一、大鼠脑缺血预处理对额叶神经细胞凋亡和P~(53)蛋白表达的影响（论文文献综述）
陈嘉希[1]（2020）在《丹酚酸B预处理对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用研究》文中进行了进一步梳理目的:观察丹酚酸B预处理对肠缺血再灌注大鼠的保护作用,并对其作用机制进行初步研究。方法:本次实验设置了阴性对照组和模型组,丹酚酸B给药组也设置相应的对照组和模型组,每组中随机配备雄性SD大鼠12只,通过夹闭肠系膜上动脉,制造肠道缺血,时间维持60min,随后再灌注24h从而得到实验所需的肠缺血再灌注模型。测定各组大鼠血清中的CAT、SOD、GSH、MDA含量,测定各组大鼠回肠组织中CAT、SOD、GSH、MDA以及TNF-α、IL-1β、IL-6等因子的含量;检测其髓过氧化物酶（MPO）活性、NF-κB p65水平;肠粘膜通透性的测定运用异硫氰酸荧光素（FITC）结合葡聚糖的方法。取1cm回肠组织的进行HE染色,观察对应切片的病理学变化,并进行Chiu’s评分;分析TNF-α、IL-1β、IL-6的含量与NF-κB p65的表达是否存在相关性;分析TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65水平与Chiu’s评分是否存在相关性。此外,还将采用RT-PCR法和Western Blot法测定各组大鼠回肠组织PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的m RNA表达以及蛋白水平。结果:1.模型组大鼠血清中MDA水平较阴性对照组明显升高,抗氧化剂SOD、CAT、GSH的含量则显着降低（P<0.01）。与模型组进行比较,丹酚酸B+模型组大鼠血清中的MDA含量显着降低,而抗氧化剂SOD、CAT、GSH的含量则有所升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.相较于阴性对照组,模型组大鼠回肠组织中MDA的含量明显升高,而抗氧化剂SOD、CAT和GSH均表现出明显下降的趋势,差异具备统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,丹酚酸B+模型组大鼠回肠组织中MDA水平大幅下降,而抗氧化剂SOD、CAT和GSH均呈现大幅升高,差异明显（P<0.01）。3.与阴性对照组比较,模型组大鼠回肠组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均大幅增加（P<0.01）。而丹酚酸B+模型组相较于模型组,上述指标含量均明显降低,差异具备统计学意义（P<0.01）。4.与阴性对照组比较,模型组大鼠回肠组织匀浆的MPO和NF-κB p65水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。相较于模型组,丹酚酸B+模型组大鼠的MPO水平和NF-κB p65降低,差异极显着（P<0.01）。5.与阴性对照组比较,模型组大鼠血清中的FITC-葡聚糖含量大幅增加,其粘膜通透性升高。相较于模型组,丹酚酸B+模型组大鼠血浆中的FITC-葡聚糖的含量减少,肠黏膜通透性降低,差异极显着（P<0.01）。6.与阴性对照组比较,模型组中大鼠肠道粘膜受损严重,毛细血管破裂,导致腺体功能受损,并可发现中性粒细胞浸润现象,Chiu’s的评分明显增加（P<0.01）;相较于模型组,丹酚酸B+模型组大鼠肠道黏膜轻微损伤,Chiu’s评分降低,差异极显着（P<0.01）。7.以回肠组织内IL-1β、IL-6、TNF-α含量与NF-κB p65水平的为指标,在大鼠肠缺血再灌注损伤过程中,分析二者的相关性发现呈显着的正相关,对应的相关系数依次为0.932、0.949、0.937（P<0.01）;肠缺血再灌注大鼠回肠组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB p65含量与回肠组织的Chui’s评分均呈显着正相关,相关系数分别为0.901、0.884、0.873、0.898（P<0.01）。8.与阴性对照组比较,模型组大鼠回肠组织中PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的m RNA表达降低,差异极显着（P<0.01）;对比模型组大鼠,丹酚酸B+模型组回肠组织中的PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的m RNA表达明显升高（P<0.01）。9.将模型组大鼠与阴性对照组比较可以发现,模型组大鼠回肠组织中PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组大鼠进行对比,丹酚酸B+模型组回肠组织中的PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的蛋白水平显着升高,差异显着（P<0.01）。结论:1.丹酚酸B能够有效降低缺血再灌注对机体造成的损伤,作用机理涉及抑制氧化反应、改善肠粘膜的通透性和抑制炎症反应。2.丹酚酸B可能通过对NF-κB信号通路的调节,从而发挥其对IL-1β、IL-6、TNF-α表达的抑制作用。3.丹酚酸B可能通过调节PI3K/Akt信号通路,从而减轻、改善肠道缺血再灌注损伤。
高胤桐[2]（2020）在《头穴丛刺预处理对急性脑缺血大鼠神经功能及脑组织MAG表达的影响》文中进行了进一步梳理目的观察头穴丛刺法预处理及头穴丛刺法对MCAO大鼠不同时间窗神经功能及MAG蛋白表达的影响,从行为学及蛋白角度分析头穴丛刺法及头穴丛刺预处理防治急性脑梗死的可能机制。方法将72只SD大鼠随机分为假手术组（A组）、模型组（B组）、头穴丛刺法组（C组）、头穴丛刺预处理组（D组）,每组18只,各组再按取材时间窗分为24h、3d、7d三个亚组,每个亚组6只。其中B组、C组、D组采用改良线栓法对SD大鼠进行大脑中动脉梗阻模型制备,对A组SD大鼠进行假手术。C组在造模后至取材前采用头穴丛刺法进行干预,D组在造模前7天进行头穴丛刺法预处理干预,A组、B组不予手术外治疗性干预。各组大鼠分别于术后4h以及24h、3d、7d取材前,进行Zea-Longa神经功能评分;随后分别在24h、3d、7d三个时间窗对大鼠梗死半球海马组织进行取材并利用Western blot技术对取材部分MAG蛋白含量进行检测分析,从而观察头穴丛刺法预处理及头穴丛刺法对MCAO大鼠不同时间窗神经功能评分及海马组织中MAG蛋白表达的影响,探讨头穴丛刺法防治脑缺血可能的机制。结果1.神经功能评分组间比较:对各组大鼠在术后4h,进行第一次Zea-Longa神经功能评分:与假手术组（A组）相比较,模型组（B组）、头穴丛刺法组（C组）、头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分均显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组（B组）相比较,头穴丛刺法组（C组）神经功能评分无明显差异（P>0.05）;头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分显着降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。与头穴丛刺法组（C组）相比较,头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分显着降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。对各组大鼠在24h、3d、7d时间窗取材前,进行第二次Zea-Longa神经功能评分:（1）24h、3d、7d时间窗中:与假手术组（A组）相比较,模型组（B组）、头穴丛刺法组（C组）、头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分均显着升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。（2）24h时间窗中:与模型组（B组）相比较,头穴丛刺法组（C组）神经功能评分无明显差异（P>0.05）;头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。与头穴丛刺法组（C组）相比较,头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。（3）3d时间窗中:与模型组（B组）相比较,头穴丛刺法组（C组）、头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分差异均无统计学意义（P>0.05）。与头穴丛刺法组（C组）相比较,头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。（4）7d时间窗中:与模型组（B组）相比较,头穴丛刺法组（C组）神经功能评分显着降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。与头穴丛刺法组（C组）相比较,头穴丛刺预处理组（D组）神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。组内比较:头穴丛刺法组（C组）中:与24h时间窗相比较,3d、7d时间窗神经功能评分差异均无统计学意义（P>0.05）。头穴丛刺预处理组（D组）中:与24h时间窗相比较,3d、7d时间窗神经功能评分差异均无统计学意义（P>0.05）。2.MAG蛋白的表达组间比较:（1）在24h时间窗:与假手术组（A组）相比较,模型组（B组）MAG蛋白表达水平上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;头穴丛刺法组（C组）MAG蛋白表达水平显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）;头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）。与模型组（B组）相比较,头穴丛刺法组（C组）MAG蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）;头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。与头穴丛刺法组（C组）相比较,头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平显着下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。（2）在3d时间窗:与假手术组（A组）相比较,模型组（B组）MAG蛋白表达水平上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;头穴丛刺法组（C组）、头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组（B组）相比较,头穴丛刺法组（C组）、头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。与头穴丛刺法组（C组）相比较,头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）。（3）在7d时间窗:与假手术组（A组）相比较,模型组（B组）MAG蛋白表达水平上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;头穴丛刺法组（C组）、头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组（B组）相比较,头穴丛刺法组（C组）MAG蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。与头穴丛刺法组（C组）相比较,头穴丛刺预处理组（D组）MAG蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。组内比较:头穴丛刺法组（C组）3d时间窗与24h时间窗相比较,MAG蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;7d时间窗与24h时间窗相比较,MAG蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;7d时间窗与3d时间窗相比较,MAG蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。其余各组MAG蛋白表达水平在各时间窗差异均无统计学意义（P>0.05）。结论1.头穴丛刺可显着降低MCAO大鼠神经功能评分,促进神经功能恢复,改善大鼠运动障碍。2.头穴丛刺预处理可抑制MCAO大鼠神经功能评分的升高,降低神经功能损伤,发挥预防保护作用。3.脑缺血后MAG蛋白表达明显上升,头穴丛刺干预可下调MAG蛋白的表达,从而促进轴突再生,促进神经功能的恢复。4.头穴丛刺预处理可下调脑缺血早期MAG蛋白的表达,提高缺血耐受能力,减轻神经损伤。
