一、7-硝基吲唑对甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱效应、CREB磷酸化和c-fos表达的影响（论文文献综述）
王采玲[1]（2020）在《甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆细胞的发现及机制研究》文中研究说明药物成瘾是一种涉及到奖赏、学习记忆、动机、决策、执行和中枢控制等一系列高级神经精神功能异常,发病机制极为复杂,复发率极高的慢性脑病,是重大的医学生物学和社会问题。根据《2018年中国毒品形势报告》,全国现有吸毒人员240.4万名,甲基苯丙胺成瘾人员135万名,,占56.1%,甲基苯丙胺已经成为我国目前最主要的成瘾物质。与传统毒品相比,甲基苯丙胺具有极强的躯体依赖性和精神依赖性,严重损害中枢神经系统并造成不可逆损伤,不仅严重危害成瘾者自身健康,还引发了诸多社会、经济及公共卫生等问题。然而,甲基苯丙胺成瘾的神经生物学机制尚未阐明,目前仍未有有效的干预和治疗措施。现有的研究认为,治疗药物成瘾的关键在于解决复吸问题,而解决复吸问题的关键在于消除成瘾记忆的“顽固性”。药物成瘾记忆是在成瘾性药物的正性奖赏、戒断负性情绪及药物相关线索的综合影响下,形成的持久的、难以消退的病理性学习记忆,使得成瘾患者即使在经历数年、数十年的戒断之后,仍能被诱发对药物的强烈渴求和复吸。其中,药物相关线索诱发成瘾者对药物的渴求是临床上导致复吸的最重要因素之一。虽然大量研究表明,线索在成瘾的形成、维持和复吸中发挥的重要作用与其被赋予的条件性强化效应和奖赏效应相关,但背后的神经生物学机制并未阐明。联合学习记忆是一种重要的信息获取方式,其对于逻辑推理、联想思维、比较和计算都是必不可少的。两个或多个事件在时间和空间上有反复多次的相互作用时,它们之间能够相互关联,使机体明白个事件的出现意味着其它事件的出现,即建立联合学习记忆。联合学习分为巴甫洛夫条件反射和操作性条件反射两种类型。王晋辉研究员发现,建立触觉-嗅觉巴甫洛夫式的联合学习记忆后,触觉皮层神经元可以被嗅觉刺激激活,引起触觉信号引起的行为;反之亦然。这提示联合学习记忆对被关联的两个刺激具有双向的作用。此外,联合学习记忆的建立伴随触觉和嗅觉相关皮层之间神经投射的增加和突触结构、突触功能的变化,提示存储联合学习记忆的联合记忆细胞可能是联合学习记忆的物质基础。鉴于药物成瘾也是一种与离散线索、辨别线索、情境线索相关联的病理性学习记忆,联合学习记忆是否也有可能参与甲基苯丙胺成瘾及复吸呢?前人的大量研究采用巴甫洛夫向操作性条件反射转换（Pavlovian-to-Instrumental Transfer,PIT）模型,通过从操作行为中分离出线索与成瘾性药物的巴甫洛夫配对,揭示药物相关线索的内生动机（而非条件性强化效应）是其诱发复吸的原因。然而,在用药环境外开展的线索消退治疗虽然能够减少机体对药物相关线索的主观渴求和生理反应,却并不能减少复吸,提示药物相关线索诱发复吸的背后一定存在内生动机之外的其他机制。另一方面,小剂量药物诱发复吸被认为与机体的内感受相关,但其机制同样尚未阐明。那么,在甲基苯丙胺成瘾和线索诱发复吸中,是否也有可能存在联合学习记忆对关联刺激（甲基苯丙胺和相关线索）的双向作用呢?这种改变及其背后的神经生物学机制是否是甲基苯丙胺成瘾和复吸的重要原因呢?前人关于成瘾的研究仅关注了联合学习记忆对药物相关线索的影响,而一直忽略了联合学习记忆对药物自身效应的研究。我们的科学假说认为甲基苯丙胺成瘾记忆与感觉联合记忆相似,机体在线索和甲基苯丙胺奖赏效应之间建立快速、强烈的联合学习记忆,存储在成瘾联合学习记忆细胞中,使线索能够引起机体对甲基苯丙胺的反应,同时甲基苯丙胺的出现也能够引起类似线索信号的反应。在这一过程中,联合学习增强了甲基苯丙胺和线索相关脑区间原有的联系,形成了新的神经投射和新的突触连接,易化学习过程,促进甲基苯丙胺成瘾的形成和维持。同时,由于成瘾联合学习记忆细胞存储甲基苯丙胺和线索相关的记忆,所以甲基苯丙胺和线索都可以激活成瘾联合学习记忆细胞,从而诱发用药行为和觅药行为（复吸行为）。因此,不仅药物相关线索可以在没有甲基苯丙胺的情况下诱发机体对药物的渴求,从而引起复吸行为;而且药物自身引起的反应也会得到增强。要证明此假说的客观性,我们必须在行为学和神经生物学水平上找到证据。这对于阐明甲基苯丙胺成瘾和复吸的机制具有重要的理论意义,还可能为干预和治疗甲基苯丙胺成瘾及复吸提供新线索和新思路。实验方法1.在经典的小鼠自身给药模型上和改进的小鼠自身给药模型上研究伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆对甲基苯丙胺+视觉线索、甲基苯丙胺自身诱发用药行为的影响。2.在改进的小鼠PIT模型上区分视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习和视觉线索的条件性强化效应,研究其对甲基苯丙胺自身诱发成瘾行为形成及环境消退的影响。3.进行Tet on条件性基因表达系统验证,为在药物作用的初级脑区腹侧被盖区（Ventral Tegmental Area,VTA）和视觉刺激的初级脑区视觉纹状皮层V1区（striatum cortex V1,SCV1）标记成瘾联合学习记忆细胞,揭示甲基苯丙胺成瘾的联合学习记忆机制打下基础。研究结果1.伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆对成瘾行为的影响（1）形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆增强甲基苯丙胺诱发的自身给药行为的形成,增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药行为在经典的自身给药模型固定比率1（fixed ratio,FR1,触1次有效鼻触获得1次药物注射）程序下,在为期11天的训练阶段（形成期,3小时/天,注射次数上限为100次）,小鼠随机分为配对线索刺激组（Paired Stimulus Group,PS组,1次甲基苯丙胺注射伴随5 s鼻触灯）、不配对线索刺激组（Unpaired Stimulus Group,UPS组,随机出现的5 s鼻触灯与甲基苯丙胺注射不关联）和对照组（Control Group,Con组,鼻触灯不亮）。结果显示,与UPS组和Con相比,PS组甲基苯丙胺（0.05 mg/kg/次）注射次数显着增加（具有一个重复测量的双因素方差分析:线索配对主效应P<0.01,时间主效应P<0.001,交互作用P<0.001,n=6）。第12天进行药物单一刺激测试,3组小鼠1次有效鼻触均只能获得1次甲基苯丙胺（0.05mg/kg/次）注射,无视觉线索（鼻触灯不亮）。实验结果显示,与UPS组和C on组相比,PS组甲基苯丙胺注射次数显着增加（单因素方差分析:线索配对主效应P<0.05,n=6）。以上结果提示,形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆增强甲基苯丙胺诱发的自身给药行为的形成,增强形成期甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药行为。然而,在该模型中,PS组甲基苯丙胺总摄入量也显着高于UPS组和Con组（单因素方差分析:线索配对主效应P<0.05,n=6）,存在甲基苯丙胺摄药量不均衡的问题,导致3组间药物正性强化作用存在差异。因此,无法区分该模型中药物自身效应的增强足联合学习记忆的直接作用还是联合学习记忆通过增强操作行为,增加PS组甲基苯丙胺摄入量和奖赏效应而产生的间接作用。（2）在摄药量相同的情况下,形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆直接增强形成期用药动机,对于药物和线索各自引起的反应具有双向的增强作用为了研究联合学习记忆能否直接对甲基苯丙胺自身给药行为形成以及甲基苯丙胺自身作用产生影响,必须首先排除各组摄药量不均衡引起的药物正性强化作用的差异。因此,我们对传统自身给药模型的训练模式进行了调整。改进后的自身给药模型（训练模式2）采用FR1训练程序,小鼠依旧分为PS组（1次甲基苯丙胺注射伴随5 s鼻触灯）、UPS组（随机出现的5s鼻触灯与甲基苯丙胺注射不关联）和Con组（鼻触灯不亮）,测量各组小鼠每天获得30次甲基苯丙胺（0.05 mg/kg/次）注射所需时间,以此评价3组小鼠用药动机的强弱。在为期12天的自身给药形成阶段,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠获得30次甲基苯丙胺（0.05 mg/kg/次）注射所需时间显着降低（具有一个重复测量的双因素方差分析:线索配对主效应P<0.001,时间主效应P>0.05,交互作用P>0.05,n=8～9）。在第13天进行药物单一刺激测试,3组小鼠1次有效鼻触均只能获得1次甲基苯丙胺（0.05 mg/kg/次）注射,无视觉线索（鼻触灯不亮）。实验结果显示,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠获得30次甲基苯丙胺注射所需时间显着降低（单因素方差分析:线索配对主效应P<0.001,n=8～9）。第14天对PS组和UPS组进行线索单一刺激测试,小鼠1次有效鼻触均只能获得1次视觉线索（5 s鼻触灯）,无甲基苯丙胺注射。实验结果显示,与UPS组相比,PS组小鼠获得30次视觉线索所需时间显着降低（t检验,P<0.01,n=9）。以上结果提示,形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆直接增强甲基苯丙胺+视觉线索、甲基苯丙胺自身诱发的用药动机,增强线索自身诱发的觅药动机。因此,联合学习记忆不仅直接增强用药动机,而且对药物和线索各自引起的反应具有双向的增强作用。2.视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习对成瘾行为的影响前人的大量研究认为药物相关线索的条件性强化效应和内生动机是线索增强成瘾行为形成以及消退后诱发复吸的原因。然而,我们的研究发现建立了视觉线索（鼻触灯）与甲基苯丙胺的联合学习记忆后,即便没有线索出现时,甲基苯丙胺自身诱发的用药行为也得到了增强,这提示线索增强成瘾形成可能还存在其他的作用机制。为了进一步研究是药物与线索巴甫洛夫联合的直接作用,还是线索条件性强化效应的间接作用,造成了形成期甲基苯丙胺自身效应的增强,我们采用改进的PIT模型分离巴甫洛夫训练和操作性行为训练。（1）视觉线索和甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习直接增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药动机,促进甲基苯丙胺成瘾行为的形成在改进的PIT模型中,首先进行为期8天的FR1训练（3小时/天,注射次数上限为100次,无视觉线索,即鼻触灯不亮）,建立小鼠甲基苯丙胺（0.05mg/kg/次）自身给药行为。第9天进行前测,1次有效鼻触获得1次甲基苯丙胺注射,无视觉线索（鼻触灯不亮）,将每只小鼠在第6-8天的平均甲基苯丙胺注射次数设置为各自的任务量,测量每只小鼠完成各自的任务量所需时间。前测后,综合考虑每只小鼠的任务量、前测时间、1-9天甲基苯丙胺总摄入量将小鼠均衡分为配对线索刺激组（PS组）、不配对线索刺激组（UPS组）和对照组（Con组）。在第10天和14天分别进行视觉线索（鼻触灯）与甲基苯丙胺的巴甫洛夫配对,3小时/天。在巴甫洛夫配对阶段,小鼠获得甲基苯丙胺（0.05 mg/kg/次）被动注射,且每只小鼠获得的注射次数与其在前测时的任务量相等,以此保证每只动物获得的奖赏强度不变。PS组每次甲基苯丙胺被动注射伴随5s鼻触灯;UPS组甲基苯丙胺被动注射与随机出现的5 s鼻触灯不关联;Con组只获得甲基苯丙胺被动注射,鼻触灯不亮。在第11-13天及第15-16天进行后测,即无视觉线索（鼻触灯不亮）出现的甲基苯丙胺单一刺激测试,方法与第9天前测完全相同。结果显示,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠完成各自任务量所需时间显着降低（双因素方差分析:线索配对主效应P<0.001,时间主效应P>0.05,交互作用P>0.05,n=4）,提力视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习直接增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药动机,促进甲基苯丙胺成瘾行为的形成。以上结果说明,线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习不仅是线索的条件性强化和内生动机的基础,而且对甲基苯丙胺成瘾的形成具有直接的增强作用;这是甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆机制存在的行为学证据。（2）视觉线索和甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习减慢甲基苯丙胺成瘾的环境消退过程为了研究视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆对消退复吸的影响,我们从第17天开始对3组小鼠进行14天的环境消退,3小时/天,触有效鼻触和无效鼻触均只记录,无甲基苯丙胺注射和视觉线索（鼻触灯不亮）。结果显示,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠有效鼻触数显着升高（双因素方差分析:线索配对主效应P<0.05,时间主效应P<0.001,交互作用P>0.05,n=4）,提示形成期视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习减慢甲基苯胺成瘾的环境消退过程。