一、转基因植物中RNA介导的病毒抗性机制（论文文献综述）
王梦雨[1]（2021）在《转录因子BoaMYB51和BoaBIM1调控芥蓝吲哚族芥子油苷代谢机理及其功能研究》文中认为芥子油苷是一类主要存在于十字花科植物中的含氮含硫的植物次生代谢物质。芥子油苷的生物学功能非常广泛,不仅可以帮助植物抵御病原菌侵袭、防御昆虫及提高自身免疫,而且其自身及降解产物具有较强的抗癌活性。芸薹属蔬菜是我国蔬菜产业的重要组成部分。芥子油苷在芸薹属蔬菜中含量丰富,其不仅影响芸薹属蔬菜的风味和营养,而且在抵御蔬菜重要病害如黑斑病等中发挥重要的作用。目前,在模式植物拟南芥中芥子油苷生物合成途径和调控网络的研究已经较为深入,而在作物中研究较少。我国特产的甘蓝类蔬菜——芥蓝中芥子油苷种类和含量丰富,是芸薹属蔬菜中研究芥子油苷代谢调控网络的良好材料。本论文以芥蓝为材料,综合运用分子生物学、生理学、遗传学、基因组学等手段探究了吲哚族芥子油苷代谢途径的转录调控机制。主要研究结果如下:1.VIGS沉默BoaMYB51降低了芥蓝黑斑病抗性。本论文中利用virus-induced gene silencing（VIGS）技术获得了转录因子BoaMYB51基因沉默材料。通过接种芸薹链格孢孢子悬浮液进行侵染发现,BoaMYB51-VIGS的芥蓝叶片接种后菌斑面积及菌斑溶于水后的孢子浓度均显着高于对照叶片。结果表明,在芥蓝响应芸薹链格孢侵染的过程中,BoaMYB51参与正向调控芥蓝对黑斑病的抗性。2.BoaMYB51过表达促进芥蓝中吲哚族芥子油苷的合成。为了验证芥蓝中BoaMYB51的功能,通过遗传转化和VIGS技术获得了芥蓝BoaMYB51转基因材料和基因沉默材料。芥子油苷组分和含量分析结果显示,各吲哚族芥子油苷组分的含量在BoaMYB51基因沉默材料中均显着低于对照,而在芥蓝BoaMYB51基因过表达材料中均显着高于对照。相对应的,芥子油苷生物合成关键基因表达分析结果表明,BoaMYB51基因沉默材料中吲哚族芥子油苷生物合成关键基因BoaCYP79B2、BoaCYP79B3、BoaCYP83B1等均受到显着下调,而在BoaMYB51基因过表达材料中则显着上调。以上结果表明,BoaMYB51正向调控芥蓝中吲哚族芥子油苷的生物合成。3.bHLH类转录因子BoaBIM1与BoaMYB51互作。利用酵母双杂交筛选芥蓝cDNA文库,筛选到30个可能与BoaMYB51存在互作关系的蛋白,其中包括转录因子、核定位的调控蛋白、参与蛋白调控的蛋白以及功能未知的蛋白。之后对鉴定到的bHLH类转录因子BoaBIM1与BoaMYB51进行了酵母双杂交点对点验证,以及pull-down实验的进一步蛋白互作验证。在芥蓝中,共鉴定到两个BoaBIM1基因,氨基酸比对和进化树分析表明,BoaBIM1与At BIM1有较高的同源性。利用烟草瞬时表达系统对BoaBIM1蛋白进行亚细胞定位分析发现,其定位于细胞核中。芥蓝不同组织器官及芥蓝幼苗不同生长时期的表达模式分析显示,BoaBIM1在嫩叶、花、茎和根中表达量较高,而在角果中表达量很低。除此之外,芥蓝各组织器官中BoaBIM1.1的表达量均显着高于BoaBIM1.2。4.BoaBIM1转录调控吲哚族芥子油苷的生物合成。为了验证芥蓝中BoaBIM1的功能,利用VIGS基因沉默技术获得了BoaBIM1-VIGS的芥蓝材料。芥子油苷组分和含量分析结果表明,不同的BoaBIM1-VIGS芥蓝株系中吲哚族芥子油苷各组分的含量均显着低于对照。相比于对照,BoaBIM1-VIGS芥蓝植株中吲哚族芥子油苷重要转录因子BoaMYB51.1的基因表达量显着下降,而BoaMYB51.2的基因表达量则没有明显变化;吲哚族芥子油苷合成途径的关键酶基因表达均明显下降,其中以BoaCYP79B2.2和BoaSUR1.1下降最为显着。通过农杆菌浸花法获得了拟南芥BoaBIM1基因过表达植株,进一步测定了芥子油苷含量和芥子油苷合成相关基因表达量。在BIM1及其同源基因都缺失的三突突变体bim123中,各吲哚族芥子油苷组分含量显着低于野生型,而BoaBIM1.1过表达株系Col-035S:BoaBIM1.1和BoaBIM1.2过表达株系Col-035S:BoaBIM1.2中各吲哚族芥子油苷组分含量都显着高于野生型。与野生型拟南芥相比,突变体bim123中吲哚族芥子油苷的重要调节基因At MYB51及合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、CYP81F2、SUR1表达量均显着下降,而BoaBIM1过表达植株中则显着升高。说明在拟南芥中BIM1对吲哚族芥子油苷途径相关的基因有正向调控作用。染色体免疫共沉淀实验结果表明,BIM1能够直接结合到吲哚族芥子油苷合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、CYP81F2启动子的E-box上发挥作用。综上所述,本论文在芥蓝中揭示了BoaMYB51转录调控吲哚族芥子油苷合成的机制,并发现其正向调控芥蓝对黑斑病的抗性;筛选到BoaMYB51的互作蛋白——bHLH类转录因子BoaBIM1,发现BoaMYB51和BoaBIM1可能形成蛋白复合体,共同转录调控吲哚族芥子油苷相关基因的表达。本研究不仅在理论上丰富了芸薹属蔬菜中吲哚族芥子油苷的代谢调控网络和生物学功能,也为芸薹属蔬菜重要真菌病害黑斑病的控制提供了新的策略。
蒲小剑[2]（2021）在《红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化》文中认为红三叶（Trifolium pratense L.）是营养价值和草产量仅次于苜蓿（Medicago Sativa L.）的多年生豆科牧草之一。该牧草用途广泛,具有广阔的开发应用前景。白粉菌（Erysiphales）作为一类普遍而重要的专性生物营养型病原菌,可严重降低红三叶草产量与品质,限制其在草牧业中的应用与发展。为阐明白粉菌对红三叶生理生化、内源激素和细胞结构的影响并验证抗白粉病TpGDSL基因的功能,本研究首先对感白粉病品种（岷山红三叶）和×抗白粉病品种（“甘农RPM1”红三叶）的杂交F2代进行抗病性评价,并建立白粉病抗性分离群体,采用人工接菌的方法,测定白粉菌侵染后不同抗性群体的生理生化变化、内源激素含量和细胞结构变化;利用F2代群体的抗病单株和感病单株作为试验材料,进行转录组分析;克隆由转录组分析得到的红三叶抗白粉病相关候选基因TpGDSL,同时构建p HB-GDSL过表达载体,并遗传转化拟南芥。取得的主要结果如下:1.白粉病病原菌为三叶草白粉菌（Erysiphe trifoliorum）;人工接菌后抗病材料的电导率（EC）先升高后降低、感病材料持续升高,接菌15 d时感病材料EC较接菌前增加3.57倍。抗病材料的相对含水量（RWC）先降后升,感病材料持续降低,接菌15d时感病材料的RWC含量较接菌前减少了31.85%。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性与过氧化氢酶（CAT）活性和可溶性糖（WSC）含量分别在接菌后第7 d和11 d升高,随后降低,其最高值分别为534.43±10.07 U·g-1·min-1 FW、411.73±4.08 U·g-1·min-1 FW、136.53±1.00 U·g-1·min-1 FW和32.02±0.57 mg·g-1。接菌第15 d的丙二醛（MDA）与游离脯氨酸（Pro）含量分别是接菌前的4.84和5.38倍。接白粉菌后第1和7 d,抗病材料的玉米素（ZR）、茉莉酸（JA）与水杨酸（SA）含量出现两个峰值,感病材料接菌第1d后增加,之后持续降低。抗病材料的ABA含量先升后降,感病材料的变化趋势相反。抗病材料的ZR、JA、SA与ABA含量的分别在接菌第7 d、1 d、7 d和1 d时最大,其值分别为12.23±1.27 ng·g-1、15.55±0.30 ng·g-1、124.82±1.68 ng·g-1、483.50±125.50 ng·g-1,分别较接菌前增加3.52、0.93、1.60和1.04倍。接菌后红三叶抗病材料内源激素变化幅度大于感病材料,表明抗病材料中白粉菌对红三叶体内内源激素的效应更明显。2.抗病红三叶单株叶片的上表皮细胞宽,叶片厚度、栅栏组织厚度及蜡质含量均极显着高于感病材料（P<0.01）,分别高16.13%、22.29%、29.99%与85.90%;抗病材料的上表皮细胞宽度增大、栅栏组织加厚、栅栏组织细胞排列更紧密有序,感病材料的海绵组织厚度显着增加、海绵细胞排列松散混乱。白粉菌侵染增加了细胞壁的半纤维素、纤维素和木质素含量,降低了可溶性果胶的含量,其中抗病材料纤维素、半纤维素、木质素和羟脯氨酸糖蛋白含量略高于感病材料。3.白粉菌侵染后抗性差异红三叶代谢中DEGs分别富集在苯丙烷途径、甲醛戊酸途径、木质素和木酚素途径与硫代葡萄糖苷等代谢途径。CHRs、C2H2、HAD、MYB、b ZIP和MADS等转录因子家族基因参与红三叶白粉病防御反应。SA与IAA通路中相关基因AXR1、CYP、CAND1和PPR-like可能在红三叶白粉病防御反应中具有积极作用。细胞色素P450、氧化酶类、磷酸酶、腈水解酶及GDSL脂肪酶等家族中DEGs分别富集23、20、18、14与2条。木质素代谢途径中PAL、C4H、4CL和BGL、ABA调控路径中NAD（P）-binding Rossmann-fold、赤霉素代谢途径中2-氧戊二酸/铁（II）依赖双加氧酶及JA合成前体12-Oxo-PDA等基因均参与调控红三叶的防御过程。转录组分析显示红三叶GDSL同源基因有较高的本底表达和差异表达倍数,Log2（FC）为10.62,本研究选择GDSL基因进行研究。4.克隆得到编码366个氨基酸,全长1101bp的TpGDSL基因。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）GDSL基因与该基因氨基酸序列相似性高达86.47%。TpGDSL基因编码蛋白分子式为C1776H2704N470O561S15,相对分子量为40.9672kD,理论等电点（p I）为4.39,正、负电荷残基为20和35,不稳定系数为31.38,为不稳定蛋白,脂肪系数为81.01。TpGDSL编码蛋白可能存在于细胞外基质（Extracell）。TpGDSL蛋白主要包括36.34%α螺旋（Alpha helix,Hh）、4.10%β转角（Beta turn,Tt）、17.49%延伸链（Extended strand,Ee）、及42.08%无规则卷曲（Random coil,Cc）。该基因翻译的蛋白均由二级结构和三维结构覆盖,覆盖率和可信度分别达82%和100%。本试验采用农杆菌介导的花序浸染法将重组过表达载体p HB-GDSL转入模式植物野生型拟南芥中,得到16 lines T1代阳性转基因种子,为TpGDSL基因的功能分析奠定了基础。
王宪璞[3]（2021）在《基于Pro-BIUTNT启动子的苹果原生质体高效表达体系的建立及其免疫研究应用》文中指出苹果优异基因的发掘和特异信号转导机制的深入解析离不开以苹果细胞为基础的高效精准目标蛋白表达技术体系。目前相关研究手段主要为同源稳定遗传转化体系和异源遗传转化体系,同源稳定遗传转化体系不仅技术周期长,效率低,而且在某些关键蛋白在特定时间下发生的修饰或相互作用等方面的研究中极为不便;异源遗传转化体系虽能借鉴模式植物成熟的研究手段,然而在异源植物细胞中,由于遗传基础不同,细胞特性和生化调控机理往往存在巨大差异,可能无法准确揭示目标蛋白的真实生物学功能。原生质体瞬时表达技术作为有力的生化机理研究手段,虽已在拟南芥等模式植物中得到成熟和广泛的应用,但在苹果中尚未有相关报道。本研究以‘王林’和‘紫红’苹果愈伤组织为试材分离原生质体,基于Pro-BIUTNT启动子建立苹果原生质体高效瞬时表达技术体系,并对苹果部分免疫抗性的分子机理进行了研究,初步揭示了flg22诱导BAK1和FLS2特异性互作和MKK7-MAPK6-WRKY33的苹果PTI抗性途径,并证实AvrRpt2和NAA介导AXR2降解和AvrRpt2剪切RIN4的苹果ETI抗性途径,并首次发现RIN4内源性剪切机制及NAA和RIN4介导AvrRpt2反馈降解的苹果特异性免疫抗性机制。主要研究结果如下:1.平均每克鲜重愈伤组织制得1×106个以上的原生质体,其中以继代培养10 d的愈伤组织为试材分离的原生质体产量最高,平均每克鲜重的‘王林’和‘紫红’愈伤组织分别最多制得3.68×106个和4.07×106个原生质体。培养20 d和25 d的‘紫红’愈伤组织因老化脱水,质地硬脆且致密,表面深红内部褪色变黄,未分离到正常的原生质体。2.花椰菜病毒（Cauliflower mosaic virus,CaMV）的35S启动子虽能在多种作物中有效驱动目标基因表达,然而在苹果原生质体中瞬时表达活性较弱,无法满足相关生化研究的需要。拟南芥泛素基因UBQ10（Ubiquitin 10）的天然启动子Pro-BIUTNT在苹果原生质体中具有显着高于CaMV 35S的瞬时表达活性,本研究分别检测了Pro-BIUTNT和CaMV 35S启动子驱动参试基因MdERF98、MdERF1、MdERF2、MdERF3a、MdERF6a、MdWRKY29、MdWRKY33、MdBAK1、MdFLS2、MdEIL2在苹果原生质体中的表达水平,结果表明,多数基因在Pro-BIUTNT驱动下获得了强烈的目标蛋白信号,而CaMV 35S启动子驱动的目标蛋白信号微弱或未检出。我们分别以MdERF1、MdWRKY33和MdFLS2为参试基因对愈伤组织继代培养时间和表达时间对目标蛋白表达水平影响进行了研究,结果显示,继代培养6 d的愈伤组织制得的原生质体表达目标蛋白的水平最高,孵育表达6～8 h所得目标蛋白水平最高。Pro-BIUTNT启动子还驱动了目标GFP及GFP融合蛋白在苹果原生质体和烟草叶肉细胞中的高效表达,其荧光信号水平显着强于CaMV 35S启动子。3.不同于苹果原生质体,在拟南芥原生质体中,CaMV 35S启动子具有较高的瞬时表达活性,并与Pro-BIUTNT启动子差异并不显着,且两种启动子在拟南芥原生质体中的瞬时表达活性整体高于苹果原生质体,这可能与由遗传背景决定的种间蛋白表达调控机理的差异有关。4.