Western blotting实验方法检测3周龄和8周龄的野生型和Ggt1-/-小鼠卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡水平。试验结果表明:3周龄Ggt1-/-小鼠和野生型小鼠颗粒细胞的增殖与凋亡未见显着差异;但在8周龄小鼠卵巢切片中,增殖的颗粒细胞显着减少（P<0.01）以及凋亡颗粒细胞显着增加（P<0.05）。Ggt1-/-小鼠卵巢组织蛋白中PCNA和BCL-2蛋白表达量显着降低（P<0.05）,BAX蛋白表达量显着升高（P<0.05）。（3）卵巢切片透射电镜试验结果表明:3周龄Ggt1-/-小鼠的卵巢透射电镜中未见线粒体结构和数目的改变,但在8周龄Ggt1-/-小鼠卵巢电镜中发现显着增加的结构紊乱的线粒体（P<0.05）。此外对卵母细胞线粒体功能检测,发现8周龄Ggt1-/-小鼠卵母细胞ROS水平显着增加（P<0.01）,线粒体膜电位、mt DNA拷贝数以及ATP水平显着减低（P<0.01）。此外,通过对野生型小鼠和Ggt1-/-小鼠GV期卵母细胞的进行体外培养,我们发现Ggt1-/-小鼠GV期卵母细胞的GVBD率以及第一极体排除率显着降低（P<0.01）。（4）通过在三周龄断奶Ggt1-/-小鼠饮用水中添加10 mg/mL的N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）,在一定程上恢复Ggt1-/-小鼠生长,恢复颗粒细胞生长,恢复卵泡的发育和GV期卵母细胞的体外成熟。综上所述,Ggt1是卵泡发育、排卵和雌性生育所必需的。Ggt1缺失导致线粒体功能障碍和ROS积累,导致雌性小鼠类似PCOS表型;NAC能缓解Ggt1缺乏引起的雌性小鼠线粒体功能障碍和卵母细胞发育缺陷;GGT1与TMCO1相互作用,通过颗粒细胞AA-PTGS2-PGE2通路激活cPLA2,加速PGE2合成,促进卵泡发育。本研究表明,NAC可以恢复Ggt1-/-雌性小鼠的PCOS样表型,并扩展了对人类患者PCOS潜在治疗方案的理解。
张梦垚[2]（2021）在《基于CRISPR技术的副溶血性弧菌核酸现场检测系统的研究》文中指出食品安全关系到每个人的生命健康。其中,食源性致病菌导致的食品污染影响最大、分布最广泛,已成为世界性的公共卫生问题。食品在生产、加工、流通、销售、消费等多个环节都可能存在生物安全风险,因此构建有效的致病菌检疫体系,实现致病菌现场快速检测具有重要意义。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术是检疫机构最常使用的检测技术。本论文以水产中常见的致病菌副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为研究对象,以核酸检测技术为基础,结合以规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR）及相关蛋白Cas12a酶体系为主的基因编辑技术和真空冷冻干燥技术,建立了操作简单、准确性高、成本低、荧光可视化、便于储存运输的现场快速检测系统。主要研究内容及结果如下:（1）建立了基于热循环仪的副溶血性弧菌荧光PCR检测方法。针对副溶血性弧菌的特异性不耐热溶血素（Thermolabile hemolysin,tlh）基因保守区域,设计3对特异性PCR引物并进行筛选,并优化核酸提取方法和扩增体系。为减少气溶胶污染,将PCR扩增原料里的脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine triphosphate,d TTP）替换为脱氧尿苷三磷酸（Deoxyuridine triphosphate,d UTP）,采用打开热盖的小型商业热循环仪进行PCR扩增。并将建立的PCR现场检测方法与实验室实时PCR系统检测方法相比较,结果具有一致性。该检测方案可以有效避免核酸检测过程中的气溶胶污染问题,其结果可在便携式观察仪上进行荧光可视化检测。（2）为进一步提高检测的特异性,建立了基于CRISPR/Cas12a的副溶血性弧菌现场荧光可视化检测方法。针对副溶血性弧菌tlh基因的最适特异性PCR引物的扩增片段,筛选含原间隔基序（Protospacer-adjacent motif,PAM）的区域,并设计向导核糖核酸（CRISPR RNA,cr RNA）,构建CRISPR/Cas12a体系。通过对反应试管、反应体系的优化实现了Cas12a蛋白酶最佳反应活性温度与PCR反应高温的平衡。利用商业热循环仪和实验室设计的与之配套的小型荧光观察装置,建立无需开盖即可进行后续荧光检测避免交叉污染的一体化反应。阳性扩增产生肉眼可见的绿色荧光而阴性扩增无荧光信号。该方法检测限为1.02×102 copies/reaction,且低浓度阳性扩增样本也发出明显的绿色荧光,结果判别方便直观。通过利用一次性棉签擦拭携带副溶血性弧菌的病虾进行致病菌取样,快速裂解细胞提取DNA进行后续反应验证了可行性,最终建立以便携式仪器为主的准确度高、可靠性好、操作简单、成本低廉的现场可视化检测方法。（3）为减少核酸检测试剂对低温环境的依赖,建立了应用于现场检测的核酸扩增试剂冷冻干燥方法。利用冷冻干燥技术对PCR检测试剂进行脱水处理,使检测试剂能以固体形态在室温下稳定储存和运输,并能保持其生物活性。研究优化了冻干保护剂的配方并调试了冻干工艺参数,以30%（w/v）海藻糖、10%（w/v）普鲁兰多糖和60%（w/v）甘露醇按2:2:1体积比混合的溶液作为冻干保护剂。将直径为1.8 mm的钢珠加入到PCR混合液中,预冷冻后进行6小时的真空干燥,成功制备了形态良好,具有较高韧性,可在磁力吸附作用下移动的冻干产品。复水活化后冻干试剂维持原反应活性。经验证该冻干试剂在聚丙烯、聚苯乙烯和聚乙烯等不同硬度的材质表面均具有良好的移动性能。该冻干PCR试剂不溶于油相,以15μL无核酶水复溶,数秒内即可得到澄清溶液。冻干试剂在50℃的高温条件下保存一周仍能保持较好的活性。该方法有助于解决核酸现场检测面临的冷链保存运输问题,降低现场检测的限制条件和检测成本,对推动核酸检测技术向资源匮乏地区的应用具有重大意义。
王苑馨[3]（2021）在《喜旱莲子草DMNT合成途径关键TPS的鉴定和功能研究》文中提出入侵杂草喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides,是原产南美洲的苋科（Amaranthaceae）莲子草属（Alternanthera）的宿根草本植物,目前广泛蔓延在北纬32度至南纬38度的湿润陆地上,造成严重经济及生态问题。莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila（Coleoptera:Chrysomelidae）,以下简称“跳甲”,是自南美引入、专食喜旱莲子草的优良天敌。跳甲对喜旱莲子草具有高度寄主专一性,是研究专食性昆虫与寄主相互作用的优良模型。前期研究表明,寄主挥发物（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（（E）-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene,DMNT）能够显着吸引莲草直胸跳甲,且跳甲可利用该挥发物将寄主和非寄主植物区分开,是跳甲定向、定位和取食寄主喜旱莲子草的重要线索。萜类合酶（terpene synthase,TPS）作为DMNT合成中重要的关键酶,是了解专食性昆虫选择、适应寄主以及寄主植物防御的重要突破口。本研究利用喜旱莲子草各组织混合样本转录组数据,对喜旱莲子草DMNT合成关键萜类合酶基因ApTPSs进行了筛选和鉴定,并明确了其在专食性莲草直胸跳甲与寄主喜旱莲子草互作中的功能,从植物萜类挥发物代谢角度阐明了专食性莲草直胸跳甲与寄主喜旱莲子草相互作用机制。本文主要研究结果如下:1.首先,通过调查莲草直胸跳甲取食喜旱莲子草叶片的短期行为,对触摸和取食行为进行了时间划定,随后利用qPCR分析了候选7条ApTPSs片段在跳甲接触5 min、取食1 h和机械损伤下喜旱莲子草叶片中的相对表达量及损伤后随时间推移变化的表达情况,发现跳甲的短期接触即可诱导ApTPS10、ApTPS12、ApTPS16和ApTPS19的上调表达;取食强烈诱导7条候选ApTPSs的上调表达,而机械损伤状态下,候选7条ApTPSs表现出相对较弱的延迟上调表达。结合前期跳甲取食诱导和机械损伤诱导下DMNT的挥发量变化以及TPS基因诱导表达的特性,进一步筛选了DMNT合成相关ApTPSs。2.拼接并克隆了4条ApTPSs基因:ApTPS10、ApTPS15、ApTPS19和ApTPS35。对候选ApTPSs进行生物信息学分析,发现均为TPS-g家族成员,催化非环化萜类的形成,符合DMNT合成相关萜类合酶特征。采用原核表达的方式,对4条重组蛋白的最佳诱导条件进行了摸索,并利用SPME和GC-MS,体外确定了ApTPSs催化的产物成分,初步确定4个ApTPSs的催化功能。其中,ApTPS15为双功能酶,除催化DMNT前体橙花叔醇的形成外,还催化芳樟醇的形成。ApTPS10、ApTPS19和ApTPS35均催化芳樟醇的形成。3.利用qPCR对4个ApTPSs进行组织表达分析,发现ApTPS15在喜旱莲子草叶片中相对表达量最高,而ApTPS19在喜旱莲子草各组织的相对表达量差别不大。进一步构建ApTPSs-EGFP融合表达载体,采用烟草瞬时表达系统,对ApTPSs进行亚细胞定位分析发现,ApTPS10定位在质体中,ApTPS15、ApTPS19和ApTPS15均定位在胞质中。ApTPS15的亚细胞区位符合DMNT生物合成相关萜类合酶的亚细胞定位。4.为研究ApTPS15在莲草直胸跳甲和喜旱莲子草相互作用中的贡献,构建了ApTPSs的过表达载体,利用模式植物拟南芥遗传转化系统,获得了过表达ApTPS15拟南芥株系,并将过表达ApTPS19拟南芥株系作为对比。过表达ApTPS15拟南芥株系叶片蜷缩偏小,叶片中ApTPS15的表达量是野生型的2倍以上;而过表达ApTPS19拟南芥与野生型差别不大,ApTPS15的表达量中可达到野生型的8倍以上。莲草直胸跳甲的行为选择试验表明,相对于野生型拟南芥,雌性成虫对于过表达ApTPS15拟南芥株系表现出明显的偏好性,而对于过表达ApTPS19拟南芥株系无明显偏好。该结果表明,在拟南芥中ApTPS15的表达能够影响跳甲雌性成虫的行为选择。5.最后,我们构建了pGR107-ApTPS15RNAi载体,利用VIGS技术,诱导喜旱莲子草ApTPS15沉默。ApTPS15沉默植株表现出橙花叔醇丰度的降低,同时也在个别植株出现其他萜类挥发物丰度升高的现象。莲草直胸跳甲雌性成虫更倾向于选择对照植株,而非ApTPS15沉默植株。该结果进一步证明ApTPS15是调控喜旱莲子草DMNT前体橙花叔醇合成的萜类合酶。综上所述,ApTPS15为编码喜旱莲子草DMNT前体橙花叔醇合成的萜类合酶基因,其表达变化能够显着改变喜旱莲子草叶片中橙花叔醇的含量,进而影响莲草直胸跳甲雌性成虫的行为选择。该结果有助于增强对专食性昆虫与寄主植物关系的理解。
李志[4]（2021）在《环形泰勒虫SVSPs分子互作蛋白的筛选及功能研究》文中研究表明环形泰勒虫是一种由蜱传播的、主要感染牛科动物淋巴细胞和红细胞的胞内原生寄生虫。它可侵入宿主B细胞、巨噬细胞和DC细胞并使其发生转化,转化的细胞表现出癌细胞的特征,包括无限增殖、转移和基因组不稳定性。目前,已证明多种环形泰勒虫分子可通过影响宿主细胞的信号通路而影响细胞的活性,但在转化过程中发挥关键作用的虫体蛋白及作用机制并不清楚。有研究推测,环形泰勒虫SVSP家族成员可能与细胞转化、入侵和免疫逃避有关,但是SVSPs蛋白在宿主-寄生虫互作中的具体作用并不清楚,因此探索与SVSPs蛋白互作的宿主细胞分子及其作用机制,将为解析环形泰勒虫诱发的癌细胞特性的分子机制提供新的见解。本研究以SVSP家族中的部分基因为研究对象,利用酵母双杂交系统筛选与其互作的宿主细胞分子,运用Co-IP和Bi FC技术对其互作蛋白进行鉴定。并进一步探究SVSP家族分子对宿主细胞信号通路的影响,为解析环形泰勒虫的致病机制奠定基础。主要的研究结果如下:1.构建了SVSP452、SVSP453和SVSP455的重组原核表达质粒,将其进行诱导表达与纯化,获得浓度约为0.4 mg/L的重组蛋白。将上述三种蛋白与已纯化好的SVSP450和SVSP454蛋白,分别免疫新西兰白兔,制备了这5种蛋白的兔源多克隆抗体。细胞内定位结果显示,在环形泰勒虫感染的细胞中,这些蛋白在细胞的细胞核和细胞浆中均有分布,而SVSP455主要在宿主细胞的胞浆和裂殖体表面分布。2.成功构建了SVSP447、SVSP449、SVSP450、SVSP452、SVSP453、SVSP454和SVSP455的重组诱饵质粒,并对其自激活和毒性进行了鉴定。结果表明这7个诱饵质粒均无自激活和毒性特征,可以用于酵母双杂系统的筛选。3.通过qPCR和Western blotting检测了SVSP449在环形泰勒虫不同发育阶段和感染不同代次细胞的表达特征。以SVSP449为诱饵质粒,运用Y2H系统筛选了与其互作的宿主分子RBMX2-like和UBQLN4。Co-IP和Bi FC技术验证发现SVSP449只与RBMX2-like发生互作。4.qPCR分析了SVSP454在环形泰勒虫三个发育阶段和不同代次感染细胞内的表达丰度,用Y2H系统筛选与其互作的宿主分子CCDC181和MRPL30,Co-IP和Bi FC技术证明SVSP454与CCDC181和MRPL30都发生互作。5.qPCR鉴定了SVSP455在环形泰勒虫不同发育阶段和不同代次细胞的表达丰度,用Y2H系统筛选与其互作的宿主分子HSP60和POMP,Co-IP、Bi FC和激光共聚焦技术验证发现SVSP455只与HSP60直接发生互作。通过RNA干扰HSP60以及SVSP455过表达,发现SVSP455能部分拯救宿主细胞线粒体凋亡通路相关分子表达,调控宿主细胞的凋亡。