张宝瑜[3]（2020）在《基于GluN2B/m-Calpain/p38 MAPK路径研究电针预处理对脑缺血再灌注大鼠的神经保护机制》文中提出目的:以SD大鼠实验性大脑中动脉梗死再灌注为损伤模型,基于谷氨酸诱导神经元兴奋毒性损伤的分子生物学路径,探讨电针预处理脑保护作用的机制,为针刺防治脑血管病提供依据。方法:构建SD大鼠MCAO/R大脑中动脉梗死再灌注模型,大脑中动脉梗阻缺血90min后恢复灌注。分为假手术组、模型组、电针预处理组进行比较。末次干预后2h进行造模,造模后24h通过Garcia行为学评分评价大鼠神经运动机能、TTC染色评价脑梗死体积以及TUNEL阳性神经细胞染色计数评价各组脑细胞的保护效应。通过液相色谱-质谱联用技术测定胞外谷氨酸浓度。通过Western Blot和免疫荧光双标染色观察海马GluN2B、m-Calpain、p38 MAPK蛋白表达情况。结果:1.大鼠脑缺血再灌注损伤后,Garcia神经行为学评分显着降低（P<0.001）,电针预处理能显着改善大鼠脑缺血再灌注损伤的神经行为学表现（P<0.01）。TTC染色提示缺血再灌注损伤后,大鼠大脑出现明显的梗死灶（P<0.001）,而电针预处理组的大鼠脑梗死体积百分比较单纯缺血再灌注损伤的大鼠有所减少（P<0.001）。脑缺血后,大鼠海马CA1区细胞凋亡较假手术组增加（P<0.05）,与单纯缺血再灌注模型大鼠相较,电针预处理能够显着减少海马CA1区TUNEL阳性细胞的数量（P<0.001）。2.液相色谱-质谱联用技术检测海马神经元胞外谷氨酸浓度,发现大鼠脑缺血再灌注损伤后,胞外谷氨酸浓度升高,而电针预处理组胞外谷氨酸浓度较单纯缺血再灌注损伤的大鼠有下降趋势,但差异无统计学意义。3.Western Blot和免疫荧光双标染色检测电针预处理对GluN2B受体的调控作用,发现脑缺血再灌注损伤后海马GluN2B表达升高（P<0.001）,且海马CA1区GluN2B/NeuN共定位细胞增多;相比于单纯缺血再灌注损伤大鼠,电针预处理降低海马GluN2B表达（P<0.01）,并减少海马CA1区GluN2B/NeuN共定位细胞。4.Western Blot和免疫荧光染色检测海马神经元m-Calpain的表达及电针的调控作用,发现脑缺血再灌注损伤后海马m-Calpain表达升高（P<0.001）,且海马CA1区m-Calpain/NeuN共定位细胞增多;相比于单纯缺血再灌注损伤大鼠,电针预处理降低海马m-Calpain表达（P<0.01）,并减少海马CA1区m-Calpain/NeuN共定位细胞。5.Western Blot检测海马神经元p38 MAPK表达,发现各组大鼠t-p38表达水平之间无差异,但p-p38/t-p38比值观察p38磷酸化水平发现,与单纯缺血再灌注损伤模型组大鼠相较,电针预处理能够显着降低海马p38 MAPK磷酸化水平（P<0.01）。结论:1.电针预处理可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,具有延迟性神经保护作用。2.电针预处理的延迟性神经保护作用可能不能通过调节胞外谷氨酸浓度实现。3.电针预处理可以通过调节GluN2B蛋白表达,减少脑缺血再灌注引起的神经元损伤,在损伤级联反应的最上游起始点终止缺血性卒中诱导的兴奋毒性。4.电针预处理可下调海马神经元m-Calpain、p-p38 MAPK的表达,在电针脑保护中发挥重要效用,这可能是电针预处理抑制神经元凋亡分子生物学路径的下游机制。
陈凤收[4]（2020）在《miR-23a-3p和miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及机制的研究》文中研究指明目的:脊髓缺血再灌注损伤（Spinal Cord Ischemia-reperfusion Injury,SCII）与许多疾病相关,如胸腹或胸动脉瘤修复手术、椎管内手术。脊髓缺血再灌注损伤预后不良,目前仍未解决。由于其诱导因素众多,机制尚未明确。蛋白TRIL（TLR4interactor with leucine-rich repeats,TRIL）和CXCL13（C-X-C motif ligand 13,CXCL13）在神经系统疾病发挥重要作用。近年来,mi RNA中miR-23a-3p和miR-186-5p在神经和缺血疾病方面得到关注。七氟烷对脊髓缺血再灌注损伤有保护作用,但是七氟烷是否通过调节miRNAs参与对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。本研究拟探索脊髓缺血再灌注损伤中miR-23a-3p和miR-186-5p对下游蛋白的调控机制。此外进一步探索七氟烷预处理是否通过调节miR-23a-3p和miR-186-5p对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用。研究方法:夹闭主动脉弓14min建立大鼠脊髓缺血再灌注模型。随机分为SCII组（缺血组）和Sham组（假手术组,不夹闭主动脉弓）,通过microarray芯片检测SCII后异常表达的miRNA,并进行分析,通过qRT-PCR评估miR-23a-3p和miR-186-5p的表达水平。大鼠鞘内注射siRNA-TRIL质粒沉默TRIL,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定TLR4、TLR3、NF-κB的表达,通过ELISA法测定IL-1β的表达。对miR-23a-3p和TRIL进行双荧光素酶基因检测两者是否有靶向关系。通过大鼠鞘内注射miR-23a-3p的mimics质粒构建miR-23a-3p过表达脊髓缺血再灌注模型,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定TLR4、TLR3、NF-κB的表达,通过ELISA法测定IL-1β的表达,通过TUNEL法检测凋亡情况,观察miR-23a-3p过表达对前述指标的影响。通路Western blot测定脊髓缺血再灌注损伤CXCL13的表达随时间的变化。并通过免疫双标检测脊髓缺血再灌注损伤后CXCL13的细胞定位。通过大鼠鞘内注射si-CXCL13质粒和si-CXCR5质粒分别沉默CXCL13和CXCR5,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3的表达,通过ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。同时通过生物信息学分析对miR-186-5p靶基因进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路和GO（Gene Ontology）富集分析。通过大鼠鞘内注射mi R-186-5p的mimics质粒和AMO质粒构建干扰miR-186-5p表达的脊髓缺血再灌注模型,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3的表达,通过ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。通过2.4%七氟烷预处理1h后洗脱30分钟进行造模。分别于脊髓缺血再灌注损伤后12h评估大鼠的运动功能,检测mi R-23a-3p和TRIL的表达;脊髓缺血再灌注损伤后24小时评估大鼠的运动功能,检测miR-186-5p和CXCL13的表达。结果:和Sham组相比,SCII组miR-23a-3p和mi R-186-5p表达明显降低,TRIL和CXCL13蛋白表达明显升高。沉默TRIL改善了脊髓缺血再灌注损伤后运动功能,减轻了脊髓缺血再灌注损伤后学脊髓屏障的损伤,改善了血脊髓屏障的损伤,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,降低了下游TLR4、TLR3、NF-κB和IL-1β的蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因检测发现miR-23a-1-5p对TRIL存在靶向调控关系。过表达miR-23a-3p改善脊髓缺血再灌注损伤后大鼠下肢运动功能,降低BSCB通透性,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,并且降低TRIL、TLR4、TLR3、NF-κB和IL-1β的蛋白表达。miR-23a-3p对脊髓缺血再灌注损伤的作用可能是由于miR-23a-3p靶向调节TRIL造成的。CXCL13在脊髓缺血再灌注损伤后显着升高,并且表达于神经元和小胶质细胞。CXCR5在脊髓缺血再灌注损伤后也显着升高。沉默CXCL13或者CXCR5改善了脊髓缺血再灌注损伤后运动功能,减轻了血脊髓屏障的损伤,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,降低了下游ERK、p-ERK、caspase-3、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达。同时通过生物信息学分析对miR-186-5p靶基因进行GO富集分析,发现CXCL13富集于miR-186-5p多种生物学功能。过表达miR-186-5p改善脊髓缺血再灌注损伤后大鼠下肢运动功能,降低BSCB通透性,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,并且降低CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达。而抑制miR-186-5p则加重脊髓缺血再灌注损伤。miR-186-5p对脊髓缺血再灌注损伤的影响可能是由于miR-186-5p调节CXCL13造成的。七氟烷预处理能改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后12h和24h的运动功能。七氟烷预处理能够增加大鼠脊髓缺血再灌注损伤后miR-23a-3p和miR-186-5p,降低TRIL和CXCL13蛋白的表达。miR-23a-3p和其靶基因TRIL,miR-186-5p和其潜在靶基因CXCL13,可能涉及脊髓缺血再灌注损伤的保护机制。结论:1.沉默TRIL抑制TLR4和TLR3,miR-23a-3p靶向结合TRIL,过表达miR-23a-3p调控TRIL进而调控下游通路对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用。2.脊髓缺血再灌注损伤后miR-186-5p表达明显降低。CXCL13和CXCR5蛋白表达升高。脊髓缺血再灌注损伤后CXCL13表达于神经元和小胶质细胞。CXCL13/CXCR5轴通过激活ERK介导的神经炎症和凋亡促进脊髓缺血再灌注损伤。干扰miR-186-5p的表达可能通过调节CXCL13/CXCR5轴介导的凋亡和炎症通路影响脊髓缺血再灌注损伤。3.七氟烷预处理能改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的运动功能。七氟烷预处理提升miR-23a-3p和miR-186-5p表达,抑制TRIL和CXCL13蛋白的表达。
梁克山[5]（2019）在《P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响》文中认为引言痴呆是以认知功能进行性减退为特征的综合征,是一种渐进的、退化的脑部疾病,导致认知和情感功能的丧失,最常见于记忆,而其他功能如语言、行为以及最显着的执行功能也常常受损。据估计,全世界约有2400万人患有痴呆症,到2040年,这一数字将增加3至4倍。大约60%是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,10%～20%为血管性痴呆（vascular dementia,VaD）,分别占痴呆的第一、二位,其发病机制尚未完全明了。AD特征性病理改变为颞叶海马出现β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结,VaD是由于缺血、出血、低灌注、栓塞、小血管病等血管因素及事件致认知领域损害。在影像学方面,AD是以海马、颞、顶叶皮质萎缩为主的弥漫性萎缩,VaD表现为认知相关区（额叶、颞叶、海马、顶叶、角回、丘脑等）的血管事件（梗死、出血、脑白质病变、腔隙性梗死）。除家族史和一些躯体疾病外,导致痴呆的危险因素主要有:年龄、性别、较低教育、经济水平等。两者在临床表现上各有特点。但在临床实际工作中常难以鉴别。有证据表明,相当部分的AD具有脑血管方面的病理改变,这可能是老龄化的表现之一,也有可能是AD与VaD混合状态的表现之一。同样地,VaD患者脑组织病理检查可以发现诸如老年斑之类AD改变,这可能是混合性痴呆的结果,与正常的老年化进程有关。这就导致人们对这两种疾病的关系和鉴别产生了浓厚的兴趣,这些问题的研究有助于对痴呆发生的病理机制有更加深人的了解,对临床干预策略的制定有很大的推动作用。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最早最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,并且对缺血低灌注损伤具有明显的易感性。阿尔茨海默氏病（阿尔茨海默病）是一种进行性神经退行性疾病,最终导致神经元不可逆性损伤以及各种智力缺陷,包括认知和记忆。AD已成为重要的公共卫生问题,其症状主要包括躯体、认知、情绪功能的障碍,以及长期的认知和感觉功能退化,这些均明显影响患者的生活质量。当前已有大量有关AD发生和发展方面的研究,并已取得显着成绩,但是这些研究仍然无法提供有效的疾病诊断和治疗技术。这种紧迫的需求激发了神经科学界及医疗行业对AD治疗方法发展的兴趣。根据经典的淀粉样蛋白假说,相对于其他各种淀粉衍生物,Aβ1-42在AD的发病中起着重要的作用。Aβ1-42是由淀粉样前体蛋白（APP）裂解产生的β-分泌酶和γ-分泌酶。Aβ蛋白过量导致淀粉样斑块的形成和各种神经功能障碍包括炎性级联反应的激活启动,tau蛋白磷酸化的推广,氧化应激的增加,细胞内的信号转导通路的管制,突触可塑性的损伤及诱导神经元的凋亡和细胞死亡。越来越多的证据表明,雌二醇可能既促进又会损害记忆相关的过程,因此,雌激素在AD病理过程中所扮演的确切的角色仍然是难以捉摸的。目前,通过向脑内立体定向注射Aβ1-42建立AD小鼠模型。切除小鼠双侧卵巢来观察17β-雌二醇（E2）对AD不同阶段的治疗（早期和晚期）的影响,国内外少见报道,对这一课题的进一步研究无疑具有重要意义。充分证据表明,妇女绝经后循环系统中雌激素水平会突然下降,造成氧化应激风险加大和神经退行过程加快,尤其是那些AD的高危人群。另一方面,实验研究表明,雌性动物（OVX）切除卵巢后的雌激素治疗可改善其学习和记忆过程,提高其在旋臂迷宫和对象识别中的认知能力。在临床情况下,绝经后5年内保持较高雌二醇水平的女性与保持稳定低雌二醇水平的女性相比,前者表现出更优的行为能力。此外,具有较高内源性雌激素水平的绝经后妇女在斯特鲁普任务和空间工作记忆,延迟回忆和数字排序测试方面的能力更为出色。同样,正在服用激素替代疗法的妇女在非空间工作记忆和空间工作记忆任务有更好的反应。然而,也有报道指出雌激素对绝经后妇女认知能力的负面影响。旨在了解这些差异的研究结果表明,若提前应用雌二醇,暴露于Aβ蛋白的神经元所受损伤会显着减少,而若同时或于暴露Aβ蛋白5天后应用雌二醇,神经元则无法获得雌二醇所带来的保护,甚至所受损伤会转而加剧。