拟南芥UBQ10基因的苹果直系同源基因的启动子Pro-MdBIUTNT和Pro-MdBIUTNT-2（长度分别为1539 bp和2501 bp）在苹果原生质体中同样具有优于CaMV35S的驱动表达活性,其中,两个长度为539 bp和739 bp（自ATG翻译起始位点向上游）的Pro-MdBIUTNT区段活性较强。5.鉴于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是植物叶片中含量最丰富的蛋白质,我们分别鉴定了长度分别为1972 bp和3050 bp的苹果Rubisco基因天然启动子Pro-MdRP-1和Pro-MdRP-2及长度分别为2025 bp和2542 bp的Rubisco活化酶（Rubisco activase,RCA）基因的天然启动子Pro-MdRC-1和Pro-MdRC-2在苹果原生质体中的组成型表达活性和光诱导表达活性,结果显示,Rubisco基因相关启动子在苹果原生质体中的组成型表达活性较低,光照处理后微弱提升了其表达水平。6.应用苹果原生质体瞬时表达技术进一步印证了部分苹果PTI和ETI抗性响应机制,PTI抗性方面,证实flg22诱导At BAK1与At FLS2的特异性相互作用在苹果细胞中的保守性,结合体外激酶试验结果发现At MKK7ac可通过磷酸化MdMAPK6对MdWRKY33进行蛋白修饰和磷酸激酶信号传递,MdMAPK6通过不依赖于At MKK7ac的方式提高了MdWRKY33的蛋白质稳定性。ETI抗性方面,在‘王林’苹果原生质体中,萘乙酸（NAA）处理或共表达AvrRpt2均能显着降低AXR2的蛋白质稳定性,AXR2 P87S突变后其稳定性显着提高,说明该机制在苹果细胞同样保守存在。AvrRpt2利用其自身半胱氨酸蛋白酶活性剪切RIN4的机制在苹果细胞中依旧保守存在。7.本研究首次发现了有别于模式植物的苹果特异免疫抗性机制,NAA处理显着降低了AvrRpt2的蛋白水平,说明在苹果细胞中可能存在介导病原菌效应蛋白AvrRpt2降解的特异性反馈调控机制以缓解病原菌对宿主的持续伤害,对平衡植物生长和免疫过程具有重要作用,RIN4的存在同时进一步降低了AvrRpt2的水平。苹果细胞中还存在着不依赖于AvrRpt2的特异RIN4剪切机制,说明苹果细胞中可能存在某些基于RIN4剂量的调控途径,以保持对AvrRpt2的适度敏感性。综上所述,本研究基于Pro-BIUTNT启动子建立了苹果原生质体高效瞬时表达技术体系,初步揭示了部分植物PTI和ETI抗性在苹果细胞中的保守性,同时首次发现了R IN4内源性剪切机制和NAA和RIN4介导AvrRpt2反馈降解的苹果特异性免疫调控机制,这些共性与特性并存的调控机制不仅反映了种间保守免疫机制对植物生存的重要意义,更是植物不断进化以适应自然环境的具体体现。本研究不仅为苹果功能基因和特异信号途径的相关研究提供了良好的技术支持,同时也为深入解析苹果特异免疫抗性机理提供了一定的理论和技术参考。
张露凡[4]（2021）在《小麦抗赤霉病基因PFT互作基因TaRBL的克隆及功能分析》文中进行了进一步梳理赤霉病主要是由禾谷镰刀菌属引起的,能够破坏几乎所有的主要谷类作物,特别是小麦,使我国小麦严重减产,对我国粮食生产和食品加工方面造成严重影响。然而,目前在高抗品种的选育方面并未取得良好的进展。因此,挖掘和研究小麦抗赤霉病基因,对于提高小麦对抗赤霉病的抵御力和解析其中的抗赤霉病基因生长反应机制具有十分重要的意义。据前人研究发现,PFT（pore-forming toxin-like）（Ta PFT）基因是位于Fhb1位点上的抗性基因,但PFT的抗性机理并不清楚。本实验室前期利用PFT为诱饵蛋白筛选小麦酵母双杂文库后得到候选互作基因TaRBL（ricin-B-like lectin）,TaRBL编码篦麻毒素类凝集素。本研究通过在小麦品种苏麦3号中克隆得到TaRBL基因,构建酵母表达载体和双分子荧光互补载体验证TaRBL基因与Ta PFT基因互作,利用VIGS技术在小麦中对TaRBL基因进行初步功能验证,分析TaRBL基因在小麦抗赤霉病过程中的抗病机理。主要研究结果如下:1.利用文库插入序列在小麦基因组网站比对获得TaRBL全长编码区（CDS）序列,设计特异引物,利用苏麦3号cDNA通过PCR扩增得到了TaRBL基因CDS全长,经过序列分析表明该基因CDS全长为1023 bp,编码含有340个氨基酸的蓖麻毒素类凝集素蛋白。2.构建酵母表达载体对TaRBL基因与Ta PFT基因进行互作验证,结果显示该基因与Ta PFT基因在酵母中能够发生互作。构建双分子荧光互补载体在烟草中进一步验证互作关系,结果显示该基因与Ta PFT基因能够在烟草细胞中发生互作。这些结果表明TaRBL基因与Ta PFT基因在植物体外和体内均存在互作。3.通过对抗病品种苏麦3号和感病品种济麦22接种禾谷镰刀菌孢子,然后对接种的小麦TaRBL基因进行实时荧光定量分析,检测该基因在各个时间点的相对表达量,结果显示TaRBL基因受禾谷镰刀菌诱导后在抗病品种苏麦3号中上调表达,在感病品种济麦22中下调表达,表明TaRBL基因表达受赤霉病诱导,且其表达量与赤霉病抗性呈正相关。4.分别以抗病品种苏麦3号和感病品种济麦22为材料,利用BSMV-VIGS技术于穗期对TaRBL基因进行沉默,并接种禾谷镰刀菌鉴定沉默植株的抗性变化。结果显示沉默抗病品种苏麦3号的TaRBL基因后,导致其赤霉病抗性显着降低;沉默感病品种济麦22的TaRBL基因后,导致其明显更感病,抗性进一步降低。这些结果表明TaRBL基因沉默会降低小麦赤霉病抗性。5.构建TaRBL基因过表达载体,利用农杆菌介导法对感病小麦济麦22进行遗传转化,通过GUS染色和PCR扩增等方法鉴定转基因阳性植株。进一步通过离体叶片接种赤霉病孢子悬浮液方法对转基因阳性植株进行赤霉病抗性鉴定后显示TaRBL过表达小麦的赤霉病抗性显着提高,表明TaRBL为小麦赤霉病抗性基因。综上,本文克隆了TaRBL基因全长,生物信息学分析显示其编码蛋白为篦麻毒素类凝集素。通过不同抗感品种接种禾谷镰刀菌后的基因定量研究和VIGS技术对基因进行功能分析后表明该基因具有正调控的抗赤霉病作用。进一步通过构建过表达载体转小麦获得阳性转基因植株,并对其通过离体叶片进行赤霉病抗性鉴定后发现TaRBL过表达小麦的赤霉病抗性显着提高,证明TaRBL为小麦赤霉病抗性基因。该研究结果为培育新的抗病品种提供了基因基础和理论依据,对于解析小麦抗赤霉病机制提供新途径。
彭爱红[5]（2021）在《NPR和抗菌基因对柑橘黄龙病的抗性研究》文中研究说明柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是柑橘生产上最具毁灭性的细菌病害,已对全球的柑橘产业造成了巨大的经济损失。其主要致病菌为韧皮部杆菌属亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）。目前在柑橘属植物中没有发现抗HLB的种质,也没有从感病植株中彻底根除黄龙病菌的有效方法。培育抗病品种是控制黄龙病最根本的方法,对柑橘产业的可持续健康发展有至关重要的作用。诱导植物产生系统获得抗性,以及在植物中表达对病原菌有杀灭作用的外源基因是目前抗病育种的重要手段。因此,本论文从上述2个抗病策略出发,通过同源基因和系统发育进化分析,从耐HLB的‘Jackson’葡萄柚（Citrus paradisi Macf.）中获得了2个与系统获得抗性相关的病程相关基因非表达子（nonexpressor of pathogenesis-related gene,NPR）Ciclev10031343m和Ciclev10031749m,分别被命名为CiNPR3和CiNPR4。同时,利用连接多肽LP4和2A分别连接人溶菌酶和抗菌肽Cecropin B基因,构建了2个融合基因HPC和HAC。构建上述基因的超量表达载体,将CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC分别导入易感HLB的晚锦橙（C.sinensis Osbeck）基因组中,获得能够稳定表达目的基因的转基因植株。通过嫁接传毒的方式将CLas接种于转基因植株上,传病后的植株在28℃的温室中培养2年。培养期间通过监测转基因植株中CLas含量、观察植株的发病症状对转基因植株进行HLB的抗性评价。对HLB抗性增强的转基因植株分析其叶片中的淀粉含量和观察韧皮部结构的变化。对抗HLB的CiNPR3和CiNPR4转基因植株的转录谱变化、CiNPR3和CiNPR4的互作蛋白、以及水杨酸（salicylic acid,SA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号通路中防御反应相关基因表达水平的变化进行研究,解析CiNPR3和CiNPR4调控柑橘黄龙病抗性的机制。对抗HLB的HPC和HAC转基因植株中胼胝质合成酶基因和淀粉合成相关基因的表达水平进行分析,评价HPC或HAC的导入对柑橘产生HLB抗性的作用。主要研究结果如下:1.超量表达目的基因的转基因植株的创制为了评价CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC基因对HLB抗性的影响,通过农杆菌介导的遗传转化将这4个基因导入晚锦橙,分别获得CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因株系30、26、56和64个。实时荧光定量PCR证实CiNPR3和CiNPR4分别在CiNPR3和CiNPR4转基因植株中获得表达,人溶菌酶和Cecropin B基因在HPC和HAC转基因植株中均获得表达。Western blotting证实HPC和HAC融合蛋白分别在HPC和HAC转基因植株中成功表达。转基因植株的形态表型与野生型（wild-type,WT）植株没有明显差异。2.超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC的转基因植株产生了HLB抗性转基因植株在接种CLas 9个月时,57.1%（16/28）的CiNPR3、61.5%（16/26）的CiNPR4、72.7%（16/22）的HPC和57.1%（12/21）的HAC转基因株系中CLas含量显着低于WT植株。接种CLas 18个月时,10个CiNPR3、7个CiNPR4、10个HPC和7个HAC转基因株系中的CLas含量显着低于WT植株。接种CLas 24个月后,9个CiNPR3、7个CiNPR4、7个HPC和7个HAC转基因株系中的CLas含量仍然显着低于WT植株。这些结果表明,超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC显着抑制了CLas病原菌的增殖。接种CLas 9个月后,在WT植株和部分转基因植株上可以观察到明显的HLB症状。病树上新萌发的叶片变黄变小,有的叶片叶脉突出。随着发病时间的延长,植株生长迟缓,一些植株的顶端逐步枯死。接种CLas 24个月后,28.6%（8/28）的CiNPR3转基因株系、23.1%（6/26）的CiNPR4转基因株系、27.3%（6/22）的HPC转基因株系和19.0%（4/21）的HAC转基因株系没有出现明显的HLB症状。这些结果表明,超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC降低了韧皮部中CLas含量,从而减轻了转基因植株的HLB症状,植株表现出了对HLB的抗性。3.转基因植株应答黄龙病菌感染的解剖结构和淀粉含量的变化接种CLas 24个月后,对具有HLB抗性的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株韧皮部的结构进行了感病前和感病后的解剖观察。健康的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株的韧皮部结构与健康的WT植株相比无差异。与健康的WT植株相比,感病的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株的韧皮部层变宽,韧皮部薄壁细胞膨大、排列疏松但有规律;韧皮部中的胼胝质增多。感病的WT植株的韧皮部层比感病的CiNPR3、CiNPR4、HPC和HAC转基因植株的韧皮部层明显更宽,韧皮部薄壁细胞间隙较大且在韧皮部层散乱排列;韧皮部中的胼胝质较多。这些结果表明,超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC并未改变晚锦橙的韧皮部结构,但却减轻了CLas对韧皮部结构的破坏。接种CLas 24个月后,具有HLB抗性的转基因植株叶片中的淀粉含量增加,显着高于健康的WT植株叶片中的淀粉含量,但显着低于感病的WT植株叶片中的淀粉含量。这些结果表明超量表达CiNPR3、CiNPR4、HPC或HAC降低了转基因柑橘叶片中因CLas感染所致的淀粉积累。4.超量表达CiNPR3或CiNPR4抗柑橘黄龙病的机制解析4.1超量表达CiNPR3或CiNPR4转基因植株的转录组学研究接种CLas 18个月后,随机各挑选一株具有HLB抗性的CiNPR3转基因植株C3-29和CiNPR4转基因植株C4-2,以及WT植株进行感病前和感病后的转录组分析,通过KEGG分析差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）参与的代谢或信号转导途径。感病前,与健康的WT植株相比,CiNPR3转基因植株C3-29中的DEGs显着富集在光合作用-天线蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢、光合作用通路;而CiNPR4转基因植株C4-2中的DEGs显着富集在光合作用-天线蛋白、α-亚麻酸代谢和植物激素信号转导途径。感病后,与各自健康的植株相比,CiNPR3转基因植株中的DEGs显着富集在苯丙氨酸代谢途径、内质网蛋白质加工过程;CiNPR4转基因植株中的DEGs显着富集在植物–病原物互作通路、光合作用和α-亚麻酸代谢途径;而WT植株中的DEGs显着富集在柠檬烯和蒎烯的降解、二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成途径。