张露文[5]（2021）在《Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究》文中提出糖尿病是一种在全世界范围内普遍存在的慢性代谢性疾病,对人们的健康以及医疗资源产生了严峻的影响。目前,胰岛移植有望治疗糖尿病,但由于胰岛供体短缺和免疫排斥问题而受限。因此,寻找其它来源的胰岛素分泌细胞（Insulin producing cells,IPCs）进行移植成为治疗糖尿病的有效途径。在近几年的研究中,虽然体外诱导干细胞分化为IPCs已初见成效,但IPCs的分化程度和胰岛素分泌量都很低。通过查找文献发现在胰岛的发育、成熟过程中,Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2都起着一定的作用,也有研究证明将这些基因单独转入干细胞对于诱导其向IPCs分化具有促进作用,只是分化效率不够稳定,IPCs的胰岛素分泌量低而且不随葡萄糖浓度变化而变化。本实验室之前通过测序分析筛选出可能在诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化过程中起作用的新基因Dll1,我们从研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用入手,进一步研究Dll1与Pdx1、Ngn3、Pax4或Nkx2.2不同组合重编程犬脂肪MSCs为IPCs的效果。主要研究结果如下:1.为研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用,我们在犬脂肪MSCs中过表达Dll1,以及通过si RNA将Dll1基因沉默,分别诱导Dll1基因过表达的MSCs株和Dll1基因沉默的MSCs株向IPCs分化。（1）RT-q PCR检测,过表达Dll1组Maf A、Nkx6.1和Ins基因表达量极显着高于（P<0.001）对照组（48.975±3.578 vs 33.975±3.453;55.156±6.267 vs 25.106±1.267;39.258±3.752 vs 21.533±2.401）;Dll1沉默组Pdx1、Maf A、Pcsk2和Ins基因表达量极显着低于（P<0.001）对照组（4.388±0.898 vs15.997±1.660;9.365±1.356 vs 33.975±3.453;16.358±1.258 vs 27.538±2.935;12.397±0.369vs 21.533±2.401）。（2）双硫腙染色,过表达组细胞团呈显猩红色。（3）免疫荧光检测,过表达组细胞团分泌胰岛素。（4）高糖刺激下,过表达Dll1组胰岛素分泌量（160.25±10.35μIU/105个细胞）极显着高于（P<0.001）对照组的胰岛素分泌量（125.23±4.35μIU/105个细胞）,Dll1沉默组胰岛素分泌量（101.367±5.367μIU/105个细胞）极显着低于（P<0.001）对照组的胰岛素分泌量;KCl刺激下,各个组合的胰岛素分泌量与高糖刺激下相似。过表达Dll1组的胰岛素刺激释放指数SI（2.70±0.05）显着高于（P<0.01）对照组SI（2.36±0.11）,Dll1沉默后胰岛素刺激释放指数SI（2.16±0.08）极显着低于（P<0.001）对照组SI。2.构建三个组合腺病毒多基因共表达穿梭载体p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3、p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4和p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2,验证正确后,将其分别与p Ad Easy-1重组,获得重组腺病毒多基因共表达载体p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3（组合一）、p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4（组合二）和p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2（组合三）,并进行了验证,感染293A细胞。（1）RT-q PCR显示,组合一（Pdx1 2000±100、Ngn3 1956±56和Dll1 1900±100）,组合二（Pdx1 1966±66、Ngn31865±65、Dll1 2000±100和Pax4 1999±99）和组合三（Pdx1 1856±56、Ngn3 1799±99、Dll1 1823±100和Nkx2.2 1911±100）的m RNA均有平衡表达。（2）Western-blot检测,三个组合均可表达目的基因的蛋白。3.将三个组合的重组腺病毒毒液分别感染犬脂肪MSCs,重编程犬脂肪MSCs成为IPCs。（1）感染48h后三个组合均表达GFP,培养25 d后组合二的细胞成团数最多,每106个犬脂肪MSCs中约有121±6个细胞团,细胞团的直径约为100±9μm,每个细胞团中约有115±14个细胞（n=3）。（2）双硫腙染色,三个组合中的细胞团均呈现猩红色,但组合二颜色最深。（3）RT-q PCR检测,组合二Pdx1、Maf A基因表达水平显着高于组合一（29.785±2.155 vs 21.095±2.125;24.578±2.135 vs 15.888±1.105）,组合二Nkx6.1、Pcsk2基因表达水平高于组合一（32.578±4.98 vs 19.888±5.036;18.268±3.175 vs 9.578±3.145）。组合二Pdx1、Maf A、Nkx6.1基因表达水平高于组合三（29.785±2.155 vs25.225±2.195;24.578±2.135 vs 20.018±2.175;32.578±4.98 vs 24.018±5.106）。（4）高糖刺激下,组合一胰岛素分泌量（58.51±3.64μIU/105个细胞）,组合二胰岛素分泌量（135.97±4.26μIU/105个细胞）,组合三胰岛素分泌量（113±3.26μIU/105个细胞）,组合二的的分泌量均显着高于（P<0.01）组合一和组合二,但组合二分泌在高糖刺激下胰岛素分泌量极显着低于（P<0.001）胰岛细胞的胰岛素分泌量。组合二的胰岛素刺激释放指数SI（2.33±0.09）也均高于其他两组,但显着低于（P<0.01）胰岛细胞SI（2.71±0.08）。结果表明,Dll1基因表达对体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化具有促进作用;三个组合均能使MSCs重编程为IPCs,四基因组合的重编程效果都远远优于三基因组合,在四基因组合中,组合二的重编程效果优于组合三。
王彦云[6]（2021）在《基于SNP标记的黄河鲤鱼溯源研究与应用》文中认为鱼肉是重要的优质蛋白来源,具有维生素、矿物质含量丰富,口味好、易于消化吸收的优点。黄河鲤（Cyprinus carpio）以其金鳞赤尾、肉质鲜美的特点享誉中外,属于珍贵的鱼类资源,建立黄河鲤的溯源体系,可以实现对黄河鲤产品的可追溯管理,为黄河鲤产品市场监管提供技术支持（吴潇等,2017b;王兆丹,2010）。由于人工选育和环境改变的影响,使用传统形态学方法对个体品种鉴定的难度很高,往往不能做到快速、准确,且一旦做成产品,不再具有外形特征,就无法进行鉴定。DNA标记具有操作简单、分型手段成熟、鉴定速度快和准确度高等特点,可以应用于肉产品溯源,在生产-加工-储藏-销售各环节均可使用,且不受生物形态和状态的影响。然而,目前DNA标记在溯源方面的应用存在诸多难点,包括标记的选择、成熟简便的分型技术,实际应用过程数据分析等众多问题。因此,针对以上问题,本研究开展了基于SNP标记的黄河鲤鱼溯源研究与应用,为DNA标记在鲤鱼品种溯源上的应用奠定基础。具体内容及研究结果如下:1.共收集我国主要鲤鱼品种6个,其中,黄河鲤样品70个,荷包红鲤、福瑞鲤、松浦镜鲤、建鲤和丰鲤样品各50个,所有样品均用相应标准进行了鉴定。使用数据库筛选和性状基因搜索两种方法对用于黄河鲤溯源SNP标记的筛选。一是根据Carpbase数据库检索（中国水产科学研究院生物技术研究中心）选择了54个候选标记位点,针对候选位点设计多重测序引物,并使用测序引物对170个样品进行扩增,产物二代测序作群体验证,检测出42个SNP位点,根据上述位点在各品种中的等位基因频率及基因型频率,最终获得特异性位点19个。二是通过性状基因进行位点搜索,通过NCBI和Carpbase数据库检索及文献报道,选择了与鲤鱼体色、生长性状、肉质性状相关的53个基因,针对待测片段设计多重PCR引物430对,最终优化得到111对引物对130个样品DNA目标区域进行二代测序,对获得的SNP位点按照数据库的方法进行筛选,得到特异性标记19个。从得到SNP候选位点38个中选择特异性最好的12个SNP标记,并分为五个小组,分别用于黄河鲤与其他五个鲤品种两两间的鉴别,其中,黄河鲤与松浦镜鲤、丰产鲤的鉴别效果最好,MP值均接近于0;黄河鲤与荷包红鲤、福瑞鲤、建鲤的鉴别效果较好,MP值在1×10-5至6×10-4之间。12个SNP位点组合特异性较高,黄河鲤与各品种MP值均小于6×10-4,黄河鲤鉴定效果良好。2.SNP分型检测方法建立。利用等位基因特异性,设计通用引物、突变序列引物和野生序列引物,产物通过毛细管电泳的方法进行检测,根据出峰位置进行快速判定。结果与二代测序进行比较。结果表明,该方法的结果与对应区域的二代测序结果一致。扩增后的基因组DNA通过10倍稀释法检测方法灵敏度,结果表明,该方法的灵敏度约为1.39ng/μL,效果良好。对同一模板重复5次试验,5个产物浓度的相对标准偏差（RSD）为22.88%,表明方法的重复性较好。建立了基于AS-PCR-CE的SNP分型方法,该方法结合了AS-PCR操作简单、特异性扩增的优点和毛细管电泳高效、灵敏度高、高通量、数据分析简单等优点。3.将获得的11个SNP标记分成五组用于黄河鲤与普通鲤鱼品种的溯源鉴定。对300个鲤鱼样品进行AS-PCR-CE方法的测定,其中,70个黄河鲤样品有69个样品5个分组均有出峰,有一个出峰的组数为4,黄河鲤错判率为1.43%;230个普通鲤鱼出峰的组数均小于等于4,没有一个被误判为黄河鲤,判定准确率为100%。此外,我们还从黄河郑州段、泰安黄河段鲤、北京四道口黄河鲤、河北唐山市场上分别收集了标称为黄河鲤鱼样本20个,进行真假鉴定。结果表明,黄河郑州段鲤鱼样品5个分组中均有出峰,均为黄河鲤真品;泰安黄河段鲤有4个样品5个分组均出峰,为黄河鲤真品;北京四道口黄河鲤有2个样品5个分组均出峰,为黄河鲤真品;河北唐山黄河鲤有3个样品5个分组均出峰,为黄河鲤真品;6条标称为黄河鲤鱼实为其他鲤鱼假冒,假冒率为30%。
徐巍[7]（2021）在《番茄低温下矮化坏死调控基因ndw的克隆及功能鉴定》文中进行了进一步梳理番茄（Solanum lycopersicum）是世界种植最为广泛的蔬菜作物之一。番茄生产过程中容易遭受各种生物和非生物胁迫,对其产量和产品质量都造成了严重影响。栽培番茄是一种喜温作物,低于13℃的温度下生长发育缓慢、叶片萎蔫,还可能造成落花落果,果实畸形等。因此,低温是影响番茄分布、生长发育和生产力的主要非生物因素之一。此外,番茄生产还经常受到灰霉病菌（Botrytis cinerea）等生物因子的侵染。因此,挖掘与番茄耐低温性和抗灰霉病相关基因,解析基因的作用机制具有重要的研究意义。本研究以野生潘那利番茄渐渗系IL6-2为材料,采用图位克隆的方法对其在低温下表现出植株矮化、叶片坏死性状的调控基因进行定位,并进行候选基因的功能验证。现将主要研究结果总结如下:1.对50份番茄渐渗系（背景材料为M82）的表型进行观察,发现IL6-2在低温下表现为植株矮化,萎缩,叶片甚至出现坏死斑,而其他渐渗系中并没有出现该表型。生理指标测定结果显示,12℃低温下IL6-2叶片相对电导率、丙二醛含量、过氧化氢积累均极显着高于M82,而脯氨酸含量极显着低于M82,说明IL6-2对低温更敏感。2.对IL6-2和M82的幼苗低温处理0 h、24 h、48 h后,进行RNA-seq转录组分析,共鉴定到3,459个基因在M82和IL6-2之间显着差异表达,低温处理0 h、24 h、48 h分别有1,439、2,170和888个差异表达基因（DEGs）,对DEGs进行功能聚类分析,发现IL6-2与M82之间的差异表达基因显着富集在跨膜受体蛋白激酶活性、跨膜受体活性、转移酶活性、蛋白激酶活性等分子功能类,主要涉及次生代谢产物生物合成、植物激素信号转导和植物病原菌互作途径。3.为了对IL6-2低温下矮化坏死性状的调控基因进行定位,将IL6-2与M82杂交,构建F2代遗传分离群体,通过性状遗传规律分析,得出IL6-2低温下矮化坏死属于单基因隐性性状。利用遗传分离群体,开发In Del分子标记进行基因分型,连锁分析结果将候选区段粗定位至6号染色体37.95 Mb～39.14 Mb之间约640 kb范围。进一步扩大遗传分离群体,开发新的In Del分子标记进行精细定位,最终将候选区段缩小至38.68Mb～38.76 Mb之间约77.4 kb的范围内。4.根据番茄参考基因组数据库,预测候选区段内有7个ORFs,根据基因注释信息,分别为蛋白质精氨酸甲基转移酶（ORF1）、3个类受体蛋白激酶（ORF2、ORF3、ORF4）、糖基转移酶（ORF5）、过氧化物酶起源因子（ORF6）和锌指蛋白（ORF7）。通过对7个ORFs在IL6-2和M82之间的g DNA序列进行比对分析,发现在启动子、外显子、内含子区域都存在核苷酸的差异。