以上结果说明形成期视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习使成瘾行为更难消退,这可能与在PS组建立视觉线索-甲基苯丙胺巴甫洛夫联合学习的过程中甲基苯丙胺和视觉线索自身的效应都得到了增强,且二者与环境线索都建立了更强的联合学习记忆,从而使得环境线索在消退时激活更多的记忆细胞,诱发更强的觅药动机有关;这是甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆机制存在的第二重行为学证据。3.用于成瘾联合学习记忆细胞标记的Tet on条件性基因表达系统验证通过前两章的研究,从行为学上明确了联合学习记忆参与了甲基苯丙胺成瘾行为的形成,是成瘾行为难以消退的原因。为了阐明联合学习记忆参与甲基苯丙胺成瘾的神经生物学机制,我们需要找到成瘾联合学习记忆机制的物质基础,即甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆细胞。我们将采用训练模式2,在甲基苯丙胺单一刺激测试中采用Tet on条件性基因表达系统标记仅被甲基苯丙胺激活的神经细胞（称为一相标记）,在视觉线索单一刺激测试通过Fos免疫荧光染色标记仅被视觉线索激活的神经细胞（称为二相标记）。当一个神经细胞同时被Tet on系统和Fos标记上时,我们就初步判断其为存储了甲基苯丙胺和视觉线索相关记忆的成瘾联合学习记忆细胞。Tet on系统属于四环素调控系统,其对细胞的时空特异性标记依赖于脑内Fos的表达及外源性给予强力霉素（doxycycline,Dox）。为了确定Teton系统在甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆细胞标记中的可行性及最适诱导时间,我们将Tet on病毒系统注射到小鼠VTA中,分别在甲基苯丙胺或盐水刺激取脑前6天、前3天和前1天三个时间点开始给予Dox,通过观察VTA中mCherry及Fos的表达情况,验证Teton系统。病毒表达2周后,对小鼠进行甲基苯丙胺（1 mg/kg,i.p.）或生理盐水（i.p.）刺激,4h后取脑,进行免疫荧光实验。免疫荧光结果显示,仅在刺激取脑前1天给予Dox,Teton系统能够在甲基苯丙胺刺激后启动mCherry的表达,且不给予Dox时mCherry几乎不表达,说明Teton系统的开放受Dox调控。在Dox存在的情况下,与盐水组相比,给予甲基苯丙胺之后VTA中同时表达Fos和mCherry的神经细胞增加,说明甲基苯丙胺能够通过增加VTA中Fos的表达启动Teton系统。且与刺激取脑前6天和前3天给予Dox组相比,刺激取脑前1天给予Dox组腹腔注射盐水后mCherry的非特异性表达（即非甲基苯丙胺刺激引起的表达）较低。以上结果显示,在Dox存在的情况下,甲基苯丙胺能够通过激活Fos的表达来诱导Teton系统的启动,且在刺激取脑前1天给予Dox能够在启动系统表达的同时减少mCherry的非特异性表达。结论综上所述,本课题在行为学上揭示,与感觉刺激的联合学习记忆相似,联合学习记忆对于药物和线索各自引起的反应具有双向的增强作用。巴甫洛夫联合学习通过增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药动机,促进小鼠甲基苯丙胺自身给药的形成;且减慢甲基苯丙胺成瘾的环境消退过程,为甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆机制的存在提供了行为学证据。这些结果提示联合学习记忆不仅是药物相关线索的条件性强化和内生动机的基础,而且能够直接、双向的增强甲基苯丙胺成瘾和环境消退抵抗。本课题强调甲基苯丙胺成瘾和复吸背后可能的联合学习记忆机制,这可能在介导甲基苯丙胺成瘾形成以及情境、离散线索、药物诱发的复吸中发挥重要的作用。本课题为药物成瘾联合学习记忆的研究提供了可靠的行为学范式,为进一步发现成瘾联合学习记忆细胞,进而阐明甲基苯丙胺成瘾的联合学习记忆机制奠定了坚实的基础,有望揭示甲基苯丙胺成瘾难以戒除背后的神经生物学机制,对发现有效的治疗甲基苯丙胺成瘾防复吸干预措施具有重要的意义。
任兆翔[2]（2018）在《Clk1缺失抑制甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱及其机制研究》文中进行了进一步梳理毒品滥用自古以来都是一个备受瞩目的问题,不仅仅对人类的生命健康造成了不可挽回的损伤,同时也严重威胁着社会安全和经济的持续发展。甲基苯丙胺,也就是冰毒,是一种具有较强成瘾性的合成类毒品。长期、持续的使用甲基苯丙胺会产生严重的药物依赖现象,其中主要包括躯体依赖（physical dependence）以及精神依赖（psychological dependence）两个方面。不仅如此,甲基苯丙胺的戒断也被认为是难以解决的。多次、甚至是单次使用甲基苯丙胺后,它可以通过竞争性的抑制多巴胺转运体（dopaminetransporter,DAT）的功能来抑制多巴胺的摄取从而增加突触间隙多巴胺（dopamine,DA）浓度,然后可以激活大脑中的奖赏系统,最终导致成瘾。虽然对毒品滥用的研究已经持续了数百年,但是对其具体的分子机制的认识仍然十分粗浅。Clk1,也叫做Coq7,是线粒体中一种参与泛醌合成的必要的羟化酶。以此同时,Clk1在线粒体呼吸链电子传递以及氧化应激中发挥着重要的作用。本文主要探讨了 Clk1在甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱中的作用,同时对其机制进行了研究。结果发现,与野生型小鼠相比,小鼠部分缺失Clk1可显着抑制甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱（conditioned place preference,CPP）、运动总路程（total distance）以及伏隔核（nucleus accumbens,NAc）区域的△FosB 和纹状体（striatum）区域的磷酸化cAMP response element binding（CREB）的表达。机制研究发现,Clk1缺失可以通过抑制多巴胺转运体的降解来增加其在细胞膜上的表达。同时,我们也发现Clk1缺失可以增加缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达。铁调素（hepcidin）是外排蛋白铁转运蛋白ferroportin1（FPN1）的负性调节因子,hepcidin可以与FPN1结合促进FPN1的内化和降解。而HIF-1α可以结合到hepcidin的启动子区域抑制其转录从而取消hepcidin对FPN1的抑制作用。因此,不管是体内还是体外,Clk1缺失都可以通过增加铁离子外排蛋白铁转运蛋白FPN1的表达来降低细胞内铁离子浓度。而且硫酸亚铁处理可以逆转由于Clk1缺失引起的DAT表达增高。本文首次发现Clk1缺失可以通过增加铁离子外排降低细胞内铁离子浓度来抑制DAT的降解,高水平的DAT可以及时摄取突触间隙中的由于甲基苯丙胺引起的高浓度的DA,最终实现抑制甲基苯丙胺诱导的条件位置偏爱以及一些成瘾的相关现象。
赖莉丽[3]（2017）在《伏隔核PKMζ在吗啡成瘾中的作用》文中提出目的本研究建立吗啡成瘾大鼠模型,以奖赏通路中伏隔核作为研究切入点,运用分子生物学和行为学方法,探讨大鼠伏隔核PKMζ在吗啡成瘾中的作用。以期进一步明确成瘾记忆的机制,为有效地干预、减弱或擦除成瘾记忆和开发治疗成瘾复吸的医疗措施提供新思路。方法（1）采用条件性位置偏爱装置和非倾向性训练程序建立吗啡成瘾大鼠模型。通过旷场实验方法评价吗啡成瘾对大鼠探究行为的影响。（2）运用Western blot方法检测吗啡成瘾大鼠伏隔核PKMζ的表达。（3）吗啡成瘾大鼠伏隔核行脑立体定位置管术,微量注射PKMζ抑制剂ZIP（0.5μM,每侧5μl）,持续观察其偏爱分值的变化,明确ZIP对成瘾记忆消退和复吸的作用。（4）Western blot检测吗啡成瘾大鼠伏隔核H3乙酰化水平;吗啡成瘾大鼠离体伏隔核脑片灌流HDAC抑制剂TSA（80μM）30min检测伏隔核PKMζ的表达,探究成瘾记忆形成过程中PKMζ的表达与组蛋白乙酰化的关联。结果（1）吗啡诱导大鼠条件性位置偏爱效应显着增强（p<0.05）,形成成瘾记忆,提示吗啡成瘾动物模型成功建立。（2）旷场实验结果显示吗啡成瘾大鼠的自主运动总路程和中央区域运动路程均减少,显着低于对照组（p<0.05）,提示吗啡成瘾大鼠的探究行为减少。（3）Western Blot结果显示吗啡成瘾组大鼠伏隔核PKMζ和p-PKMζ表达显着高于对照组（p<0.05）,提示伏隔核PKMζ参与大鼠吗啡成瘾过程,其表达和活性在吗啡成瘾过程中有重要作用。（4）伏隔核微量注射PKMζ抑制剂ZIP能够促进吗啡成瘾大鼠条件性位置偏爱效应的消退（p<0.05）,并对大鼠吗啡成瘾消退后复吸具有抑制作用（p<0.05）。（5）Western Blot结果显示吗啡成瘾大鼠伏隔核组蛋白H3的乙酰化水平显着高于对照组（p<0.05）,说明伏隔核组蛋白H3乙酰化水平升高在吗啡成瘾大鼠的成瘾记忆形成中有重要作用。（6）组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA使吗啡成瘾大鼠伏隔核PKMζ表达增高（p<0.05）,说明吗啡成瘾大鼠伏隔核PKMζ表达增加可能与组蛋白H3乙酰化修饰增强有关。结论伏隔核PKMζ参与大鼠吗啡成瘾的过程,其特异性抑制剂ZIP可促进吗啡成瘾消退并抑制复吸;吗啡成瘾大鼠伏隔核PKMζ表达增加可能与组蛋白H3乙酰化修饰增强有关。
李辉[4]（2014）在《组蛋白修饰对甲基苯丙胺诱发的行为敏化的影响》文中研究指明药物成瘾是世界性难题，极大地损害人类的身心健康，影响社会稳定，增加医疗和经济负担。近年来，以甲基苯丙胺为代表的新型合成毒品滥用日趋严重，已成为重大的社会和公共卫生问题，研究其神经生物学机制以及寻找有效的诊断治疗方法迫在眉睫。药物成瘾是一种慢性复发性脑疾病，具有强迫用药和觅药的典型特点。一旦成瘾，终生难以摆脱，即使戒断较长时间后仍易于复吸。近年来的研究认为，药物成瘾是机体长期接触成瘾性药物后，中枢神经系统的神经可塑性发生异常改变，最终诱发成瘾行为。越来越多证据表明，表观遗传学是调控神经可塑性的一种重要方式，它不依赖于DNA序列改变而通过其他生化过程使机体内某些基因表达终生改变。这种表观遗传学修饰极其稳定，使其足以调控成瘾易感性和药物所诱发的代偿性适应。已有研究也证实，表观遗传学与药物成瘾密切相关，如急性或长期给予可卡因和其他成瘾性物质增加伏隔核（nucleus accumbens，NAc）内组蛋白H3、H4整体乙酰化水平；另外成瘾性药物也可改变一系列的表观遗传修饰调控酶。近年来，由于甲基苯丙胺滥用日趋严重，越来越多的科研人员开始研究其成瘾机制。本课题从组蛋白修饰角度—一种表观遗传学修饰研究甲基苯丙胺成瘾机制，以进一步加深对其机制的理解。一、甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型反复给予成瘾性药物使得中枢神经系统对药物和药物相关刺激超敏，从而介导觅药和用药行为介导觅药和用药行为，表明敏化在药物复吸中发挥重要作用，并且二者具有共同的神经通路即前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）至中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）和NAc的投射，因此，本论文选定行为敏化模型研究甲基苯丙胺成瘾。行为敏化模型可分为形成、转化和表达三个阶段，本部分对形成和激发期（表达期）甲基苯丙胺给药剂量从0.25mg/kg-5.0mg/kg进行一系列的筛选，结合敏化后自发活动的变化，确定模型处理方案为连续7天给予5.0mg/kg甲基苯丙胺（s.c.，qd）后戒断7天，第15天给予1.0mg/kg甲基苯丙胺（s.c.）激发。甲基苯丙胺处理组（5.0mg/kg，s.c.，qd，7天）大鼠激发后水平活动距离明显高于生理盐水对照组大鼠（约30%），表明行为敏化模型建立成功。二、mRNA表达和组蛋白修饰的差异筛选本课题首次采用mRNA表达谱芯片和组蛋白修饰谱芯片研究甲基苯丙胺诱发的行为敏化大鼠PFC的mRNA差异表达及组蛋白修饰的改变，从转录和转录前水平分析该模型所诱发的变化。mRNA表达谱芯片筛选结果显示，共505个基因出现mRNA差异表达。具体的差异表达基因显示，在甲基苯丙胺处理后（急性给药后、转化期和表达期）mRNA表达高于盐水组，提示甲基苯丙胺活化多种基因转录；而甲基苯丙胺激发后mRNA高度表达也表明基因转录活化在敏化的表达中可能发挥了重要作用。GO分析将变化基因主要分为金属离子结合相关分子、调节转录分子、染色质重塑与DNA结合相关分子、细胞表面受体信号转导分子、质膜相关分子、参与神经系统发育分子、细胞凋亡相关分子和癌症相关分子等七类，这些分子有可能在药物成瘾中发挥重要作用。组蛋白修饰谱中差异修饰基因较多，主要变化位点为组蛋白乙酰化，2491个基因启动子位点H3乙酰化改变，5551个基因启动子位点H4乙酰化改变，而H3甲基化修饰几乎不改变，表明在甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型中，主要是组蛋白乙酰化参与转录调控。mRNA表达芯片中mRNA表达增加基因明显多于减少基因，而组蛋白修饰谱中H3、H4乙酰化修饰程度也在给与甲基苯丙胺后显着增加，提示组蛋白乙酰化修饰的增加介导基因转录的活化。