这些结果表明,超量表达CiNPR3或CiNPR4并未显着增强转基因植株的基础防御能力,但超量表达CiNPR4后转基因植株受病原菌诱导的基础防御抗性明显增强。4.2 CiNPR3和CiNPR4蛋白分别与CsTGA6和CsTGA2转录因子互作对来源于‘Jackson’葡萄柚的CiNPR3和CiNPR4通过蛋白与蛋白相互作用的亚网络分析发现,这两个蛋白都与Ciclev10005080m和Ciclev10001081m基因所编码的蛋白相结合。以甜橙为参考基因组,经过序列比对,发现Ciclev10005080m基因编码的氨基酸序列与Cs5g11160.1基因编码的氨基酸序列完全相同,而Ciclev10001081m基因编码的氨基酸序列与Cs1g16230.4基因编码的氨基酸序列有98.9%的相似性。功能注释表明,Cs1g16230.4和Cs5g11160.1分别为TGA6和TGA2转录因子基因（命名为CsTGA6和CsTGA2）。进一步,酵母双杂交分析证明CiNPR3与CsTGA6、CiNPR4与CsTGA2存在互作。4.3超量表达CiNPR3或CiNPR4显着地提高了转基因植株体内的系统获得抗性和诱导系统抗性接种CLas 18个月时,对CiNPR3和CiNPR4转基因植株中SA和JA分别介导的防御反应标志性基因CsPR1、CsPR2和CsPR5,和CsPDF1.2进行了感病前和感病后的表达分析。感病前,与WT植株相比,SA介导的CsPR1在所有的CiNPR3和CiNPR4转基因植株中显着上调表达;CsPR2在所有的CiNPR3转基因植株中显着下调表达,而在CiNPR4转基因植株中显着下调表达或表达水平无差异;CsPR5在所有的CiNPR3和CiNPR4转基因植株中表达水平无显着变化;而JA介导的防御反应相关基因CsPDF1.2在超量表达CiNPR3和CiNPR4的转基因植株中显着上调表达或表达水平无差异。感病后,WT植株中CsPR1和CsPR2上调表达,CsPR5的表达水平基本保持不变,而JA介导的CsPDF1.2的表达水平略微下调;而所有的CiNPR3和CiNPR4转基因植株中CsPR1、CsPR2、CsPR5和CsPDF1.2基因上调表达,且上调表达的倍数变化显着高于WT植株。这些结果表明超量表达CiNPR3或CiNPR4不但增强了CsPR1介导的基础防御反应和JA介导的病原菌感染引起的诱导系统抗性,而且使转基因植株获得了比WT植株更强的病原菌诱导的系统获得抗性。综上所述,超量表达CiNPR3或CiNPR4后甜橙产生HLB抗性的可能机制为:CiNPR3通过与CsTGA6转录因子结合,激活SA介导的PR基因和JA介导的PDF1.2基因的表达,启动寄主系统获得抗性和诱导系统抗性,从而增强CiNPR3转基因植株的HLB抗性;而CiNPR4通过与CsTGA2转录因子结合,激活植物（？）病原物互作通路中相关基因的转录,增强寄主的基础抗性,同时上调SA介导的PR基因和JA介导的PDF1.2基因的表达,激活寄主的系统获得抗性和诱导系统抗性,最终赋予转基因植株增强的HLB抗性。5.HPC和HAC转基因植株中胼胝质合成酶基因和淀粉合成相关基因响应CLas感染的表达有较强HLB抗性的HPC和HAC转基因植株在接种CLas 24个月后,其体内的胼胝质合成酶基因Cs Cal S7上调表达,且上调表达的倍数显着高于WT植株;而HPC和HAC转基因植株体内的淀粉合成相关基因如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因Cs SS13（Cs8g07230.1）和水溶性淀粉合成酶基因Cs SS14（Orange1.1t00566）受CLas诱导表达的上升程度显着低于WT植株,揭示了HPC和HAC转基因植株在感病后淀粉含量较低的原因。这些结果表明,超量表达HPC或HAC对转基因植株中胼胝质合成酶基因和淀粉合成相关基因响应CLas感染的表达有显着影响。
田再民[6]（2020）在《马铃薯小G蛋白基因StRab5b的克隆及其调控晚疫病抗性的功能研究》文中研究指明RAB蛋白在植物、动物、微生物中广泛分布,其一般通过鸟苷酸交换因子（GEFs）和GTP酶激活蛋白（GAPs）来调控信号通路的开闭。已有的研究结果表明,植物中的RAB GTPase参与植物的生长发育过程以及植物应对生物和非生物胁迫的能力,特别是在调控植物抗性建立方面的功能尤为重要。本研究从马铃薯中克隆得到小G蛋白基因StRab5b,对其编码蛋白的生物学信息,表达谱以及诱导表达进行了分析;并通过超表达和基因沉默,对StRAB 5b蛋白在调控马铃薯对晚疫病抗性以及耐盐性方面的功能进行了初步的研究,得到如下的结果:1.利用特异引物分别克隆得到StRab5b（607bp）和StRab（673 bp）基因,并对StRAB 5b蛋白结构进行预测分析,结果表明StRAB 5b蛋白的一级结构中包含的氨基酸数为200个,分子量为21.5 kDa;二级结构中有GGT2-Rab的催化位点,REP和3个棕榈酰化作用位点,16个磷酸化位点,未见信号肽,进化树的分析表明,马铃薯和烟草RAB 5b同源性高达94%,且StRAB 5b具有RAB蛋白共有的结构域RabF2（83～87）、RabF4（YYRGA,102～106）和 RabF5（131～135）;三级结构包含5个α螺旋和5个β折叠。2.表达谱分析的结果表明,马铃薯不同组织中StRab5b基因表达量由高到低依次是嫩叶、茎、老叶和根,且均存在显着差异。StRab5b基因在马铃薯不同品种中的相对表达量由高到低依次是紫花白（ZHB）、夏坡蒂（XPD）、陇薯7号（L7）、底西瑞（DXR）、中薯4号（ZS4）、大西洋（DXY）。冀张薯8号和底西瑞接种晚疫菌后StRab5b诱导表达的结果表明,该基因均呈现出先升高后降低的趋势,且在接种72 h后达最高值。3.马铃薯和烟草中瞬时表达结果表明,叶片中瞬时表达StRab5b和StRab基因后接种晚疫菌,接种部位的病斑面积均显着低于瞬时表达空载体（EV）和接种H2O的叶片;且在烟草中瞬时表达StRab5b基因后叶片病斑的面积要低于瞬时表达StRab基因,而在马铃薯中瞬时表达则呈现出与烟草中相反的结果。4.构建了StRab5b和StRab基因超表达和沉默载体,并通过遗传转化获得9株StRab5b和5株StRab的阳性转基因株系。StRab5b-L8、StRab-L5转基因株系的叶片接病后病斑面积均显着小于对照。同时,DAB染色结果表明,转基因株系接种晚疫菌后叶片中H2O2的积累量高于对照植株;台盼蓝染色的结果表明,接种晚疫菌后对照叶片上坏死细胞数量明显高于转基因植株。5.ET、JA和SA信号通路的关键酶基因ACS、LOX、NPR1的转录水平检测的结果表明,接种晚疫菌后（0～96 h）,LOX和NPR1基因的相对表达量分别在StRab5b-L8和StRab-L5中显着高于对照;而在StRab5b-L8和StRab-L5转基因株系中SOD、POD、CAT、APX的活性均高于对照（SOD活性72 h和POD活性24 h除外）。6.建立了马铃薯高效的基因沉默体系,并利用该体系对马铃薯中StPds,StRab5b和StRab同源基因进行沉默,沉默的效率分别为100%、61%和59%。接种晚疫菌后,沉默StRab5b和StRab基因的叶片上病斑面积均显着大于对照叶片上的病斑。考马斯亮蓝染色结果表明,沉默StRab5b和StRab基因的烟草叶片上菌丝体的数量要多于对照叶片。7.StRab5b-L8和StRab-L5的转基因株系耐盐性的研究结果表明,StRab5b和StRab基因能够正向调控马铃薯的耐盐性。
刘敏[7]（2020）在《蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用》文中研究指明植物病毒病由于严重影响作物正常生长发育,发病后又难以防治,造成巨大经济损失,如何有效防治病毒病一直是制约农业生产的重要问题。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主组分,进行复制和移动,因此如何抑制其复制与移动是防治植物病毒病的两个重要环节。植物蛋白酶抑制子（Plant Protease Inhibitor,PPI）是植物重要的防御组分,调控植物对病、虫与草等的抗性,但PPI对病毒的抗性研究还相对较少。NbSIPI6是一个被胁迫诱导表达的大豆胰蛋白酶抑制子家族成员,实验室前期研究发现烟草NbSIPI6可抑制PVX病毒的长距离移动,增强本氏烟对PVX的抗性。本实验想进一步探究NbSIPI6是否拮抗PVY,以此丰富PPI类基因对抗病毒的认识。本实验利用NbSIPI6融合GFP的转基因材料,分析NbSIPI6本氏烟对PVY病毒的抗性,并为亚细胞定位和后续免疫沉淀提供基础。此外,分析了NbSIPI6响应病毒与水杨酸（Salicylic acid,SA）的表达模式以及NbSIPI6对病毒基因沉默抑制子活性的影响,为探索蛋白酶抑制子在抗病毒中的相关作用机制提供依据。主要研究结果如下:1.构建NbSIPI6 C端超表达载体与关键氨基酸点突变NbSIPI6m融合GFP载体,遗传转化本氏烟。经GFP检测和Hyg抗生素筛选,分别获得3株与7株独立阳性株系。通过实时荧光PCR检测,发现阳性株系中NbSIPI6表达量明显高于野生型2.蛋白质发挥作用需要正确折叠为前提,有时融合蛋白会影响蛋白质正确折叠而使靶蛋白丧失功能。因此拟通过验证NbSIPI6-GFP转基因植株是否具有抗病毒功能,来确证转基因植物材料的可用性。利用获得的T1代转基因材料,接种PVX-INF1和PVY,与突变株系和野生型相比,超表达NbSIPI6-GFP植株显着抑制了病毒的扩散,抗病毒能力明显提高。这说明,NbSIPI6 C端融合GFP不改变NbSIPI6抑制病毒移动的功能,可以用于后续研究;第二,NbSIPI6对病毒抑制不仅局限于PVX,也可提高对PVY的抗性。3.为明确NbSIPI6的细胞定位,将质膜Marker mCherry在NbSIPI6-GFP超表达株系叶片中瞬时表达,激光共聚焦检测发现,（1）瞬时表达部分区域呈现黄色,表明NbSIPI6与mCherry重合,即定位于细胞膜;（2）在细胞内其它区域还有清晰的绿色呈现,表明NbSIPI6不仅存在于细胞质膜,在细胞其他区域也有分布;（3）水杨酸或PVX处理后,NbSIPI6表达量显着高于对照,说明NbSIPI6的表达能够响应水杨酸与PVX。4.基因沉默是植物抵御病毒的重要方式,病毒常常利用基因沉默抑制子来抑制植物的基因沉默作用。因此我们想探究NbSIPI6是否具有拮抗病毒沉默抑制子功能。将实验室前期构建的NbSIPI6-1300和NbSIPI6m-1300等超表达载体分别与病毒沉默抑制子Hc-Pro和P19组合,再与GFP-1300共注射16c本氏烟,通过检测绿色荧光有无和强度,评价NbSIPI6对沉默抑制子的作用。研究发现,NbSIPI6与Hc-Pro或P19组合中,绿色荧光呈现出与注射Hc-Pro/P19沉默抑制子的相似强度,推测NbSIPI6可能不具有抑制病毒沉默抑制子。
商艺纷[8]（2019）在《番茄E3泛素连接酶CTI1和RHE分别在南方根结线虫抗性及镉胁迫抗性的功能研究》文中研究指明近30年来我国设施园艺取得了快速发展,在保障蔬菜供给,提高国民健康等方面发挥了重要作用。然而,由于长期连作和过量施用化学投入品,导致设施土壤土传病虫害和重金属污染问题日趋严重,直接威胁着我国设施园艺的可持续发展和农产品安全。因此,研究并寻求克服设施土壤连作障碍及污染的有效方法,对我国设施园艺的发展,具有重要的现实和科学意义。E3泛素连接酶是组成泛素—蛋白酶体（UPS）降解系统的关键酶之一,广泛参与了植物生长发育与逆境响应的各个进程。本文研究了E3泛素连接酶CTI1（CSN-Interacting-Protein 1）介导番茄对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的抗性机制;并初步揭示了E3泛素连接酶RHE（Root-High-Expression Protein）在番茄镉胁迫抗性中的重要功能。主要研究结果如下:1)发现RING家族E3泛素连接酶CTI1（Solyc01g105620）介导番茄对RKN（Root-Knot Nematode）的抗性机制。当RKN侵染番茄根系后,番茄根系中E3泛素连接酶CTI1的基因表达被迅速诱导。利用CRISPR/Cas9技术得到的CTI1基因敲除突变体cti1相较于野生型（WT）表现出对RKN的敏感性,而CTI1过表达株系对RKN的抗性增强。RKN处理后,cti1植株中茉莉酸（JA）、茉莉酸-异亮氨酸结合物（JA-Ile）的含量和JA相关基因的表达低于WT植株,而过表达植株中JA、JA-Ile的含量和JA相关基因的表达高于WT植株,表明CTI1通过JA途径调控番茄RKN抗性。此外,通过双分子荧光互补（BiFC）和蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）实验,我们发现CTI1与COP9信号复合体亚基CSN4和CSN5A分别在体内和体外相互作用。这些结果表明,E3泛素连接酶CTI1通过激活茉莉酸信号通路,与COP9复合物互作,参与番茄RKN的基础抗性。2)发现COP9信号复合体亚基CSN4和CSN5A介导RKN抗性的机制。RKN侵染后能迅速诱导番茄根系中CSN4和CSN5的基因表达与蛋白积累。利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）将CSN4和CSN5基因沉默后植株表现出矮化表型;RKN侵染后,根系中根结数量相较于WT显着增加,细胞膜脂质过氧化程度加重。同时,在CSN4和CSN5基因沉默植株中,JA含量的积累和JA合成和信号相关基因的表达在RKN侵染根系中也受到了明显抑制。此外,蛋白互作实验表明,CSN4和CSN5B能与JA抑制因子JAZ2互作,并且CSN4或CSN5基因沉默植株中,RKN诱导的JAZ2表达也受到了抑制。总之,我们的研究结果表明,番茄CSN4和CSN5在依赖于JA信号途径的RKN基础防御中发挥着关键作用。3)发现RING家族E3泛素连接酶RHE（Solyc09g089890）介导番茄镉抗性。通过转录分析,我们发现E3泛素连接酶基因RHE对镉胁迫具有高表达响应。通过构建番茄RHE基因的过量表达和突变体材料发现,在RHE过表达材料中,植株镉抗性相较于WT显着提高,镉积累显着减少,同时20S蛋白酶体活性显着增加;而rhe突变体正好表现出相反的表型。与此同时,RHE过表达植株中镉胁迫介导的活性氧（ROS）积累得到抑制,并且植株抗氧化酶活性较高。而rhe突变体植株中镉胁迫下ROS积累和损失程度显着高于对照,抗氧化酶活性受到抑制。此外,与WT相比,RHE过表达植株中的镉累积量有所下降,rhe突变体植株中镉累积量显着增加,这可能是由于Calcium/proton exchanger 3（CAX3）、Iron transporter protein 1（IRT1）、Heavy-metal-translocating ATPase（HMA）在RHE过表达植株和在rhe突变体的表达差异有关。总之,RHE过表达植株增强镉耐受性很可能是通过Ub/26S蛋白酶体清除镉破坏的蛋白和增加抗氧化酶的活性减少氧化应激来实现的;RHE过表达植株低镉累积量可能归因于CAX3的高表达,IRT1和HMA-A/B的低表达。基于以上的实验结果,得到结论如下:1)番茄RING家族E3泛素连接酶CTI1正调控对南方根结线虫的抗性,通过与COP9信号复合体亚基CSN4和CSN5A互作调控RKN介导的JA信号;COP9信号复合体亚基CSN4和CSN5A是RKN侵染后JA合成和信号通路所必需的,且JAZ2与COP9信号复合体亚基CSN4/CSN5B互作参与CSN介导的RKN抗性。2)番茄E3泛素连接酶RHE通过提高26S蛋白酶体活性和抗氧化酶活性调控镉胁迫抗性,并受镉转运相关基因表达的影响。