RNA-seq分析IL6-2和M82之间差异基因的差异表达倍数,结合q RT-PCR对7个ORFs表达量分析结果,表明ORF2（Solyc06g060680.1.1）和ORF3（Solyc06g060690.2.1）在IL6-2中表达量极低,而ORF5（Solyc06g060710.2.1）在IL6-2中表达量显着上调,这3个基因在M82和IL6-2之间的相对表达量呈现极显着差异,因此将这3个基因作为调控潘那利渐渗系IL6-2低温下矮化坏死表型的重要候选基因。5.对3个候选基因分别构建超量表达载体和RNA干涉表达载体,并进行番茄的遗传转化,获得转基因植株。对转基因材料进行阳性检测和候选基因表达量分析,选择阳性且基因表达量显着上调的超量转基因株系、基因表达量显着下调的干涉转基因株系进行表型鉴定,结果表明超量表达ORF3（Solyc06g060690.2.1）基因,使IL6-2低温下矮化坏死的表型得到了恢复,表型接近于M82,12℃低温下3个超量转基因株系的株高极显着高于IL6-2,相对电导率、丙二醛含量极显着低于IL6-2,而脯氨酸含量极显着高于IL6-2。ORF2（Solyc06g060680.1.1）、ORF5（Solyc06g060710.2.1）转基因株系12℃低温下的表型与非转基因材料之间没有显着差异。因此,候选基因功能鉴定结果表明,ORF3（Solyc06g060690.2.1）即为正确的目的基因NDW,在番茄生长和耐低温性方面发挥重要作用。6.对NDW转基因株系接种灰霉菌的抗性进行鉴定,通过对离体叶片接种灰霉菌3d后病斑面积的测量及灰霉菌生长量的测定,结果表明与IL6-2相比,超表达NDW基因降低了植株对灰霉菌的敏感性,而在M82中抑制NDW基因的表达则提高了对灰霉菌的敏感性,说明NDW基因在调控番茄对灰霉菌的敏感性方面发挥一定作用。7.基因序列分析显示,NDW基因组全长序列为1122 bp,包含有两个外显子和一个内含子,编码一个342个氨基酸的蛋白质,在SGN数据库中的注释信息是一个类受体蛋白激酶（Receptor-like protein kinase）,其氨基酸序列包含一个PKC-like保守结构域。番茄NDW氨基酸序列与茄属其它作物具有高度的同源性,与马铃薯、辣椒、烟草中同源蛋白存在多处的保守结构域。系统进化树分析结果表明,NDW与茄属的马铃薯（Solanum tuberosum）亲缘关系最近,同源性约为79.12%,与茄属以外作物同源性较低。8.对NDW基因的表达模式进行分析,明确了NDW基因呈组成型表达,在番茄的根、茎、叶片、花蕾、花和果实中均有表达,其中在根和茎中的表达量较高。亚细胞定位结果显示NDW蛋白定位于细胞的质膜,同时在细胞质中也有少量表达,说明其发挥着类受体蛋白激酶的功能,负责对胞外信号进行感知并向胞内进行传导。9.分析NDW转基因株系和M82、IL6-2中涉及ABA合成代谢、分解及信号转导通路相关基因的表达水平,结果表明NDW基因上调了部分ABA受体基因、信号转导正向调控基因、合成相关基因的表达水平,下调了部分ABA信号转导负向调控基因,分解相关基因的表达水平,说明NDW基因与ABA的积累有关,可能通过依赖ABA途径调控植物的生长发育及逆境胁迫应答。
秦盼柱[8]（2021）在《基于核酸扩增原理的常见肉源性成分快速鉴定研究》文中研究指明肉类食品是人类饮食的重要组成部分,肉制品安全与人们的身体健康和生命安全直接相关。近年来接连发生的肉制品安全事件使人们充分意识到建立准确、有效的肉品质量监管机制的重要性。然而,目前的检测方法仍以实验室分析为主,可用于快速、简单和现场检测肉源性成分的方法较少。针对肉制品检测的研究现状,本论文以聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等核酸扩增技术为基础,并与荧光分析、荧光偏振（FP）、侧向层析试纸（LFS）和表面增强拉曼光谱（SERS）等流行的传感技术相结合,旨在建立简单、快速和灵敏的常见肉源性成分检测新方法。主要内容如下:（1）基于功能化引物设计的PCR方法检测牛肉中的马肉成分。PCR引物的末端被设计成了独特的颈环结构,颈环结构上标记了荧光基团和淬灭基团。在初始条件下,颈环上的荧光基团和淬灭基团相互靠近,荧光信号很弱。当马肉成分存在时,功能化的引物会参与扩增过程,导致引物末端的颈环结构被打开并产生荧光信号的恢复。且马肉成分越多,收集的荧光信号越强。在最优条件下,该方法对牛肉中掺假马肉的检测限为0.04%（w/w）。此外,对加工牛肉样品的检测进一步证实了该方法的实际应用潜力。与传统PCR相比,该方法在检测效率上具有明显的优势,并充分突出了其快速检测和易于操作的特点。（2）基于单链结合蛋白增强的荧光偏振策略检测牛肉中的鸡肉成分。将传统PCR技术与FP技术相结合,提出了一种基于单链结合蛋白（SSB）增强的FP策略,可用于灵敏检测肉品中的鸡肉成分。基因组模板提取后,首先使用荧光基团标记的针对鸡肉特异的引物进行PCR扩增。然后在扩增产物中加入SSB,使单链引物与SSB充分结合。当没有鸡肉成分时,荧光基团标记的引物可以与后续添加的SSB牢固结合,荧光基团的运动被束缚,因此FP信号很高。当存在鸡肉成分时,荧光基团标记的引物在扩增过程中被消耗,不能与后续添加的SSB结合,导致FP信号降低。而且,鸡肉成分越多,测量的FP信号越低,进而建立起鸡肉掺假比例与FP信号的相关关系。在最优条件下,该方法对牛肉中掺假鸡肉的检测限为0.035%（w/w）。该方法强调了FP技术在PCR产物快速分析中的应用,突出了SSB对FP信号的增强作用。与基于电泳分析和荧光回收的传统检测方法相比,该方法具有设计简单、操作方便和检测快速的优点。（3）基于环介导等温扩增的荧光偏振方法快速检测牛肉中的猪肉成分。通过巧妙地将荧光基团标记的引物应用于LAMP的反应系统,构建了一种结合了LAMP技术的等温扩增优势和FP技术的快速检测优势的理想平台。荧光基团标记的引物分子量较小且旋转速率较快,因此显示的FP信号有限。当存在猪肉成分时,分子量较小的引物经过扩增被转变成大分子量的产物,导致荧光基团的旋转受到限制,因此FP信号显着增强。在最优条件下,该方法可以检测到牛肉中低至0.01%（w/w）的掺假猪肉。与需要复杂分析过程的传统检测方法相比,该策略具有简单、灵敏、快速和现场检测的优点。重要的是,这种独特的方法也适用于加工肉产品的检测。我们期望本研究能为食品安全检测方法的建立提供新的视角。（4）基于多重PCR的侧向层析试纸方法同时检测鸡肉、鸭肉和猪肉成分。把多重PCR和LFS技术相结合,开发了一种同时检测肉品中多种肉类成分的可视化方法。针对鸡肉、猪肉和鸭肉的三组引物末端分别连接了不同的核酸标签,因此获得的扩增产物两端也具有不同的核酸标签。使用LFS分析扩增产物时,扩增产物的一端可以与金纳米粒子（Au NPs）上的识别探针杂交,另一端可以与对应检测线上的捕获探针杂交,从而把Au NPs固定到对应的检测线上并使之变红。重要的是,每种掺假成分分别对应一条检测线,因此可以通过一次反应实现对三种掺假成分的同时和可视化检测。得益于PCR技术的高效率和LFS技术的简便性,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.006%（w/w）、0.004%（w/w）和0.007%（w/w）。（5）基于重组酶聚合酶扩增的侧向层析试纸方法同时检测鸭肉、鸡肉和猪肉成分。把RPA技术与LFS技术相结合,建立了一种同时检测肉品中鸭肉、鸡肉和猪肉成分的可视化方法。在RPA的扩增体系中,我们引入了三组分别针对鸭肉、鸡肉和猪肉特异的末端功能化的引物,因此可以实现对三种目标基因的同时扩增。当掺假成分存在时,通过扩增可以获得两端标记的双链产物,借助双链产物的桥接作用即可把Au NPs固定到对应的检测线上并使之变红。该方法重点突出了RPA技术的等温扩增和多重放大优势,强调了RPA技术与LFS技术的联合使用在肉类掺假检测中的应用潜力。在最优条件下,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.009%（w/w）、0.005%（w/w）和0.004%（w/w）。（6）基于表面增强拉曼光谱的侧向层析试纸方法同时检测牛肉中的多种肉类成分。以RPA的扩增产物为媒介,将SERS技术和LFS技术相结合,提出了一种检测肉品中多种肉类成分的新方法。为简化LFS的设计,采用三种拉曼信标作为三种肉类的标记物,只使用一条检测线同时捕获三种扩增产物。当检测线显色时即可证明样品中有目标成分存在,然后利用拉曼光谱分析肉品的具体成分。该方法是在（5）中研究的基础上发展出来的,重点强调了RPA技术、LFS技术和SERS技术在肉类成分检测中的联合应用。在最优条件下,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.006%（w/w）、0.005%（w/w）和0.009%（w/w）。
钱程[9]（2021）在《荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究》文中研究指明核酸检测技术是以生物体内的核酸为靶标进行分析的检测手段。该技术目前已经被广泛应用于食品安全检测、环境污染物监控、临床诊断、遗传分析等众多领域。从样本获取到结果输出,核酸检测技术一般包含提取、扩增和检测三个基本环节。目前,已知的核酸检测技术或是需要复杂的样本提取操作、或是需要耗时冗长的扩增环节、或是需要毒性较大的凝胶电泳鉴定等,都存在着许多的缺陷。为了能够将该技术更好的在实际使用场合中进行推广,本论文从该技术的三个基本环节入手,针对其中的不足之处进行了相应的优化和改进,建立了集荧光可视化、便携性、低成本等优点的核酸分析平台。论文中选取了三种重要的感染于常见农副产品的动植物病菌作为应用对象,将所建立的分析平台用于对这些病菌的快速检测以评估其实际性能。本论文主要研究内容及相关结论如下:（1）论文建立了集核酸快速提取、快速PCR扩增、终点肉眼检测于一体的高效核酸分析平台,并将其应用于对虾传染性皮下组织及造血器官坏死病病毒（IHHNV）的检测。为了尽可能简化核酸检测的流程,提高检测效率,本论文分别从提取、扩增、检测的三个环节进行了相应的优化。首先,论文中引入了碱裂解法用以快速获取核酸样本,将繁琐的核酸提纯环节缩短到仅需3 min即可完成;其次,引入了快速PCR体系,通过对“平衡范例方程”的理解和探索,将传统的三温区PCR循环简化为动态双温区进行,成功地将本需要2 h的PCR扩增环节缩短到10 min以内;接着,引入了分子信标技术,通过对其结构的研究,设计了具有较高特异性的探针体系,实现了在常温下对靶标核酸的肉眼荧光可视化结果判读。此外,通过改变分子信标末端的荧光标记,实现了在同一反应管内对两种不同靶标核酸的高灵敏度双重检测。该分析平台具有较高的特异性和灵敏度,可以充分用于虾苗的IHHNV感染情况的初筛和周期性复检,其低成本、易操作的特性也十分适宜现场检测的应用,该病毒在对虾养殖产业中危害巨大,连年造成不小的经济损失。基于该分析平台的方法可以实现在15 min内对虾苗样本中的IHHNV靶标进行快速可视化分析,检测限达到每反应1000拷贝。与现行国标方案相比,将检测时间从3 h缩短到仅需15 min,并且减少了对大型仪器设备的需求,大大提高了检测效率和实用性。（2）论文建立了集防止核酸污染、恒温扩增、荧光可视化终点检测为一体的分析平台,并将其应用于对柑橘黄龙病病菌的快速检测。论文中引入了基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术通过对CRISPR/Cas系统的探索,验证了Cas12a效应蛋白尚未被报道的新PAM序列“UUUN”。基于此新PAM序列,论文中进一步引入了利用尿嘧啶糖基化酶（UracilDNA Glycosylase,UDG）体系来实现防止核酸扩增子气溶胶污染的方案,解决了核酸检测领域的这一痛点。此外,用更为便携和快捷的环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）代替国标采用的PCR方法,可以进一步缩短整个检测流程的时间并减少对复杂温控仪器的需求。利用CRISPR/Cas体系的高特异性,当特殊设计的cr RNA与靶标黄龙病病菌的核酸配对后会与Cas12a效应蛋白形成复合体,从而激活该蛋白的旁路切割活性,使得体系中带有荧光标记的单链寡核苷酸探针被切割降解,进而导致荧光信号的释放,实现荧光可视化的高灵敏度检测。该分析平台可以实现对柑橘养殖产业影响颇大的的柑橘黄龙病的致病菌——黄龙病病菌（Cirtus huanglongbing,HLB）每反应10拷贝的高灵敏度检测,其检测限相较传统的嵌入式染料方法提高了约100倍。（3）论文建立了针对组分复杂样本的免核酸提纯分析方案,并结合玻璃化手段为热敏感的酶类试剂提供了一种更方便的储藏思路。为了进一步提高核酸检测技术的实际使用性能,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文以近些年在全球范围内疯狂肆虐的非洲猪瘟疫情的病原菌非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）为应用对象,建立了基于玻璃化CRISPR体系及免样本提取的荧光可视化核酸分析平台。基于对CRISPR体系在灵敏度和特异性方面的探索和相关研究结果,论文中进一步尝试省略样本提纯的繁琐步骤,对全血样本不进行任何预处理直接对其中的核酸靶标进行检测。通过对三种常用的具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的实验探究,筛选出了最适宜的酶种,用以对未经处理的原始全血样本进行直接扩增,并进行后续的可视化检测。此外,为了更好地将LAMP扩增体系与热敏感的CRISPR体系兼容于同一反应管中,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文探索了以普鲁兰糖和海藻糖作为保护剂,通过玻璃化的方法,将液态的CRISPR试剂脱水成膜的手段来实现其较长时间的稳定储存。基于该方法,经过老化加速试验的测试,原本需要低温储存环境的CRISPR体系可以在室温下稳定储藏180天。该方案可以很好地解决此类热敏感的酶类试剂对于储存环境的超低温要求,并且可以大大节省其远距离冷链运输的成本。该平台可以实现对家猪全血样本中的非洲猪瘟病毒每反应100拷贝级别的检测灵敏度,并且整个检测过程都可以在便携的装置上完成,实现“从样本到结果”的直观输出。