综合分析mRNA表达和/或组蛋白修饰、基因功能、信号通路及基因在PFC内的基础表达量，选定Anp32a、Arrdc1、Atp5i、Avp、Bal2l1、Bdnf、Cadm3、Camk2n1、Cox6a1、Cox8a、E2f3、Egr1、Eml2、Exog、Galnt9、Hira、Limk1、Lnx2、Metrn、Ndst4、Nmur1、Oma1、Pou3f2、Shoc2、Stk32c、Stx2、Syt8、Tacr2、Trim17、Usp9x、Zfp36等共31个分子进行验证。三、转录上游分析组蛋白乙酰化修饰主要受两类酶调节：组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）。在此模型中，大鼠PFC的CBP在激发后mRNA表达量下降至盐水对照的80%左右，HDAC1、2（属于I型Hdac）主要在甲基苯丙胺急性给药以及形成期慢性给药后下降，HDAC4、5（属于II型HDAC）则主要是在戒断（转化期）和激发后下降，提示不同类型的Hdac在此模型不同阶段发挥功能。HDAC活性则主要是在长期给药后降低，戒断和激发后显着增加。组蛋白修饰谱芯片提示，甲基苯丙胺处理后（急性给药后、转化期和表达期）总体组蛋白乙酰化明显增加，并且1.0mg/kg甲基苯丙胺激发后，组蛋白乙酰化修饰明显增加，与HDAC活性结果相反。上述结果的差异存在两种可能①本课题未研究的HAT和HDAC在此模型中发挥功能；②某一种或几种而非全部HDAC亚型参与此模型调控。这也为成瘾的进一步研究提供了线索和证据。四、候选分子验证及Pou3f2等基因在甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型中转录和转录前的动态变化经过mRNA和组蛋白修饰两方面验证，选定Anp32a、Egr1、Eml2和Pou3f2四个分子作为候选分子，研究候选分子在甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型各个阶段的动态变化。结果显示，Anp32a、Pou3f2组蛋白修饰与mRNA表达变化较一致，在整个敏化过程中，急性及形成期给药使其组蛋白修饰和mRNA表达增加，戒断后恢复至正常水平，激发后显着增加。Egr1、Eml2组蛋白修饰与mRNA表达则不完全一致。Egr1在急性给药后及敏化形成期H4乙酰化有所增加，但mRNA表达量反而下降；7天戒断及激发后，Egr1组蛋白修饰和mRNA表达均无明显变化。Eml2在急性给药后H4组蛋白乙酰化增加，而mRNA显着降低；形成期给药后组蛋白修饰和mRNA表达均有一定程度的上升；戒断后，Eml2启动子位点H3、H4乙酰化修饰显着增加，但mRNA表达与盐水组无差异；而激发后，组蛋白修饰和mRNA表达均无明显变化。这些结果说明，组蛋白乙酰化修饰只是调控转录的一种方式，参与但并不一定决定基因转录能力。在上述候选分子中，在甲基苯丙胺成瘾的关键阶段，Pou3f呈现较明显的变化。文献表明，Pou3f2作为脑内特异表达的一个转录因子，与成瘾中研究较多的分子和通路（例如cAMP通路、Notch通路、MAPK通路等）密切相关，但是目前尚未研究Pou3f2本身与成瘾的关系。因此，本课题进一步研究Pou3f2与成瘾的关系。五、Pou3f2与甲基苯丙胺诱发行为敏化的相关性本部分成功建立了干涉Pou3f2的慢病毒。PFC亚区缘前皮层（prelimbiccortex，PL）注射慢病毒后建立甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型，初步研究显示下调大鼠PL区Pou3f2mRNA的表达使甲基苯丙胺诱发的行为敏化大鼠激发后自发活动量降低约50%，提示Pou3f2可能是调控甲基苯丙胺诱发的行为敏化的重要分子，有可能在药物成瘾中发挥重要作用。综上所述，本课题研究发现，在甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型中，大鼠PFC的基因组整体组蛋白乙酰化水平增加并介导下游基因的开放表达；而在转录上游，甲基苯丙胺通过调控CBP和HDAC的mRNA表达和活性而动态调控组蛋白乙酰化水平，这些结果提示PFC的组蛋白乙酰化修饰可能在甲基苯丙胺成瘾中发挥重要作用。另外，甲基苯丙胺诱导PFC内转录因子Pou3f2启动子区组蛋白乙酰化修饰及其转录水平的改变，可能是行为敏化形成的重要基础。
刘伟[5]（2014）在《斑马鱼药物依赖模型与啮齿类动物模型的比较研究》文中研究说明背景药物滥用是公共卫生的主要威胁之一。苯丙胺类兴奋剂（Amphetamine-type stimulants,ATS）等是近十年才开始被普遍滥用的一种新型毒品,甲基苯丙胺（冰毒）是一个广泛滥用苯丙胺类物质。在2011年,全球在15-64岁之间的人群0.7%的人（约3380万）使用苯丙胺类药物。而甲基苯丙胺仍然是苯丙胺类使用最多的,2011年占全球的71%。苯丙胺类兴奋剂的滥用不仅导致滥用者身心健康严重损害,还因药物作用的影响,滥用者在极度兴奋下极易发生各种违法犯罪行为,这对社会公共安全造成极大威胁。因此,对于苯丙胺成瘾的干预是一项刻不容缓的医学任务和社会任务。高效低毒无成瘾性戒毒药物的开发成为药物依赖干预的重大难题,中药戒毒有着悠久的历史,中药资源极其广泛,每种中药又含有数十至数百种活性成分,由于传统药物依赖动物模型的限制,使得戒毒药物的高通量筛选难以开展。国内甲基苯丙胺药物依赖动物模型研究主要以神经细胞和大、小鼠动物模型为主,由于试验经费和试验室条件的限制,国内大多数试验室都未能建立药物依赖猴模型。斑马鱼作为一种理想的模式生物在生命科学领域被广泛的应用,特别在人类疾病模型和药物高通量筛选方面,已成为斑马鱼研究的热点,但国内外对甲基苯丙胺药物依赖斑马鱼模型报道都很少。在戒毒中药和活性成分高通量筛选方面,现有的大小鼠模型,乃至恒河猴模型由于试验周期长、用药量大、费用高昂等因素,使戒毒药物的高通量筛选难以开展,而斑马鱼模型的特性使之成为寻找有效药物的最佳选择。与啮齿类动物甲基苯丙胺药物依赖模型相比,斑马鱼模型的研究起步较晚,整体生物学体征及神经机制有待进一步研究。实验目的1.建立小鼠和成年斑马鱼的甲基苯丙胺CPP动物模型,观察小鼠和成年斑马鱼CPP效应,从行为学方面来对比小鼠和成年斑马鱼两种模型的依赖效果,同时用中药有效成分钩藤碱进行干预,对比观察形成依赖后不同动物模型的行为变化。2.采用免疫组化法,观测甲基苯丙胺条件性位置偏爱小鼠和成年斑马鱼脑内TH、NR2B、GluR1阳性细胞数目的改变及中药活性成分钩藤碱对其干预后变化情况的对比。3.采用蛋白免疫印迹（Western blotting）方法,观测甲基苯丙胺条件性位置偏爱小鼠和成年斑马鱼脑内TH、NR2B、GluR1受体蛋白表达的改变及中药活性成分钩藤碱对其干预后变化情况的对比。4.通过对两种动物模型不同组别及指标结果的分析,对比两种模型造模及给药后不同指标的改变趋势。实验方法1.参照课题组前期研究成果建立小鼠和成年斑马鱼条件性位置偏爱模型,从行为学方面来对比小鼠和成年斑马鱼两种模型的CPP效果取符合实验条件的50只小鼠,按随机原则分为5个组:即①空白对照组,②甲基苯丙胺模型组,③钩藤碱低剂量（40mg/kg）组,④钩藤碱高剂量（80mg/kg）组,⑤氯胺酮（15mg/kg）组,每组10只小鼠。②～⑤组每天上午（8:00）皮下注射甲基苯丙胺4 mg/kg,连续4天;①组注射同体积生理盐水,其它处理同②组;③和④组从第二天起每天上午（7:30,即注射甲基苯丙胺前30min）灌胃相应剂量的钩藤碱,连续3天;⑤组从第二天起在注射甲基苯丙胺之前15min,腹腔注射氯胺酮（15 mg/kg）,连续3天。各组下午（16:00,间隔8h）均给予生理盐水（0.15 ml,sc） 1次。将箱体中间的隔板置于中间,第一天上午注射生理盐水或甲基苯丙胺后立即将小鼠置于白箱,下午注射生理盐水后立即将小鼠置于黑箱,均放置1h,连续4天。24 h后（第5天）进行位置偏爱检测,记录小鼠5 min内在白箱中停留的时间。取经过自然位置偏爱测定合格的成年斑马鱼50条,按随机分组原则分为:①正常对照组,②甲基苯丙胺模型组,③钩藤碱低剂量组（50μg/g）,④钩藤碱高剂量组（1OOμg/g）,⑤氯胺酮组（150μg/g）。整个实验需要进行9d,d1将斑马鱼置于独立的用于训练的CPP箱,每个CPP箱的水位不低于5cm,以保证足够的水压,适应性喂养至少2d。d3测试正常状态下,所有斑马鱼的位置偏爱箱（15 min内）,并且用Noldus动物行为学分析系统来跟踪其路线图（5 min内）。在d4、d6、d8,将除开空白组以外的所有斑马鱼浸入200mg/L tricaine methanesulfonate溶液中麻醉,用微量注射器迅速腹腔注射甲基苯丙胺（40μg/g）,然后将其置于非偏爱箱（伴药箱）45 min。之后的训练步骤与建立模型的训练步骤相同。12h后,将除开空白组以外的所有斑马鱼再次浸入200mg/L tricaine methanesulfonate溶液中麻醉,用微量注射器迅速腹腔注射相应的处理药物（模型组注射等体积生理盐水,低剂量组注射50μg/g钩藤碱溶液,高剂量组注射100μg/g钩藤碱溶液,氯胺酮组注射150μg/g氯胺酮溶液）,之后将其移至较大的有蓝色环境的鱼缸。空白组斑马鱼用200mg/L tricaine methanesulfonate溶液麻醉后注射等体积鱼用生理盐水,其他处理与模型组一致。d5和d7在与d4注射的同一时间,给予斑马鱼注射等体积的鱼用生理盐水,然后将其置于偏爱箱（非伴药箱）45 min。按上述相同的步骤,对斑马鱼进行训练。最后一次注射24h后（即d9）,测试所有斑马鱼的伴药箱停留时间以及在鱼缸的路线图,比较它们在伴药箱前后停留时间的差值。2.采用免疫组化法,观测甲基苯丙胺条件性位置偏爱小鼠和成年斑马鱼脑内TH、NR2B、GluR1阳性细胞数的改变及中药活性成分钩藤碱对其干预后变化情况的对比。试验最后一天将各组试验动物处死,将各组动物组织（小鼠取整个脑组织,斑马鱼取整个头部）于4%多聚甲醛（PFA）中固定,常规石蜡包埋,切片,免疫组化染色,显微镜下进行观察,拍片,观察阳性颗粒在细胞内的分布,细胞中出现棕黄色颗粒为阳性。采用Image-Proplus6.0图像分析软件,测定阳性细胞的积分光密度（IOD）。3.采用蛋白免疫印迹（Western blotting）方法,观测甲基苯丙胺条件性位置偏爱小鼠和成年斑马鱼脑内TH、NR2B、GluR1表达的改变及中药活性成分钩藤碱对其干预后变化情况的对比。试验最后一天将各组试验动物处死,取脑,提取脑总蛋白、测定蛋白含量。配制好实验所需的10×TBS、10%SDS、1.0MTris-HCl（PH=8.3）、1.0M Tris-HCl（PH=8.8）、1.0M Tris-HCl（PH=6.8）、1XTBST 以及 Transfer Buffer 等。配制凝胶、SDS-PAG电泳、转膜、一抗、二抗的孵育、显影、定影,用Metamorph软件分析TH、NR2B、GluR1受体每个特异条带的OD值。4.统计学方法本论文中的所有数据均采用SPSS 13.0进行分析。所有数据以（x±s）表示,如果各组比较方差齐采用单向方差分析（One-Way ANOVA）,方差不齐采用了 Welch检验,方差齐多重比较采用最小显着差值法（least significant different,LSD）,方差不齐,采用Dunnett’s T3法。采用相关性分析方法,用相关系数（r）方法考察两种动物模型及给予中药活性成分钩藤碱干预后不同指标之间的相关性的情况。实验结果1、CPP实验结果给予一定量甲基苯丙胺后,小鼠及成年斑马鱼药物依赖模型均产生CPP效应,与空白组对比有统计学意义（P<0. 01）,通过钩藤碱干预均有调节作用。斑马鱼与小鼠的伴药箱中逗留的时间存在正相关r =0.593, P=0.000。2、TH实验结果免疫组化结果:小鼠及成年斑马鱼甲基苯丙胺药物依赖模型脑内TH阳性细胞数均显着增加（P<0.01）,通过钩藤碱干预有改善作用。斑马鱼与小鼠的脑内TH阳性细胞数存在正相关（r=0.408, P=0.000）。western结果:两种动物模型脑内TH蛋白表达显着加强（P<0.01）,通过钩藤碱干预均有改善作用。斑马鱼与小鼠脑内脑内TH蛋白表达呈正相关（r=0.337, P=0.000）。3、NR2B实验结果免疫组化结果:小鼠及成年斑马鱼甲基苯丙胺药物依赖模型脑内NR2B阳性细胞数均增加（P<0.01）,通过钩藤碱干预均有改善作用。斑马鱼与小鼠脑内NR2B阳性细胞数呈正相关（r =0.803, P=0.000）。western结果:小鼠及成年斑马鱼甲基苯丙胺药物依赖模型脑内NR2B蛋白表达加强（P<0.01）,通过钩藤碱干预均有改善作用。斑马鱼与小鼠NR2B蛋白表达呈正相关（r =0.502,P=0.000）。4、GluR1实验结果免疫组化结果:小鼠及成年斑马鱼甲基苯丙胺药物依赖模型脑内GluR1阳性细胞数均增加（P<0.01）,通过钩藤碱干预均有改善作用。斑马鱼与小鼠GluR1阳性细胞数呈正相关（r =0.626, P=0.000）。western结果:小鼠及成年斑马鱼甲基苯丙胺药物依赖模型脑内GluR1表达加强（P<0.01）,通过钩藤碱干预均有改善作用。斑马鱼与小鼠GluR1蛋白表达呈正相关（r =0.875,P=0.000）。实验结论1、给予一定量甲基苯丙胺后,小鼠及成年斑马鱼药物依赖模型均产生CPP效应,通过相关性分析,两种模型动物CPP效果显着相关,提示与成熟的啮齿类动物（小鼠）药物依赖模型相比,斑马鱼药物依赖模型是成功的、稳定的、可复制的。2、通过对TH、NR2B、GluR1三个指标免疫组化和western结果的分析,小鼠及成年斑马鱼药物依赖模型两组数据间都存在正相关,提示两种动物模型分子生物学作用机制相似,斑马鱼动物模型在很大程度上与啮齿类动物模型相似。3、通过钩藤碱干预后,对小鼠及成年斑马鱼药物依赖模型行为学及TH、NR2B、GIuR1三个指标均有调节作用,两组数据间基本都存在正相关,提示钩藤碱对两种模型效果相近,斑马鱼模型由于具有周期短、用药少、体型小等生物学优势,更有利于进行药物研究及药物筛选。