总之,在阿尔茨海默病的病理过程中雌激素起着微妙又重要的作用,可在不同阶段施加积极或消极的影响。因此,本实验通过研究AD不同病理阶段的17β-雌二醇（E2）治疗（早期和晚期）,全面了解E2在AD病理过程中的角色和评估E2作为预防药物的意义。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最先最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,但SB202190和SB203580对海马神经元凋亡因子表达和学习记忆能力的影响却少有报道,特别是SB202190和SB203580对海马神经元凋亡和Bcl-2、Caspase-3表达影响的研究国内外未见有报道。为了探讨海马神经元凋亡在AD和VaD中的致病机制以及对认知功能的影响,历时6年课题组做了以下3项课题:1.应用雌二醇对AD痴呆小鼠模型海马神经细胞元凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-42的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗,研究Aβ1-42诱导的海马神经毒性及分子机制,评价E2拮抗Aβ1-42诱导的海马神经毒性的效果和分子机制。2.应用p38MAPK抑制剂对VaD痴呆大鼠模型海马神经细胞凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,在这项研究中,我们研究了 SB203580、SB202190对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡和学习记忆能力的影响。观察了 p38 MAPK抑制剂对脑细胞凋亡的保护作用,并借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。3.应用TPX2研究对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,H E染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK和p38 MAPK的表达,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p21中mRNA的表达水平。观察了 TPX2对经β1-42处理脑组织的细胞凋亡有保护作用,进一步通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达而探讨了其作用机理。总之,课题组通过以上3项研究,旨在进一步阐明p38MAPK抑制剂和雌二醇对痴呆鼠模型海马神经元凋亡的保护作用机制以及对痴呆模型认知功能的影响。第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用目的:本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-442的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗。检测Aβ1-42诱导的神经毒性及分子机制;评价E2拮抗Aβ1-42诱导的神经毒性的效果和分子机制。方法:1.双侧卵巢切除术:所有小鼠双侧卵巢切除并立即皮下植入药物,可以持续释放药物60天,内含有E2 0.18毫克。2.动物模型的制备:AD模型组小鼠Aβ1-42（4μg/mouse）,缓慢注射（0.5μl/min）;安慰剂组小鼠注射等量生理盐水（4μg/mouse）。3.BrdU注射:BrdU连续3次腹腔注射,间隔6小时,给药剂量为50mg/kg。4.雌二醇治疗:（1）早期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,后给予7天雌二醇皮下注射,3 μg/day。（2）后期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,7天后再给予7天雌二醇皮下注射,3 μ g/day。5.Morris水迷宫实验:计算每组小鼠平均游泳速度、延迟时间。在实验的第8天,撤去隐蔽的水面下平台,观察并记录小鼠的游泳速度及登台潜伏期。6.免疫染色:采用NeuN和BrdU免疫染色检测海马神经的生成。7.ELISA检测:检测促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、雌激素（Estrogen）、孕酮（Progesterone）血清水平。8.RT-PCR:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。总mRNA采用Trizol试剂提取和RNA反转录与PrimeScriptTMRT试剂盒。9.Western blotting检测信号通路蛋白的表达:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。蛋白样品的提取采用放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液。10.cAMP浓度测定:海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。组织颗粒在裂解缓冲液中裂解10分钟,在4℃、14000 rpm离心10分钟,收集上清液并用LANCETM cAMP 384试剂盒测定环磷酸腺苷（cAMP）浓度。11.透射电子显微镜:腹腔麻醉后小鼠,经心脏用2.5%戊二醛灌注并取出海马组织,海马组织继续用2.5%戊二醛固定过夜,在4℃,四氧化锇固定2小时后制作超薄切片（60 nm）,用丙酮脱水和醋酸铀染色。结果:1.小鼠海马注射Aβ1-42后,进行Morris水迷宫测试评,估认知功能,特别是空间学习和记忆能力（图1A）。在培训第1-2天,接受Aβ1-42注射的“老年”鼠在发现可见平台的游泳速度或时间延迟上与对照组相比没有差异,这表明空间学习能力不是在Aβ1-42注射后立即受到影响（P>0.05,n=10;见图1A）。相反,改为隐藏平台培训的第3-7天,Aβ1-42小鼠比对照组小鼠时间延迟更长,这些差异在5-7天显着,这表明记忆功能是在Aβ1-42注射后5天开始明显受损（P<0.01,n=10;见图 1A）。从迷宫中去掉平台后,观察小鼠在每个象限停留的时间比例（图1B）。Aβ1-42小鼠在象限虚拟平台的位置所花费的时间百分比明显减少。在本研究中,通过NeuN和BrdU染色标记海马神经元（图1C）,染色结果显示Aβ1-42模型组小鼠BrdU注射后21到28天,NeuN、BrdU 阳性细胞数量均显着减少（P<0.01,n=10;图1D）。这些结果表明,小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害。2.为评估E2对AD小鼠病理过程中早期阶段的影响,在造模后立即给予E2治疗（图2C）。与单纯对照组相比,接受E2治疗的对照组海马神经元再生无明显变化,而Aβ1-42小鼠接受E2治疗与未接受E2治疗比较,NeuN和BrdU 阳性细胞显着增加（P<0.01,n=3;图2D）。此外,给予E2治疗后,AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期显着降低（P<0.01,n=10;图2A）,在撤出平台的象限所停留的时间比例明显升高（P<0.01,n=10;图2B）。这些研究结果表明,在Aβ1-42小鼠AD病理过程的早期阶段,雌激素治疗增加海马元神经再生并促进认知功能的恢复。3.为评估E2对AD小鼠病理过程中后期阶段的影响,在造模后第7天开始给予E2治疗（图2C）。无论是对照组还是模型组,E2治疗均没有改善海马神经元再生,NeuN和BrdU阳性细胞没有明显变化（P>0.05,n=3;见图3D）。此外,给予E2治疗,并没有降低AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期（P>0.05,n=10;见图3A）。在撤出平台的象限停留时间比例没有明显升高（P>0.05,n=10;见图3B）。4.通过测定LH、FSH、雌激素和孕激素的血清水平,确认E2的效果。在E2治疗前FSH,LH,雌激素或孕激素水平没有显着差异（P>0.05,n=6;图4A-D）,但在E2治疗后LH、FSH、雌激素水平显着增加,而孕酮水平明显下降（P<0.01,n=6;图 4A-D）。在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,TrkB、BDNF的mRNA及蛋白水平显着上调,而P75NTR表达水平减少（P<0.01,n=3;图4E,F）。这些结果表明,E2诱导的神经发生,至少部分通过BDNF/TrkB通路。对这一途径的下游因子进行了检测（图4E,F）和结果与以前的研究结果相一致,STAT3/CREB/ERK信号通路的激活明显增加（P<0.01,n=3;图4E,F）。本研究还对cAMP水平进行评估,以确认BDNF/TrkB下游信号通路的活化（图4D）。5.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的A β 1-42小鼠,NO和ROS的水平明显降低（P<0.01,n=3;图5A）。相应的细胞死亡相关的Cytochrome-c/Bax/Bcl-2/acspase-3 信号通路因子活化下调（P<0.01,n=3;图5B-C）。这些结果表明,E2降低AD病理过程早期阶段海马区的细胞的氧化应激及死亡通路相关因子的活化,促进认知功能的恢复。6.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,胶质细胞增生显着降低（P<0.01,n=3:图6A,B）。E2介导的炎症反应,上调抗炎信号通路的因子活化（CD206,FIZZ1,1、TGFβ）并下调促炎信号通路因子的活化（IL-1β,TNF 和 IL-6。P<0.01,n=3;图 6C-E）。7.在本研究中,使用透射电镜观察海马突触的超微结构。与后期E2治疗及未给与E2治疗比较,发现在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,突触的数量显着增加（P<0.01,n=3;图7A）。为了进一步探讨E2对不同类型突触的作用,采用Western blot对海马NMDA受体和AMPAR受体水平进行分析。NMDA受体（GluN1和GluN2）水平没有明显影响,而AMPAR受体水平（GluA1 GluA2）明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）。此外,还有重要的突触后蛋白Hevin和SPARC表达明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）,这两种蛋白在突触的生成及功能方面起着重要作用。结论:1.Aβ1-42小鼠认知功能减退与海马区神经元发生有关。小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害,海马神经元损害在认知功能障碍方面起到重要作用。2.AD早期阶段E2可增加海马神经元再生并促进认知功能的恢复,而后期阶段E2治疗对的海马神经元再生及认知功能无改善。3.AD早期阶段E2治疗上调Aβ1-42小鼠海马神经元再生相关信号通路。4.AD早期阶段E2治疗可减少氧化应激、下调细胞死亡相关的信号通路活性。5.AD早期阶段E2治疗抑制Aβ1-42小鼠海马小胶质细胞过度增生。6.AD早期阶段E2治疗可增加海马神经元突触受体数量。第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响目的:本研究利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,经侧脑室内注射SB202190和SB203580的方法对VaD大鼠学习记忆能力进行研究,观察p38MAPK抑制剂对VaD大鼠海马依赖的Morris水迷宫的认知功能所起的作用,并通过研究海马神经元凋亡、海马区P38MAPK磷酸化变化及Bcl-2和Caspase-3表达,研究SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制,探讨海马神经元凋亡在血管性痴呆的发病机制中所起的作用。方法:利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,随机分为SB202190治疗组、SB203580治疗组、对照组和假手术组。假手术组只分离出双侧颈总动脉并不对其结扎,作为两血管法VaD模型的正常对比。治疗组采用侧脑室注射给药方式分别给予P38MAPK抑制剂SB202190、SB203580,对照组和假手术组采用侧脑室注射给药方式给予等量二甲基亚矾（DMSO）,注射药物2周后用Morris水迷宫法测试各组大鼠的学习记忆能力的变化。注射药物后应用TUNEL法检测海马区神经元凋亡,应用蛋白印迹（Western blot）法检测大鼠海马区P38MAPK磷酸化变化,免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察大鼠海马区Bcl-2和Caspase-3表达,以探讨SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制。结果:1.本研究对平台逃避潜伏期、空间学习、大鼠的SB203580或SB202190治疗效果均进行了研究。结果表明,SB203580和SB202190治疗组平台逃避潜伏期与假手术组和对照组相比明显缩短（**P<0.01）,说明大鼠的空间学习能力得以提高。2.给予SB203580和SB202190治疗5天后我们还观察到海马磷酸化激活P38 MAPK表达水平在各治疗组间差异显着（**P<0.01,SB203580治疗组或SB202190组治疗VS假手术组和对照组）。结果显示,SB203580或SB202190治疗后p38MAPK的表达显着降低。SB203580和SB202190治疗组间无显着差异。3.SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。为了探索SB203580和SB202190是否对血管性痴呆大鼠体外海马细胞凋亡和学习记忆能力有效,本实验用HT22细胞测试SB203580和SB202190的治疗效果。