梁楠松[10]（2021）在《水曲柳FmTCP2和FmTCP15参与叶发育与干旱耐受性的功能分析》文中研究说明植物的TCP家族是一组新颖的植物特异性的转录因子家族,在植物的形态建成以及环境适应性中发挥着极其重要作用。赤霉素是一类内源性的植物激素,能够调控植物生长发育的各个方面,以往的研究,主要集中于其在植物发育中的作用而忽略了它参与胁迫响应的特点。最新的研究发现,TCP转录因子能够从GA合成、降解等多个角度,参与GA信号通路,调控生长发育与胁迫平衡。关于TCP转录因子的研究目前主要集中于拟南芥、烟草以及棉花等草本植物,然而,草本与林木经历了不同的演化过程,其基因功能也会相应的发生巨大的变化。水曲柳是我国重要的营林和生态树种,同时具有很强的胁迫耐受力。在水曲柳中以基因家族形式全面揭示TCP家族在发育和适应胁迫耐受过程中发挥的作用,能够为林木分子育种提供功能更加显着的基因资源,丰富逆境分子生物学理论,同时能够指导水曲柳的繁殖和育种工作。本文对水曲柳TCP转录因子家族进行了全面的鉴定和筛选,分别以FmTCP2和FmTCP15作为TCP家族Class Ⅱ和Class Ⅰ的代表,对其功能进行了研究,阐述了其能够与赤霉素通路关键基因DELLA蛋白互作,调控植物生长发育,尤其是叶片发育及与干旱胁迫的关系。主要结果如下:（1）通过水曲柳基因组转录组数据库联合分析,对水曲柳TCP转录因子家族全部成员进行筛选、鉴定并克隆。水曲柳TCP转录因子家族由27个成员组成,并根据保守结构特征分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类,Class Ⅰ又称PCF进化枝,共由16个成员组成,Class Ⅱ则进一步分为CIN和CYC/TB1两个进化枝。家族成员都包含有一个完整的由57个氨基酸残基组成的TCP结构域。结合生物信息学预测以及基因表达分析表明,水曲柳TCP转录因子启动子具备响应生长发育、激素响应以及胁迫响应的调控的能力,能够响应ABA、GA3和SA等植物激素,并且参与到包括低温、盐、干旱、碱和重金属等的胁迫耐受的调控中。并筛选出分别以FmTCP2和FmTCP15作为Class Ⅱ和ClassⅠ代表的关键基因,进行深入研究。（2）FmTCP2和FmTCP15的时空表达模式以及激素和胁迫响应分析表明,FmTCP2和FmTCP15都能够响应赤霉素信号转导,并参与干旱和高盐的调控,但Fm TCP2主要在叶片中表达,而FmTCP15主要在茎中表达。（3）建立了水曲柳嫩枝皮层原生质体分离技术与嫩枝皮层原生质体外源基因转化技术,可有效的对FmTCP2和FmTCP15进行亚细胞定位,丰富了水曲柳分子生物学研究工具。（4）FmTCP2和FmTCP15在烟草和水曲柳中的过表达,均能引起转基因植株的形态发生的变化。相同点:FmTCP2和FmTCP15的过表达均能够导致转基因烟草叶表皮细胞体积变小,叶肉细胞密度增大,最终导致转基因烟草叶型变窄,叶表面积减小,植株高度变矮。区别:FmTCP2的过表达导致叶片增厚变窄,部分叶片对称性破坏、表皮毛增多、叶脉变粗,但气孔指数变化不大。FmTCP15的过表达导致气孔指数升高,但对叶片厚度、对称性、表皮毛和叶脉均无影响。（5）FmTCP2和FmTCP15的过表达对烟草表型的改变与赤霉素通路的调控有着重要联系,首先,过表达烟草内源赤霉素含量显着降低,其次,外源施加赤霉素也能够一定程度恢复由于FmTCP2和FmTCP15的过表达对烟草生长的抑制作用。（6）FmTCP2的过表达增强了转基因烟草以干旱为主的非生物胁迫耐受性,而FmTCP15的过表达则降低了转基因烟草的胁迫耐受性。转基因烟草在遭遇干旱胁迫时,FmTCP2过表达烟草株系的叶片仍能维持较高的叶绿素含量,且叶片活性氧积累、电解质渗透率以及丙二醛含量均较低,脯氨酸含量较高,表现出较强的胁迫耐受性。与之对应的是,FmTCP15过表达烟草株系叶片叶绿素降解、叶片变黄,甚至失水死亡,而内源防御响应信号也能印证其较弱的胁迫耐受特征。（7）FmTCP2和FmTCP15能够与赤霉素通路关键蛋白DELLA家族成员互作,并调控其表达,说明它们能够通过蛋白-蛋白互作,形成蛋白复合体的方式,共同调控赤霉素通路,参与植物生长发育与非生物胁迫耐受性形成。综上所述,本研究对水曲柳TCP转录因子家族进行了全面的筛选与鉴定,有针对性的研究分别从属于Class Ⅱ和Class Ⅰ的关键基因FmTCP2和FmTCP15。FmTCP2和FmTCP15通过与赤霉素信号通路关键蛋白DELLA家族成员互作,通过调控内源赤霉素稳态,改变植物叶细胞的发育（包括叶表皮细胞、表皮毛和气孔指数等）,进而改变叶片形态学特征（包括叶片大小、厚度和对称性等）,参与叶片发育的调控。而FmTCP2和FmTCP15参与的赤霉素通路,也作用于植物的非生物胁迫耐受性的调控中,并呈现出不同的作用结果。Class Ⅱ的FmTCP2增强了植物对干旱胁迫的耐受性,而Class Ⅰ的FmTCP15则呈现出与之相反的结果。本研究揭示了 FmTCP2和FmTCP15调控叶片发育与干旱耐受过程中的生物学功能,为林木分子育种提供功能更加显着的基因资源,丰富逆境分子生物学理论,同时能够指导水曲柳的繁殖和育种工作。
二、利用软件Primer Premier 5.0进行PCR引物设计的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用软件Primer Premier 5.0进行PCR引物设计的研究（论文提纲范文）
（1）GGT1不同剪接体鉴定及其对哺乳动物卵泡发育和排卵的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究问题的由来 |
| 2 哺乳动物卵泡发育过程及调控 |
| 2.1 卵泡发育 |
| 2.2 卵母细胞的成熟 |
| 2.3 颗粒细胞在卵泡发育过程中的功能 |
| 2.4 卵泡发育过程中的激素调控作用 |
| 3 氧化应激与卵泡发育 |
| 3.1 卵巢中活性氧的来源 |
| 3.2 氧化应激对卵泡发育的损伤 |
| 4 选择性剪接概述 |
| 4.1 剪接因子 |
| 4.2 卵泡发育过程中的选择性剪接 |
| 4.3 选择性剪接的调控 |
| 5 GGT1基因概述 |
| 5.1 GGT1基因简介 |
| 5.2 GGT1基因的生物学功能 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 GGT1基因不同剪接体调控猪卵巢颗粒细胞功能和前列腺素合成的研究 |
| 1 试验材料与分析网站 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 动物组织和细胞 |
| 1.1.2 菌株和抗体 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.1.4 主要试剂与试剂盒 |
| 1.1.5 常用试剂及配制 |
| 1.2 生物信息学网站及分析软件 |
| 1.2.1 生物信息学网站 |
| 1.2.2 分析软件 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 猪GGT1基因不同剪接体的功能研究 |
| 2.1.1 猪GGT1基因不同剪接体的验证 |
| 2.1.2 猪GGT1基因不同剪接体表达载体的构建 |
| 2.1.3 猪GGT1不同剪接体干扰片段的合成 |
| 2.1.4 猪卵巢细胞的分离 |
| 2.1.5 细胞的培养和转染 |
| 2.1.6 细胞总RNA的提取 |
| 2.1.7 cDNA的制备 |
| 2.1.8 实时荧光定量PCR检测基因mRNA的表达水平 |
| 2.1.9 蛋白质提取及浓度测定 |
| 2.1.10 Western blotting |
| 2.1.11 MTT |
| 2.1.12 EdU染色 |
| 2.1.13 流式细胞仪分析细胞凋亡 |
| 2.1.14 免疫共沉淀 |
| 2.1.15 免疫荧光 |
| 2.1.16 ELISA分析 |
| 2.1.17 抑制剂处理细胞 |
| 2.2 调控猪GGT1基因选择性剪接的关键剪接因子及功能研究 |
| 2.2.1 关键剪接因子真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 剪接因子SRSF1干扰片段的合成 |
| 2.2.3 剪接因子SRSF1不同结构域缺失的表达载体的构建 |
| 2.2.4 GGT1小基因片段真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 RNA免疫沉淀 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪GGT1基因不同剪接体的鉴定 |
| 3.2 GGT1基因不同剪接体对猪卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 3.2.1 GGT1基因不同剪接体在猪卵巢颗粒细胞增殖过程中的功能研究 |
| 3.2.2 GGT1基因不同剪接体在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中的功能研究 |
| 3.2.3 GGT1基因不同剪接体对猪卵巢颗粒细胞线粒体功能的研究 |
| 3.2.4 GGT1基因不同剪接体对猪卵巢颗粒细胞激素合成的影响 |
| 3.2.5 GGT1基因不同剪接体对猪卵泡发育相关基因的调控作用 |
| 3.3 GGT1基因不同剪接体调控猪卵巢颗粒细胞的前列腺素合成 |
| 3.3.1 猪GGT1基因不同剪切体的γ-谷氨酰转移酶活性检测 |
| 3.3.2 猪GGT1基因不同剪切体调控花生四烯酸的合成 |
| 3.3.3 猪GGT1基因不同剪切体调控花生四烯酸的合成的限速酶表达 |
| 3.3.4 猪GGT1基因不同剪切体通过调控钙离子浓度激活cPLA2活性 |
| 3.3.5 猪GGT1-02与TMCO1 互作调控颗粒细胞中钙离子浓度 |
| 3.4 剪接因子SRSF1调控猪GGT1基因选择性剪接 |
| 3.4.1 调控猪GGT1基因选择性剪接的主要剪接因子的鉴定 |
| 3.4.2 剪接因子SRSF1参与猪GGT1基因选择性剪接调控 |
| 3.4.3 剪接因子SRSF1通过RRM2和RS结构域调控猪GGT1基因选择性剪接 |
| 3.4.4 剪接因子SRSF1与hnRNPH1互作调控猪GGT1基因选择性剪接 |
| 3.5 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪卵巢颗粒细胞功能的研究 |
| 3.5.1 SRSF1调控猪卵巢颗粒细胞增殖 |
| 3.5.2 SRSF1调控猪卵巢颗粒细胞凋亡 |
| 3.5.3 SRSF1调控猪卵巢颗粒细胞前列腺素合成 |
| 3.5.4 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪颗粒细胞细胞的增殖 |
| 3.5.5 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪卵巢颗粒细胞的凋亡 |
| 3.5.6 SRSF1调节GGT1基因选择性剪接从而调控猪卵巢颗粒细胞的前列腺素合成 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GGT1不同剪接体在猪卵巢颗粒细胞中的功能研究 |
| 4.2 猪GGT1-02与TMCO1互作通过AA-PGTS2-PGE2通路调控前列腺素合成 |
| 4.3 SRSF1调控猪GGT1不同剪接体的选择性剪接 |
| 第三章 利用基因敲除小鼠模型研究Ggt1基因在卵泡发育和排卵过程中功能 |
| 1 试验材料与分析网站 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 抗体 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂与试剂盒 |
| 1.1.5 常用试剂及配制 |
| 1.2 生物信息学软件及分析网站 |
| 1.2.1 生物信息学软件 |
| 1.2.1 分析网站 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 Ggt1基因敲除小鼠的构建 |
| 2.1.1 相关引物设计与合成 |
| 2.1.2 CRISPR/Cas9 sgRNA的体外转录 |
| 2.1.3 显微注射 |
| 2.1.4 胚胎移植 |
| 2.1.5 突变小鼠的鉴定 |
| 2.2 Ggt1基因敲除小鼠表型研究 |
| 2.2.1 乙酰半胱氨酸添加 |
| 2.2.2 血清主要生殖激素检测 |
| 2.2.3 组织的固定及包埋 |
| 2.2.4 苏木精-伊红(H&E)染色 |
| 2.2.5 组织免疫荧光 |
| 2.2.6 EdU染色 |
| 2.2.7 TUNEL染色 |
| 2.2.8 超数排卵和交配 |
| 2.2.9 裸卵的收集与培养 |
| 2.2.10 卵母细胞活性氧的检测 |
| 2.2.11 卵母细胞线粒体膜电位检测 |
| 2.2.12 卵母细胞ATP检测 |
| 2.2.13 qRT-PCR相关引物的合成 |
| 2.2.14 统计学处理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ggt1基因敲除小鼠的构建 |
| 3.2 Ggt1~(-/-)小鼠具有与人多囊卵巢综合征相似的临床表型 |
| 3.2.1 Ggt1基因敲除小鼠不孕 |
| 3.2.2 Ggt1~(-/-)小鼠生长缓慢 |