马鹏[6]（2013）在《调节一氧化氮信号通路对成瘾药物诱发条件化活动的影响》文中指出背景与目的：一氧化氮（NO）信号通路在学习记忆过程中发挥重要作用，成瘾药物诱导的条件化活动是一种异常的学习记忆行为，有研究表明NO与成瘾记忆密切相关，其发生部位及机制还有待进一步确定。为深入探讨NO信号通路在成瘾药物诱发的条件化活动中的作用，本文研究：1)外周给予NO供体及抑制剂对可卡因诱导的小鼠条件性自发活动（CL）的影响；2)对中枢NO信号通路进行干预，观察其对吗啡诱导的大鼠条件性位置偏爱（CPP）的影响。方法：对雄性SD大鼠及雄性ICR小鼠分别进行吗啡条件性位置偏爱训练（采用递增剂量方式：5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg，皮下注射，6天）和可卡因条件性自发活动（可卡因：20mg/kg，腹腔注射，5天）训练，建模成功后随机分为对照组、L-NAME组、7-NI组、MOL组、SNP组及联合注射L-NAME与MOL组，采用岛叶微注射或腹腔注射NO抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯（L-NAME）、7-硝基吲唑（7-NI）及NO供体吗多明（MOL）、硝普钠（SNP）等对各组动物进行中枢及外周NO信号干预，采取单次及联合给药两种模式，测试给药前后大鼠CPP得分率及小鼠条件性自发活动的变化。结果：1)与对照组相比，群体训练小鼠条件性自发活动显着增加（P <0.01），单独训练小鼠条件性自发活动呈增加趋势，但无统计学意义（P>0.05），群体训练方式更有易于形成条件性自发活动；2)与对照组相比，大剂量NO抑制剂L-NAME（30mg/kg）组、7-N（I10mg/kg）组小鼠条件性自发活动（P＜0.001，P＜0.01）和自发活动行为（P <0.05，P <0.01）显着降低，小剂量（L-NAME10mg/kg、7-NI2.5mg/kg）组小鼠条件性自发活动（P＜0.05）显着降低但自发活动行为无明显变化（P>0.05），NO抑制剂可以抑制小鼠的条件性自发活动；3)与对照组相比，NO供体MOL（20mg/kg）及小剂量SNP（1mg/kg）不影响小鼠的自发活动与条件性自发活动（P>0.05），NO供体对小鼠条件性自发活动无明显影响；4)L-NAME可以抑制小鼠可卡因诱导的条件性自发活动（P＜0.01），而联合注射MOL时小鼠条件性自发活动无明显变化（P>0.05），联合注射MOL可以逆转L-NAME对条件性自发活动的抑制作用；5)与对照组相比，岛叶微注射NO抑制剂L-NAME组、7-NI组大鼠吗啡CPP的表达显着降低（P＜0.01，P <0.05），CPP再测试过程中7-NI组大鼠CPP的表达仍显着降低（P <0.05），岛叶微注射NO抑制剂可抑制大鼠条件性位置偏爱，7-NI对大鼠CPP的抑制时间相对较长（>24h）；6)岛叶微注射NO供体MOL对大鼠吗啡CPP的表达无显着影响（P>0.05），岛叶微注射MOL对大鼠条件性位置偏爱无影响；7)L-NAME可以抑制大鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱（P＜0.01），而联合注射MOL时大鼠CPP表达无明显变化（P>0.05），岛叶联合注射MOL可以逆转L-NAME对条件性位置偏爱的抑制作用；8)吗啡诱导大鼠CPP实验中，手术及微注射、CPP训练、恢复等操作环节对大鼠穿梭次数无影响（P>0.05），实验中各操作环节对大鼠的活动能力无影响。结论：外周及中枢给予NO抑制剂可以抑制成瘾药物诱发的条件化活动，联合注射NO供体则可以逆转这种抑制作用。NO信号通路可以介导成瘾药物诱发的条件化活动，岛叶NO信号参与成瘾药物诱导的学习记忆过程。
吕涛[7]（2013）在《硫氧还蛋白及其诱导物在甲基苯丙胺成瘾中的作用研究》文中研究指明甲基苯丙胺（methamphetamine, METH）,属于苯丙胺类中枢神经系统兴奋剂,外观为纯白色结晶体,俗称“冰毒”。因制作成本低廉、起效快、作用时间持久,滥用率逐年增长并趋向低龄化,是联合国精神药品公约明令管制的精神药物。METH成瘾已成为亟待解决的全球性问题。METH成瘾是一种反复服用METH而引起的慢性、复发性脑疾病,主要特点是强迫性觅药、强烈的渴求心理以及中断用药后出现戒断症状。长期使用会引起机体内神经元产生异常的代偿性适应,导致耐受、敏化、依赖及复吸等症状。中脑边缘多巴胺系统,即腹侧被盖区（Ventral Tegmental Area, VTA）及其投射区伏隔核（nucleus accumbens, NAc）、前额叶皮质（prefrontal cortex, PFC）等其他脑区共同构成的区域,与多数成瘾药物相关,是强迫觅药和复吸行为的重要的神经环路。该回路改变可产生强化效应、记忆、与渴求相关联的条件反应以及戒断症状中的恐惧、焦虑等情绪反应。另外,由VTA/NAc/Hippocampus构成的强化学习记忆回路的激活在METH成瘾及复吸中发挥重要作用。METH选择性地作用于这部分脑区,促进多巴胺（dopamine, DA）j释放,引起机体发生一系列的适应性变化。METH成瘾所涉及的信号通路主要有多巴胺D1受体介导的腺苷酸环化酶（adenylate cyclase, AC）及其下游环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate, cAMP）通路与多巴胺D2受体介导的phosphatidyl inositol3kinase, PI3K/Akt/Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3通路,在METH引起的神经元结构和功能适应性改变的过程中,cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein, CREB）, ΔFosB蛋白和细胞周期依赖蛋白激酶5（Cyclin-depdent kinase5, Cdk5）起到重要的调节作用,但确切的分子机制尚未阐明。METH成瘾及毒性机制与氧化应激相关。METH会引起脑内谷胱甘肽、过氧化氢酶等水平降低,脂质过氧化物和蛋白羰基的增加；引起DA、5-羟色胺等神经递质的氧化；许多与成瘾药物相关的分子（如：fos/Jun、钙调激酶、NF-κB和CREB等）对神经元内的氧化还原状态敏感。与药物成瘾引起的突触可塑性变化相关的长时程增强（long-term potentiation, LTP）也受机体的氧化还原状态的调节,进入胞内的METH通过破坏神经元氧化还原平衡,导致氧化应激,促使DNA、蛋白质等的损伤,从而加剧多巴胺能神经元凋亡。已有研究证实,抗氧化剂能缓解药物成瘾的发生。这些现象提示我们：维持机体氧化还原平衡可能干预METH成瘾。硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）是一种重要的氧化还原应答蛋白,具有高度保守的氧化还原活性位点：-Cys-Gly-Pro-Cys-（CGPC）。Trx、NADPH和硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductase, TrxR）组成的Trx还原系统,在维持细胞内的氧化还原平衡方面起重要调节作用,Trx具有多种生物活性,包括调节多种转录因子的活性,如激活蛋白1（activator protein-1, AP-1）、NF-κB、CREB等,促神经突触生长,调控细胞周期、抗凋亡、抗炎等。因此,我们认为Trx是中枢神经系统疾病预防或治疗的重要靶点。已有研究证明替普瑞酮（Geranylgeranylacetone, GGA）、神经妥乐和萝卜硫素等多种药物都可以诱导Trx-1的表达。本论文选择GGA作为Trx-1的诱导物,因为,GGA具有亲脂性,能够透过血脑屏障,更有效地作用于脑区;并且,已有研究报道：GGA具有保护神经免于帕金森病毒性物的损害作用；可以缓解吗啡引起的条件位置偏爱及戒断症状。基于METH成瘾及毒性作用机理与Trx-1的生物学功能,本论文提出三个假设：Trx-1参与了METH的作用过程,Trx-1诱导物GGA可以抵抗METH成瘾,Trx-1诱导物GGA可以抵抗METH引起的神经元凋亡以及肝脏肾脏损伤。本论文的研究结果如下：（1）明确Trx-1参与了METH作用过程。本论文采用多巴胺能神经元模型——大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（1at pheochromocytoma tumor cell line, PC12）作为研究细胞,首先,用浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0mM的METH刺激PC12细胞,通过MTT分析、LDH释放分析检测细胞存活率及损伤程度,结果发现,从2.0mM开始,METH抑制了PC12细胞的存活且引起细胞损伤。用1mM的METH刺激PC12细胞1、2、4、12、24h,通过蛋白免疫印迹（Western Blotting）检测Trx-1表达水平,结果发现,在METH作用1h的情况下,Trx-1表达水平显着升高,而从12h开始,Trx-1表达水平明显降低。由于1mM的METH作用PC12细胞1h未出现凋亡,此时Trx-1分子水平已经发生变化。因此,第二章后续实验均采用的METH的剂量为1mM,作用时间为1h。为了证明METH对Trx-1诱导的分子机制,本论文分别采用0.5mM的SQ22536（AC的抑制剂）、20μM的LY294002（P13K的抑制剂）、5mM Licl （GSK-3β的抑制剂）预刺激,结果发现,只有LY294002降低了METH诱导的Trx-1的表达,说明METH对Trx-1的诱导通过了PI3K通路,为了进一步验证这一结论,本论文检测了PI3K的下游分子Akt和GSK-3β的活性,即p-Akt和p-GSK-3β的表达水平,结果发现,二者均被激活,从而确定了METH是通过PI3K/Akt信号通路诱导Trx-1表达。CREB在METH作用过程中起重要作用,调节即可早期蛋白的表达,本论文发现1mM的METH作用PC12细胞1h引起了CREB活性升高,且升高的活性能够被LY294002预刺激所抑制,说明：METH激活CREB也是通过PI3K/Akt这条信号通路。为了进一步阐明Trx-1与METH作用的关系,本论文采用SiRNA的方法将Trx-1蛋白表达降低,并检测到CREB的活性也明显降低,说明Trx-1作为上游分子介导了CREB的激活。这些数据提示我们,Trx-1确实参与了METH的作用,且发挥了重要的调节作用。（2）Trx-1诱导物GGA能够抵抗METH成瘾。本论文采用METH成瘾小鼠模型作为研究材料,首先,通过METH慢性给药（2.5mg/kg,隔天腹腔注射,共8天）构建METH成瘾小鼠模型,通过条件性位置偏爱实验验证其构建成功,并检测了小鼠脑内VTA、NAc、PFC及海马区相关分子的变化,结果显示,METH慢性给药引起了VTA和NAc区ΔAFosB和细胞周期依赖蛋白激酶5（Cdk5）表达水平增加,Trx-1表达水平降低,CREB活性和热休克蛋白70（heat shock protein70, Hsp70）表达水平变化不显着；为了研究Trx-1诱导物GGA对METH成瘾的抵抗作用,本论文给予小鼠GGA预处理（800mg/kg/d,灌胃8天）,之后METH给药,行为检测结果发现,GGA能降低METH急性作用（2.5mg/kg,一次腹腔注射）所引起的小鼠行为能力的增强,抑制METH慢性给药（2.5mg/kg,隔天腹腔注射,共8天）引起的条件性位置偏爱的形成,条件性位置偏爱消退点燃以及行为敏化。METH成瘾患者伴有明显的消瘦,本论文证明了GGA预处理可以抑制METH慢性给药造成的体重降低；在分子水平上,GGA恢复了METH’慢性给药（2.5mg/kg,隔天腹腔注射,共8天）引起的VTA和NAc区ΔFosB和Cdk5表达的增加及Trx-1表达的降低；降低了METH条件性位置偏爱消退点燃后海马区Cdk5表达的增加。这些数据说明,GGA可以抵抗METH所致的位置偏爱及其消退点燃,行为敏化和运动能力增强,这种抵抗作用主要可能是GGA诱导Trx-1的高表达而实现的。（3） Trx-1诱导物GGA能够抵抗METH引起的神经元凋亡和肝脏、肾脏损伤。METH成瘾不仅涉及中枢神经系统的适应性改变,同时也是机体对药物毒性积累的过程,对METH成瘾患者的尸检报告显示,METH在大脑、肝脏、肾脏中积累最多,且造成的损伤最大,因此,本论文采用PC12细胞及METH成瘾模型小鼠的肝脏、肾脏为研究材料,首先,通过MTT分析检测到METH（2mM,24h）可引起PC12细胞存活率明显下降,且可以被GGA预刺激（10μM,提前30min）显着缓解。酪氨酸羟化酶是合成多巴胺过程中的限速酶,被认为是多巴胺能神经元活性的标志,为了进一步研究METH对PC12细胞的神经毒性,本论文还检测了TH的表达量,结果发现,METH （2mM,24h）引起了TH表达的降低,同样可以被GGA预刺激（10μM,提前30min）显着缓解。其次,检测了METH处理（2mM,24h）的PC12细胞pro-caspase酶的表达量,结果发现METH能够降低pro-caspase-9、pro-caspase-3,而对pro-caspase-12无明显作用,说明,METH处理激活了线粒体介导的细胞凋亡途径,而pro-caspase-9、pro-caspase-3的降低可以被GGA预刺激（10μM,提前30min）所缓解。同样,本论文还检测了METH慢性给药（2.5mg/kg,隔天腹腔注射,共8天）后小鼠肝、肾脏pro-caspase酶的表达量,与PC12细胞的结果相一致,GGA预处理（800mg/kg/d,灌胃8天）抑制了METH所致pro-caspase-9、pro-caspase-3的降低,而pro-caspase-12无明显变化。更重要的是,无论是PC12细胞还是METH成瘾模型小鼠的肝脏、肾脏,GGA预处理均能够逆转METH引起的Trx-1和Hsp70表达降低。以上数据说明,GGA可以抑制METH对PC12细胞及小鼠肝脏、肾脏的毒性作用,这种保护作用是通过对Trx-1和Hsp70的共诱导而实现的。综上所述,Trx-1与甲基苯丙胺导致的成瘾密切相关,硫氧还蛋白诱导物具有抵抗甲基苯丙胺成瘾的作用以及抵抗甲基苯丙胺毒性作用。