王智慧[9]（2019）在《Os-miR319b调控水稻对稻瘟病抗性的机制研究及与Argonaute2蛋白结合的小分子RNA文库的构建》文中研究指明稻瘟病是一种影响水稻产量的重要病害,严重时可导致水稻减产50%。因此,提高水稻对稻瘟病的抗性是当前迫切需要解决的问题,研究水稻抗稻瘟病的机制显得十分重要。小分子RNA介导的基因沉默是植物对病原菌抗性的重要调控途径。本研究通过构建水稻-稻瘟菌互作系统,利用高通量测序鉴定到了参与水稻-稻瘟菌互作的小分子RNA-miR319b。揭示了 miR319b通过沉默其靶标基因OsTCP21抑制茉莉酸信号通路,负调控水稻对稻瘟菌的抗性。此外,本研究拟构建水稻-稻瘟菌互作过程中与Argonaute 2（AGO2）蛋白相结合的小分子RNA文库,为挖掘参与稻瘟病抗性调控的小分子RNA提供新的方法和思路。具体研究成果如下:一、稻瘟病菌侵染诱导水稻miR319b上调表达,进而沉默其靶标基因OsTCP21,抑制茉莉酸信号通路,拮抗水稻抗病性。本研究通过稻瘟病菌Guy11侵染日本晴建立水稻-稻瘟菌互作系统,利用高通量测序以及生物信息学分析获得11个高度差异表达的Os-miRNAs。对候选的Os-miRNAs进行Northern Blot验证并筛选出miR319b进行下一步研究。miR319b预测的靶标基因为OsTCP21。通过原生质体瞬时转化系统观察到OsTCP21定位于细胞核,且原生质体内过表达OsTCP21可显着诱导H2O2的积累。为确定miR319b/OsTCP21在响应Guy 11侵染中的作用,观察Guy 11侵染日本晴（NPB）、miR319b 过表达株系（miR319b-OE）、OsTCP21过表达株系（OsTCP21-OE）、OsTCP21靶标位点同义突变株系（OsTCP21-Res）后表型差异以及ROS积累量,发现miR319b-OE株系相对于NPB更为感病,ROS积累量相对较少,而OsTCP21-OE和OsTCP21-Res株系相对抗病,ROS积累量较多。进一步检测水杨酸和茉莉酸通路的关键基因,发现茉莉酸通路的关键合成基因如OsLOX2、OsLOX5等在OsTCP21-OE和OsTCP21-Res株系中均被诱导表达,而水杨酸通路的关键基因无明显变化,表明miR319b/OsTCP21响应Guy11与茉莉酸通路相关。二、构建与水稻Argonaute 2（AGO2）蛋白相结合的小分子RNA文库。小分子RNA通过与Argonaute（AGO）蛋白结合形成RNA介导的沉默复合体（RISCs）来调控转录或转录后基因表达,进而参与调控植物生长发育以及逆境胁迫应答。前期本实验室研究发现,稻瘟菌亲和性菌株Guy11侵染之后,水稻ago2突变体相对于野生型日本晴水稻抗病性增强,并利用根癌农杆菌介导的水稻转化技术构建了OsAGO2过表达转基因株系。本实验首先验证了OsAGO2过表达转基因株系,进一步通过免疫沉淀富集稻瘟病菌侵染后的OsAGO2蛋白,并从中提取与OsAGO2蛋白相结合的小分子RNA,再经过连接RNA 3’Adapter、连接RNA 5’Adapter、反转录、PCR验证四个步骤构建与OsAGO2蛋白结合的小分子RNA文库。在此基础上,我们将利用高通量测序以及生物信息学分析,鉴定和稻瘟病抗性相关的小分子RNA,并对其功能进行深入研究。
于静[10]（2018）在《三个转录因子在本氏烟抗疫病中的功能与机制研究》文中提出疫霉属包含多种破坏性植物病原菌,其中寄生疫霉（Phytophthora parasitica,又名烟草疫霉）寄主范围广,可以为害多种作物,每年给农业生产带来严重危害。本氏烟（Nicotiana benthamiana）对寄生疫霉等多种疫霉菌敏感,易于进行病毒诱导的基因沉默和蛋白瞬时表达等操作,是研究植物与疫霉互作的一个优良模式植物。前期研究表明在寄生疫霉侵染本氏烟的过程中,大量的转录因子被病原菌诱导,然而这些转录因子在植物与疫霉互作中的作用和机制尚不清楚。例如,哪些转录因子在互作过程中发挥重要作用?它们参与调控的信号通路和代谢途径是什么?又是如何发挥作用的?本研究以本氏烟与寄生疫霉互作体系为体系,综合利用RNA-Seq、qRT-PCR、VIGS、酵母单杂交和ChIP-Seq等技术,较为系统地分析了本氏烟转录因子的生物信息学特征,鉴定了参与抗病的重要转录因子,并初步阐述了其中3个转录因子的作用机制。主要研究内容与结果如下:本氏烟与疫霉互作过程中的生物信息学分析。通过分析寄生疫霉侵染本氏烟叶片的RNA-Seq数据,鉴定获得了 1016个差异表达转录因子。通过荧光定量和半定量技术对其中300多个差异表达的转录因子进行了表达量的验证,挑选差异表达明显的32个转录因子进行VIGS沉默,对沉默效率超过50%的本氏烟叶片接种寄生疫霉和灰霉,进行抗病性分析,最终获得10个抗病相关的候选转录因子。生物信息学分析发现bHLH（basichelix-loop-helix）家族在寄生疫霉侵染本氏烟的过程中差异表达明显,且该家族在本氏烟中数量最庞大,于是推测该转录因子家族必然在本氏烟抗疫霉侵染过程中发挥着重要的作用。通过全基因组搜索方法鉴定了本氏烟bHLH转录因子（NbbHLHs）,发现NbbHLHs在本氏烟中高度富集,并且一些bHLH亚家族出现了选择性的扩张,导致部分亚家族中成员较多。分析发现,基因复制可能是造成该植物bHLH家族扩张的主要原因。28个NbbHLHs在疫霉侵染的过程中显着上调,并进一步预测了它们的顺式作用元件和互作蛋白。本氏烟NbERF1转录因子的抗病功能研究。通过分析寄生疫霉侵染本氏烟的RNA-Seq数据,发现NbERF1在侵染过程中强烈诱导上调表达,含有保守的53个残基的AP2/ERF DNA结合结构域。在本氏烟中过表达NbERF1可以增强本氏烟对寄生疫霉的抗性,而沉默该转录因子显着降低了其抗性,表明NbERF1正调控本氏烟对疫霉菌的抗性。通过RNA-Seq分析寄生疫霉发现NbERF1沉默后受体蛋白激酶（Receptor-like protein kinase,RLK）家族基因的上调表达受到严重的抑制。经生物信息学预测,发现有9个RLK基因的启动子区含有GCC-box。对这9个候选RLK基因进行qRT-PCR验证,结果表明NbERF1沉默后,RLK基因降低了对寄生疫霉的敏感性。此外,将RLK基因在本氏烟中过表达后,对寄生疫霉的抗性增强。因此推测,NbERF1通过结合RLK基因启动子区的GCC-box,调节下游RLKs基因的表达水平,增强本氏烟对寄生疫霉的抗性。本氏烟NbERF173在其抗病过程的功能分析。在寄生疫霉侵染过程中转录因子NbERF173显着上调表达。该转录因子含有一个保守的52个碱基的AP2/ERF的DNA结合结构域。在本氏烟中过表达NbERF173可以增强对寄生疫霉的抗性,而沉默该转录因子显着降低了对寄生疫霉和灰葡霉菌的抗性,表明NbERF1 73正调控本氏烟对疫霉菌的抗性。通过RNA-Seq分析寄生疫霉菌侵染NbERF1 73沉默的本氏烟叶片发现,在该转录因子沉默后,几个防御相关基因表现为显着的下调表达,尤其是2个蛋白酶抑制子PI1-B和KTI在NbERF173沉默后的表达被明显抑制。而将这2个蛋白酶抑制子基因在本氏烟中瞬时过表达,对寄生疫霉的抗性增强,在NbERF173沉默的本氏烟叶片中过表达,可以部分恢复本氏烟对寄生疫霉的抗性。本氏烟NbMYB57转录因子的抗病功能研究。通过分析寄生疫霉侵染本氏烟的RNA-Seq数据,发现NbMYB57也是一个疫霉菌侵染诱导转录因子,该基因含有2个保守的MYBDNA结合结构域。在本氏烟中沉默该转录因子显着降低了本氏烟对寄生疫霉和灰霉的抗性,表明NbMYB57正调控本氏烟对疫霉菌的抗性。结合RNA-Seq分析、ChIP-Seq分析和酵母单杂交文库的筛选,鉴定NbMYB57可能调控的下游靶标基因,发现茉莉酸信号通路中的调控因子JAZ3,WRKY转录因子和bHLH转录因子,可能是NbMYB57调控的靶标基因。
二、转基因植物中RNA介导的病毒抗性机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因植物中RNA介导的病毒抗性机制（论文提纲范文）
（1）转录因子BoaMYB51和BoaBIM1调控芥蓝吲哚族芥子油苷代谢机理及其功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 芥子油苷生物合成和代谢调控研究进展 |
| 1.1.1 芥子油苷的生物合成与降解 |
| 1.1.2 芥子油苷的代谢调控网络 |
| 1.1.3 芥子油苷在调节植物抗性中的作用机制研究进展 |
| 1.2 芸薹属蔬菜中芥子油苷代谢及功能研究进展 |
| 1.2.1 芥子油苷对芸薹属蔬菜风味的贡献 |
| 1.2.2 芥子油苷在芸薹属蔬菜抗性中的作用研究进展 |
| 1.2.3 化学调控和基因工程调节芸薹属蔬菜中芥子油苷代谢研究进展 |
| 1.3 黑斑病病原真菌及其致病机制研究进展 |
| 1.3.1 黑斑病病原真菌的种类及生物学特性 |
| 1.3.2 黑斑病病原真菌的致病机理 |
| 1.3.3 芸薹属蔬菜对黑斑病病原真菌抗性机制研究进展 |
| 1.4 R2R3-MYB类转录因子及其功能研究进展 |
| 1.4.1 MYB转录因子的结构 |
| 1.4.2 R2R3-MYB类转录因子功能研究进展 |
| 1.5 bHLH类转录因子BIM1研究进展 |
| 1.6 立题依据和研究目标 |
| 2 BoaMYB51在芥蓝黑斑病抗性中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 生物信息学分析网站 |
| 2.2.4 相关生化试剂 |
| 2.2.5 芥蓝培养 |
| 2.2.6 VIGS材料构建 |
| 2.2.7 芸薹链格孢的培养和接种 |
| 2.2.8 RNA的提取和表达分析 |
| 2.2.9 芥子油苷的提取和含量分析 |
| 2.2.10 数据统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 BoaMYB51-VIGS芥蓝植株黑斑病抗性分析 |
| 2.3.2 BoaMYB51-VIGS芥蓝植株IGS含量分析 |
| 2.3.3 BoaMYB51-VIGS芥蓝植株IGS合成基因表达分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 BoaMYB51正向调控芥蓝对黑斑病的抗性 |
| 2.4.2 BoaMYB51在芥蓝IGS合成中是重要的转录因子 |
| 3 BoaMYB51在芥蓝中IGS生物合成中的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 相关生化试剂 |
| 3.2.3 芥蓝培养 |
| 3.2.4 载体构建 |
| 3.2.5 芥蓝的遗传转化 |
| 3.2.6 RNA的提取和表达分析 |
| 3.2.7 芥蓝基因组DNA的提取 |
| 3.2.8 芥子油苷提取和分析 |
| 3.2.9 数据统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 芥蓝遗传转化过表达植株的获得和鉴定 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9系统产生BoaMYB51基因编辑材料 |
| 3.3.3 BoaMYB51过表达材料中黑斑病抗性分析 |
| 3.3.4 BoaMYB51过表达材料中IGS组分和含量分析 |
| 3.3.5 BoaMYB51过表达材料中IGS合成基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 4 酵母双杂交系统筛选BoaMYB51互作蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料及生化试剂 |
| 4.2.2 酵母自激活验证 |
| 4.2.3 酵母双杂交筛选芥蓝cDNA文库 |
| 4.2.4 酵母双杂交点对点验证蛋白互作 |
| 4.2.5 蛋白免疫印迹(western blot) |
| 4.2.6 原核蛋白诱导表达和蛋白纯化 |
| 4.2.7 Pull-down验证蛋白互作 |
| 4.2.8 烟草培养 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BoaMYB51的转录激活域的确定 |
| 4.3.2 酵母双杂交筛选BoaMYB51互作蛋白 |
| 4.3.3 BoaMYB51与筛选到蛋白的互作验证 |