| 3.2.3 Ggt1~(-/-)小鼠卵泡发育停滞 |
| 3.2.4 Ggt1~(-/-)小鼠激素水平异常 |
| 3.3 Ggt1~(-/-)小鼠卵巢颗粒细胞生长受阻 |
| 3.4 Ggt1~(-/-)小鼠卵巢线粒体相关功能受损 |
| 3.4.1 8周龄Ggt1~(-/-)小鼠卵巢线粒体结构破坏 |
| 3.4.2 8周龄Ggt1~(-/-)小鼠卵巢线粒体功能受损 |
| 3.5 Ggt1~(-/-)小鼠卵母细胞体外发育受损 |
| 3.6 NAC挽救Ggt1~(-/-)小鼠生殖缺陷 |
| 3.6.1 NAC促进Ggt1~(-/-)小鼠生长 |
| 3.6.2 NAC促进Ggt1~(-/-)小鼠卵巢颗粒细胞生长 |
| 3.6.3 NAC促进Ggt1~(-/-)小鼠GV期卵母细胞体外成熟 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Ggt1缺失小鼠具有与人多囊卵巢综合征患者相似的临床症状 |
| 4.2 Ggt1~(-/-)小鼠的线粒体功能障碍导致卵泡生长停滞 |
| 4.3 NAC的添加可以挽救Ggt1~(-/-)小鼠生殖缺陷 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 下一步工作计划 |
| 已发表的论文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）基于CRISPR技术的副溶血性弧菌核酸现场检测系统的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号清单 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.1.1 食品安全概况 |
| 1.1.2 食源性致病菌的危害 |
| 1.1.3 食源性致病菌现场检测的重要性 |
| 1.2 副溶血性弧菌的研究进展 |
| 1.2.1 副溶血性弧菌的生物特性及危害 |
| 1.2.2 副溶血性弧菌的检测方法 |
| 1.2.2.1 传统生物学诊断 |
| 1.2.2.2 分子生物学检测 |
| 1.3 核酸扩增检测方法基本流程及其存在的问题 |
| 1.4 冷冻干燥技术原理概述 |
| 1.5 基于CRISPR技术的核酸检测方法研究进展 |
| 1.6 研究目的、内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究目的和内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 1.7 本章小结 |
| 第二章 基于热循环仪的荧光PCR检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.1.1 实验材料 |
| 2.2.1.2 常用试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 实验细菌培养及核酸提取 |
| 2.2.3.2 实时荧光PCR引物设计与体系建立 |
| 2.2.3.3 基于打开热盖的热循环仪的荧光PCR可视化检测 |
| 2.2.3.4 特异性与灵敏度评估 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 实时荧光PCR引物设计及体系建立 |
| 2.3.2 基于热循环仪的PCR扩增可行性评估 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于CRISPR/Cas12a的现场可视化检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.1.1 实验材料 |
| 3.2.1.2 常用试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.3.1 副溶血性弧菌核酸快速提取 |
| 3.2.3.2 基于CRISPR/Cas12a的可视化检测体系建立 |
| 3.2.3.3 CRISPR-PCR一体化检测 |
| 3.2.3.4 特异性与灵敏度评估 |
| 3.2.3.5 实际样本的检测分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas12a体系的设计 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas12a体系用于PCR扩增的兼容性评估 |
| 3.3.3 CRISPR-PCR的特异性和灵敏度评估 |
| 3.3.4 CRISPR-PCR在实际样本中的检测应用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 应用于现场检测的核酸扩增试剂冷冻干燥方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.1.1 实验材料 |
| 4.2.1.2 常用试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.3.1 副溶血性弧菌核酸提取及PCR扩增 |
| 4.2.3.2 冻干PCR试剂的制备 |
| 4.2.3.3 冻干工艺的优化 |
| 4.2.3.4 冻干PCR试剂的性能测试 |
| 4.2.3.5 包裹钢珠的冻干PCR试剂的制备及性能测试 |
| 4.2.3.6 冻干PCR试剂的保存稳定性评估 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 冻干工艺的优化 |
| 4.3.1.1 冻干保护剂的优化与筛选 |
| 4.3.1.2 冻干参数的优化 |
| 4.3.2 包裹钢珠的冻干PCR试剂的制备 |
| 4.3.3 包裹钢珠的冻干PCR试剂的性能测试 |
| 4.3.4 冻干PCR试剂的保存稳定性评估 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要特色及创新点 |
| 5.3 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）喜旱莲子草DMNT合成途径关键TPS的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫与植物关系 |
| 1.1.1 植食性昆虫的食性特化 |
| 1.1.2 植食性昆虫物种多样性形成假说 |
| 1.2 昆虫与寄主植物互作机制 |
| 1.2.1 昆虫的寄主选择与寄主适应 |
| 1.2.2 植物虫害诱导信号转导与植物防御 |
| 1.3 专食性昆虫与寄主互作 |
| 1.3.1 鞘翅目专食性昆虫 |
| 1.3.2 莲草直胸跳甲与喜旱莲子草 |
| 1.4 植物萜类化合物 |
| 1.4.1 萜类化合物的合成 |
| 1.4.2 萜类化合物的多样性 |
| 1.4.3 萜类化合物的分类 |
| 1.4.4 低分子量萜类挥发物 |
| 1.4.5 C11、C16萜烯同系物 |
| 1.5 萜类合酶 |
| 1.5.1 萜类合酶基因家族 |
| 1.5.2 萜类合酶的催化机制 |
| 1.5.3 萜类合酶的基本结构 |
| 1.5.4 单萜合酶和倍半萜合酶 |
| 1.5.5 萜类合酶与动植物相互作用 |
| 1.6 病毒诱导的基因沉默技术 |
| 1.6.1 VIGS的发现和作用机制 |
| 1.6.2 VIGS的优势与不足 |
| 1.6.3 VIGS技术的开发与应用 |
| 1.7 本研究目的及内容 |
| 第二章 喜旱莲子草DMNT合成途径关键ApTPSs的筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 被试植物 |
| 2.1.2 被试昆虫 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 莲草直胸跳甲短期取食行为调查 |
| 2.2.2 喜旱莲子草不同损伤处理 |
| 2.2.3 喜旱莲子草不同损伤处理下定量PCR内参基因的筛选 |
| 2.2.4 ApTPSs基因筛选及表达分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 候选ApTPSs基因 |
| 2.3.2 莲草直胸跳甲短期取食行为 |
| 2.3.3 昆虫接触、取食和机械损伤下叶片中内参基因的稳定性评估结果 |
| 2.3.4 健康状态下各候选ApTPSs基因的基础表达量 |
| 2.3.5 莲草直胸跳甲接触诱导候选ApTPSs表达 |
| 2.3.6 莲草直胸跳甲取食强烈诱导喜旱莲子草候选ApTPSs表达 |
| 2.3.7 机械损伤诱导候选ApTPSs低水平延迟表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 喜旱莲子草ApTPSs的克隆与功能验证 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 载体 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 植物材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 候选ApTPSs基因的克隆 |
| 3.2.2 候选ApTPSs基因的序列分析 |
| 3.2.3 候选ApTPSs基因的组织表达分析 |
| 3.2.4 候选ApTPSs基因的原核表达 |
| 3.2.5 原核表达蛋白ApTPSs酶学反应挥发物测定 |
| 3.2.6 莲草直胸跳甲对ApTPSs原核表达产物的选择 |
| 3.2.7 ApTPSs的亚细胞定位 |
| 3.2.8 拟南芥过表达ApTPSs基因 |
| 3.2.9 利用VIGS技术沉默ApTPS15 基因 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ApTPSs的克隆 |
| 3.3.2 ApTPSs的序列分析 |
| 3.3.3 ApTPSs组织表达谱 |
| 3.3.4 ApTPSs基因的原核表达 |
| 3.3.5 ApTPSs产物测定 |
| 3.3.6 莲草直胸跳甲对ApTPSs原核表达产物的选择 |
| 3.3.7 ApTPSs的亚细胞定位 |
| 3.3.8 拟南芥过表达ApTPSs基因 |
| 3.3.9 利用VIGS技术沉默ApTPS15 基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
| 博士在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）环形泰勒虫SVSPs分子互作蛋白的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环形泰勒虫研究概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行病学特征 |
| 1.2 蛋白互作技术研究进展 |
| 1.2.1 免疫共沉淀技术 |
| 1.2.2 酵母双杂交技术 |
| 1.2.3 双荧光分子互作技术(Bi FC) |
| 1.2.4 Pull Down技术 |
| 1.2.5 荧光能量共振转移技术 |
| 1.3 亚端粒编码可变蛋白的研究进展 |
| 1.4 环形泰勒虫转化宿主免疫细胞的表型 |
| 1.4.1 环形泰勒虫转化免疫细胞的增殖信号机制 |
| 1.4.2 入侵与转移激活 |
| 1.4.3 细胞能量失调 |
| 1.4.4 泰勒虫感染细胞的死亡抑制 |
| 1.4.5 免疫逃避和炎症 |
| 1.4.6 泰勒虫转化的牛细胞与癌细胞的差异 |
| 1.4.6.1 生长抑制逃避 |
| 1.4.6.2 基因组完整性 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 亚端粒编码可变蛋白(SVSP)的表达与多抗制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂与耗材 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SVSP家族基因的扩增与生物信息学分析 |
| 2.2.1.1 环形泰勒虫感染细胞系的培养 |
| 2.2.1.2 环形泰勒虫感染细胞总RNA提取 |
| 2.2.1.3 c DNA的合成 |
| 2.2.1.4 SVSP家族基因的扩增 |
| 2.2.1.5 PCR产物纯化 |
| 2.2.1.6 克隆载体的制备 |
| 2.2.1.7 菌液PCR鉴定 |
| 2.2.1.8 生物信息学分析 |
| 2.3 SVSPs基因的表达与鉴定 |
| 2.3.1 构建重组质粒 |
| 2.3.2 蛋白表达与纯化 |
| 2.3.3 蛋白浓度的测定 |
| 2.3.4 蛋白反应原性和免疫原性的鉴定 |
| 2.4 SVSP家族蛋白的多抗制备与纯化 |
| 2.4.1 多抗制备 |
| 2.4.2 抗体纯化 |
| 2.5 SVSPs蛋白在转化细胞中的定位 |
| 2.6 结果 |
| 2.6.1 SVSP的鉴定与生物信息学分析 |
| 2.6.2 SVSP452、SVSP453和SVSP455 重组原核表达质粒的构建 |
| 2.6.3 SVSP452、SVSP453和SVSP455 蛋白表达与纯化 |
| 2.6.4 SVSP家族蛋白的反应原性鉴定 |
| 2.6.5 SVSP家族(SVSP450、SVSP452、SVSP453、SVSP454和SVSP455)兔源多克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.7 讨论 |