与对照组相比,用SB203580或SB202190治疗后实验组海马神经元凋亡减少。实验也证实了在体内SB203580、SB202190对海马细胞凋亡和血管性痴呆大鼠学习记忆能力是有疗效的。侧脑室注射SB203580和SB202190治疗五天后,处死大鼠,与对照组、SB203580和SB202190组相比,假手术组TUNEL阳性细胞数（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记,绿色荧光）显着下降（**P<0.01）。然而,SB203580和SB202190组与对照组相比,前者TUNEL阳性细胞数目显着降低;而且SB203580组与SB202190组相比,前者TUNEL 阳性细胞较少。总之,SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。4.本实验研究了 SB203580和SB202190对VaD大鼠海马区施加的抗凋亡能力。脑室注射五天后,处死大鼠获取VaD大鼠海马标本。SB203580或SB202190培养48小时后,进行实验计算实验组凋亡细胞的数量（n=3）。P38MAKA培养后,HT22细胞出现皱缩,碎裂成膜结合凋亡小体,很快被邻近细胞吞噬。P38MAKA能够减少HT22细胞的凋亡。而SB203580或SB202190治疗组凋亡的HT22细胞数量均显着低于对照组。5.在VaD大鼠模型的海马标本上进行了 P38 MAKA和凋亡相关基因之间的关系研究。我们对P38MAKA诱导细胞凋亡相关的mRNA的表达水平进行了分析。与假手术组和对照组相比,细胞凋亡抑制基因BAX和Bcl-2在VaD大鼠海马经SB203580 或 SB202190 治疗后表达增加。caspase-8、caspase-3 和 caspase-9 的表达在SB202190或SB203580治疗组比对照组均显着降低。但SB202190治疗组细胞凋亡抑制基因Bax和Bcl-2的表达比SB203580组略高,这表明SB202190可通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。6.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长 实验组其余VaD大鼠模型继续存活以观察治疗的远期疗效。假手术组和对照组大鼠在第30天处死。相反,约30%SB202190组和60%SB203580组的动物最后需要处死（**P<0.01）。这说明与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。其中,相对于SB203580,SB202190较好的治疗效果体现在VaD大鼠显着的生存优势（**P<0.05）结论1.P38MAPK抑制剂SB202190和SB203580,能提高或改善VaD大鼠的学习记忆能力。2.本研究给予VaD大鼠P38MAPK抑制剂治疗后p38MAPK的表达显着降低,有效减少海马神经元细胞凋亡,促进记忆障碍重建,且耐受性良好。3.SB203580和SB202190通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。4.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长,与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究目的:研究TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。方法:将90只大鼠随机分为药物组、对照组和空白组,每组30只。在药物治疗组和空白组大鼠用1 0%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g剂量）,在大鼠双侧海马区域的准确位置注入Aβ1-425ul（浓度1μg/ul）建立模型。将配置的TPX2抑制剂制成溶液。模型建立后,各组大鼠分别给予不同的治疗方法;药物组大鼠将TPX2-siRNA溶液连接10μl微量注射器给予侧脑室注射10μl,对照组大鼠给予侧脑室注射等量1%DMSO溶液。空白组为正常健康组,本组大鼠未作任何手术或药物治疗。大鼠脑组织分为两个部分,一部分是固定、脱水、石蜡包埋、制成约5um厚度的切片。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,HE染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK、MAPK和p38的表达水平,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p38中mRNA的表达水平。结果:一周后,TUNEL染色显示在药物组脑组织细胞凋亡率明显高于对照组和空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用TPX2抑制剂后,药物组TPX2的mRNA表达水平显着低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）,分别检测MAPK和p38蛋白的mRNA表达水平,药物组MAPK水平显着高于对照组及空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Western blot灰度值比较中发现,MAPK和p38的表达水平无显着差异,其差异不具有统计学意义（P>0.05）。然而,在药物组中,MAPK、p38表达水平明显高于对照组,空白组MAPK灰度值则明显下降,其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:因此,TPX2通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达抑制经Aβ1-42处理的脑组织细胞发生凋亡,对其有保护作用。
谢坤[6]（2019）在《围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景“脑卒中”（cerebral stroke）是一种中枢神经系统急性脑血流循环障碍性疾病,是世界公认的第三大致死性疾病,给患者带来了严重的心理和经济负担,极大地影响患者生活质量。其中缺血性脑血管病占比60%～80%,是脑血管病的主要类型。缺血性脑血管病（ischemic cerebralvascular disease,ICVD）引起的脑损伤包括缺血期原发性损伤和继发脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury,CIRI）。在围手术期间,多种手术创伤可导致CIRI的发生,可能会导致远期学习、记忆及认知功能障碍,如体外循环、术中持续低血压导致脑血流灌注不足,神经外科手术损伤脑血管等多种情况。对于缺血期原发性损伤,临床上可在治疗时间窗内给予溶栓等措施对症处理,及时恢复血液供应,但对于继发的CIRI,目前临床治疗手段和疗效远未达到预期。因此,围术期脑CIRI的发病机制及防治措施的研究成为亟待解决的科学问题。CIRI的病理生理过程是一个复杂的级联反应,涉及多种损伤机制,如氧化应激、炎症损伤、能量代谢障碍、线粒体损伤、神经元自噬效应、细胞内钙超载等,这些损伤机制既可以单独作用,也可交替、循环作用,相互间产生前馈、正反馈和叠加作用,互为因果、共同作用,影响疾病的发生发展和转归。氧化应激、炎性损伤及神经元自噬效应在CIRI发生发展过程中的作用已经成为当前研究的热点。正常机体内存在抑制氧化应激的酶系统,如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶,其中SOD是机体内主要的抗氧化酶、活性氧清除剂。在CIRI发生发展的过程中,大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生、释放,造成细胞膜磷脂分子中的不饱和脂肪酸过氧化,产生脂质过氧化物,又经过氧化酶作用后生成大量毒性代谢产物,如丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等,MDA可使细胞膜磷脂结构发生变化,细胞膜受损严重,引起神经细胞坏死、凋亡。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）是炎症反应活动中具有关键作用的细胞因子,被认为是全身炎性反应的始动介质,可直接导致血管内皮细胞功能减退、血管通透性增加、循环阻力降低,并诱导IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子及黏附分子的“瀑布样”释放,构成炎性损伤的级联放大效应。转录因子NF-κB是脑缺血再灌注损伤时炎症反应的中心环节,许多研究已证实,NF-κB可通过调节凋亡相关基因的表达实现对细胞凋亡的干预,提高神经细胞的存活率。自噬是机体在缺血和缺氧下产生的压力反应,这个过程是通过囊泡将某些细胞组分转运到到溶酶体得以降解。在真核生物中,自噬不仅与生长发育、代谢和免疫等生理过程有关,还参与脑缺血、心肌缺血和肾缺血等病理过程的发生。近几年来研究表明,脑缺血再灌注过程中自噬被激活,不仅具有神经保护作用,而且参与神经细胞的死亡调节,因此,脑缺血再灌注可以激活自噬。在CIRI引起神经元损伤的不同机制中,不同种类基因蛋白酶的表达对细胞的凋亡或存活的转归有重要的作用:（1）B淋巴细胞瘤（B-cell lymphoma,Bc1）基因家族成员Bcl-2和Bax基因是目前研究比较明确的功能对立的凋亡调控基因;（2）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族是另一大类细胞凋亡调控因子,Caspase-3是Caspase激活级联反应中下行最重要的凋亡执行蛋白酶,激活的Caspase-3通过裂解细胞骨架蛋白、DNA依赖性的蛋白激酶及其他Caspase相关底物蛋白等,改变细胞结构,最终导致细胞凋亡的发生;（3）自噬是细胞凋亡的一种方式,其激活主要与ULK复合物的活性有关,而ULK复合物活性主要由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin,mTOR）调控。（4）C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase,JNK）属于线粒体激活蛋白激酶超级家族。JNK信号通路可以通过细胞因子、生长因子、压力和其他因素被激活,并参与各种生理过程,如细胞增殖和分化、细胞凋亡和应激反应。此外,JNK信号通路与自噬的激活密切相关,在神经退行性疾病、缺血性再灌注损伤中也发挥重要作用。低温治疗目前是重症医学科对急危重症患者经常采取的治疗方式之一,围手术期重症患者也多有采用。在降低身体耗能的同时,通过低温抑制中枢细胞损伤、凋亡,起到脑保护作用,可能与以下机制有关:（1）使神经元Bcl-2表达升高,Bax表达降低,显着减少神经细胞凋亡;（2）抑制炎症因子（细胞色素C、ROS、NO）等对caspase-3的激活,使caspase-3表达下降,起到对脑神经细胞的保护作用;（3）促进P-ERK1/2表达,而对JNK表达仅有较小的上调作用,从而提高缺血再灌注神经元存活率;（4）促进P-Akt表达,抑制细胞凋亡。目前国际上通用的低温划分方式是将轻度低温（33～35℃）、中度低温（28～32℃）合称为亚低温（mild hypothcrmia,MH）。经过多年的动物实验研究和临床应用,亚低温技术已经逐渐成熟,广泛应用于心脏骤停、重度颅脑损伤以及脑卒中的治疗,收到了积极的临床疗效。丁苯酚（3-n-butylphthalide,NBP）又名芹菜甲素,是我国脑血管疾病治疗领域第一个拥有自主知识产权的一类新药。大量的国内外研究表明丁苯酚可以阻断缺血性再灌注损伤的多个环节,具有明确的治疗作用:（1）可改善线粒体中Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性,保护线粒体功能;（2）减少细胞色素C的释放,弱化凋亡蛋白酶的作用;（3）抑制细胞内钙超载;（4）减少兴奋性氨基酸的释放;（5）减轻血脑屏障的破坏程度;（6）改善缺血区微循环和能量代谢;（7）延长溶栓治疗时间窗。鉴于脑缺血再灌注损伤的病理生理机制和治疗研究成果、亚低温治疗的机制和NBP的生物学功能,我们可以合理地推测:相比单独使用MH或NBP治疗,NBP与MH联合使可能具有更强的改善脑缺血再灌注损伤、保护脑组织的效果。右美托咪定（Dexmedetomidine,Dex）作为一种新型具有高度选择性的α2肾上腺素受体激动剂,具有良好的镇静作用,是临床实践中常用于患者的镇静。研究发现,Dex可以通过减少氧化应激和降低炎症介质的释放来减轻大鼠的缺血再灌注损伤。然而,对于术后应用Dex是否对脑缺血再灌注损伤具有保护作用及作用机制尚未明确,本研究另一个重点是Dex后处理通过抑制炎症反应和神经元自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的的保护机制。综上所述,本研究对围术期脑缺血再灌注损伤的保护机制研究主要分为两个部分:（1）通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用MH与NBP联合治疗,检测脑组织中炎性因子的含量,观察神经元形态,检测凋亡相关蛋白的表达,验证NBP与MH联合使用对脑缺血再灌注损伤的保护作用。（2）通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探讨Dex后处理对空间学习和记忆能力、脑梗死区、细胞凋亡的影响,这个过程中海马CA1区域神经元的病理变化,以及可能涉及的JNK信号通路分子机制。第一部分MH和NBP联合作用对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制目的本研究主要通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用MH与NBP联合治疗,通过检测氧化损伤和炎症相关因子的含量以及炎症相关蛋白的表达,研究MH和NBP联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的神经保护作用。