贺燕[8]（2013）在《钩藤碱对新生鼠原代海马神经元NR1和NR2B表达的影响》文中指出研究背景茜草科（Rubiaceae）钩藤植物是常用中药,被《中华人民共和国药典》2010年版收载,其中正品钩藤包括：钩藤Uncaria rhynchophylla （Miq） Miq. ex Havil.、大叶钩藤Uncaria macrophylla Wall.、毛钩藤Uncaria hirsute Havil.、华钩藤Uncaria sinensis （Oliv.） Havil.、无柄果钩藤Uncaria sessilifructus Roxb.。其药用历史可追溯到魏晋时期,《名医别录》、《本草纲目》、《药性论》等古籍均有记载。钩藤味甘,性凉,归肝、心包经,具有息风定惊、清热平肝的功效。主治肝风内动,惊痫抽搐,高热惊厥,感冒夹惊,小儿惊啼,妊娠子痫,头痛眩晕,多以复方入药。现代主要用于治疗原发性及继发性高血压、脑神经性疾病及脑血管疾病,还可用于治疗癫痫、老年期痴呆和防治药物依赖。钩藤碱（Rhynchophylline, Rhy）是钩藤中含量最高的吲哚类生物碱,占总生物碱的20-30%,其他生物碱还包括异钩藤碱、柯诺辛碱、柯诺辛碱B、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱及柯楠因碱等。现代药理研究表明钩藤碱主要作用于心血管和中枢神经系统,不仅在高血压、心律失常、心肌肥大、血栓等方面具有疗效；而且在脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、癫痫、惊厥、焦虑症、药物依赖方面也具有神经保护作用。其作用机制与抑制L-钙通道和钾通道,拮抗NMDA受体和AMPA受体,调节谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、内啡肽、5-羟色胺等中枢神经递质的代谢有关。NMDA受体是与Ca2+通道偶联的离子型兴奋性氨基酸受体。天然的NMDA受体由NRl、NR2和NR3三种亚基组成的异聚体。其中NR2又分为NR2A、NR2B、NR2C和NR2D4个亚型。NRl是基本的功能单位,NR2决定受体的性质,NR3在NMDA受体中主要发挥抑制作用。NMDA受体广泛分布于脑、脊髓和外周组织。NMDA受体拮抗剂分为竞争性和非竞争性拮抗剂两类。竞争性NMDA受体拮抗剂作用于兴奋性氨基酸的识别位点,如AP5、AP7、CPP等。非竞争性NMDA受体拮抗剂作用于离子通道,如MK-801、氯胺酮、PCP等。非选择性的NMDA受体拮抗剂存在严重的不良反应,包括拟精神病药作用和对运动功能的影响。NR2B选择性拮抗剂,如：艾芬地尔、依利罗地、氟哌啶醇、苯丙氨酯具有神经保护、抗惊厥、镇痛等作用。NMDA受体的激活可以触发长时程增强和长时程抑制,是大脑学习、记忆、认知、突触可塑性的生理机制。但是,NMDA受体的过度激活也可引发多种中枢神经系统疾病,如脑中风、帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症等。有文献报道,钩藤的水提物具有抗焦虑作用。本课题组前期进行的钩藤碱药效学实验表明,钩藤碱（60mg/kg）增加小鼠在5分钟内进入开臂次数和延长在开臂滞留的时间,增加10分钟内的穿箱次数和延长在明箱滞留的时间,证实钩藤碱确有抗焦虑的功效。但是,钩藤碱抗焦虑作用的机制仍未明确。前期研究发现钩藤碱抑制苯丙胺诱导的条件性位置偏爱大鼠杏仁核和伏核中NR2BmRNA和蛋白的表达,且钩藤碱本身无精神依赖作用。还发现钩藤碱抑制NMDA受体钙通道的激活,降低甲基苯丙胺引起的原代皮质神经元胞内的钙超载,具有神经保护作用,提示钩藤碱可能是NMDA受体抑制剂。我们推测,钩藤碱抗焦虑作用可能与NMDA受体有关。研究目的钩藤碱不仅在高血压、心律失常、心肌肥大、血栓等心血管方面具有疗效；而且在脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、癫痫、惊厥、焦虑症、药物依赖等神经系统方面具有保护作用。的钩藤碱药效学预实验证实,钩藤碱具有抗焦虑的作用,但机制尚未明确。药物依赖的药理学实验表明,钩藤碱可能是NMDA受体抑制剂。钩藤碱是否通过调节NMDA受体发挥抗焦虑效应是本文关注的重点。鉴于以上分析,在本课题组前期研究的基础上,本文以原代培养的新生鼠海马神经元为研究对象,从定位、定量、定性三个角度观察钩藤碱对NMDA受体NRl、NR2B亚基的影响。实验方法1.原代海马神经元模型的建立和鉴定：取24h内的SD新生鼠,急性处死,钝性分离左右海马,剥去脑膜,剪成粥糜状,用0.125%胰酶于37℃消化30min,终止消化后,轻轻吹打至组织块消失。所有操作在冰上进行。将细胞悬液过200目筛网,离心。种植培养基调整密度为5×105个/ml,按2ml/孔接种于6孔板中。37℃,5%C02孵箱中孵育。12h内换维持培养基,以后每4天半量换液。倒置显微镜下观察神经元的生长情况。神经元特异性烯醇化酶鉴定。在显微镜下观察,随机选取五个视野,计数每个视野中阳性细胞数,计算海马神经元平均纯度。2.NRl和NR2B亚基在神经元上的共定位表达：将原代的海马神经元以5×105个/ml的密度接种于预包被的小玻片上,待生长至第8天时,取形态良好的细胞用于后续的实验。用免疫荧光双标法对细胞进行染色,一抗为兔抗大鼠NR1和小鼠抗大鼠NR2B,二抗为FITC-羊抗兔和CY5-羊抗小鼠,DAPI染核。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。3.MTT法分别检测钩藤碱和MK-801的神经毒性：根据钩藤碱和MK-801的测试浓度,将生长至6天的原代神经元分为8组,即空白对照组、正常对照组、50μmol/L组、100μmol/L组、200μmol/L组、400μmol/L组、800gmol/L组、1000μmol/L组。以1×106个/ml的密度接种于预包被的96孔板内,每组6个复孔,每孔接种100μl,空白对照组不接种细胞,以100μl培养基替代。将1mmol/L钩藤碱和MK-801母液稀释成50μmol/L、100μtmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L,每孔加入相应浓度的含药维持培养基100μl,空白对照组和正常对照组每孔加入100μl新鲜的维持培养基。37℃、5%C02孵育48h。按照MTT实验步骤,分别检测钩藤碱和MK-801处理后神经元的活力,用酶标仪在490nm波长下测定光密度值,重复3次实验。所有数据以均数±标准差（x±s）表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）,以P<0.05为差异具有统计学意义。4.钩藤碱对NRl和NR2B mRNA表达的影响：将新生鼠原代海马神经元以1×106个/ml接种于预包被的6孔板内,6天后,将细胞分为正常对照组、MK-801200μmol/L组、钩藤碱100μmol/L组、钩藤碱200pmol/L组、钩藤碱400μmol/L组。将1mmol/L MK-801母液稀释成200μmol/L,1mmol/L钩藤碱母液分别稀释为100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L。正常对照组给予新鲜维持培养基2ml/孔,其余各组给予相应浓度的含药培养基2ml/孔,37℃、5%CO2分别孵育6h和48h。采用Real-time PCR技术检测各组NR1和NR2B mRNA的表达。每组3个复孔,重复3次实验。所有数据以x±s表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）,以P<0.05为差异具有统计学意义。5.钩藤碱对NRl和NR2B蛋白表达的影响：将新生鼠原代海马神经元以5×105个/ml接种于放有预包被小玻片的6孔板内,6天后,将细胞分为正常对照组、MK-801200μmol/L组、钩藤碱400μmol/L组,每组3个复孔。将1mmol/LMK-801母液稀释成200μmol/L,1mmol/L钩藤碱母液稀释为400μmol/L。正常对照组给予新鲜维持培养基2ml/孔,其余各组给予相应浓度的含药培养基2ml/孔,37℃、5%C02分别孵育48h。按照免疫荧光双标法的操作步骤,进行细胞染色。一抗为兔抗大鼠NR1和小鼠抗大鼠NR2B,二抗为FITC-羊抗兔和CY5-羊抗小鼠,DAPI染核。激光共聚焦显微镜下观察并拍照,拍照时保持每张片子的仪器参数一致。IPP5.1软件对细胞进行荧光强度分析,分别计算单个神经元FITC、CY5和DAPI的平均荧光强度。实验结果1.神经元形态观察、鉴定和纯度计算：神经元接种6-8d后,胞体较大,呈三角形、圆形或椭圆形,透光性强,周边有光晕。神经元突起增长增粗,交织成网状,细胞完全成熟,可用于实验。14d后,杂细胞增多,细胞慢慢老化。神经元特异性烯醇化酶鉴定细胞为阳性。经计算,神经元纯度最低值为85.9%,最高值为97.5%,平均纯度为（92.6±4.62）%。胰酶消化法结合无血清培养能成功建立原代海马神经元模型,6-8d的神经元形态和纯度均达到实验要求。2.NRl和NR2B在神经元上的共定位：NRl主要分布于神经元的轴突和树突干及近突起的胞质内和胞膜上；NR2B分布于胞体膜、轴突和树突膜上,在神经元的郎飞结和突触末端有高密度分布。NRl和NR2B在突触末端、树突干、树突棘共定位表达,表明NR1和NR2B可能与离子流动、神经冲动的传导、递质的调节有关。3.钩藤碱和MK-801的神经毒性：钩藤碱和MK-801的OD-C曲线均呈现“反S”形。钩藤碱400μmol/L以下处于平台期,对神经元的活力无影响；400-1000μmol/L处于斜线期,随着浓度的增大,钩藤碱的神经毒性也逐渐增大；大于1000μmol/L处于平台期,钩藤碱对神经毒性不随浓度增大而增大。MK-801在200μmol/L以下处于平台期,对神经元活力无影响：200～800μmol/L处于斜线期,MK-801的神经毒性随浓度增大而增大；大于800μmol/L处于平台期,MK-801的神经毒性不随浓度的增大而增大。钩藤碱各浓度OD值比MK-801高,表明钩藤碱毒性要比MK-801小。筛选出钩藤碱的安全实验浓度为100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L,MK-801的浓度为200μmol/L。4.钩藤碱对NR1和NR2B mRNA的表达：MK-801作用6h后,MK-801下调NRl和NR2B mRNA的表达；作用48h后,MK-801上调NRl和NR2BmRNA的表达。钩藤碱作用6h,钩藤碱低、中、高剂量组NR1mRNA增高,对NR2B mRNA表达没有影响：作用48h后,钩藤碱低、中、高剂量组上调NR1mRNA的表达,下调NR2B mRNA表达。MK-801对NRl和NR2B mRNA的表达随时间变化呈先降后升的趋势。钩藤碱对NR1mRNA的表达均呈现持续上升趋势,对NR2B mRNA的表达呈下降趋势。钩藤碱可能选择性抑制NR2B的表达。5.钩藤碱对NR1和NR2B蛋白表达的影响：药物处理48h后,与正常组相比,钩藤碱增强神经核周围的NRl蛋白表达,对胞膜上NRl影响不明显,降低树突上NR2B的膜表达;MK-801明显增强神经核周围NRl的蛋白表达,并呈点状分布,树突棘上NR2B表达增高。结论1.胰酶消化法结合无血清培养能获得纯度较高、稳定可靠的神经元模型。2.NR1分布于神经元轴突、树突干和突起端的胞质内和胞膜上,NR2B分布于神经细胞膜、轴突膜、树突膜上,在神经元的突触末端、树突棘和郎飞结有高密度分布。3.钩藤碱在低浓度下具有神经保护,最大安全浓度为400μmol/L,随着浓度的增加,细胞毒性增加,大于1000μmol/L,细胞活力降到最低值；MK-801在低浓度下对神经元无影响,最大安全浓度为200μmol/L,随着浓度的增加,细胞毒性增加,1000μmol/L细胞活力降到最低值。4.钩藤碱上调NR1mRNA的表达,具有浓度依赖性和时间依赖性；下调NR2B的mRNA表达,具有时间依赖性,但不具有浓度依赖性。钩藤碱对NR2B具有选择性抑制作用。5.钩藤碱上调神经细胞核周围NR1蛋白表达,下调树突干、树突棘和轴突上NR2B的蛋白表达,树突干、树突棘和突触末端膜上NR1/NR2B受体族数量减少,表明钩藤碱可能是一个选择性的非竞争性NMDA受体抑制剂。钩藤碱对NMDA受体的选择性抑制作用可能是其抗焦虑作用的机制之一。