| 第三章 SVSP家族基因诱饵质粒构建、自激活和毒性鉴定 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.2 相关实验设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 诱饵质粒构建 |
| 3.3.2 自激活和毒性检测 |
| 3.3.2.1 酵母细胞培养 |
| 3.3.2.2 诱饵质粒在酵母细胞中转化效率的鉴定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 诱饵质粒构建 |
| 3.4.2 诱饵质粒自激活和毒性鉴定 |
| 3.4.3 诱饵质粒转化效率鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 SVSP449 分子互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂与耗材 |
| 4.1.2 相关仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 SVSP449 在环形泰勒虫不同生活史阶段和转化的不同细胞代次的表达特征 |
| 4.2.1.1 环形泰勒虫不同生活史阶段RNA提取与c DNA合成 |
| 4.2.1.2 环形泰勒虫转化细胞不同代次细胞RNA提取与c DNA合成 |
| 4.2.1.3 SVSP449 在环形泰勒虫不同生活史阶段和感染不同代次细胞的转录水平特征 |
| 4.2.1.4 SVSP449 在环形泰勒虫感染不同代次细胞的蛋白水平特征 |
| 4.2.2 SVSP449 在环形泰勒虫感染不同细胞代次的亚细胞定位 |
| 4.2.3 SVSP449 与宿主互作蛋白的筛选 |
| 4.2.3.1 酵母感受态细胞的制备 |
| 4.2.3.2 酵母感受态细胞的转化(在文库规模下) |
| 4.2.3.3 在DDO/X/A和 QDO/X/A培养基中筛选 |
| 4.2.3.4 酵母质粒的提取 |
| 4.2.4 SVSP449 与宿主互作蛋白的鉴定 |
| 4.2.4.1 SVSP449 与可能的互作蛋白的表达和亚细胞定位 |
| 4.2.4.2 免疫共沉淀技术 |
| 4.2.4.3 双荧光分子互补技术(Bi FC) |
| 4.2.4.4 流式细胞术 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SVSP449 在环形泰勒虫不同生活史阶段和其感染不同细胞代次的表达分析 |
| 4.3.2 SVSP449 在环形泰勒虫转化细胞系中亚细胞定位 |
| 4.3.3 SVSP449 与宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 4.3.4 SVSP449 与互作蛋白的表达与亚细胞定位鉴定 |
| 4.3.5 SVSP449 与互作蛋白的鉴定 |
| 4.3.5.1 免疫共沉淀技术对SVSP449 与其互作蛋白的鉴定 |
| 4.3.5.2 双荧光分子互补技术(BiFC)对 SVSP449与RBMX2-like和UBQLN4互作分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 SVSP454 分子互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料与相关试剂 |
| 5.1.2 相关仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 SVSP454 在环形泰勒虫不同生活史阶段和转化细胞的不同细胞代次的表达特征 |
| 5.2.1.1 环形泰勒虫不同生活史阶段RNA提取与c DNA合成 |
| 5.2.1.2 环形泰勒虫转化不同细胞代次细胞RNA提取与与c DNA合成 |
| 5.2.1.3 SVSP454 在环形泰勒虫不同生活史阶段和感染不同代次细胞的转录水平特征 |
| 5.2.2 SVSP454 在环形泰勒虫感染不同细胞代次的亚细胞定位 |
| 5.2.3 SVSP454 与宿主互作蛋白的筛选 |
| 5.2.3.1 酵母感受态细胞的制备 |
| 5.2.3.2 酵母感受态细胞的转化(在文库规模下) |
| 5.2.3.3 在DDO/X/A和 QDO/X/A板子中筛选 |
| 5.2.3.4 酵母质粒的提取与拯救 |
| 5.2.4 SVSP454 与宿主互作蛋白的鉴定 |
| 5.2.4.1 SVSP454 与可能的互作蛋白的表达和亚细胞定位 |
| 5.2.4.2 免疫共沉淀技术 |
| 5.2.4.3 双荧光分子互补技术(Bi FC) |
| 5.2.4.4 流式细胞术 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SVSP454 在环形泰勒虫不同生活史阶段和其感染不同细胞代次的表达分析 |
| 5.3.2 SVSP454 在环形泰勒虫转化细胞系中亚细胞定位 |
| 5.3.3 SVSP454 与宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 5.3.4 SVSP454 与互作蛋白的表达与亚细胞定位鉴定 |
| 5.3.5 免疫共沉淀技术对SVSP454 与其互作蛋白的鉴定 |
| 5.3.6 双荧光分子互补技术(BiFC)对 SVSP454与CCDC181和MRPL30互作分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 SVSP455-HSP60 相互作用调控宿主细胞线粒体凋亡 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 试验材料与相关试剂 |
| 6.1.2 相关仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 SVSP455 在环形泰勒虫不同生活史阶段和转化细胞的不同细胞代次的表达特征 |
| 6.2.1.1 环形泰勒虫不同生活史阶段RNA提取与c DNA合成 |
| 6.2.1.2 环形泰勒虫转化不同细胞代次细胞RNA提取与与c DNA合成 |
| 6.2.1.3 SVSP455 在环形泰勒虫不同生活史阶段和感染不同代次细胞的转录水平特征 |
| 6.2.2 SVSP455 在环形泰勒虫感染细胞中的亚细胞定位 |
| 6.2.3 SVSP455 与宿主互作蛋白的筛选 |
| 6.2.3.1 酵母感受态细胞的制备 |
| 6.2.3.2 酵母感受态细胞的转化(在文库规模下) |
| 6.2.3.3 在DDO/X/A和 QDO/X/A板子中筛选 |
| 6.2.3.4 酵母质粒的提取与拯救 |
| 6.2.4 SVSP455 与宿主互作蛋白的鉴定 |
| 6.2.4.1 SVSP455 与可能的互作蛋白的表达和亚细胞定位 |
| 6.2.4.2 免疫共沉淀技术 |
| 6.2.4.3 双荧光分子互补技术(Bi FC) |
| 6.2.4.4 流式细胞术 |
| 6.2.5 SVSP455与HSP60 在环形泰勒虫感染细胞中的亚细胞定位 |
| 6.2.5.1 HSP60 的表达与纯化 |
| 6.2.5.2 HSP60 多克隆抗体的制备与纯化 |
| 6.2.5.3 激光共聚焦实验 |
| 6.2.6 SiRNA干扰 |
| 6.2.6.1 HSP60 在环形泰勒虫感染细胞中的表达特征 |
| 6.2.6.2 RNA oligo转染细胞 |
| 6.2.6.3 qPCR检测HSP60 的干扰效率 |
| 6.2.6.4 HSP60 干扰后SVSP455 水平变化 |
| 6.2.6.5 HSP60 对线粒体凋亡通路分子水平的影响 |
| 6.2.7 SVSP455 对环形泰勒虫感染的细胞的免疫功能的影响 |
| 6.2.7.1 SVSP455 在环形泰勒虫中转染 |
| 6.2.7.2 SVSP455 对宿主细胞线粒体凋亡通路分子的影响 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 SVSP455 在环形泰勒虫不同生活史阶段和其感染不同细胞代次的表达分析 |
| 6.3.2 SVSP455 在环形泰勒虫转化细胞系中亚细胞定位 |
| 6.3.3 SVSP455 与宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 6.3.4 SVSP455 与潜在互作蛋白的表达与亚细胞定位鉴定 |
| 6.3.5 Co-IP技术对SVSP455 与其互作蛋白的鉴定 |
| 6.3.6 Bi FC技术对SVSP455 与其互作蛋白的分析 |
| 6.3.7 SVSP455 与其互作蛋白在环形泰勒虫感染细胞中的定位分析 |
| 6.3.8 SVSP455 对环形泰勒虫感染细胞免疫功能的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 糖尿病的研究进展 |
| 1.1.1 糖尿病概述 |
| 1.1.2 糖尿病传统治疗 |
| 1.2 干细胞治疗糖尿病的研究进展 |
| 1.2.1 胚胎干细胞与糖尿病 |
| 1.2.2 诱导多能性干细胞与糖尿病 |
| 1.2.3 间充质干细胞与糖尿病 |
| 1.3 胰岛 β 细胞发育过程及相关转录因子的研究进展 |
| 1.3.1 胰岛β细胞发育过程 |
| 1.3.2 胰岛β细胞相关转录因子 |
| 1.4 转基因技术的研究进展 |
| 1.5 多基因共表达载体构建的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 Dll1 在体外诱导犬脂肪MSCs向 IPCs分化中的作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 犬脂肪MSCs的复苏培养 |
| 2.2.2 Dll1 插入片段的获得 |
| 2.2.3 Dll1 过表达腺病毒载体的构建及包装 |
| 2.2.4 构建Dll1 过表达犬脂肪MSCs株并体外诱导其向IPCs分化 |
| 2.2.5 构建Dll1 沉默犬脂肪MSCs株并体外诱导其向IPCs分化 |
| 2.2.6 诱导分化效果的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬Dll1 基因的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 重组腺病毒载体的构建及包装结果 |
| 2.3.3 Dll1 过表达犬脂肪MSCs株的荧光表达情况 |
| 2.3.4 Dll1 沉默犬脂肪MSCs株的荧光表达情况、沉默效果及诱导后细胞形态 |
| 2.3.5 诱导分化效果的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组腺病毒多基因共表达载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 目的基因的合成和扩增 |
| 3.2.2 重组腺病毒多基因共表达载体的构建及包装 |
| 3.2.3 重组腺病毒多基因共表达载体的表达鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组腺病毒多基因共表达载体的构建结果 |
| 3.3.3 重组腺病毒多基因共表达载体的表达鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2 联合重编程犬脂肪MSCs为 IPCs |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 多基因重组腺病毒感染犬脂肪MSCs |
| 4.2.2 双硫腙染色 |
| 4.2.3 RT-q PCR检测胰岛β细胞发育相关基因的表达 |
| 4.2.4 葡萄糖刺激试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 多基因重组腺病毒感染犬脂肪MSCs后 GFP表达情况及细胞成团情况 |
| 4.3.2 双硫腙染色结果 |
| 4.3.3 胰岛β细胞发育相关基因的表达结果 |
| 4.3.4 胰岛素分泌量的检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于SNP标记的黄河鲤鱼溯源研究与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 我国市场上主要鲤鱼品种 |
| 1.3 黄河鲤概述 |
| 1.3.1 传统的黄河鲤鉴定方法 |
| 1.3.2 鲤鱼基因组研究 |
| 1.4 SNP标记的特点 |
| 1.4.1 数量多,分布广 |
| 1.4.2 遗传稳定性高 |
| 1.4.3 富有代表性 |
| 1.4.4 易实现分析的自动化 |
| 1.5 SNP的开发 |
| 1.5.1 基于数据库和文献位点的开发 |
| 1.5.2 基于性状基因位点的开发 |
| 1.6 SNP分型检测方法 |
| 1.7 SNP标记在肉产品溯源中的应用 |
| 1.7.1 肉类品种的鉴别 |
| 1.7.2 个体来源的鉴定 |
| 1.7.3 产品产地的鉴别 |
| 1.8 总结 |
| 第二章 SNP标记的筛选 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本DNA提取及质量控制 |
| 2.2.2 基于数据库位点的筛选 |
| 2.2.3 基于性状基因位点的筛选 |
| 2.2.4 文库制备 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DNA提取及质量验证 |
| 2.3.2 位点筛选结果 |