方法75只SPF级健康雄性SD大鼠（220-250g）由中国科学院上海实验动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组、模型组、MH组、NBP组和MH+NBP组,每组15只。NBP组和MH+NBP组大鼠术前给予含NBP（80mg/kg）生理盐水灌胃7天（每天一次）,假手术组、模型组和MH组均给予等量生理盐水。药物治疗7天后,采用改良Pulsinelli四血管闭塞法构建大鼠脑缺血再灌注模型。应用0.9%氯化钠溶液（4-5℃）通过20G硅胶管泵入头部进行MH治疗,使海马温度降至（33.0±0.5）℃后,双侧颈总动脉与动脉夹结扎15min,在自然复温前保持低温1h。缺血再灌注8小时后,冰浴收集一部分脑组织,匀浆,取上清液,用MDA检测试剂盒,SOD检测试剂盒,NO检测试剂盒和NOS检测法测定MDA、SOD、NO和NOS含量。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测脑组织中炎性因子IL-6和IL-1β的含量。一部分脑组织浸泡于10%福尔马林溶液中固定,进行石蜡包埋和常规切片。通过Nissl染色,在光学显微镜下观察脑组织神经元细胞的形态。采用免疫印迹测定Bcl-2、caspase-3、p-NF-κB、p-mTOR、mTOR等凋亡相关蛋白的表达量及磷酸化水平。结果1.脑组织中氧化应激因子含量变化采用试剂盒检测相应氧化应激因子,结果表明MH,NBP和MH+NBP治疗均能降低脑缺血再灌注损伤时的氧化应激因子MDA,NO,NOS的含量,增加SOD的含量,而且MH+NBP抑制脑缺血再灌注引起的氧化损伤的作用优于单独的MH和NBP治疗。2.脑组织中炎症因子含量变化ELISA检测结果显示,与模型组相比,MH组,NBP组及MH+NBP组IL-6和IL-1β含量均有不同程度的降低,MH+NBP组IL-6和IL-1β含量明显低于模型组。3.脑组织中神经元细胞结构变化尼氏染色结果显示,MH组和NBP组神经元数量较模型组明显增加,细胞排列规则,部分尼氏体丢失。与模型组比较,MH+NBP组神经元数量明显增加,且MH+NBP组与MH组、NBP组相比,神经元数量有所增加,神经元细胞结构完整,并且富含尼氏体。4.自噬相关信号m-TOR蛋白的活化Western Blot检测结果显示,采用MH和NBP联合治疗后p-mTOR蛋白表达水平显着降低。5.凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的变化Western Blot检测结果显示,采用MH和NBP治疗后较模型组Bcl-2蛋白表达水平增加,Bax蛋白表达显着降低。采用MH和NBP联合治疗后Bcl-2蛋白表达水平进一步增加,Bax蛋白表达降低。6.炎症相关信号NF-κB蛋白的活性Western Blot检测结果显示,与模型组相比,NH和NBP组p-NF-κB蛋白水平显着降低,NH+NBP组进一步降低p-NF-κB蛋白水平。结论1.MH和NBP联合治疗较单独使用MH和NBP治疗能更好地抑制脑缺血再灌注引起的氧化损伤和炎症反应。2.MH和NBP联合治疗可以减少脑缺血再灌注引起的大鼠脑神经细胞损伤,这种保护作用优于MH和NBP单独治疗。3.NH和NBP联合治疗可以通过抑制mTOR和NF-κB蛋白的磷酸化,促进Bcl-2表达和抑制Bax表达,对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用。第二部分右美托咪定后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制目的本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探讨Dex后处理对大鼠空间学习和记忆能力、脑梗死区、细胞凋亡的影响,这个过程中海马CA1区域神经元的病理变化,以及JNK信号通路的蛋白表达,为术后减轻脑缺血再灌注损伤的治疗提供理论依据。方法180只雄性健康成年SD大鼠,随机分成6组（每个治疗组30只大鼠）,假手术（Sham）组,缺血再灌注损伤（I/R）组,右美托咪定后处理（Dex）组,JNK抑制剂（SP600125）组,右美托咪定后处理+JNK激动剂（Dex+Anisomycin）组,阳性药物尼莫地平对照（Nim）组。采用缝合闭塞法建立大鼠中脑动脉闭塞（MCAO）模型。脑缺血再灌注24小时后,进行莫里斯水迷宫试验以评价大鼠的空间学习能力和记忆能力。取每组6只大鼠脑组织,切片,利用TTC染色检测缺血脑区面积。取每组6只大鼠脑组织,浸泡于4%多聚甲醛固定,切片,进行TUNEL染色,检测脑组织中凋亡细胞的数量,通过HE染色观察CA1脑区的病理变化。取6组大鼠的血清,利用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α,IL-6,IL-1β的含量。取每组6只大鼠脑组织,浸泡于2.5%戊二醛固定,通过透射电镜观察海马CA1区神经元的结构变化。提取每组6只大鼠脑组织的RNA,利用qRT-PCR检测自噬相关基因的表达。提取每组6只大鼠脑组织的总蛋白,利用免疫印迹技术检测自噬相关蛋白及JNK磷酸化水平。结果1.行为学测试利用莫里斯水迷宫测试对大鼠的空间学习和记忆能力进行评价。与Sham组相比,其他组逃逸潜伏期（EL）明显延长,而跨平台时间和停留原始平台时间减少。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组EL明显缩短,而跨平台和平台时间显着增加。与Dex组相比,EL显着延长,而跨平台和平台象限时间在Dex+Anisomycin组中显着缩短。2.脑组织的梗死区域TTC染色测定脑组织梗死面积。在I/R组、Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中观察到不同大小的白色梗死区域。大鼠脑组织的梗死区以梗死区/非梗死区域的百分比表示。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组脑组织的梗死区域显着减少。与Dex组相比,Dex+Anisomycin组的白色梗死区域增加。3.大鼠海马CA1区神经元凋亡TUNEL测定用于检测大鼠大脑海马CA1区神经元凋亡。与Sham组相比,其他组显示阳性凋亡的神经元数量显着增加。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组阳性凋亡的神经元数量有不同程度的明显下降。与Dex组相比,Dex+Anisomycin组神经元凋亡数量明显增加。4.大鼠海马CA1区域神经元的病理变化通过HE染色观察大鼠海马CA1区域神经元的病理变化。与Sham组相比,其他组神经元表现出不同程度的形态异常。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组神经元病理变化程度降低,Dex组、Nim组和SP600125组之间无显着差异,而Dex+Anisomycin组神经元病理变化程度稍重。5.血清中炎症因子的变化ELISA测定大鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达水平。与Sham组相比,其他组中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显着增加。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显着下降。与Dex组相比,Nim组与SP600125组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平无显着差异,而Dex+Anisomycin组TNF-α、IL-6和IL-1 β的含量增加。6.海马CA1区域的自噬效应通过透射电镜观察海马CA1区域的自噬效应。电子镜下细胞中出现自噬小体或吞噬细胞被认为是自噬的形态特征。与I/R组相比,自噬程度有不同程度地降低,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组水肿和空泡化程度降低。Dex组、Nim组和SP600125组之间没有显着差异,而Dex+Anisomycin组自噬程度稍重。7.大鼠脑组织Beclin-1,Caspase-3,LC3 mRNA和蛋白质的表达通过qRT-PCR检测大鼠脑组织自噬相关mRNA的表达。与Sham组相比,其他组Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达显着增加。与I/R组相比,Sp600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达显着减少。Dex组、Sham组和SP600125组之间无显着差异,而Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达在Dex+Anisomycin组略高。免疫印迹结果显示,与Sham组相比,Beclin-1、Caspase-3和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白质表达在其他组（P<0.05）中明显升高,总体变化趋势变化与qRT-PCR结果一致。8.JNK信号通路活性的检测免疫印迹结果显示,与Sham组相比,其他组p-JNK1的蛋白表达明显上升,JNK1总含量无显着变化。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中p-JNK1的蛋白质表达显着减少。与Dex组相比,p-JNK1的蛋白质表达在Dex+Anisomycin组中略有上升。结论1.右美托咪定后处理和JNK通路抑制剂治疗可改善大鼠脑缺血性灌注损伤引起的学习和记忆功能障碍,减少脑组织梗死区域面积。2.右美托咪定后处理和JNK通路抑制剂治疗能减轻大鼠脑缺血性灌注损伤引起的海马CA1区域神经元的阳性凋亡和病理变化。3.右美托咪定后处理能够减少大鼠脑缺血性灌注损伤引起的炎症反应和自噬作用,可能与抑制JNK通路活化有关,并影响炎症因子和自噬相关蛋白质的表达。
李世鹏[7]（2019）在《天麻素调控小胶质细胞抗大鼠脑缺血再灌注损伤机制研究》文中认为[研究背景]脑卒中在全球范围内是仅次于缺血性心脏病的第二大致死原因。随着中国经济发展和生活方式的改变,脑卒中已成为我国国民的第一致死疾病,其中缺血性脑卒中占到了卒中总数的69.6%-77.8%,给社会和家庭带来严重损失和沉重经济负担。急性脑卒中主要治疗方式还是早期rt-PA溶栓或机械取栓使得血管再开通。但受制于3-4.5 h较短的时间窗,和血管再通后缺血再灌注损伤带来的脑水肿、颅内出血和出血转化等并发症,其治疗效率有待进一步提升。寻找合适的神经保护剂治疗脑缺血再灌注损伤配合早期的血管开通是近年来的治疗急性缺血性脑卒中的研究热点之一。脑缺血再灌注损伤主要发病机制包括能量耗竭、炎性反应、氧自由基损伤、钙离子超载、一氧化氮和一氧化氮合酶的作用、兴奋性氨基酸毒性以及血脑屏障破坏及细胞坏死调亡等。其中,血脑屏障破坏和炎性反应在缺血再灌注病理过程中起到关键作用。小胶质细胞作为神经血管单元的组成细胞,在维持血脑屏障结构完整和功能维持以及神经炎症的启动和调控方面都起到了重要作用。天麻素是传统中药天麻的主要有效单体成分之一,目前在临床应用广泛,可通过抗氧化应激、抗神经炎性反应、调节神经递质、调节神经重构、抗凋亡抗自噬等多途径在多种神经系统疾病中发挥神经保护作用。目前关于天麻素在缺血再灌注损伤中对血脑屏障的保护和对小胶质细胞缺血再灌注损伤导致的神经炎症的调控机制现在尚未有深入研究。因此,本研究通过构建体内外缺血再灌注模型,研究天麻素对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为、梗死体积的保护作用,评估天麻素对血脑屏障及相关蛋白的影响,从细胞层面探讨天麻素对小胶质细胞在缺血再灌注损伤导致的神经炎症的调控和机制。为缺血性脑卒中的治疗提供一个新的可能治疗靶点和治疗思路。第一部分天麻素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[目 的]本实验部分建立SD大鼠缺血再灌注体内实验模型和BV-2小胶质细胞OGD/R体外模型,通过天麻素预处理,观察天麻素对缺血再灌注损伤大鼠的神经行为、梗死体积、脑含水量的作用,评估天麻素对血脑屏障影响,研究天麻素在体内外小胶质细胞中对血脑屏障损伤相关蛋白的调控。[方 法]通过线栓法制作SD大鼠MCAO模型来建立缺血再灌注体内实验部分动物模型;通过BV-2小胶质细胞氧糖剥夺再灌注在体外模拟细胞缺血再灌注损伤过程。使用各剂量天麻素（体内50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg,体外20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）预处理,并同阳性对照尼莫地平（NIM）及阴性对照组比较。使用Garcia JH评分评估各组神经行为学变化;使用TTC染色测量脑组织梗死体积,通过测量脑组织EB渗漏量和脑组织含水量以及HE染色检测反映血脑屏障通透性的变化,通过Western blot和免疫荧光染色检测各组大鼠脑组织和小胶质细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP2）和基质金属蛋白酶-9（MMP9）,以及水通道蛋白-4（AQP4）和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）的变化。[结 果]1.不同浓度GAS和NIM预处理的MCAO大鼠神经功能评分较MCAO组明显改善（P<0.001）。各治疗组中GAS 100mg/kg组评分最高。2.同MCAO组相比,GAS 100 mg/kg组和GAS 200 mg/kg组脑组织梗死体积明显减少（P<0.001）。3.MCAO组EB的渗漏明显增加,天麻素各治疗组和NIM组的EB渗漏量较MCAO组明显减少（P<0.01,P<0.001）。其中GAS 100 mg/kg组减少趋势最明显。4.MCAO组脑组织含水量明显升高,GAS 100 mg/kg能明显降低IRI脑组织含水量（P<0.01）。5.Western blot结果显示MCAO组IRI72 h后MMP2和MMP9、AQP4的表达显着增加（P<0.01）,而ZO-1的表达减少（P<0.01）,同时在 GAS 治疗（100mg/kg）组和 NIM 治疗（4mg/kg）组中 MMP2和MMP9、AQP4的表达较MCAO组显着减少（P<0.01）,而ZO-1的表达增加。