| 4.3.4 BoaMYB51与Bol043819的蛋白互作结构域 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 碳末端是BoaMYB51的转录激活区域 |
| 4.4.2 Bol043819可能是IGS生物合成的调控蛋白 |
| 5 芥蓝中bHLH类转录因子BoaBIM1的鉴定与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 菌株与载体 |
| 5.2.3 生物信息学分析网站及数据库网站 |
| 5.2.4 相关生化试剂 |
| 5.2.5 芥蓝培养 |
| 5.2.6 RNA的提取和表达分析 |
| 5.2.7 芥子油苷的提取和含量分析 |
| 5.2.8 数据统计分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 芥蓝中BoaBIM1的蛋白序列比对 |
| 5.3.2 芥蓝中BoaBIM1的进化分析 |
| 5.3.3 芥蓝中BoaBIM1的亚细胞定位 |
| 5.3.4 芥蓝中BoaBIM1的基因表达分析 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 6 BoaBIM1转录调控IGS生物合成基因表达 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 植物材料 |
| 6.2.2 菌株与载体 |
| 6.2.3 生物信息学分析网站及数据库网站 |
| 6.2.4 相关生化试剂 |
| 6.2.5 芥蓝培养 |
| 6.2.6 VIGS材料构建 |
| 6.2.7 拟南芥转化(浸花法) |
| 6.2.8 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 6.2.9 RNA的提取和表达分析 |
| 6.2.10 芥子油苷的提取和含量分析 |
| 6.2.11 数据统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 BoaBIM1-VIGS芥蓝植株中IGS含量分析 |
| 6.3.2 BoaBIM1-VIGS芥蓝植株中IGS合成基因表达分析 |
| 6.3.3 拟南芥BoaBIM1异源过表达植株中IGS含量和相关基因表达分析 |
| 6.3.4 BoaBIM1转录调控IGS生物合成相关基因 |
| 6.3.5 BoaBIM1提高寄主植物对芸薹链格孢的抗性 |
| 6.3.6 BoaBIM1对植物根长有显着的促进作用 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 BoaBIM1正向调控芥蓝中IGS的合成 |
| 6.4.2 BoaBIM1直接转录调控芥蓝中IGS合成基因 |
| 6.4.3 BoaBIM1可能协同促进植物生长与抗性 |
| 7 讨论 |
| 7.1 转录因子MYB51是调控IGS生物合成和改善芸薹属蔬菜抗性的重要靶点 |
| 7.2 bHLH类转录因子BIM1协同促进植物生长与抗性 |
| 7.3 从模式植物中的基础研究到作物中的研究 |
| 7.3.1 模式植物拟南芥的基础研究在作物中的运用 |
| 7.3.2 作物研究中的模式体系 |
| 7.3.3 作物研究潜在的困难 |
| 8 结论、创新点与后续研究展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 后续研究展望 |
| 8.3.1 BoaMYB51基因功能的研究 |
| 8.3.2 BoaBIM1与BoaMYB51蛋白互作调控IGS代谢的分子机制 |
| 8.3.3 BIM1协同调控植物生长与抗性的机制 |
| 8.3.4 BIM1在提高芸薹属蔬菜优质安全高效生产中的应用 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（2）红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 红三叶主要病虫害、作物白粉病及病原菌鉴定的研究进展 |
| 2.1 红三叶主要病虫害 |
| 2.2 白粉病研究进展 |
| 2.3 病原菌鉴定研究进展 |
| 3 寄主植物-病原菌互作的转录组学研究进展 |
| 3.1 转录组学 |
| 3.2 转录组学在寄主植物与病害研究中的进展 |
| 4 植物抗病机制与GDSL脂肪酶的研究进展 |
| 4.1 作物病害生理生化反应研究进展 |
| 4.2 植物结构抗性研究进展 |
| 4.3 植物内源激素抗病性响应研究进展 |
| 4.4 GDSL脂肪酶基因研究进展 |
| 5 选题依据与意义 |
| 5.1 选题依据 |
| 5.2 主要研究内容 |
| 5.3 主要技术路线 |
| 第二章 红三叶抗白粉病的生理响应机制 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶白粉菌分离、鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 病害症状观察 |
| 1.3 病原菌形态学观察 |
| 1.4 病原菌rDNA-ITS片段的PCR扩增和序列测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病害症状与病原菌形态特征观察 |
| 2.2 rDNA ITS片段的扩增与测序 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病生理基础 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 测定方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶的生理生化差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶的生理生化差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×接菌后时间交互作用间红三叶生理生化的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 白粉菌侵染后红三叶内源激素的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 测定项目与方法 |
| 1.3 色谱条件及流动相的选择 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 标准样品保留时间?回归方程和决定系数 |
| 2.2 单因素处理间各内源激素的差异 |
| 2.3 二因素交互作用间各内源激素的差异 |
| 2.4 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶内源激素的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 红三叶响应白粉菌侵染的结构抗病性 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的细胞结构变化规律 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 白粉病不同抗性红三叶叶片显微结构 |
| 2.2 不同红三叶抗性材料叶片组织结构特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 白粉菌侵染后红三叶叶片细胞壁成份变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 红三叶抗白粉病的分子机制及TpGDSL基因的克隆与遗传转化 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的转录组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料与试验设计 |
| 1.2 测序样品准备和RNA提取 |
| 1.3 建库、测序及信息分析 |
| 1.4 测序数据质控与转录组组装 |
| 1.5 Unigene的注释 |
| 1.6 差异表达基因数字分析 |
| 1.7 基因功能注释及通路富集 |
| 1.8 差异表达基因的qRT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA-seq结果的实时定量PCR验证 |
| 2.2 转录组组装与注释 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)分析 |
| 2.4 接种白粉菌后DEGs的GO富集分析 |
| 2.5 接种白粉菌后DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.6 白粉菌侵染红三叶叶片诱导的 DEGs的 Map Man分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病TpGDSL基因克隆与遗传转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 红三叶TpGDSL基因克隆 |
| 1.2.2 构建表达载体 |
| 1.2.3 红三叶抗白粉病基因TpGDSL遗传转化拟南芥 |
| 1.2.4 拟南芥T_1代阳性植株鉴定 |
| 1.2.5 目的基因生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TpGDSL基因阳性克隆鉴定 |
| 2.2 TpGDSL基因的核苷酸序列分析 |
| 2.3 TpGDSL基因编码蛋白的一级结构分析 |
| 2.4 TpGDSL基因编码蛋白的二级结构分析 |
| 2.5 TpGDSL基因编码蛋白的三级结构分析 |
| 2.6 TpGDSL基因克隆与表达载体构建 |
| 2.7 转基因拟南芥T_1阳性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论与研究展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）基于Pro-BIUTNT启动子的苹果原生质体高效表达体系的建立及其免疫研究应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 苹果遗传转化技术 |
| 1.1.1 苹果同源遗传转化技术 |
| 1.1.2 苹果异源遗传转化技术 |
| 1.2 植物原生质体技术研究进展 |
| 1.3 植物组成型启动子 |
| 1.3.1 CaMV35S启动子 |
| 1.3.2 拟南芥泛素10(UBQ10)基因启动子 |
| 1.4 植物先天免疫防御机制 |
| 1.4.1 病原菌相关分子模式激发的免疫(PTI) |
| 1.4.1.1 FLS2 介导的植物PTI抗性 |
| 1.4.1.2 EFR和 CERK1 介导的植物PTI抗性 |
| 1.4.2 病原菌效应因子激发的免疫(ETI) |
| 1.4.2.1 ETI的“警卫”模型 |
| 1.4.2.2 ETI的“诱饵”模型 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物试材 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 表达载体 |
| 2.2 生物化学试剂 |
| 2.3 仪器设备及耗材 |
| 2.4 溶液和培养基配制 |
| 2.4.1 Western blot和蛋白纯化 |
| 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.4.3 正钒酸钠激活储存液 |
| 2.4.4 培养基 |
| 2.4.4.1 LB(Luria-Bertani)培养基 |
| 2.4.4.2 ‘王林’愈伤组织MS培养基 |
| 2.4.4.3 ‘紫红’愈伤组织MS培养基 |
| 2.4.4.4 拟南芥MS培养基 |
| 2.4.5 质粒大量提取 |
| 2.4.6 原生质体分离和转化 |
| 2.4.7 Luciferase报告试验 |
| 2.4.8 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.4.9 体外激酶试验 |
| 2.4.10 植物RNA提取(CATB法) |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 基因序列信息检索、引物设计和启动子调控元件预测 |
| 2.5.2 植物试材培养 |
| 2.5.2.1 ‘王林’愈伤组织继代培养 |
| 2.5.2.2 ‘紫红’愈伤组织继代培养 |
| 2.5.2.3 本生烟烟草(Nicotiana benthamiana)培养 |
| 2.5.2.4 野生哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana col-0)培养 |
| 2.5.3 重组表达载体构建策略 |
| 2.5.3.1 重组瞬时表达载体构建策略 |
| 2.5.3.2 重组二元表达载体构建策略 |
| 2.5.4 植物总RNA提取(CTAB法) |
| 2.5.5 cDNA第一链的合成 |
| 2.5.6 植物基因组DNA提取(试剂盒法) |
| 2.5.7 载体构建 |
| 2.5.7.1 基因和启动子克隆 |
| 2.5.7.2 琼脂糖凝胶回收 |
| 2.5.7.3 阳性选择克隆载体构建 |
| 2.5.7.4 转化大肠杆菌感受态 |
| 2.5.7.5 菌落PCR鉴定阳性转化 |
| 2.5.7.6 阳性克隆载体的提取与目的片段酶切回收 |
| 2.5.7.7 目标表达载体的酶切和目标核酸片段连接 |
| 2.5.7.8 目标重组表达载体的筛选鉴定 |
| 2.5.8 重组载体定向突变 |
| 2.5.9 质粒大量提取 |
| 2.5.10 原生质体分离 |
| 2.5.10.1 苹果愈伤组织原生质体分离 |