韩文妍[9]（2012）在《内侧前额叶皮层和背侧海马在甲基苯丙胺诱导精神依赖性中作用机制及催产素抗成瘾作用研究》文中研究表明甲基苯丙胺（methamphetamine, MAP）所致精神依赖性是导致其滥用的重要原因,其对中脑皮层边缘系统的影响已受到广泛关注。催产素（oxytocin, OT）作为一种垂体神经肽已被证实参与多种药物成瘾的调节。本论文首先研究了MAP诱导精神依赖性模型——条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）各阶段小鼠内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）和背侧海马（dorsal hippocampus, DHC）内氨基酸类递质释放规律,继而以CPP模型为基础,分别对急性MAP、MAP诱导CPP表达和重现为对象探讨了中脑皮层边缘系统参与调节MAP引起的精神依赖性作用机制；并深入研究了OT在MAP引起的药物复吸模型中的拮抗作用与相关机制。本文首先构建了MAP诱导小鼠CPP模型,然后采用脑微透析技术结合高效液相荧光检测法,考察了CPP形成期、表达期、消退期和重现期内小鼠mPFC和DHC细胞外谷氨酸（glutamate, Glu）和Y-氨基丁酸（γ—minobutyric acid, GABA）释放规律。结果显示,MAP诱导的CPP可以显着升高mPFC细胞外的Glu水平。其中,在表达期Glu释放水平达到峰值,在消退期逐渐下降；当重现期再次给予低剂量MAP诱导偏爱重现时,发现Glu释放再次升高；DHC细胞外Glu水平在形成期显着升高,然后逐渐下降,到表达期时显着下降,在消退期时有所回升,再次给予低剂量MAP能够再次引起Glu水平下降。此外,在表达期内,mPFC和DHC内Glu/GABA比值分别显着升高和下降。提示,mPFC和DHC中谷氨酸能神经系统在MAP诱导精神依赖性行为学中产生神经适应性调节作用。其次,本文研究了兴奋性毒性物质海人藻酸（kainic acid, KA）或N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid, NMDA）损毁mPFC或DHC对MAP诱导CPP表达和重现的影响。结果显示,KA损毁mPFC能够显着抑制偏爱表达和低剂量MAP诱导的偏爱重现；NMDA损毁mPFC能够显着抑制偏爱表达；KA损毁DHC能够显着抑制偏爱表达,并且NMDA损毁DHC能够显着抑制低剂量MAP诱导的偏爱重现。进一步说明mPFC和DHC内谷氨酸能神经系统参与调节MAP诱导的精神依赖性,并且在CPP不同时期,不同类型谷氨酸受体发挥不同调节功能。本文根据以上研究结果的基础上继续探讨了单次给予MAP对自主活动的影响,并深入研究了mPFC和DHC之间的谷氨酸能联系。之后又在CPP表达基础上比较CPP不同消退方式的影响。为此,本文考察了KA或NMDA损毁mPFC和DHC对单次给予MAP引起小鼠自主活动增加的影响及机制。结果显示,KA或NMDA损毁mPFC均能显着增强MAP引起的小鼠自主活动增加；并且NMDA损毁DHC能够显着抑制MAP引起的mPFC细胞外Glu水平的升高,进一步降低GABA的水平,还能够引起PFC内囊泡谷氨酸转运体Ⅱ（VGLUT2）的显着增加。提示,DHC内NMDA受体参与MAP引起的自主活动增加小鼠mPFC内Glu和GABA的释放变化,并可能是通过囊泡谷氨酸转运体进行调节的。近年来关于线索诱发药物渴求与空间学习记忆的相关信号机制成为药物成瘾研究关注的热点之一。有证据表明在CPP表达后不同消退方式对MAP诱导CPP有不同影响。本文又进一步通过不连续CPP刺激成功建立了条件性线索诱发MAP渴求模型,并研究了侧脑室注射OT对该模型引起的PFC和海马内谷氨酸转运体GLT1、VGLUT2、谷氨酸受体NMDAR2B、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2（pERK1/2）、钙离子钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、磷酸化cAMP反应结合蛋白（pCREB）的表达变化的影响。研究表明,不连续CPP环境刺激能够显着诱发MAP渴求,与连续CPP消退相比,小鼠对伴药侧的偏爱程度下降缓慢,而且这种行为还能够显着增强小鼠空间巡航定位能力；能够显着增加PFC内GLT1、VGLUT2. pERK1/2和pCREB和抑制海马内VGLUT2、CaMKⅡ和pCREB的蛋白表达。侧脑室给予OT能够通过其受体显着抑制线索诱发MAP渴求行为,并且显着抑制渴求行为引起的PFC内GLT1、VGLUT2、pERK1/2和pCREB表达增加和海马内VGLUT2、CaMKⅡ和pCREB的蛋白表达降低。结果提示,不连续CPP刺激能够导致条件性线索诱发MAP渴求行为,并且能够增强空间学习记忆能力；侧脑室给予OT能够通过调节中脑皮层边缘系统内谷氨酸转运体和下游信号通路,以直接或间接调节兴奋性氨基酸在线索诱发MAP渴求行为中的作用。前期研究表明侧脑室注射OT能够显着抑制束缚应激诱导的CPP重现。本文继续考察了局部核团注射OT对束缚应激诱导MAP位置偏爱重现的影响。结果表明,mPFC注射OT能够显着抑制束缚应激诱导位置偏爱重现行为,该作用可被OT受体抑制剂阿托西班完全拮抗；同时OT能够通过其受体显着抑制偏爱重现引起的PFC内GLT1、VGLUT2、NR2B、CaMKII和pCREB表达增加；双侧DHC内注射OT能够显着抑制偏爱重现,该作用是通过OT受体抑制海马内VGLUT2. pERK1/2和pCREB表达降低实现的。提示,OT在中脑皮层边缘系统中对MAP引起的成瘾具有神经保护作用。综上所述,中脑皮层边缘系统中谷氨酸神经系统参与MAP诱导的精神依赖性,其中DHC参与调节mPFC内氨基酸释放过程。另外OT可以通过其受体调节谷氨酸能转运体和下游ERK-CREB和NR2B-CaMKⅡ-CREB信号通路,进而参与调节MAP精神依赖引起的行为学变化,并产生神经保护作用。本研究为深入探讨中脑皮层边缘系统中谷氨酸能神经系统在MAP诱导精神依赖性中的作用机制以及OT的潜在抗成瘾作用提供了实验依据。
仲维高[10]（2010）在《眼镜蛇细胞毒素CTXn、CTX1戒毒作用及其机制的实验研究》文中研究指明目的:探讨眼镜蛇毒细胞毒素有效组分CTXn、CTX1对抗吗啡依赖作用及机制。方法:（1）建立吗啡依赖CPP模型,观察眼镜蛇毒中分离粗毒细胞毒素Ⅳ低、中、高剂量对吗啡成瘾大鼠CPP影响,及对催促戒断行为学影响。（2）筛选: SD大鼠吗啡（10mg/kg,sc）训练8天,形成稳定CPP模型后,大鼠分为粗毒毒素Ⅳ各单体组分高剂量组、吗啡成瘾对照组及0.9%N.S组,实验组给予粗毒毒素Ⅳ不同组分1/10 LD50剂量,观察各组分对吗啡已形成CPP影响。（3）观察CTXn对吗啡CPP获得和维持影响。①建立吗啡依赖模型后,腹腔给予CTXn不同剂量（0.5、1.0、2.0mg/kg）连续5天,测试CPP及痛觉变化,大脑切片,免疫组化染色,观察TNF-α在齿状回表达;②SD大鼠在施吗啡前30分钟腹腔给予不同剂量CTXn（0.5、1.0、2.0mg/kg）,连续8天,观察CTXn预处理对吗啡CPP获得及镇痛影响;③SD大鼠腹腔注射不同剂量CTXn（0.5、1.0、2.0mg/kg）,连续18天,观察其自身是否引起CPP;④SD大鼠分别腹腔给予CTXn（1.0mg/kg）或鞘内给予CTXn（0.025mg/kg）,连续用药24天在d0、d2、d4、d6、d8、d10、d12、d14、d16、d18、d20、d22、d24测试大鼠痛阈,观察痛阈变化,同时在d0、d4、d8、d12、d16、d20、d24采用ELISA法检测血清抗体效价。（4）观察CTX1对吗啡CPP获得和维持影响。①建立吗啡依赖模型后,再腹腔给予不同剂量CTX1（0.1、0.2、0.4mg/kg）连续5天,测试CPP及痛觉变化,大脑切片,免疫组化染色,观察TNF-α在海马的表达;②SD大鼠在施吗啡前30分钟腹腔给予CTX1不同剂量（0.1、0.2、0.4mg/kg）,连续8天,观察CTX1预处理对吗啡CPP获得及镇痛影响、TNF-α的含量变化及其在CA区表达、LTP;③SD大鼠腹腔注射不同剂量CTX1（0.1、0.2、0.4mg/kg）,连续8天,观察其自身是否引起CPP;④SD大鼠分别腹腔给予CTX1（0.2mg/kg）组或鞘内给予CTX1（10μg/kg）,连续用药24天在d0、d2、d4、d6、d8、d10、d12、d14、d16、d18、d20、d22、d24测试大鼠痛阈,观察痛阈变化,在d0、d4、d8、d12、d16、d20、d24采用ELISA法检测血清抗体效价。结果:（1）吗啡可诱导大鼠产生明显CPP,眼镜蛇粗毒细胞毒素Ⅳ高、中、低剂量组自身均不能引起CPP;不同剂量粗毒细胞毒素Ⅳ可抑制吗啡已形成CPP,抑制纳洛酮诱导的戒断症状。（2）细胞毒素Ⅳ分离纯化得到5个组分,分别为:Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ4、Ⅳ5、Ⅳ7。其中组分Ⅳ4、Ⅳ5可抑制大鼠引起CPP;抑制纳洛酮诱发戒断症状,与组分Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ7不同,组分Ⅳ4、Ⅳ5组大鼠体重平均增长分别为:15.5%、17.1与生理盐水组增长相似,Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ7组大鼠体重平均增长为6.2%、4.9、8.8%与吗啡对照组相似。氨基酸序列测定组分Ⅳ4为CTXn,组分Ⅳ5为CTX1。CTXn序列:LKCNQ LIPPF YKTCA AGKNL CYKMF MVAAP KVPVK RGCID VCPKS SLLVK YVCCN TDRCN CTX1序列:LKCNK LIPIA SKTCP AGKNL CYKMF MMSDL TIPVK RGCID VCPKS NLLVK YVCCN TDRCN（3）CTXn对吗啡CPP获得和维持影响①大鼠吗啡成瘾后CTXn处理可剂量依赖性地抑制吗啡诱导CPP及痛敏。CTXn不同剂量组（0.5、1.0、2.0mg/kg）CPP值分别从成瘾时的451.8s±49.2s、450.8s±72.3s及450.7s±91.2s下降到164s±49.5s、77.4s±41.1s及68.2s±37.2s;大鼠痛阈值分别从成瘾时15.5s±1.6s、15.2s±3.2s及15.6s±2.3s,提高至22.4s±1.7s、27.5s±2.8s及28.6s±3.6s。②吗啡成瘾后,CTXn后处理可明显增加齿状回TNF-α表达,一定程度上恢复齿状回神经元数量。③CTXn预处理后,大鼠CPP值未见显着升高,可剂量依赖性抑制吗啡CPP获得。预处理呈剂量依赖性的增强镇痛作用。④CTXn自身不会产生CPP。CTXn腹腔用药后,血清CTXn抗体效价增高,镇痛效力下降;但CTXn鞘内给药未见CTXn抗体产生及镇痛耐受。（4）CTX1对吗啡CPP获得和维持影响:①大鼠吗啡成瘾后CTX1后处理可剂量依赖性地抑制吗啡诱导CPP维持及痛觉过敏。大鼠成瘾后,CTX1处理可明显增加海马CA区TNF-α表达。②CTX1预处理可剂量依赖性地抑制吗啡诱导CPP获得,镇痛作用呈剂量依赖性。CTX1可明显增加在血清中TNF-α含量及在海马CA区表达,解除吗啡对LTP的影响。③CTX1自身不会产生CPP。CTX1腹腔用药后,血清抗CTX1抗体效价逐渐增高,镇痛作用相应下降,但CTX1鞘内给药后未见抗体产生及镇痛耐受。结论:（1）细胞毒素Ⅳ中分离纯化的单体组分CTXn和CTX1剂量依赖性抑制吗啡诱导CPP获得及维持。（2）CTXn和CTX1自身没有成瘾性,二者可抑制吗啡诱导CPP获得,预防吗啡成瘾,有良好镇痛作用,可抑制吗啡痛敏,长期应用会产生抗体引起镇痛耐受导致镇痛效力降低,鞘内给药可避免。（3）CTXn促进TNF-α在海马齿状回表达、促进神经元恢复。CTX1可增加TNF-α的含量,促进TNF-α在中枢海马表达,影响吗啡成瘾大鼠LTP。（4）CTXn、CTX1对吗啡成瘾有较好抑制和预防作用。
二、7-硝基吲唑对甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱效应、CREB磷酸化和c-fos表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、7-硝基吲唑对甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱效应、CREB磷酸化和c-fos表达的影响（论文提纲范文）
（1）甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆细胞的发现及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 成瘾概述 |
| 2. 中脑皮层边缘奖赏环路与药物成瘾 |
| 3. 联合学习记忆理论与联合记忆细胞 |
| 4. 成瘾联合学习记忆细胞与甲基苯丙胺成瘾 |
| 第一章 伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆对成瘾行为的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 试剂及药物的配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 2. 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆增强甲基苯内胺诱发的自身给药行为的形成,增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药行为 |
| 3.2 在摄药量相同情况下,形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆直接增强形成期用药动机,对于药物和线索各自引起的反应具有双向的增强作用 |
| 第二章 视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习对成瘾行为的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 试剂和药物的配制 |
| 2. 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习直接增强药物单一刺激诱发的用药动机,促进甲基苯丙胺成瘾行为的形成 |
| 3.2 视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习减慢甲基苯胺成瘾的环境消退过程 |
| 第三章 用于成瘾联合学习记忆细胞标记的TET ON条件性基因表达系统验证 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 中英文缩略词表 |
| 参考文献 |