免疫荧光显示在脑组织小胶质细胞中也有类似的趋势。6.Western blot显示BV-2细胞OGD/R各时间点中3 h和6 h时间点各蛋白变化程度最明显,GAS 40μmol/L、80 μmol/L在3 h时均能抑制MMP2和MMP9、AQP4在OGD/R后升高趋势,同时能增加ZO-1的表达。[结 论]1.SD大鼠脑缺血后再灌注72h时间点仍存在神经功能缺损,血脑屏障通透性增加和脑含水量增加。2.天麻素预处理能明显改善MCAO大鼠再灌注72 h时的神经功能,减少脑梗死体积和血脑屏障通透性。3.天麻素100mg/kg在大鼠体内和40 μmol/L在体外能抑制小胶质细胞MMP2,MMP9和AQP4,增加ZO-1表达从而发挥其在MCAO和OGD/R模型中对缺血再灌注损伤的保护作用。第二部分天麻素对缺血再灌注损伤后小胶质细胞中SOX4的调控[目 的]本实验部分通过构建缺血再灌注损伤动物模型及细胞模型,使用Western blot及免疫荧光观察检测缺血再灌注损伤后体内体外小胶质细胞中SOX4蛋白变化。同时通过天麻素干预缺血再灌注损伤动物模型及细胞模型,探讨研究天麻素对小胶质细胞中SOX4表达的影响。并用天麻素干预SOX4过表达的BV-2细胞,检测SOX4过表达BV-2细胞中MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1表达的变化,研究天麻素对缺血再灌注损伤的保护机制。[方 法]通过线栓法制作SD大鼠建立脑缺血再灌注动物模型;提取和纯化大鼠原代小胶质细胞并培养传代;通过BV-2小胶质细胞和原代小胶质细胞OGD/R在体外模拟缺血再灌注损伤过程。将实验动物和细胞分为对照组,模型组和天麻素干预组,体外部分分别使用GAS50mg/kg、GAS 100mg/kg、GAS200 mg/kg,体内部分分别使用 GAS 20 μmol/L、GAS 40 μmol/L、GAS 80 μmol/L 对实验模型将进行预处理。通过Western blot和免疫荧光染色检测各组大鼠脑组织和两种小胶质细胞株中SOX4的基础表达,和在MCAO、OGD/R刺激后以及GAS干预后SOX4的表达变化。构建SOX4过表达和空载的质粒,用慢病毒载体系统包装带有GFP荧光标记的SOX4过表达质粒和对照空载质粒,建立SOX4慢病毒稳定感染BV-2细胞系和对照空载病毒稳定感染BV-2细胞系。天麻素干预转染细胞系OGD/R模型,Western blot和免疫荧光染色检测SOX4,MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1表达的变化。[结 果]1.SOX4蛋白在BV-2永生小胶质细胞株和新生SD大鼠原代小胶质细胞中有基础表达,在SD大鼠胼胝体区小胶质细胞中也有少量表达。2.Western blot结果显示MCAO组IRI72 h后脑组织SOX4的表达增加（P<0.01）;同时GAS 100 mg/kg和GAS 200 mg/kg治疗可抑制SOX4增加的趋势,以100 mg/kg组明显。免疫荧光显示在脑组织小胶质细胞中也有类似的趋势。3.Western blot显示BV-2细胞和原代小胶质细胞中OGD/R后各时间点中3h时间点SOX4升高程度最明显,GAS 40 μmol/L能抑制OGD/R后3 h时SOX4升高趋势。4.GAS 40 μmol/L预处理能减少OGD/R BV-2小胶质细胞中SOX4、MMP2和MMP9、AQP4表达并且增加ZO-1的表达。在SOX4过表达细胞系中,GAS 40μmol/L预处理不能减少MMP2、MMP9、AQP4和增加ZO-1的表达。[结论]1.SOX4蛋白在BV-2永生小胶质细胞株和新生SD大鼠原代小胶质细胞中有基础表达,在SD大鼠胼胝体区小胶质细胞中也有少量表达。2.OGD/R以及MCAO能明显增加SOX4在体内外小胶质细胞中的表达,天麻素预处理能抑制SOX4增高的趋势。3.SOX4过表达能逆转GAS对OGD/R小胶质细胞中MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1的影响,提示GAS可通过SOX4调控MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1进而发挥神经保护作用。
陈陆敏[8]（2019）在《特境微生物天然产物体外神经保护活性筛选及其作用机制研究》文中研究说明新生儿缺氧缺血性脑病（neonatal hypoxie-ischemic encephalopathy,NHIE）是指在围产期窒息而导致脑的缺氧缺血性损伤,NHIE不仅严重威胁着新生儿的生命,更是新生儿期后病残儿中最常见的病因之一。NHIE会导致人类新生儿死亡和慢性神经功能障碍,星形胶质细胞参与构成血脑屏障,是遭受缺血危险后第一个受损害的脑细胞,保护受损星形胶质细胞成为治疗NHIE的有效策略。因此,基于NHIE的发生机制,寻找疗效可靠的神经保护药物,对治疗新生儿缺氧缺血性脑病具有重要的现实意义。近年来,从陆生植物和环境微生物中发现新化合物的几率越来越小,因此,越来越多的科研人员开始关注特殊生境微生物,尤其植物内生菌和海洋微生物。特境微生物更容易产生具有丰富的结构多样性和生物活性多样性的次生代谢产物,能够为新药研制提供丰富的先导化合物。糖氧剥夺（Oxygen-Glucose Deprivation,OGD）细胞模型常被用来模拟NHIE进行药物研究,因此,本学位论文建立大鼠原代星形胶质细胞OGD模型体外模拟NHIE。实验发现,缺氧缺糖6h时模型细胞的凋亡率已超过50%,因此,无糖培养基缺氧6 h培养能成功建立OGD星形胶质细胞模型。在此基础上,本学位论文采用OGD星形胶质细胞模型对黄花蒿内生菌M roridum、白茅内生菌C.globosum和海洋真菌P.janthinellum来源的天然产物及有关结构修饰产物进行了神经保护活性筛选。结果显示,化合物NBS-1（8）对正常星形胶质细胞有明显的毒性;NaBH4-1（13）、NaBH4-2（14）、BnNCO（16）和guxi-2（17）在浓度大于20 μg/mL具有一定的毒性;其余化合物对止常星形胶质细胞无毒性。对无神经毒性的化合物进行神经保护活性评价,结果发现,化合物cytoglobosin Ab（1）、chaetoglobosin F（6）、mCPBA-1（7）、HWE-1（11）、Guxi-2（17）、Penicilon B（18）和6-（2-acetyl-3,5-dihydroxybenzyl）-4-hydroxy-3-methyl-2H-pyran-2-one（19）能明显逆转 OGD引起的大鼠星形胶质细胞死亡,表现出对OGD损伤星形胶质细胞的保护作用,说明这些化合物在缺血缺氧损伤相关疾病治疗药物研制方面具有很好的潜力。根据筛选结果,本学位论文进一步研究了活性化合物chaetoglobosin F和guxi-2的体外神经保护活性机制。Chaetoglobosin F是从白茅内生菌C globosum中分离得到的一个细胞松弛索化合物。本学位论文研究发现,chaetoglobosin F能逆转OGD引起的LDH和ROS的水平上升和SOD的活性降低,说明其能减少细胞裂解,减弱调节氧化应激。同时发现,OGD模型细胞经chaetoglobosin F预处理后,SIRT1在细胞核中表达并且.表达上调,SIRT1的底物蛋白 Hif-1α和Ac-p53的表达下降,说明SIRT1脱乙酰酶活性增强;NF-κB激活入核减少;模型星形胶质细胞的凋亡率下降,Bax、Caspase-3和Cleavedcaspase-3表达下调,而Bcl-2表达上调,说明chaetoglobosin F的神经保护作用与阻止细胞凋亡相关。此外还发现,chaetoglobosin F预处理可以促进缺氧后共培养的神经元主要神经突的生长,说明chaetoglobosin F预处理可以避免星形胶质细胞过度活化对神经元的影响。上述这一系列研究表明,chaetoglobosin F能潜在地激活SIRT1,调控SIRT1/acety-p53/NF-κκB通路,减少OGD诱导的氧化损伤和星形胶质细胞的凋亡。Guxi-2是从黄花嵩内生菌M roridum中分离获得的一个个新环十肽化合物。本学位论文研究发现,guxi-2能下调LDH和ROS的活性,上调SOD的活性,说明其能减少细胞死亡,缓解氧化应激;OGD模型细胞经guxi-2预处理后,SIRT1在细胞核中表达并且表达上调,SIRT1的底物蛋白Hif-1α和Ac-p53的表达下降,说明SIRT1脱乙酰酶活性增强;且NF-κB激活入核减少并且降低总NF-κB mRNA的表达;同时发现,模型细胞中Bax、Caspase-3和Cleaved caspase-3表达下调,Bcl-2表达上调,说明guxi-2的神经保护作用与阻止细胞凋亡有关。上述这一系列研究表明,guxi-2表现出显着的神经保护活性。guxi-2能潜在地激活SIRT1,调控SIRT1/acety-p53/NF-κB通路,减少OGD诱导的氧化损伤和星形胶质细胞的凋亡。SIRT1通过脱乙酰化这种表观修饰手段负向调控氧化应激和细胞调亡相关转录因子,有望为NHIE临床治疗提供新的靶点。上述两个化合物都是SIRT1潜在的激活剂,通过作用于SIRT1调控SIRT1/acety-p53/NF-κB通路,表现出显着的神经保护活性,极有希望成为治疗NHIE的药物先导化合物。
杨超[9]（2019）在《针刺对血管性痴呆大鼠NGB和HIF-1α的表达及其作用机制研究》文中研究指明目的:1、通过比较各组VD大鼠治疗后Morris水迷宫测试成绩,验证针刺对血管性痴呆大鼠认知记忆能力的影响。2、通过HE染色观察针刺对血管性痴呆大鼠脑海马组织形态学的影响。3、检测针刺对血管性痴呆模型大鼠的脑组织海马区Ngb和HIF-1α基因转录及蛋白表达的影响。方法:1、国际公认的4-VO方法改良后复制血管性痴呆大鼠模型。2、选取12只仅暴露4条血管的大鼠作为假手术组,另外将造模成功的36只大鼠随机分为模型组、电针组、药物组,每组各12只。电针组予以针刺百会、风府穴,同时予以电针刺激,刺激电流1m A,频率为2Hz,每天治疗1次,留针30分钟,从治疗开始每连续治疗6天后,休息一天,共治疗4周。药物组给予尼莫地平灌胃治疗,与电针组同时开始治疗,每天一次,每连续治疗6天后,休息一天,共治疗4周。模型组和假手术组只做抓取、固定而不给予任何治疗。3、于造模后、治疗后,分别进行Morris水迷宫测试,筛选大鼠及检测大鼠认知记忆能力的改善。4、使用HE染色观察海马神经元的形态学改变。5、采用Western blot法,进行Ngb和HIF-1α蛋白的定性、定量分析（神经元:采用神经丝蛋白（Neurofilament,NF）,星形胶质细胞:采用神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP））。6、采用RT-PCR方法检测Ngb、HIF-1α和p53RFPm RNA的表达。结果:模型组与假手术组相比,大鼠水迷宫测试逃避潜伏期明显延长,跨越平台次数明显减少（p<0.05）;治疗后,电针组、药物组与模型组相比,逃避潜伏期明显缩短,跨越平台次数明显增多,差异明显（p<0.05）,其中电针组比药物组改善更加明显（p<0.05）。HE染色于400倍显微镜下观察神经细胞,可见模型组大鼠海马CA1区神经细胞数量明显减少,部分神经元突起出现病理性缩短甚至消失。电针组、药物组与模型组大鼠相比海马CA1区神经细胞数量增加,排列相对整齐,细胞结构及形态基本正常,细胞水肿程度较轻,且电针组更明显。电针组和药物组较模型组,大鼠脑神经元损伤程度明显减轻,Ngb、HIF-1α、NFm RNA与蛋白的表达明显增加,p53m RNA、GFAPm RNA与蛋白的表达明显降低,有显着差异（p<0.05）;电针组与药物组相比,改善更加显着（p<0.05）。结论:针刺“百会”、“风府”能提高血管性痴呆大鼠水迷宫成绩,改善其学习记忆能力,并能通过促进大脑海马中Ngb、HIF-1α、NF的表达,降低P53、GFAP的含量,来抑制神经元细胞的凋亡。
叶涛,朱路文,唐强,李宏玉,吴孝军,陈晨,姜云飞,李佳帅[10]（2018）在《电针预处理对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗区细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响》文中研究指明目的探讨电针预处理对脑缺血再灌注后细胞凋亡的保护作用。方法雄性Sprague-Dawley大鼠72只随机分成假手术组（n=24）、模型组（n=24）和电针预处理组（n=24）。后两组采用改良Longa法制备大鼠缺血2 h再灌注模型,电针预处理组造模前连续电针百会2周。再灌注24 h后,采用改良神经损害严重程度评分（m NSS）进行评估,TTC染色观测脑梗死体积,TUNEL法观察缺血半暗区细胞凋亡情况,Western blotting检测缺血半暗区p53、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与模型组比较,电针预处理组mNSS评分降低（P<0.05）,脑梗死体积缩小（P<0.05）,TUNEL阳性细胞数减少（P<0.05）,p53、Bax蛋白水平均降低（P<0.05）,Bcl-2蛋白水平升高（P<0.05）,Bax/Bcl-2比降低（P<0.05）。结论电针预处理对脑缺血再灌注大鼠有保护作用,可能与其抑制缺血半暗区p53蛋白表达,下调Bax/Bcl-2比值,从而减轻细胞凋亡有关。
二、大鼠脑缺血预处理对额叶神经细胞凋亡和P~(53)蛋白表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠脑缺血预处理对额叶神经细胞凋亡和P~(53)蛋白表达的影响（论文提纲范文）
（1）丹酚酸B预处理对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 缺血再灌注损伤研究概况 |
| 1.1.1 肠缺血再灌注损伤的概念 |
| 1.1.2 肠缺血再灌注损伤的发病机制 |
| 1.1.3 中医药治疗肠缺血再灌注损伤 |
| 1.1.4 西药治疗肠缺血再灌注损伤 |
| 1.2 丹参抗缺血再灌注损伤的研究概况 |
| 1.2.1 化学成分研究 |
| 1.2.2 药理作用研究 |
| 1.3 丹酚酸B的研究概况 |