| 2.5.10.2 拟南芥原生质体分离 |
| 2.5.11 PEG介导的原生质体转化和瞬时表达 |
| 2.5.12 原生质体免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.5.13 原生质体luciferase报告试验 |
| 2.5.14 蛋白质印迹试验(western blot) |
| 2.5.15 MBP融合蛋白制备 |
| 2.5.15.1 pMAL重组载体转化大肠杆菌DE3 感受态 |
| 2.5.15.2 MBP融合蛋白原核诱导表达与纯化 |
| 2.5.16 体外激酶试验 |
| 2.5.17 转化农杆菌LBA4404 感受态 |
| 2.5.17.1 农杆菌LBA4404 感受态的制备 |
| 2.5.17.2 转化农杆菌LBA4404 感受态 |
| 2.5.17.3 农杆菌阳性转化单克隆菌落鉴定和保存 |
| 2.5.18 苹果愈伤组织遗传转化和阳性转化细胞系鉴定 |
| 2.5.18.1 苹果愈伤组织遗传转化 |
| 2.5.18.2 阳性转化细胞系鉴定 |
| 2.5.19 农杆菌介导烟草叶片下表皮细胞瞬时转化 |
| 2.5.20 GFP荧光信号显微观察 |
| 2.5.20.1 烟草叶片下表皮细胞GFP荧光信号显微观察 |
| 2.5.20.2 苹果原生质体GFP荧光信号显微观察 |
| 2.5.21 原生质体显微观察、计数和直径计算 |
| 2.5.21.1 原生质体显微观察 |
| 2.5.21.2 原生质体显微计数 |
| 2.5.21.3 原生质体平均直径计算 |
| 2.5.22 数理统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 苹果愈伤组织原生质体分离及条件优化 |
| 3.1.1 酶解时间、蔗糖和果胶酶对‘王林’苹果愈伤组织原生质体分离产量的影响 |
| 3.1.2 不同愈伤组织继代培养时间对原生质体分离产量的影响 |
| 3.2 Pro-BIUTNT启动子驱动目标基因在苹果原生质体中高效表达 |
| 3.2.1 Pro-BIUTNT启动子驱动参试基因在苹果原生质体中高效表达 |
| 3.2.2 不同愈伤组织继代培养时间和原生质体表达时间对目标蛋白表达水平的影响 |
| 3.2.3 Pro-MdBIUTNT启动子的不同区段在苹果原生质体中的活性比较 |
| 3.2.4 Pro-BIUTNT和 CaMV35S启动子在拟南芥和苹果原生质体中的活性比较 |
| 3.2.5 Pro-BIUTNT和 Pro-MdBIUTNT序列比对、相似度计算和相关调控元件预测 |
| 3.2.6 苹果细胞对Md MAPK6 的动态调控 |
| 3.2.7 Rubisco基因相关启动子在苹果原生质体中的驱动表达活性 |
| 3.3 Pro-BIUTNT高效驱动GFP融合蛋白在苹果原生质体和烟草表皮细胞中瞬时表达 |
| 3.3.1 Pro-BIUTNT驱动目标GFP融合蛋白在苹果原生质体中高效表达 |
| 3.3.2 Pro-BIUTNT驱动目标GFP融合蛋白在烟草叶片下表皮细胞中高效表达 |
| 3.4 基于Pro-BIUTNT的苹果原生质体瞬时表达技术在苹果免疫调控研究中的应用 |
| 3.4.1 flg22 诱导At BAK1和At FLS2 在苹果原生质体中的特异性蛋白互作 |
| 3.4.2 MKK7-MdMAPK6-MdWRKY33 介导的苹果PTI信号途径 |
| 3.4.3 Avr Rpt2 介导的苹果ETI抗性机制 |
| 3.4.3.1 AvrRpt2 和苹果细胞内源机制介导的RIN4 特异性剪切 |
| 3.4.3.2 生长素负反馈调控苹果原生质体Avr Rpt2 蛋白水平 |
| 4 讨论 |
| 4.1 酶解时间和愈伤组织培养时间对苹果原生质体分离和瞬时表达的影响 |
| 4.2 UBQ10 基因启动子高效促进目标基因在苹果原生质体中表达 |
| 4.3 5’-UTR和基因特异性调控对目标蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.1 5’-UTR对目标蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.2 基因特异性调控对目标蛋白表达水平的影响 |
| 4.4 AvrRpt2 介导的苹果特异ETI防御机制 |
| 4.4.1 不依赖于AvrRpt2的RIN4 细胞内源性剪切 |
| 4.4.2 生长素负调控苹果原生质体中AvrRpt2 的蛋白水平 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）小麦抗赤霉病基因PFT互作基因TaRBL的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 小麦赤霉病研究现状 |
| 1.2.1 小麦赤霉病及其危害 |
| 1.2.2 赤霉病抗性类型 |
| 1.2.3 形态抗性机制 |
| 1.2.4 细胞学抗性机制 |
| 1.2.5 生理抗性机制 |
| 1.2.6 分子抗性机制 |
| 1.2.7 抗性相关基因 |
| 1.2.8 其他与赤霉病相关物质 |
| 1.2.9 研究目的及意义 |
| 第二章 小麦TaRBL基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要溶液和培养基的配制 |
| 2.2.2 小麦总RNA提取 |
| 2.2.3 小麦RNA反转录 |
| 2.2.4 TaRBL基因的克隆 |
| 2.2.5 实验所用引物 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 小麦TaRBL基因的克隆 |
| 2.3.2 小麦TaRBL蛋白的序列分析 |
| 2.3.3 小麦TaRBL蛋白的进化关系分析 |
| 2.3.4 本章小结 |
| 第三章 小麦TaRBL基因与PFT基因的互作分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与载体 |
| 3.1.2 主要试剂及配制 |
| 3.1.3 植物培养 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 酵母双杂交载体构建 |
| 3.2.3 酵母感受态制备 |
| 3.2.4 酵母转化 |
| 3.2.5 PFT诱饵载体自激活检测与自毒检测 |
| 3.2.6 小麦TaRBL基因与Ta PFT基因互作验证 |
| 3.2.7 双分子荧光互补载体构建 |
| 3.2.8 农杆菌转化 |
| 3.2.9 双分子荧光互补试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 酵母双杂与双分子荧光互补载体的构建 |
| 3.3.2 TaPFT蛋白的自激活与自毒检测 |
| 3.3.3 酵母双杂交验证TaRBL与 Ta PFT相互作用 |
| 3.3.4 双分子荧光互补试验验证互作 |
| 3.3.5 本章小结 |
| 第四章 TaRBL基因功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料及载体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 不同抗感品种接种禾谷镰刀菌后TaRBL基因表达量的测定 |
| 4.2.2 FES的配制 |
| 4.2.3 VIGS载体构建 |
| 4.2.4 质粒线性化 |
| 4.2.5 病毒RNAs体外转录 |
| 4.2.6 小麦培养与病毒接种 |
| 4.2.7 禾谷镰刀菌孢子接种小麦 |
| 4.2.8 BSMV-VIGS沉默效率分析 |
| 4.2.9 TaRBL基因过表达载体的构建 |
| 4.2.10 小麦的遗传转化与鉴定 |
| 4.2.11 转基因小麦叶片DNA提取 |
| 4.2.12 转基因小麦叶片赤霉病抗性鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同抗感材料接种禾谷镰刀菌孢子后对TaRBL基因表达的影响 |
| 4.3.2 小麦VIGS的体系构建 |
| 4.3.3 BSMV-VIGS技术初步验证TaRBL基因功能 |
| 4.3.4 转基因植株GUS染色鉴定与PCR鉴定 |
| 4.3.5 转基因小麦叶片赤霉病抗性鉴定 |
| 4.3.6 本章小结 |
| 第五章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）NPR和抗菌基因对柑橘黄龙病的抗性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 柑橘黄龙病的发生与危害 |
| 1.2 柑橘黄龙病的研究现状 |
| 1.2.1 柑橘黄龙病的病原研究 |
| 1.2.2 柑橘黄龙病的病原检测 |
| 1.2.3 柑橘黄龙病的传播途径 |
| 1.2.4 柑橘黄龙病菌致病机理及与寄主的互作 |
| 1.3 柑橘黄龙病的防控 |
| 1.3.1 常规防控技术 |
| 1.3.2 柑橘抗黄龙病的遗传改良 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 技术路线 |
| 第3章 NPR和抗菌基因的筛选及遗传转化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 NPR基因的生物信息学分析 |
| 3.1.4 NPR基因的合成 |
| 3.1.5 NPR超表达载体和亚细胞定位载体的构建 |
| 3.1.6 NPR基因的亚细胞定位 |
| 3.1.7 人溶菌酶和抗菌肽超表达载体的构建 |
| 3.1.8 柑橘的遗传转化 |
| 3.1.9 转基因植株的检测 |
| 3.1.10 转基因植株中目的基因的表达分析 |
| 3.1.11 Western blotting分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 NPR蛋白的进化和氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 CiNPR3和CiNPR4蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.3 超表达载体构建 |
| 3.2.4 转基因植株的获得 |
| 3.2.5 NPR转基因植株中目的基因的表达分析 |
| 3.2.6 HPC和HAC转基因植株中人溶菌酶和抗菌肽CB的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CiNPR3和CiNPR4氨基酸序列的差异 |
| 3.3.2 CiNPR3和CiNPR4定位于细胞核 |
| 3.3.3 连接多肽LP4和2A的剪切效率 |
| 第4章 转基因植株对柑橘黄龙病的抗性表现 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 转基因植株的嫁接繁殖 |
| 4.1.3 毒源的筛选与接种 |
| 4.1.4 转基因植株中CLas含量的测定 |
| 4.1.5 转基因植株中淀粉含量的测定 |
| 4.1.6 转基因植株韧皮部结构的观察 |
| 4.1.7 感染CLas的转基因植株中外源基因的表达分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转基因植株中黄龙病病原菌的含量 |
| 4.2.2 转基因植株中外源基因的表达水平与CLas含量的相关性 |
| 4.2.3 转基因植株的发病率 |
| 4.2.4 转基因植株中淀粉含量的变化 |
| 4.2.5 转基因植株韧皮部结构的变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 CiNPR3和CiNPR4增强了转基因柑橘对黄龙病的抗性 |
| 4.3.2 人溶菌酶协同抗菌肽有效控制了CLas在转基因柑橘中的增殖 |
| 4.3.3 提高植株自身的防御反应能力和直接杀死病原菌是两种有效的提高柑橘黄龙病抗性的途径 |
| 第5章 NPR基因调控柑橘黄龙病抗性的机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 转基因植株C3-29和C4-2的转录组测序 |
| 5.1.3 CiNPR3和CiNPR4蛋白的酵母双杂交分析 |
| 5.1.4 转基因植株中SA和JA含量的测定 |
| 5.1.5 基因的表达分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 CiNPR3和CiNPR4转基因植株的转录组测序 |
| 5.2.2 CiNPR3和CiNPR4分别与CsTGA2和CsTGA6转录因子互作 |
| 5.2.3 CiNPR3和CiNPR4参与了SA和JA介导的信号途径 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 CiNPR4激活了PTI和ETI途径中防御反应相关基因的表达 |
| 5.3.2 CiNPR3和CiNPR4分别影响了柑橘体内的SA和JA水平 |
| 5.3.3 CiNPR3和CiNPR4调节了SA和JA分别介导的CsPR和CsPDF1.2基因的表达 |
| 5.3.4 CiNPR3和CiNPR4调节了柑橘对黄龙病的防御反应 |
| 第6章 导入HPC和HAC对柑橘响应黄龙病感染的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 转基因植株中胼胝质合成酶基因的表达分析 |
| 6.1.3 转基因植株中淀粉合成相关基因的表达分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 HPC和HAC转基因植株中响应黄龙病感染的胼胝质合成酶基因的表达分析 |