| 综述 甲基苯丙胺成瘾分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）Clk1缺失抑制甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Clk1缺失抑制甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 条件性位置偏爱(Conditioned place preference) |
| 1.5 旷场实验(Open-field test) |
| 1.6 细胞培养 |
| 1.7 蛋白免疫印记(Western blotting) |
| 1.8 免疫组织化学 |
| 1.9 siRNA转染 |
| 1.10 DAT泛素化 |
| 1.11 贴壁细胞膜蛋白提取(Thermo kit) |
| 1.12 组织膜蛋白提取 |
| 1.13 细胞病毒感染实验 |
| 2. 数据处理和统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 Clk1缺失抑制甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱 |
| 3.2 Clk1缺失抑制伏隔核(NAc)△FosB的表达 |
| 3.3 Clk1缺失抑制cAMP-CREB通路的激活 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 Clk1缺失通过增加铁离子外排抑制多巴胺转运体降解 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 细胞培养与细胞系的构建 |
| 1.5 动物组织ICP-MS样品制备 |
| 1.6 蛋白免疫印记(Western blotting) |
| 1.7 总RNA的提取及实时荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 1.8 细胞免疫荧光染色 |
| 2. 数据处理和统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 Clk1~(+/-)突变型小鼠纹状体、海马及前额叶皮层的Clk1表白均有显着降低 |
| 3.2 Clk1~(+/-)-缺失增加DAT表达 |
| 3.3 Clk1缺失抑制DAT降解而非促进合成 |
| 3.4 Clk1缺失下调铁离子浓度 |
| 3.5 DFO时间依赖性的上调DAT及HIF-1α |
| 3.6 Clk1缺失诱导的铁离子浓度降低在DAT表达升高中发挥重要作用 |
| 3.7 Clk1~(+/-)突变型小鼠纹状体及海马铁离子浓度下调 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 综述 |
| 毒品滥用的社会学思考——毒品对人类及社会的严重危害 |
| 参考文献 |
| 参与甲基苯丙胺成瘾以及神经毒性的研宄进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间出版或公开发表的论着、论文 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 致谢 |
（3）伏隔核PKMζ在吗啡成瘾中的作用（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂与溶液配方 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.条件位置性偏爱(conditioned place preference,CPP) |
| 2.1 吗啡成瘾模型的建立 |
| 2.2 吗啡成瘾消退组模型的建立 |
| 2.3 CPP重现组模型的建立 |
| 3.Western-blot检测方法 |
| 3.1 检测吗啡成瘾大鼠伏隔核PKMζ的表达变化 |
| 3.2 检测吗啡成瘾大鼠伏隔核组蛋白H3 乙酰化水平 |
| 4.脑立体定位及微量注射 |
| 4.1 伏隔核脑立体定位手术 |
| 4.2 伏隔核微量注射 |
| 5.伏隔核脑片灌流给药 |
| 5.1 伏隔核脑片的制备 |
| 5.2 伏隔核脑片灌流给药 |
| 6.图像处理 |
| 7.统计分析 |
| 结果 |
| 1.吗啡条件性位置偏爱大鼠模型的建立 |
| 2.吗啡成瘾对大鼠探究行为的影响 |
| 3.吗啡成瘾大鼠伏隔核PKMζ的表达和活性增强 |
| 4.PKMζ特异性抑制剂 ZIP 对大鼠吗啡成瘾记忆的抑制作用 |
| 4.1 ZIP促进大鼠吗啡条件性位置偏爱效应的消退 |
| 4.2 ZIP对大鼠吗啡成瘾记忆的表达有抑制作用 |
| 5.ZIP对大鼠吗啡条件性位置偏爱效应消退后重建有抑制作用 |
| 6.吗啡成瘾大鼠伏隔核组蛋白 H3K9 的乙酰化水平升高 |
| 7.HDAC抑制剂使吗啡成瘾大鼠伏隔核 PKMζ 表达增高 |
| 讨论 |
| 1.吗啡条件性位置偏爱大鼠模型 |
| 2.PKMζ在成瘾记忆中的重要作用 |
| 3.伏隔核组蛋白H3乙酰化参与成瘾记忆的形成 |
| 4.成瘾过程中组蛋白乙酰化修饰增强促进 PKMζ 的转录翻译 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）组蛋白修饰对甲基苯丙胺诱发的行为敏化的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 药物成瘾的危害及早期研究 |
| 2. 表观遗传在药物成瘾中发挥的重要作用 |
| 3. 国内外甲基苯丙胺表观遗传研究现状 |
| 4. 研究目的和意义 |
| 一、甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 形成期、表达期给药剂量筛选 |
| 2.2 建立行为敏化模型 |
| 3.讨论 |
| 二、mRNA 和组蛋白修饰的差异筛选 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 差异表达 mRNA 的筛选 |
| 2.2 组蛋白修饰谱芯片 |
| 2.3 两类芯片综合分析 |
| 3.讨论 |
| 三、转录上游分析 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 甲基苯丙胺急性给药后 HAT、HDAC mRNA 和活性的变化 |
| 2.2 甲基苯丙胺行为敏化形成期 HAT、HDAC mRNA 和活性变化 |
| 2.3 甲基苯丙胺行为敏化转化期 HAT、HDAC mRNA 和活性变化 |
| 2.4 甲基苯丙胺行为敏化表达期 HAT、HDAC mRNA 和活性变化 |
| 3.讨论 |
| 四、候选分子验证及 Pou3f2 等基因在甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型中转录和转录前的动态变化 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 mRNA 差异表达分子及组蛋白乙酰化差异变化的验证 |
| 2.2 候选分子 mRNA 表达和组蛋白乙酰化修饰在甲基苯丙胺诱发的行为敏化模型中的动态变化 |
| 3.讨论 |
| 五、Pou3f2 与甲基苯丙胺诱发行为敏化的相关性 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 质粒、克隆、菌株和细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 确定 RNA 干涉序列 |
| 2.2 下调 PFC 内 Pou3f2 对甲基苯丙胺诱发行为敏化的影响 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 论着 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）斑马鱼药物依赖模型与啮齿类动物模型的比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 甲基苯丙胺危害及研究不足 |
| 1.2 甲基苯丙胺药物依赖的神经生物学机制研究进展 |
| 1.3 啮齿类动物模型研究进展 |
| 1.4 斑马鱼动物模型研究现状 |
| 1.5 甲基苯丙胺药物依赖的干预研究进展 |
| 1.6 本研究的研究目的和意义 |
| 第二章 小鼠位置偏爱模型的复制及钩藤碱的干预 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 第三章 成年斑马鱼位置偏爱模型的复制及钩藤碱干预 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 第四章 斑马鱼药物依赖模型与啮齿类动物模型的结果比较及相关性分析 |
| 4.1 CPP实验结果比较及相关性分析 |
| 4.2 TH实验结果比较及相关性分析 |
| 4.3 NR2B实验结果比较及相关性分析 |
| 4.4 GLUR1实验结果比较及相关性分析 |
| 第五章 全文讨论 |
| 结论 |
| 本课题创新之处 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（6）调节一氧化氮信号通路对成瘾药物诱发条件化活动的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 2. 研究现状 |
| 2.1 成瘾药物诱发的条件化活动 |
| 2.1.1 成瘾药物诱发条件性位置偏爱 |
| 2.1.2 成瘾药物诱发条件性自发活动 |
| 2.2 NO 的生物学效应 |
| 2.2.1 NO 在中枢神经系统中的作用 |
| 2.2.2 NO 与学习记忆 |
| 2.2.3 NO-cGMP 与学习记忆 |
| 2.2.4 NO 信号通路在药物奖赏中的作用 |
| 2.3 NO 供体与抑制剂 |
| 2.3.1 NO 供体 |
| 2.3.2 NO 抑制剂 |
| 2.4 岛叶与学习记忆 |
| 2.4.1 岛叶功能概述 |
| 2.4.2 学习记忆及其分类 |
| 2.4.3 学习记忆的相关脑区 |
| 2.4.4 学习记忆环路及可能机制 |
| 3. 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验药品及试剂 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.2.1 实验分组设计 |
| 3.2.2 药品的配制、选用剂量及给药方法 |
| 3.2.3 可卡因条件性自发活动实验 |
| 3.2.4 岛叶立体定位微注射方法 |
| 3.2.5 吗啡条件性位置偏爱实验 |
| 3.3 数据统计与分析 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 NO 信号通路对可卡因诱导的条件性自发活动的影响 |
| 4.1.1 不同训练方式对小鼠 CL 的影响 |
| 4.1.2 单次注射 NO 供体或抑制剂对小鼠 CL 的影响 |
| 4.1.3 联合注射 NO 供体和抑制剂对小鼠 CL 的影响 |
| 4.2 岛叶 NO 信号通路对吗啡诱导的条件性位置偏爱的影响 |
| 4.2.1 岛叶单次微注射 NO 供体或抑制剂对大鼠 CPP 的影响 |
| 4.2.2 岛叶联合微注射 NO 供体和抑制剂对大鼠 CPP 的影响 |
| 4.3 大鼠岛叶组织学鉴定 |
| 5. 分析与讨论 |
| 5.1 NO 抑制剂及供体对成瘾药物诱发的条件化活动的影响 |
| 5.2 联合注射 NO 抑制剂与供体对成瘾药物诱发的条件化活动的影响 |
| 5.3 岛叶在学习记忆中的作用 |
| 5.4 成瘾药物可诱发强烈的奖赏记忆 |
| 5.5 NO 参与学习记忆的可能机制 |
| 5.6 小结 |
| 6. 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士（硕士）期间发表的论文及所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）硫氧还蛋白及其诱导物在甲基苯丙胺成瘾中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略语索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甲基苯丙胺成瘾 |
| 1.1.1 简介 |
| 1.1.2 甲基苯丙胺成瘾与中脑边缘多巴胺系统 |
| 1.1.3 甲基苯丙胺成瘾及其相关受体 |
| 1.1.4 与甲基苯丙胺成瘾有关的调节分子 |
| 1.1.5 甲基苯丙胺与氧化应激 |
| 1.2 硫氧还蛋白 |
| 1.2.1 简介 |
| 1.2.2 硫氧还蛋白的分布、分类及亚细胞定位 |
| 1.2.3 硫氧还蛋白的生物学活性 |
| 1.2.5 硫氧还蛋白与神经系统疾病 |
| 1.3 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 硫氧还蛋白参与甲基苯丙胺作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方案 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验药物 |
| 2.3.3 实验试剂 |
| 2.3.4 实验仪器 |
| 2.3.5 实验试剂配方 |
| 2.3.6 实验方法 |
| 2.3.7 数据统计学处理 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 METH诱导细胞凋亡 |
| 2.4.2 METH对Trx-1表达随时间变化的影响 |
| 2.4.3 METH诱导Trx-1表达的分子机制 |