| 1.3.1 丹酚酸B对心脏的药理作用 |
| 1.3.2 丹酚酸B对大脑的药理作用 |
| 1.3.3 对肝、肾的作用 |
| 1.3.4 抗癌 |
| 1.3.5 其他 |
| 1.4 立题依据 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物分组及给药 |
| 2.3.2 大鼠肠缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 2.3.3 标本收集与处理 |
| 2.3.4 血清MDA、SOD、CAT、GSH的测定 |
| 2.3.5 回肠组织MDA、SOD、CAT、GSH的测定 |
| 2.3.6 回肠组织MPO活力和促炎细胞因子的测定 |
| 2.3.7 肠通透性测定 |
| 2.3.8 小肠HE染色 |
| 2.3.9 RT-PCR测定回肠组织PI3Kp85α和 p-AKT(ser473)m RNA的表达 |
| 2.3.10 Western Blot法检测回肠组织PI3Kp85α和 p-AKT(ser473)的蛋白水平 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 丹酚酸B预处理对肠缺血再灌注大鼠血清抗氧化剂和脂质过氧化产物活性的影响 |
| 3.2 丹酚酸B预处理对肠缺血再灌注大鼠回肠抗氧化剂和脂质过氧化产物活性的影响 |
| 3.3 丹酚酸B预处理对回肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力的影响 |
| 3.4 丹酚酸B预处理对回肠组织促炎细胞因子的影响 |
| 3.5 丹酚酸B预处理对肠通透性的影响 |
| 3.6 丹酚酸B预处理对回肠病理组织学变化的影响 |
| 3.7 IL-1β、IL-6、TNF-α与 NF-p65 的相关性研究 |
| 3.8 丹酚酸B预处理对回肠组织中PI3Kp85α、p-Akt(ser473)m RNA表达的影响 |
| 3.9 丹酚酸B预处理对回肠组织中PI3Kp85α、p-Akt(ser473)蛋白水平的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 肠道缺血再灌注模型的建立 |
| 4.2 肠缺血再灌注损伤与氧化应激 |
| 4.3 肠缺血再灌注损伤与炎症反应 |
| 4.4 肠缺血再灌注与肠道黏膜损伤 |
| 4.5 肠缺血再灌注损伤与NF-κB通路 |
| 4.6 肠缺血再灌注损伤与PI3K/Akt通路 |
| 4.7 创新与不足 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 丹酚酸 B 药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
（2）头穴丛刺预处理对急性脑缺血大鼠神经功能及脑组织MAG表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 缺血性卒中针灸预处理研究现状 |
| 1. 脑缺血性疾病针灸预处理的理论基础 |
| 2. 针刺预处理对脑缺血性疾病的保护机制 |
| 3. 针刺预处理时间的设定与穴位的选择 |
| 4. 针刺预处理的研究价值 |
| 综述二 髓磷脂相关糖蛋白的功能机制及其在脑缺血疾病中的表达规律 |
| 1. 轴突再生抑制蛋白 |
| 2. MAG蛋白的生理结构及在中枢神经系统疾病中的功能机制 |
| 3. MAG蛋白在脑缺血性疾病中的表达规律 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1. 实验材料及方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 头穴丛刺法对MCAO术后大鼠神经功能评分的影响 |
| 2.2 头穴丛刺法对MCAO大鼠脑组织MAG蛋白表达的影响 |
| 3. 讨论部分 |
| 3.1 中医对缺血性中风的认识 |
| 3.2 实验针刺方法——于氏头穴丛刺法 |
| 3.3 头穴丛刺法预处理及头穴丛刺法对MCAO大鼠神经功能评分影响 |
| 3.4 头穴丛刺法预处理及头穴丛刺法对MCAO大鼠脑组织MAG蛋白表达的影响 |
| 3.5 头穴丛刺预处理临床可行研究方案探讨 |
| 4. 本实验的创新 |
| 5. 本实验的不足与展望 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 附录一: 蛋白样品制备及Western blot检测 |
| 附录二: Western blot附图 |
（3）基于GluN2B/m-Calpain/p38 MAPK路径研究电针预处理对脑缺血再灌注大鼠的神经保护机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 电针预处理对大鼠实验性脑缺血再灌注损伤的脑保护效应研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第二部分 电针预处理对大鼠实验性脑缺血再灌注损伤后兴奋毒性的调控作用 |
| 实验一 电针预处理对脑缺血再灌注损伤后胞外谷氨酸浓度的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠GluN2B受体的调控作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第三部分 电针预处理促进缺血再灌注大鼠神经元保护的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 卒中病理生理概述 |
| 2 “预处理” |
| 3 实验配穴及针刺参数探讨 |
| 4 结果讨论 |
| 5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 兴奋毒性与缺血性卒中的关系及针刺干预研究进展 |
| NMDA受体和神经元生存信号通路 |
| NMDA受体和神经元死亡信号通路 |
| 针刺治疗兴奋毒性的机制研究 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）miR-23a-3p和miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :大鼠脊髓缺血再灌注损伤后miRNA-23a-3p和 miR-186-5p表达的变化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.2.3 动物手术模型建立 |
| 2.2.4 行为学检测 |
| 2.2.5 取材 |
| 2.2.6 HE染色观察脊髓组织病理情况 |
| 2.2.7 TUNEL反应检测凋亡 |
| 2.2.8 伊文思蓝(EB)测定血-脊髓屏障(BSCB)通透性 |
| 2.2.9 miRNA表达谱分析 |
| 2.2.10 芯片结果验证及探索miRNA-23a-3p和 miR-186-5p表达随时间的变化 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 miRNA表达谱改变 |
| 3.1.1 鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢功能评分影响 |
| 3.1.2 脊髓缺血再灌注损伤BSCB通透性影响 |
| 3.1.3 脊髓缺血再灌注损伤后HE染色情况 |
| 3.1.4 脊髓缺血再灌注损伤后凋亡情况 |
| 3.1.5 miRNA表达谱改变 |
| 3.2 qRT-PCR验证对照组和脊髓缺血再灌注组miRNA含量并探索其表达随时间变化 |
| 3.2.1 qReal-time PCR检测miRNA-23a-3p表达随时间的变化 |
| 3.2.2 qReal-time PCR检测miR-186-5p表达随时间的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :miR-23a-3p通过调节TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 检测沉默TRIL效果 |
| 2.2.2 验证抑制TRIL对脊髓缺血再灌注的影响 |
| 2.2.3 双荧光素酶报告基因测定miR-23a-3p和 TRIL的结合 |
| 2.2.4 检测过表达miR-23a-3p效果 |
| 2.2.5 干预miR-23a-3p对缺血再灌注损伤后TRIL的蛋白表达影响 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响 |
| 3.1.1 检测沉默TRIL效果 |
| 3.1.2 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢运动功能的影响 |
| 3.1.3 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后BSCB的影响 |
| 3.1.4 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后组织学改变的影响 |
| 3.1.5 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后TLR4、TLR3、NFκB、IL-1β表达的影响 |
| 3.2 miR-23a-3p和 TRIL的双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.3 过表达miR-23a-3p对缺血再灌注损伤后脊髓功能的影响 |
| 3.3.1 验证过表达miR-23a-3p效果 |
| 3.3.2 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的BSCB影响 |
| 3.3.4 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的凋亡的影响 |
| 3.3.5 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的组织学影响 |
| 3.3.6 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后TLR4、TLR3、NFκB、IL-1β表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :miR-186-5p通过调节CXCL13 对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 检测沉默CXCL13和CXCR5 效果 |
| 2.2.2 验证抑制CXCL13/CXCR5 信号通路对脊髓缺血再灌注的影响 |
| 2.2.3 miR-186-5p的靶基因预测及生物信息学分析 |
| 2.2.4 检测干扰miR-186-5p的结果 |
| 2.2.5 干预miR-186-5p对缺血再灌注损伤后CXCL13/CXCR5 信号通路影像 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 沉默CXCL13/CXCR5 信号通路对脊髓缺血再灌注的影响 |
| 3.1.1 检测沉默CXCL13 和沉默CXCR5 效果 |
| 3.1.2 CXCL13表达随时间的变化及分布 |
| 3.1.3 沉默CXCL13对脊髓缺血再灌注后运动功能的影响 |
| 3.1.4 沉默CXCL13 对脊髓缺血再灌注后BSCB的影响 |
| 3.1.5 沉默CXCL13对脊髓缺血再灌注后前角运动神经元数量和形态的影响 |
| 3.1.6 沉默CXCL13 对脊髓缺血再灌注后CXCL13,CXCR5,ERK,p-ERK和 caspase-3的影响 |
| 3.1.7 沉默CXCL13 对脊髓缺血再灌注后IL-1β、IL-6、TNF-α |
| 3.1.8 沉默CXCR5对脊髓缺血再灌注后运动功能的影响 |
| 3.1.9 沉默CXCR5 对脊髓缺血再灌注后BSCB的影响 |
| 3.1.10 沉默CXCR5对脊髓缺血再灌注后神经元数量和形态的影响 |
| 3.1.11 沉默CXCR5 对脊髓缺血再灌注后CXCL13,CXCR5,ERK,p-ERK和 caspase-3的影响 |
| 3.1.12 沉默CXCR5 对脊髓缺血再灌注后IL-1β、IL-6、TNF-α |
| 3.2 miR-186-5p的靶基因预测及生物信息学分析 |
| 3.2.1 miR-186-5p的靶基因预测 |
| 3.2.2 miR-186-5p的靶基因的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO(Gene ontology)分析 |
| 3.3 干预miR-186-5p对缺血再灌注损伤后CXCL13/CXCR5 信号通路影像 |
| 3.3.1 检测干扰miR-186-5p表达效果 |
| 3.3.2 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的BSCB影响 |
| 3.3.4 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的组织学影响 |
| 3.3.5 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注后CXCL13,CXCR5,ERK,p-ERK和 caspase-3的影响 |
| 3.3.6 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注后IL-1β、IL-6、TNF-α |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 :七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注损伤后miR-23a-3p/TRIL轴和miR-186-5p/CXCL13轴影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-23a-3p和 TRIL表达的影响 |