| 6.2.2 HPC和HAC转基因植株感染黄龙病后淀粉合成相关基因的表达分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 转基因植株感染黄龙病后胼胝质合成酶基因表达水平的变化 |
| 6.3.2 转基因植株感染黄龙病后淀粉合成相关基因的表达变化 |
| 第7章 讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.2.1 CiNPR3和CiNPR4提高了转基因柑橘对HLB抗性 |
| 7.2.2 人溶菌酶和抗菌肽Cecropin B基因融合产生的协同作用能明显抑制黄龙病病原菌的增殖 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ 缩略词 |
| 附录 Ⅱ 不同来源的NPR基因的序列号 |
| 附录 Ⅲ 酵母双杂交分析的培养基及配置方法 |
| 致谢 |
| 博士学位学习期间发表论文及参与研究项目 |
（6）马铃薯小G蛋白基因StRab5b的克隆及其调控晚疫病抗性的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 马铃薯晚疫病概述 |
| 1.1.1 马铃薯晚疫病的症状及危害 |
| 1.1.2 马铃薯晚疫病的防治 |
| 1.1.3 病原菌与寄主的互作 |
| 1.2 植物RAB蛋白的结构与功能 |
| 1.2.1 植物RAB蛋白的结构和特点 |
| 1.2.2 植物RAB蛋白的调控机制 |
| 1.2.3 植物RAB蛋白的功能 |
| 1.3 马铃薯晚疫病的抗性和信号通路 |
| 1.3.1 R基因主导的垂直抗性 |
| 1.3.2 QTL有关的水平抗性 |
| 1.3.3 马铃薯晚疫病相关的信号通路 |
| 1.4 马铃薯晚疫病抗性与植物体内ROS清除酶活性的关系 |
| 1.5 马铃薯晚疫病抗性相关基因功能的研究策略 |
| 1.5.1 利用基因沉默技术研究基因的功能 |
| 1.5.2 超表达研究基因的功能 |
| 1.6 马铃薯抗病育种现状 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 2 小G蛋白StRAB 5b的生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物物种的RAB蛋白序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 StRAB 5b蛋白功能的预测 |
| 2.2.2 StRAB 5b等RAB蛋白的系统进化树分析方法 |
| 2.2.3 StRAB 5b蛋白三级结构的预测 |
| 2.2.4 StRAB 5b的保守结构域分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 StRab5b和StRab的全基因序列分析 |
| 2.3.2 StRAB 5b蛋白功能的预测 |
| 2.3.3 StRAB 5b蛋白的三级结构 |
| 2.3.4 StRab 5b基因的系统进化树分析 |
| 2.3.5 StRAB 5b蛋白的保守结构域分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 StRab5b和StRab基因的克隆以及StRab5b基因表达谱和诱导表达研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 马铃薯品种 |
| 3.1.2 晚疫菌 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 马铃薯总RNA的提取方法 |
| 3.2.2 cDNA第一链的合成方法 |
| 3.2.3 RT-PCR扩增的体系和方法 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳的方法 |
| 3.2.5 StRab5b相对表达量以及诱导表达的检测 |
| 3.2.6 方差分析的方法 |
| 3.2.7 晚疫菌的培养、诱孢和接种 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 马铃薯总RNA的提取 |
| 3.3.2 StRab5b和StRab的基因克隆 |
| 3.3.3 晚疫菌的形态观察及诱孢后的显微观察 |
| 3.3.4 StRab5b基因的表达谱分析 |
| 3.3.5 StRab5b基因的诱导表达 |
| 3.4 讨论 |
| 4 StRab5b和StRab基因超表达载体和沉默表达载体的构建 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 载体和菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 YEB和LB培养基的制备 |
| 4.2.2 克隆片段的胶回收 |
| 4.2.3 质粒提取的方法 |
| 4.2.4 RT-PCR和PCR扩增的体系和方法 |
| 4.2.5 目的基因片段与载体的连接 |
| 4.2.6 酶切反应体系 |
| 4.2.7 目的基因片段与超表达和沉默表达载体的连接 |
| 4.2.8 StRab5b和StRab基因超表达载体和沉默表达载体的构建策略 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 平末端载体与StRab5b和StRab重组质粒酶切鉴定 |
| 4.3.2 PLG片段与StRab5b和StRab的重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.3.3 StRab5b和StRab超表达载体的构建 |
| 4.3.4 pBIA1300-StRab5b和StRab质粒转化农杆菌和PCR鉴定 |
| 4.3.5 pTRV2与VIGSStRab5b和StRab的质粒酶切鉴定 |
| 4.3.6 pTRV2-StRab5b和StRab的质粒的PCR鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 5 StRab5b的亚细胞定位和功能初步研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料和载体 |
| 5.1.2 马铃薯晚疫菌和培养基 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 亚细胞定位的方法 |
| 5.2.2 叶片中瞬时表达的方法 |
| 5.2.3 测定病斑的方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 StRab5b的亚细胞定位 |
| 5.3.2 StRab5b基因在烟草中的瞬时表达 |
| 5.3.3 StRab5b在马铃薯中的瞬时表达 |
| 5.4 讨论 |
| 6 StRab5b和StRab转基因植株的获得和调控马铃薯抗性的功能研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 菌液和试剂 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 引物 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 无菌苗的扩繁 |
| 6.2.2 农杆菌的扩繁 |
| 6.2.3 农杆菌侵染和共培养 |
| 6.2.4 芽的诱导分化 |
| 6.2.5 生根及抗性植株筛选 |
| 6.2.6 DAB染色液的配制和染色方法 |
| 6.2.7 台盼蓝染色液的配制和染色方法 |
| 6.2.8 壮苗和生薯培养基的配制 |
| 6.2.9 转基因植株实时定量PCR的鉴定 |
| 6.2.10 过氧化氢标准曲线的绘制和定量分析方法 |
| 6.2.11 SOD活性的测定 |
| 6.2.12 CAT活性的测定 |
| 6.2.13 POD活性的测定 |
| 6.2.14 APX活性的测定 |
| 6.2.15 抗性相关基因表达量的研究 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 马铃薯遗传转化体系的建立 |
| 6.3.2 马铃薯阳性转基因植株的PCR鉴定 |
| 6.3.3 马铃薯阳性植株中目标基因表达量的qRT-PCR鉴定 |
| 6.3.4 StRab5b和StRab转基因植株的表型鉴定 |
| 6.3.5 StRab5b和StRab转基因植株对P.infestans的抗性鉴定 |
| 6.3.6 StRab5b和StRab转基因植株接种后H_2O_2的积累 |
| 6.3.7 StRab5b和StRab转基因植株接种后坏死细胞数量检测 |
| 6.3.8 StRab5b和StRab转基因植株接种后SOD酶活性的变化 |
| 6.3.9 StRab5b和StRab转基因植株接种后POD酶活性的变化 |
| 6.3.10 StRab5b和StRab转基因植株接种后CAT酶活性的变化 |
| 6.3.11 StRab5b和StRab转基因植株接种后APX酶活性的变化 |
| 6.3.12 转基因植株接种后抗性相关基因ACS、LOX、NPR1转录水平的变化 |
| 6.4 讨论 |
| 7 烟草中沉默StRab5b、StRab同源基因及转基因植株的耐盐性评价 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 菌液和试剂 |
| 7.1.3 仪器设备 |
| 7.1.4 引物 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 VIGS侵染液的配制 |
| 7.2.2 菌液的制备和叶片注射 |
| 7.2.3 测定病斑的方法 |
| 7.2.4 RNA提取、cDNA第一链合成、半定量RT-PCR和q-PCR反应体系 |
| 7.2.5 考马斯亮蓝染色液的配制和染色方法 |
| 7.2.6 沉默效率的计算方法 |
| 7.2.7 DNA的提取 |
| 7.2.8 不同盐浓度的设置和组培苗的处理 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 烟草VIGS沉默体系的建立 |
| 7.3.2 烟草中Pds、Rab5b和Rab基因的沉默效率 |
| 7.3.3 烟草中Rab5b和Rab基因沉默后对晚疫病的抗性鉴定 |
| 7.3.4 烟草中沉默Rab5b和Rab基因后病菌的定性以及定量测定 |
| 7.3.5 StRab5b和StRab转基因植株的耐盐性评价 |
| 7.4 讨论 |
| 8 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物抗病毒的分子机制 |
| 1.1 植物病毒病 |
| 1.2 植物抗病毒的分子机制 |
| 1.2.1 R基因介导的抗病毒机制 |
| 1.2.2 基因沉默介导的抗病毒机制 |
| 2.马铃薯Y病毒的研究进展 |
| 2.1 马铃薯Y病毒 |
| 2.2 基因组结构 |
| 2.2.1 辅助成分蛋白酶HC-Pro |
| 3.蛋白酶抑制子(PI)在抗病中的研究进展 |
| 4.研究目的及意义 |
| 第二章 NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体构建及本氏烟遗传转化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂和培养基 |
| 2.3 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300融合载体的构建 |
| 2.3.1 NbSIPI6-pGEM T-Easy、NbSIPI6m-pGEM T-Easy及GFP-1300质粒的提取 |
| 2.3.2 目的载体的双酶切 |
| 2.3.3 NbSIPI6、NbSIPI6m片段及GFP-1300片段凝胶回收 |
| 2.3.4 连接与转化 |
| 2.3.5 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体的验证及测序 |
| 2.3.6 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体质粒提取 |
| 2.3.7 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体双酶切验证 |
| 2.4 农杆菌GV3101的转化 |
| 2.4.1 制备农杆菌感受态细胞 |
| 2.4.2 质粒转化农杆菌 |
| 2.5 载体遗传转化本氏烟 |
| 2.5.1 无菌播种本氏烟 |
| 2.5.2 扩大培养含表达载体的农杆菌菌液 |
| 2.5.3 预培养 |
| 2.5.4 烟草愈伤侵染共培养 |
| 2.5.5 烟草愈伤组织菌体洗涤及筛选 |
| 2.5.6 分化培养 |
| 2.5.7 生根培养 |
| 2.5.8 炼苗及种植 |
| 2.6 转基因烟草的验证 |
| 2.6.1 转基因烟草幼苗PCR鉴定 |
| 2.6.2 T0代转基因烟草PCR鉴定 |
| 2.7 实时定量PCR分析Nb SIPI6 的表达量 |
| 2.7.1 转基因烟草RNA的提取 |
| 2.7.2 靶基因cDNA一链的合成 |
| 2.7.3 实时荧光定量PCR检测T0代转基因苗的相对表达量 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 超表达NbSIPI6、点突变NbSIPI6m融合载体的构建 |
| 3.2 转基因植株的获得 |
| 3.3 转基因烟草植株鉴定 |
| 3.4 实时定量PCR分析Nb SIPI6 的表达 |
| 4 讨论 |
| 第三章 Nb SIPI6-GFP与 Nb SIPI6m-GFP转基因植株的抗病性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂与培养基 |
| 2.3 转基因烟草T1代抗生素抗性筛选 |