| 2.4.4 METH激活了PI3K/Akt/GSK-3β信号通路 |
| 2.4.5 METH对CREB活性的影响及其机制 |
| 2.4.6 METH对PC12细胞作用中p-CREB与Trx-1的关系 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 替普瑞酮对甲基苯丙胺成瘾的抵抗作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方案 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 实验药物 |
| 3.3.3 实验试剂 |
| 3.3.4 实验仪器 |
| 3.3.5 实验试剂配方 |
| 3.3.6 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 METH成瘾小鼠模型的构建 |
| 3.4.2 METH给药对小鼠大脑内CREB活性的影响 |
| 3.4.3 METH给药对小鼠大脑内△FosB表达水平的影响 |
| 3.4.4 METH给药对小鼠大脑内Cdk5表达水平的影响 |
| 3.4.5 METH给药对小鼠大脑内Trx-1表达水平的影响 |
| 3.4.6 METH给药对小鼠大脑内Hsp70表达水平的影响 |
| 3.4.7 GGA缓解METH急性作用引起的小鼠自主活动增强 |
| 3.4.8 GGA抑制METH引起的条件性位置偏爱 |
| 3.4.9 GGA缓解METH引起的小鼠体重降低 |
| 3.4.10 GGA预处理对METH给药小鼠大脑内△FosB表达水平增加的影响 |
| 3.4.11 GGA预处理对METH给药小鼠大脑内Cdk5表达水平增加的影响 |
| 3.4.12 GGA预处理对METH给药小鼠大脑内Trx-1表达水平降低的影响 |
| 3.4.13 GGA抑制METH给药引起的小鼠条件性位置偏爱的消退点燃 |
| 3.4.14 GGA缓解METH给药引起的小鼠行为敏化 |
| 3.4.15 GGA缓解METH给药引起的小鼠体重降低 |
| 3.4.16 GGA对METH成瘾小鼠条件性位置偏爱消退点燃后的△FosB、Cdk5和Trx-1表达水平的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 替普瑞酮对甲基苯丙胺毒性的抵抗作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方案 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验药物 |
| 4.3.3 实验试剂 |
| 4.3.4 实验仪器 |
| 4.3.5 实验试剂配方 |
| 4.3.6 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 GGA缓解METH引起的PC12细胞存活率的降低 |
| 4.4.2 GGA缓解METH引起的TH表达降低 |
| 4.4.3 GGA通过抑制线粒体介导的凋亡途径缓解METH引起的PC12细胞毒性 |
| 4.4.4 GGA缓解METH引起PC12细胞Trx-1和Hsp70表达的下调 |
| 4.4.5 GGA通过抑制线粒体介导的凋亡途径缓解METH引起的小鼠肝肾损伤 |
| 4.4.6 GGA缓解METH引起的成瘾小鼠肝、肾脏Trx-1和Hsp70表达的下调 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 全文总结及展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
（8）钩藤碱对新生鼠原代海马神经元NR1和NR2B表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 原代神经元模型的建立和鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂配制 |
| 2.2.2 实验前准备 |
| 2.2.3 神经元培养 |
| 2.2.4 神经元鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 不同时间细胞形态观察 |
| 2.3.2 神经元鉴定和纯度 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 NR1和NR2B亚基共定位 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 钩藤碱和MK-801对神经元活性的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 主要试剂配制 |
| 4.2.2 细胞种植及分组 |
| 4.2.3 MTT法检测钩藤碱和MK-801的神经毒作用 |
| 4.2.4 数据处理和统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 钩藤碱对NR1和NR2B mRNA和蛋白表达的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验试剂配制 |
| 5.2.2 Real-time PCR法检测NRl和NR2B mRNA的表达 |
| 5.2.3 免疫荧光双标法检测NR1/NR2B的表达 |
| 5.2.4 数据处理与统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 钩藤碱对NR1 mRNA表达的影响 |
| 5.3.2 钩藤碱对神经元NR2B mRNA表达的影响 |
| 5.3.3 钩藤碱对NR1和NR2B蛋白表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 全文讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 成果 |
| 致谢 |
（9）内侧前额叶皮层和背侧海马在甲基苯丙胺诱导精神依赖性中作用机制及催产素抗成瘾作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 甲基苯丙胺诱导条件性位置偏爱小鼠内侧前额叶皮层和背侧海马内细胞外谷氨酸含量变化影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 1. MAP诱导小鼠CPP模型 |
| 2. 脑微透析手术方法 |
| 3. 脑微透析灌流方法 |
| 4. 小鼠脑内兴奋性损毁 |
| 5. 组织学检查 |
| 6. 统计学处理 |
| 实验结果 |
| 1. MAP诱导小鼠CPP模型建立结果 |
| 2. MAP诱导小鼠CPP模型消退期及重现期结果 |
| 3. MAP诱导CPP各阶段小鼠mPFC细胞外氨基酸水平变化影响 |
| 4. MAP诱导CPP各阶段小鼠DHC细胞外氨基酸水平变化影响 |
| 5. MAP诱导CPP小鼠mPFC和DHC细胞外Glu变化规律 |
| 6. KA和NMDA损毁mPFC和DHC对MAP诱导CPP表达和重现影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 KA和NMDA损毁小鼠内侧前额叶皮层和背侧海马对甲基苯丙胺引起自主活动增加和递质变化的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 1. 兴奋性毒性氨基酸损毁方法 |
| 2. 小鼠自主活动检测方法 |
| 3. 透析探头的制作与埋植 |
| 4. 脑微透析灌流方法 |
| 5. 免疫印迹实验方法 |
| 6. 组织学检查 |
| 7. 统计方法 |
| 实验结果 |
| 1. KA或NMDA损毁mPFC和DHC对MAP引起小鼠自主活动增加的影响 |
| 2. KA或NMDA损毁DHC对单次给予MAP引起小鼠mPFC内细胞外Glu和GABA水平影响 |
| 3. KA或NMDA损毁mPFC对单次给予MAP引起小鼠mPFC内细胞外Glu和GABA水平影响 |
| 4. KA或NMDA损毁mPFC和DHC对海马和前皮层内VGLUT2的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 侧脑室注射催产素对线索诱发甲基苯丙胺渴求和对甲基苯丙胺引起背侧海马内神经递质水平变化的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 1. 条件性线索诱发MAP渴求 |
| 2. Morris水迷宫 |
| 3. 侧脑室给药导管的制作和埋管方法 |
| 4. 脑微透析管制作和埋植 |
| 5. western blotting免疫印迹法 |
| 6. 组织学检查 |
| 7. 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1. 不同消退方法对MAP诱导CPP表达小鼠药物渴求行为的影响 |
| 2. 线索诱发药物渴求对空间学习记忆的影响 |
| 3. VGLUT2和CREB在表达期当天和线索诱发MAP渴求当天蛋白表达结果 |
| 4. OT对线索诱发药物渴求的影响 |
| 5. OT(0.5和2.5 μg/μl)对线索诱发药物渴求测试后1h PFC和海马内GLT1、VGLUT2、NR2B、ERK1/2、CaMKII和CREB表达的影响 |
| 6. 侧脑室注射2.5 μg/μlOT对单次给予MAP引起细胞外DHC中Glu含量的影响 |
| 7. 侧脑室注射2.5 μg/μlOT对单次给予MAP引起细胞外DHC中GABA含量的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 局部注射催产素对束缚应激诱发条件性位置偏爱重现行为和蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 1. 双侧mPFC和DHC局部给药导管制作和埋管方法 |
| 2. OT对束缚应激诱导CPP重现的影响 |
| 3. Western blotting实验方法 |
| 4. 组织学检查 |
| 5. 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1. 束缚应激诱导小鼠甲基苯丙胺诱导的CPP重现模型 |
| 2. mPFC和DHC内注射OT对束缚应激诱发CPP重现的影响 |
| 3. 双侧mPFC注射OT对束缚应激引起CPP重现1h后PFC和海马内GLT1、VGLUT2、NR2B、ERK1/2、CaMKII和CREB表达的影响 |
| 4. 双侧DHC注射OT对束缚应激引起CPP重现1h后PFC和海马内GLT1、VGLUT2、NR2B、ERK1/2、CaMKII和CREB表达的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 个人简介 |
| 在读期间发表文章 |
（10）眼镜蛇细胞毒素CTXn、CTX1戒毒作用及其机制的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 眼镜蛇粗毒细胞毒素Ⅳ戒毒作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 筛选眼镜蛇毒细胞毒素Ⅳ中有效戒毒成分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CTX n 抑制吗啡CPP 获得和维持实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CTX1 抑制吗啡CPP 获得及维持实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新及意义 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文及申报的专利 |
| 致谢 |
四、7-硝基吲唑对甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱效应、CREB磷酸化和c-fos表达的影响（论文参考文献）
- [1]甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆细胞的发现及机制研究[D]. 王采玲. 南京中医药大学, 2020(01)
- [2]Clk1缺失抑制甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱及其机制研究[D]. 任兆翔. 苏州大学, 2018(01)
- [3]伏隔核PKMζ在吗啡成瘾中的作用[D]. 赖莉丽. 福建医科大学, 2017(04)
- [4]组蛋白修饰对甲基苯丙胺诱发的行为敏化的影响[D]. 李辉. 中国人民解放军军事医学科学院, 2014(01)
- [5]斑马鱼药物依赖模型与啮齿类动物模型的比较研究[D]. 刘伟. 南方医科大学, 2014(01)
- [6]调节一氧化氮信号通路对成瘾药物诱发条件化活动的影响[D]. 马鹏. 中北大学, 2013(10)
- [7]硫氧还蛋白及其诱导物在甲基苯丙胺成瘾中的作用研究[D]. 吕涛. 昆明理工大学, 2013(06)
- [8]钩藤碱对新生鼠原代海马神经元NR1和NR2B表达的影响[D]. 贺燕. 南方医科大学, 2013(03)
- [9]内侧前额叶皮层和背侧海马在甲基苯丙胺诱导精神依赖性中作用机制及催产素抗成瘾作用研究[D]. 韩文妍. 沈阳药科大学, 2012(01)
- [10]眼镜蛇细胞毒素CTXn、CTX1戒毒作用及其机制的实验研究[D]. 仲维高. 广州医学院, 2010(08)