| 2.2.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-186-5p和 CXCL13 表达的影响 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-23a-3p和 TRIL表达的影响 |
| 3.1.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注损伤12h运动功能的影响 |
| 3.1.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-23a-3p和 TRIL表达的影响 |
| 3.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-186-5p和 CXCL13 表达的影响 |
| 3.2.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注损伤24h运动功能的影响 |
| 3.2.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-186a-5p和 CXCL13 表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文部分 |
| 第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文部分 |
| Chronic estradiol administration during the early stage ofAlzheimer's disease pathology rescues adult hippocampalneurogenesis and ameliorates cognitive deficits in Ap"2 mice |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Summary |
| Reference |
| Figure legends |
| The Effect of P38MAPK Inhibitors on Hippocampus Apoptosisand Learning Memory Ability in Vascular Dementia Rat |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 3. Results |
| 4. Discussion |
| Conflict of Interests |
| Authors, Contribution |
| Reference |
| Figure legend |
| Protective Effects and Mechanism Researches of TPX2 onNeurocytes Apoptosis of Rats with Alzheimer's Disease Model |
| Introduction |
| Materials and methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
（6）围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MH和NBP联合作用对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：脑缺血再灌注损伤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（7）天麻素调控小胶质细胞抗大鼠脑缺血再灌注损伤机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 天麻素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 天麻素对缺血再灌注损伤后小胶质细胞中SOX4的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 天麻素在神经系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）特境微生物天然产物体外神经保护活性筛选及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 SIRT1对神经系统损伤的保护作用 |
| 1.1 SIRTI蛋白 |
| 1.2 SIRT1的小分子调节剂 |
| 1.2.1 SIRT1激活剂 |
| 1.2.2 SIRT1抑制剂 |
| 1.3 SIRT1在脑损伤中的作用 |
| 1.3.1 SIRT1与神经退行性疾病 |
| 1.3.1.1 阿尔茨海默病与SRT1 |
| 1.3.1.2 帕金森病与SRT1 |
| 1.3.1.3 亨廷顿舞蹈病与SRT1 |
| 1.3.2 SIRT1在急性脑损伤中的作用 |
| 1.3.2.1 缺血性脑卒中与SRT1 |
| 1.3.2.2 创伤性脑损伤与SRT1 |
| 1.3.2.3 蛛网膜下腔出血后早期脑损伤与SIRT1 |
| 1.4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 特境微生物天然产物对OGD模型大鼠星形胶质细胞保护活性筛选 |
| 2.1 仪器与材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 药品与试剂 |
| 2.1.4 待筛选天然药物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 化合物和溶液的配制 |
| 2.2.2 星形胶质细胞的培养 |
| 2.2.3 OGD模型的建立和实验分组 |
| 2.2.4 免疫荧光试验鉴定星形胶质细胞 |
| 2.2.5 化合物对正常大鼠星形胶质细胞的毒性测定 |
| 2.2.6 化合物对OGD模型大鼠星形胶质细胞的保护活性测定 |
| 2.2.7 数据统计分析方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 星形胶质细胞的鉴定 |
| 2.3.2 化合物对正常星形胶质细胞的毒性 |
| 2.3.3 化合物对OGD模型星形胶质细胞的神经保护活性 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 活性化合物对OGD模型大鼠星形胶质细胞保护作用机制研究 |
| 3.1 仪器与材料 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 药品与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液的配制 |
| 3.2.2 星形胶质细胞培养 |
| 3.2.3 OGD模型的建立和实验分组 |
| 3.2.4 神经元-星形胶质细胞的共培养 |
| 3.2.5 细胞上清液中LDH的测定 |
| 3.2.6 细胞内SOD水平的测定 |
| 3.2.7 细胞内ROS水平分析 |
| 3.2.8 流式细胞术分析细胞凋亡率 |
| 3.2.9 Western Blot法测定蛋白表达水平 |
| 3.2.10 免疫荧光试验观察SIRT1和NF-κB的定位 |
| 3.2.11 RT-PCR测定NF-κB和Bax的mRNA表达 |
| 3.2.12 数据统计分析方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 化合物chaetoglobosin F对OGD模型细胞的神经保护作用机制研究 |
| 3.3.1.1 化合物chaetoglobosin F对OGD模型细胞LDH、SOD和ROS水平的影响 |
| 3.3.1.2 化合物chaetoglobosin F对OGD模型细胞GFAP mRNA表达的影响 |
| 3.3.1.3 化合物chaetoglobosin F对OGD模型细胞SIRT1、Hif-1α和Ac-p53蛋白表达的影响 |
| 3.3.1.4 化合物chaetoglobosin F对OGD模型细胞NF-κB蛋白表达的影响 |
| 3.3.1.5 化合物chaetoglobosin F对OGD模型细胞凋亡的影响 |
| 3.3.1.6 化合物chaetoglobosin F预处理对共培养神经元神经突生长的影响 |
| 3.3.2 化合物guxi-2对OGD模型细胞的神经保护作用机制研究 |
| 3.3.2.1 化合物guxi-2对OGD模型细胞LDH、SOD和ROS水平的影响 |
| 3.3.2.2 化合物guxi-2对OGD模型细胞GFAP mRNA的影响 |
| 3.3.2.3 化合物guxi-2对OGD模型细胞SIRT1、Hif-1α和Ac-p53蛋白表达的影响 |
| 3.3.2.4 化合物guxi-2对OGD模型细胞NF-κB mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.3.2.5 化合物guxi-2对OGD模型细胞凋亡的影响 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录: 筛选化合物的结构 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（9）针刺对血管性痴呆大鼠NGB和HIF-1α的表达及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验主要仪器和试剂 |
| 2.3 实验动物的筛选 |
| 2.4 分组 |
| 2.5 模型复制方法 |
| 2.6 模型成功的标准 |
| 2.7 治疗方法 |
| 2.8 指标检测 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3.技术路线图 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 水迷宫实验检测结果 |
| 4.2 HE染色观察海马组织结构结果 |
| 4.3 Western blot法检测Ngb、HIF-1α、NF、GFAP蛋白表达水平结果 |
| 4.4 RT-PCR法检测p53RFP、Ngb、HIF-1α mRNA的表达水平结果 |
| 5.讨论 |
| 5.1 血管性痴呆概述 |
| 5.2 中医对血管性痴呆的认识 |
| 5.3 现代医学对血管性痴呆的认识 |
| 5.4 血管性痴呆的治疗方法 |
| 5.5 针刺督脉组穴对血管性痴呆的治疗意义 |
| 5.6 实验模型的选择依据 |
| 5.7 穴位选取依据 |
| 5.8 实验结果讨论 |
| 5.9 HIF-1α和Ngb表达及调控在血管性痴呆神经元损伤中的作用 |
| 5.10 GFAP对脑缺血再灌注损伤的影响 |
| 5.11 NF对脑缺血再灌注损伤的影响 |
| 5.12 P53对脑缺血再灌注损伤的影响 |
| 5.13 西药尼莫地平的选择依据 |
| 6.结论 |
| 7.不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）电针预处理对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗区细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 实验设备和试剂 |
| 1.3 模型建立 |
| 1.4 电针预处理[9] |
| 1.5 改良神经损害严重程度评分 (modified Neurologic Severity Score, m NSS) [11] |
| 1.6 取材 |
| 1.7 观察指标 |
| 1.7.1 脑梗死体积[12] |
| 1.7.2 凋亡细胞计数 |
| 1.7.3 Western blotting |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 m NSS |
| 2.2 凋亡细胞计数 |
| 2.3 Western blotting |
| 2.4 脑梗死体积 |
| 3 讨论 |
四、大鼠脑缺血预处理对额叶神经细胞凋亡和P~(53)蛋白表达的影响（论文参考文献）
- [1]丹酚酸B预处理对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用研究[D]. 陈嘉希. 南昌大学, 2020(01)
- [2]头穴丛刺预处理对急性脑缺血大鼠神经功能及脑组织MAG表达的影响[D]. 高胤桐. 北京中医药大学, 2020(04)
- [3]基于GluN2B/m-Calpain/p38 MAPK路径研究电针预处理对脑缺血再灌注大鼠的神经保护机制[D]. 张宝瑜. 天津中医药大学, 2020(03)
- [4]miR-23a-3p和miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及机制的研究[D]. 陈凤收. 中国医科大学, 2020(01)
- [5]P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响[D]. 梁克山. 山东大学, 2019(02)
- [6]围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究[D]. 谢坤. 山东大学, 2019(02)
- [7]天麻素调控小胶质细胞抗大鼠脑缺血再灌注损伤机制研究[D]. 李世鹏. 昆明医科大学, 2019
- [8]特境微生物天然产物体外神经保护活性筛选及其作用机制研究[D]. 陈陆敏. 扬州大学, 2019
- [9]针刺对血管性痴呆大鼠NGB和HIF-1α的表达及其作用机制研究[D]. 杨超. 安徽中医药大学, 2019(02)
- [10]电针预处理对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗区细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响[J]. 叶涛,朱路文,唐强,李宏玉,吴孝军,陈晨,姜云飞,李佳帅. 中国康复理论与实践, 2018(01)