| 2.4 黄河鲤的鉴定效果评估 |
| 2.4.1 耦合概率 |
| 2.4.2 黄河鲤的鉴定效果评估 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 SNP分型检测方法建立 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 设计AS-PCR引物 |
| 3.2.2 PCR扩增 |
| 3.2.3 毛细管电泳检测 |
| 3.2.4 高通量测序验证 |
| 3.2.5 方法灵敏度及重复性检验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 AS-PCR-CE方法建立 |
| 3.3.2 等位特异性PCR结合毛细管电泳方法验证 |
| 3.3.3 方法灵敏度及重复性检验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于SNP标记的黄河鲤鱼肉与普通鲤鱼肉的鉴定研究 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 样本采集 |
| 4.2.2 SNP标记筛选及引物设计 |
| 4.2.3 PCR扩增及毛细管电泳分离 |
| 4.2.4 样本等位基因频率分析 |
| 4.2.5 实际样本验证结果 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 SNP位点及引物 |
| 4.3.2 PCR扩增及毛细管电泳分离 |
| 4.3.3 鲤鱼样本等位基因频率分析 |
| 4.3.4 实际样本测定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）番茄低温下矮化坏死调控基因ndw的克隆及功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 低温对植物的影响 |
| 1.1.1 低温对植物细胞膜的影响 |
| 1.1.2 低温对植物光合作用的影响 |
| 1.1.3 低温对植物渗透调节物质的影响 |
| 1.2 植物应答低温胁迫的机理 |
| 1.2.1 低温胁迫信号的感知 |
| 1.2.2 低温信号转导 |
| 1.2.3 CBF应答低温转录调控 |
| 1.2.4 植物激素参与低温胁迫应答 |
| 1.3 图位克隆技术 |
| 1.3.1 图位克隆技术的简介 |
| 1.3.2 图位克隆的过程 |
| 1.3.3 图位克隆技术的应用 |
| 1.4 类受体蛋白激酶研究进展 |
| 1.4.1 类受体蛋白激酶概述 |
| 1.4.2 类受体蛋白激酶对非生物胁迫的响应 |
| 1.4.3 类受体蛋白激酶对植物免疫的响应 |
| 1.4.4 类受体蛋白激酶调控生长发育 |
| 第二章 野生潘那利番茄渐渗系IL6-2 低温下矮化坏死调控基因的定位 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验材料的种植及表型鉴定 |
| 2.2.2 RNA-seq分析 |
| 2.2.3 遗传群体的构建及性状遗传规律分析 |
| 2.2.4 DNA的提取 |
| 2.2.5 分子标记的开发 |
| 2.2.6 目的基因的粗定位和精细定位 |
| 2.2.7 预测候选基因 |
| 2.2.8 基因相对表达量的测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 潘那利渐渗系IL6-2 的表型鉴定 |
| 2.3.2 IL6-2 和M82 低温处理下的转录组分析 |
| 2.3.3 遗传群体的构建及性状遗传规律分析 |
| 2.3.4 ndw基因的粗定位 |
| 2.3.5 ndw基因的精细定位 |
| 2.3.6 ndw候选基因预测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NDW候选基因表达载体的构建及番茄遗传转化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株及载体 |
| 3.1.2 主要的试剂及仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 NDW候选基因超量表达载体的构建 |
| 3.2.2 NDW候选基因干涉表达载体的构建 |
| 3.2.3 农杆菌转化 |
| 3.2.4 番茄遗传转化 |
| 3.2.5 转基因番茄植株的检测 |
| 3.2.6 转基因番茄材料的培育 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 候选基因超量表达载体和干涉表达载体的构建 |
| 3.3.2 番茄的遗传转化 |
| 3.3.3 转基因植株的阳性检测 |
| 3.3.4 转基因株系候选基因的相对表达量分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 NDW候选基因的功能鉴定与分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 转基因株系低温下的表型鉴定 |
| 4.2.2 转基因株系对灰霉菌的抗性鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 ORF2 转基因株系低温下的表型鉴定 |
| 4.3.2 ORF5 转基因株系低温下的表型鉴定 |
| 4.3.3 ORF3 转基因株系低温下的表型鉴定 |
| 4.3.4 ORF3 转基因株系对灰霉菌的抗性鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 NDW基因的结构与表达分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 菌株及载体 |
| 5.1.2 主要的试剂及仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 基因序列分析及系统进化树的构建 |
| 5.2.2 亚细胞定位 |
| 5.2.3 基因组织表达谱分析 |
| 5.2.4 IL6-2和M82中CBF途径基因表达量分析 |
| 5.2.5 转基因株系ABA通路相关基因表达量分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 NDW基因的序列分析 |
| 5.3.2 NDW蛋白的亚细胞定位 |
| 5.3.3 NDW基因在不同组织中的表达量分析 |
| 5.3.4 NDW基因对CBF途径相关基因表达量的影响 |
| 5.3.5 NDW基因对ABA通路相关基因表达量的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文结论与创新点 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 后续研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（8）基于核酸扩增原理的常见肉源性成分快速鉴定研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 检测方法研究现状 |
| 1.2.1 感官分析 |
| 1.2.2 光谱分析 |
| 1.2.3 色谱和质谱分析 |
| 1.2.4 电泳分析 |
| 1.2.5 免疫分析 |
| 1.2.6 基于聚合酶链式反应的分析 |
| 1.2.7 基于等温扩增的分析 |
| 1.3 本论文的研究目的及意义 |
| 1.4 本论文的研究内容 |
| 第二章 基于功能化引物设计的PCR方法检测牛肉中的马肉成分 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 肉样品准备 |
| 2.3.2 肉样品DNA提取 |
| 2.3.3 PCR扩增及分析 |
| 2.3.4 方法可行性验证 |
| 2.3.5 扩增条件优化 |
| 2.3.6 不同循环数时方法的灵敏度 |
| 2.3.7 特异性验证 |
| 2.3.8 加工肉制品检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 实验原理 |
| 2.4.2 方法可行性验证 |
| 2.4.3 扩增条件优化 |
| 2.4.4 不同循环数时的灵敏度分析 |
| 2.4.5 特异性验证 |
| 2.4.6 加工肉制品检测 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于单链结合蛋白增强的荧光偏振策略检测牛肉中的鸡肉成分 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 肉样品准备及DNA提取 |
| 3.3.2 PCR扩增 |
| 3.3.3 荧光偏振分析 |
| 3.3.4 方法可行性验证 |
| 3.3.5 实验条件优化 |
| 3.3.6 灵敏度分析 |
| 3.3.7 特异性验证 |
| 3.3.8 实际样品检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 实验原理 |
| 3.4.2 方法可行性验证 |
| 3.4.3 实验条件优化 |
| 3.4.4 灵敏度分析 |
| 3.4.5 特异性验证 |
| 3.4.6 加工肉制品检测 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 基于环介导等温扩增的荧光偏振方法快速检测牛肉中的猪肉成分 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肉样品准备及DNA提取 |
| 4.3.2 LAMP扩增及分析 |
| 4.3.3 q PCR扩增 |
| 4.3.4 FITC标记引物的选择 |
| 4.3.5 反应条件优化 |
| 4.3.6 灵敏度检测 |
| 4.3.7 特异性验证 |
| 4.3.8 重复性验证 |
| 4.3.9 实际样品检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 实验原理 |
| 4.4.2 FITC标记引物的选择 |
| 4.4.3 反应条件优化 |
| 4.4.4 灵敏度分析 |
| 4.4.5 特异性验证 |
| 4.4.6 重复性验证 |
| 4.4.7 实际样品检测 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 基于多重PCR的侧向层析试纸方法同时检测鸡肉、鸭肉和猪肉成分 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 金纳米粒子(AuNPs)的制备 |
| 5.3.2 金-探针偶联物(AuNP-RP)的制备 |
| 5.3.3 LFS的构建 |
| 5.3.4 肉样品准备及DNA提取 |
| 5.3.5 PCR扩增 |
| 5.3.6 LFS检测 |
| 5.3.7 qPCR扩增 |
| 5.3.8 NAT标记引物的验证 |
| 5.3.9 可行性验证 |
| 5.3.10 扩增条件优化 |
| 5.3.11 LFS参数优化 |
| 5.3.12 灵敏度分析 |
| 5.3.13 特异性验证 |
| 5.3.14 实际样品检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 实验原理 |
| 5.4.2 NAT标记引物的验证 |
| 5.4.3 方法可行性验证 |
| 5.4.4 扩增条件优化 |
| 5.4.5 LFS参数优化 |
| 5.4.6 灵敏度检测 |
| 5.4.7 特异性验证 |
| 5.4.8 实际样品检测 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 基于重组酶聚合酶扩增的侧向层析试纸方法同时检测鸭肉、鸡肉和猪肉成分 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 AuNPs的制备 |
| 6.3.2 AuNPs与FITC抗体偶联物(AuNP-Ab)的制备 |
| 6.3.3 LFS的制备 |
| 6.3.4 肉样品准备及DNA提取 |
| 6.3.5 mRPA扩增 |
| 6.3.6 LFS检测 |
| 6.3.7 qPCR扩增 |
| 6.3.8 引物浓度优化 |
| 6.3.9 方法可行性验证 |
| 6.3.10 单组分检测 |
| 6.3.11 相同趋势的多组分检测 |
| 6.3.12 不同趋势的多组分检测 |
| 6.3.13 特异性验证 |
| 6.3.14 稳定性检测 |
| 6.3.15 实际样品检测 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 实验原理 |
| 6.4.2 引物浓度优化 |
| 6.4.3 方法可行性验证 |
| 6.4.4 单组分检测 |
| 6.4.5 相同趋势的多组分检测 |
| 6.4.6 不同趋势的多组分检测 |
| 6.4.7 特异性验证 |
| 6.4.8 稳定性验证 |
| 6.4.9 实际样品检测 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 基于表面增强拉曼的侧向层析试纸方法同时检测牛肉中的多种肉类成分 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与仪器 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 AuNPs的制备 |
| 7.3.2 拉曼信标的制备 |
| 7.3.3 拉曼信标与探针的偶联 |
| 7.3.4 LFS的制备 |
| 7.3.5 肉样品准备及DNA提取 |
| 7.3.6 mRPA扩增 |
| 7.3.7 LFS检测 |
| 7.3.8 qPCR扩增 |
| 7.3.9 可行性验证 |
| 7.3.10 信号分子浓度优化 |
| 7.3.11 单组分检测 |
| 7.3.12 相同趋势的多组分检测 |
| 7.3.13 不同趋势的多组分检测 |
| 7.3.14 特异性验证 |
| 7.3.15 实际样品检测 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 实验原理 |
| 7.4.2 材料表征结果 |
| 7.4.3 信号分子浓度优化 |
| 7.4.4 可行性研究 |
| 7.4.5 单组分掺假样品的检测 |
| 7.4.6 多组分掺假样品的检测 |
| 7.4.7 特异性验证 |
| 7.4.8 实际样品检测 |
| 7.5 结论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果清单 |
（9）荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景及意义 |
| 1.1.1 核酸检测技术在分子诊断方面的应用 |
| 1.1.2 农副产品中动植物病菌快速检测的重要性 |
| 1.1.3 本节小结 |
| 1.2 核酸扩增检测技术的原理和基本流程 |
| 1.2.1 核酸提取 |
| 1.2.2 核酸扩增 |
| 1.2.3 核酸扩增子检测 |
| 1.2.4 本节小结 |
| 1.3 新型核酸检测分析方法的研究进展 |
| 1.3.1 核酸气溶胶污染防止办法 |
| 1.3.2 快速PCR技术的应用 |
| 1.3.3 免扩增的核酸分析方法 |
| 1.3.4 新型探针技术的应用 |
| 1.3.5 基因编辑技术的应用 |
| 1.3.6 本节小结 |
| 1.4 核酸检测技术目前面临的问题 |
| 1.5 研究目的、内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 基于分子信标和快速PCR的双重荧光可视化检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 对虾IHHNV病毒标准PCR检测方法建立 |
| 2.3.2 快速PCR体系循环时间参数探索 |
| 2.3.3 分子信标用于可视化检测条件探索 |
| 2.3.4 可视化检测平台灵敏度与特异性评估 |
| 2.3.5 可视化检测平台应用于双重检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于基因编辑技术的防污染核酸荧光可视化检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 针对柑橘黄龙病菌的LAMP扩增体系 |
| 3.3.2 Cas12a效应蛋白新PAM序列可行性分析 |
| 3.3.3 基于Cas12a效应蛋白的荧光可视化检测体系 |
| 3.3.4 基于UDG酶消解的防污染核酸检测体系 |
| 3.3.5 防污染荧光可视化核酸分析平台的搭建 |
| 3.3.6 防污染荧光可视化核酸分析平台灵敏度评估 |
| 3.3.7 防污染荧光可视化核酸分析平台用于柑橘黄龙病菌检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于玻璃化CRISPR及免样本提取的荧光可视化核酸分析方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 针对非洲猪瘟病毒的LAMP扩增体系 |
| 4.3.2 免样本提取的恒温核酸扩增体系 |
| 4.3.3 针对非洲猪瘟病毒的CRISPR/Cas12a检测体系 |
| 4.3.4 普鲁兰糖和海藻糖用于对CRISPR体系的保护 |
| 4.3.5 玻璃化的CRISPR薄膜加速老化试验 |
| 4.3.6 免样本提取可视化核酸分析平台搭建 |
| 4.3.7 免样本提取可视化核酸分析平台用于非洲猪瘟病毒检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（10）水曲柳FmTCP2和FmTCP15参与叶发育与干旱耐受性的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 TCP转录因子 |
| 1.2.1 TCP转录因子家族简介 |
| 1.2.2 TCP转录因子的蛋白和DNA互作原理 |
| 1.2.3 TCP转录因子调控植物的生长和发育 |
| 1.2.4 TCP转录因子调控植物的非生物胁迫响应 |
| 1.2.5 TCP转录因子参与赤霉素信号通路调节生长发育和非生物胁迫的平衡 |
| 1.3 赤霉素通路参与生长发育和非生物胁迫的响应 |
| 1.3.1 赤霉素通路简介 |
| 1.3.2 赤霉素通路调控细胞增殖和扩增与叶片发育 |
| 1.3.3 非生物胁迫下赤霉素通路受到的调控作用 |
| 1.3.4 赤霉素通路与多种激素信号串扰调控非生物胁迫 |
| 1.4 水曲柳非生物胁迫研究进展及存在的问题 |
| 1.5 本论文研究的目的意义 |
| 1.6 本研究的主要内容和技术路线 |
| 2 水曲柳TCP转录因子家族基因的鉴定与表达分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 水曲柳TCP转录因子家族基因的克隆 |
| 2.2.2 水曲柳TCP转录因子家族的生物信息分析 |
| 2.2.3 水曲柳TCP转录因子启动子顺式作用元件分析 |
| 2.2.4 水曲柳TCP转录因子的GO功能注释 |
| 2.2.5 水曲柳TCP转录因子家族的表达特性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 水曲柳TCP转录因子家族的鉴定 |
| 2.3.2 水曲柳TCP转录因子家族蛋白系统进化关系分析 |
| 2.3.3 水曲柳TCP转录因子家族基因结构分析 |
| 2.3.4 水曲柳TCP转录因子家族保守结构域与保守基序分析 |
| 2.3.5 水曲柳TCP转录因子家族启动子顺式元件分析 |
| 2.3.6 水曲柳TCP转录因子GO功能分析 |
| 2.3.7 水曲柳TCP转录因子家族的表达特性分析 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 FmTCP2和FmTCP15基因的克隆及表达分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要试剂与药品 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15蛋白序列分析和3D建模 |
| 3.2.2 不同组织部位取材 |
| 3.2.3 植物材料的激素与非生物胁迫处理 |
| 3.2.4 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因的表达模式分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15的序列特征 |
| 3.3.2 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因在植株不同部位表达模式分析 |
| 3.3.3 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因对激素响应模式分析 |
| 3.3.4 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因的非生物胁迫表达模式分析 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 水曲柳原生质体转化技术建立与FmTCP2和FmTCP15瞬时转化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 主要试剂与药品 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.1.5 试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因亚细胞定位载体构建 |
| 4.2.2 水曲柳嫩枝皮层原生质体的分离 |
| 4.2.3 水曲柳原生质体分离体系的优化 |
| 4.2.4 水曲柳原生质体的转化 |
| 4.2.5 水曲柳原生质体的转化体系的优化 |
| 4.2.6 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因的亚细胞定位 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因植物表达载体构建 |
| 4.3.2 水曲柳嫩枝皮层原生质体的分离 |
| 4.3.3 水曲柳原生质体的分离体系的优化 |
| 4.3.4 水曲柳原生质体的转化体系的建立与优化 |
| 4.3.5 FmTCP2和FmTCP15基因的原生质体瞬时转化 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 FmTCP2和FmTCP15在发育和胁迫响应中的功能 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 主要试剂与药品 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.1.5 试剂配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 电穿孔法转化农杆菌 |
| 5.2.2 根瘤农杆菌介导的遗传转化 |
| 5.2.3 转基因植株的分子鉴定 |
| 5.2.4 转基因烟草的表型变化 |
| 5.2.5 转基因烟草的激素调控 |
| 5.2.6 转基因烟草叶片胁迫响应 |
| 5.2.7 转基因烟草的干旱处理与防御指标测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 电穿孔转化根瘤农杆菌 |
| 5.3.2 转基因过表达烟草植株的获得 |
| 5.3.3 转基因过表达水曲柳植株的获得 |
| 5.3.4 FmTCP2和FmTCP15基因过表达烟草的表型变化 |
| 5.3.5 转基因烟草植株的内源激素含量变化 |
| 5.3.6 转基因烟草对赤霉素响应 |
| 5.3.7 转基因烟草叶片的非生物胁迫耐受性 |
| 5.3.8 转基因烟草在干旱胁迫下的防御响应 |
| 5.4 本章讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 FmTCP2和FmTCP15与赤霉素通路DELLA蛋白互作 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 菌株与载体 |
| 6.1.3 主要试剂与药品 |
| 6.1.4 仪器设备 |
| 6.1.5 试剂配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 水曲柳幼苗的瞬时侵染 |
| 6.2.2 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因相关基因表达分析 |
| 6.2.3 酵母双杂交载体构建 |
| 6.2.4 酵母感受态细胞的制备 |
| 6.2.5 酵母双杂交bait载体的自激活和活性检测 |
| 6.2.6 水曲柳FmTCP2和FmTCP15的相关蛋白的互作验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 FmTCP2和FmTCP15调控植物激素及胁迫响应通路基因表达 |
| 6.3.2 FmTCP2和FmTCP15与赤霉素通路DELLA蛋白直接互作 |
| 6.4 本章讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
四、利用软件Primer Premier 5.0进行PCR引物设计的研究（论文参考文献）
- [1]GGT1不同剪接体鉴定及其对哺乳动物卵泡发育和排卵的功能研究[D]. 王玲. 华中农业大学, 2021
- [2]基于CRISPR技术的副溶血性弧菌核酸现场检测系统的研究[D]. 张梦垚. 浙江大学, 2021(01)
- [3]喜旱莲子草DMNT合成途径关键TPS的鉴定和功能研究[D]. 王苑馨. 山西农业大学, 2021
- [4]环形泰勒虫SVSPs分子互作蛋白的筛选及功能研究[D]. 李志. 中国农业科学院, 2021
- [5]Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究[D]. 张露文. 西北农林科技大学, 2021
- [6]基于SNP标记的黄河鲤鱼溯源研究与应用[D]. 王彦云. 中国农业科学院, 2021(09)
- [7]番茄低温下矮化坏死调控基因ndw的克隆及功能鉴定[D]. 徐巍. 石河子大学, 2021(02)
- [8]基于核酸扩增原理的常见肉源性成分快速鉴定研究[D]. 秦盼柱. 合肥工业大学, 2021(02)
- [9]荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究[D]. 钱程. 浙江大学, 2021(01)
- [10]水曲柳FmTCP2和FmTCP15参与叶发育与干旱耐受性的功能分析[D]. 梁楠松. 东北林业大学, 2021