| 2.4 T1代转基因株系GFP荧光检测 |
| 2.5 转基因株系的抗病性分析 |
| 2.5.1 转基因株系接种PVX-INF1病毒 |
| 2.5.2 转基因株系接种PVY病毒 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因烟草T1代抗生素抗性筛选 |
| 3.2 T1代转基因株系GFP荧光检测 |
| 3.3 转基因烟草抗病性分析 |
| 3.3.1 转基因株系接种PVX-INF1 的表型 |
| 3.3.2 转基因株系接种PVY病毒后的表型 |
| 3.3.3 转基因株系接种PVY后 Nb SIPI6 的表达模式 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NbSIPI6 的亚细胞定位及表达特点 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂与培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 亚细胞定位 |
| 2.3.2 Nb SIPI6受外源水杨酸的诱导表达 |
| 2.3.3 Nb SIPI6受PVX病毒的诱导表达 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 亚细胞定位 |
| 3.2 NbSIPI6 受外源水杨酸(SA)的诱导表达 |
| 3.3 NbSIPI6受PVX的诱导表达 |
| 4 讨论 |
| 第五章 NbSIPI6对基因沉默的抑制作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与实验方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂与培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 烟草材料培养 |
| 2.3.2 农杆菌GV3101的转化 |
| 2.3.3 农杆菌扩大培养 |
| 2.3.4 农杆菌瞬时表达16c转基因烟草 |
| 2.3.5 检测NbSIPI6是否具有抑制沉默抑制子的活性 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 第六章 讨论与展望 |
| 1 研究讨论 |
| 2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（8）番茄E3泛素连接酶CTI1和RHE分别在南方根结线虫抗性及镉胁迫抗性的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 根结线虫概述 |
| 1.1.1 根结线虫的寄生过程 |
| 1.1.2 植物对根结线虫的抗性机制 |
| 1.1.2.1 PTI |
| 1.1.2.2 ETI |
| 1.1.2.3 激素信号途径 |
| 1.1.2.4 UPS调控的蛋白泛素化在植物免疫中的作用 |
| 1.2 植物镉胁迫的研究进展 |
| 1.2.1 植物对镉的吸收和转运 |
| 1.2.2 植物对镉的耐受机制 |
| 1.2.2.1 细胞壁和根系分泌物固定 |
| 1.2.2.2 液泡隔离解毒 |
| 1.2.2.3 植物螯合素(PCs)具有抗Cd胁迫的作用 |
| 1.2.2.4 金属硫蛋白(MTs)在Cd耐受中起作用 |
| 1.2.2.5 UPS依赖的蛋白酶体活性参与Cd胁迫 |
| 1.3 E3 泛素连接酶及其在胁迫中的作用 |
| 1.3.1 E3 泛素连接酶 |
| 1.3.2 RING家族E3 泛素连接酶在植物激素信号和胁迫中的作用 |
| 1.4 COP9 信号复合体的概述 |
| 1.4.1 COP9 信号复合体的发现 |
| 1.4.2 CSN的结构 |
| 1.4.3 CSN在植物病原响应中的作用 |
| 1.4.3.1 R基因介导的对病原体的抗性 |
| 1.4.3.2 JA介导的防卫反应 |
| 1.4.3.3 SA介导的防卫反应 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 番茄E3 泛素连接酶CTI1 介导的南方根结线虫抗性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料及生长条件 |
| 2.1.2 南方根结线虫的培养与接种 |
| 2.1.3 根结品红染色与数量统计 |
| 2.1.4 番茄CTI1 过表达载体和CRISPR/Cas9 敲除载体的遗传转化 |
| 2.1.4.1 培养基的配置 |
| 2.1.4.2 无菌苗的培养 |
| 2.1.4.3 预培养 |
| 2.1.4.4 共培养与分化培养 |
| 2.1.4.5 生根培养与移栽培养 |
| 2.1.5 转基因植株的分子检测 |
| 2.1.5.1 PCR法在DNA水平上检测转基因植株 |
| 2.1.5.2 番茄CTI1 过表达阳性植株Western Blot蛋白水平的检测 |
| 2.1.6 总RNA提取和基因表达分析 |
| 2.1.7 JA、JA-Ile含量测定 |
| 2.1.8 蛋白相关实验 |
| 2.1.8.1 蛋白提取 |
| 2.1.8.2 蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.1.8.3 体外泛素化实验 |
| 2.1.8.4 烟草双分子荧光互补(BiFC)实验 |
| 2.1.8.5 免疫共沉淀反应 |
| 2.1.9 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 CTI1 在番茄中的组织特异性表达 |
| 2.2.2 CTI1 的亚细胞定位研究 |
| 2.2.3 CTI1 的自身泛素化活性分析 |
| 2.2.4 CTI1 过表达载体和CRISPR/Cas9 敲除载体的构建 |
| 2.2.4.1 CTI1 过表达载体的构建 |
| 2.2.4.2 CTI1 CRISPR/Cas9 敲除载体的构建 |
| 2.2.5 CTI1 过表达和CRISPR/Cas9 敲除植株的获得 |
| 2.2.6 CTI1 过表达和CRISPR/Cas9 敲除植株的鉴定 |
| 2.2.6.1 CTI1 过表达植株的鉴定 |
| 2.2.6.2 番茄CTI1 CRISPR/Cas9 敲除植株的鉴定 |
| 2.2.7 CTI1 过表达和敲除植株对RKN的抗性分析 |
| 2.2.7.1 番茄根系中CTI1 受根结线虫诱导 |
| 2.2.7.2 番茄CTI1 过表达和敲除植株对根结线虫抗性分析 |
| 2.2.8 CTI1 在响应RKN侵染反应的JA信号通路是必需的 |
| 2.2.8.1 根结线虫侵染对CTI1 过表达和敲除植株的JA和 JA-Ile含量的影响 |
| 2.2.8.2 根结线虫侵染对CTI1 过表达和敲除植株中JA信号通路基因表达量的影响 |
| 2.2.9 番茄CTI1与CSN4/CSN5A互作 |
| 2.2.9.1 BiFC验证CTI1与CSN4/CSN5A互作 |
| 2.2.9.2 Co-IP验证CTI1与CSN4/CSN5A互作 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 CTI1 编码的蛋白具有E3 泛素连接酶活性 |
| 2.3.2 CTI1 在基础防御中的作用 |
| 2.3.3 CTI1 调控JA介导的番茄对RKN的抗性 |
| 3 番茄COP9 信号复合体介导的南方根结线虫抗性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料及生长条件 |
| 3.1.2 病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建和病毒侵染 |
| 3.1.2.1 VIGS载体构建 |
| 3.1.2.2 农杆菌介导的病毒侵染 |
| 3.1.3 南方根结线虫的培养与接种 |
| 3.1.4 根结品红染色与数量统计 |
| 3.1.5 根提取物中脂质过氧化的测定 |
| 3.1.6 总RNA提取和基因表达分析 |
| 3.1.7 JA、JA-Ile含量测定 |
| 3.1.8 蛋白互作验证分析 |
| 3.1.8.1 酵母双杂 |
| 3.1.8.2 烟草双分子荧光互补(BiFC)系统 |
| 3.1.9 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 番茄COP9 复合体各亚基系统进化树分析 |
| 3.2.2 CSN番茄植株防御反应中的表达谱分析 |
| 3.2.3 CSN在番茄植株防御反应中的蛋白积累分析 |
| 3.2.4 沉默CSN4和CSN5 后抗RKN的表型分析 |
| 3.2.5 沉默CSN4和CSN5 抑制RKN诱导的CSN4和CSN5 蛋白积累 |
| 3.2.6 CSN4和CSN5是RKN侵染反应中JA合成和信号通路所必需 |
| 3.2.7 CSN4和CSN5与JA负调控因子JAZ2 的相互作用 |
| 3.2.7.1 CSN4和CSN5与JA负调控因子JAZ2 在酵母系统中互作 |
| 3.2.7.2 BiFC验证JAZ2和CSN4/CSN5B互作 |
| 3.2.8 JAZ2 参与CSN介导的RKN抗性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CSN4和CSN5 调节植物对RKNs的基础防御 |
| 3.3.2 JA生物合成和信号响应需要CSN4和CSN5 |
| 3.3.3 CSN4和CSN5 影响JA共受体COI1/JAZ2 的稳定性 |
| 3.3.4 CTI1与CSN4/CSN5B互作对RKN抗性的机制 |
| 4 番茄E3 泛素连接酶RHE耐镉胁迫的功能研究 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料及处理 |
| 4.1.2 番茄RHE过表达载体和CRISPR/Cas9 敲除载体的遗传转化 |
| 4.1.3 转基因植株的分子检测 |
| 4.1.3.1 PCR法在DNA水平上检测转基因植株 |
| 4.1.3.2 番茄RHE过表达阳性植株Western Blot蛋白水平的检测 |
| 4.1.4 总RNA提取和基因表达分析 |
| 4.1.5 镉含量测定 |
| 4.1.6 镉胁迫下光合参数Fv/Fm的测定 |
| 4.1.7 抗氧化酶活力测定 |
| 4.1.8 H_2O_2 含量测定 |
| 4.1.9 蛋白的原核表达与纯化 |
| 4.1.10 体外泛素化实验 |
| 4.1.11 20 S蛋白酶体活性测定 |
| 4.1.12 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RHE在番茄中的组织特异性表达 |
| 4.2.2 RHE的亚细胞定位 |
| 4.2.3 RHE是具有E3 泛素连接酶活性的蛋白 |
| 4.2.3.1 RHE蛋白的原核诱导与纯化 |
| 4.2.3.2 RHE蛋白体外泛素化活性分析 |
| 4.2.4 RHE过表达载体和CRISPR/Cas9 敲除载体的遗传转化 |
| 4.2.4.1 RHE过表达载体的构建 |
| 4.2.4.2 RHE CRISPR/Cas9 敲除载体的构建 |
| 4.2.5 RHE过表达和CRISPR/Cas9 敲除植株的获得 |
| 4.2.6 RHE过表达和CRISPR/Cas9 敲除植株的鉴定 |
| 4.2.6.1 RHE过表达植株的鉴定 |
| 4.2.6.2 RHE CRISPR/Cas9 敲除植株的鉴定 |
| 4.2.7 RHE过表达和基因敲除植株镉胁迫表型分析 |
| 4.2.8 镉对RHE过表达和基因敲除植株镉含量的影响 |
| 4.2.9 镉对RHE过表达和基因敲除植株蛋白酶体活性的影响 |
| 4.2.10 镉对RHE过表达和基因敲除植株抗氧化酶系统的影响 |
| 4.2.10.1 镉对RHE过表达和基因敲除植株H_2O_2 含量的影响 |
| 4.2.10.2 镉对RHE过表达和基因敲除植株抗氧化酶含量的影响 |
| 4.2.11 镉对RHE过表达和基因敲除植株镉转运相关基因表达的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 过表达RHE提高蛋白酶体活性可能通过清除镉损伤蛋白增强镉耐受性 |
| 4.3.2 提高RHE表达和蛋白酶体活性通过减少氧化应激提高镉耐受性 |
| 4.3.3 提高RHE表达和蛋白酶体活性通过调控镉转运体基因的表达增强镉耐受性 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
（9）Os-miR319b调控水稻对稻瘟病抗性的机制研究及与Argonaute2蛋白结合的小分子RNA文库的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 miRNAs调控水稻对稻瘟病抗性的研究进展 |
| 1 水稻稻瘟病的研究进展 |
| 1.1 稻瘟病的症状及危害 |
| 1.2 稻瘟菌的致病机制 |
| 1.3 稻瘟病的防治 |
| 2 植物miRNAs的研究进展 |
| 2.1 miRNAs的生物合成 |
| 2.2 miRNAs在生物胁迫中的作用 |
| 2.3 miRNAs调控水稻抗病性的研究进展 |
| 2.4 miR319和TCP转录因子的研究进展 |
| 3 植物Argonaute蛋白的研究进展 |
| 3.1 Argonaute蛋白概况 |
| 3.2 RNA介导的沉默复合体(RISCs) |
| 3.3 Argonaute 2蛋白参与植物免疫的作用研究 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 Os-miR319b调控水稻对稻瘟病抗性的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株与植物 |
| 1.2 培养基的配置 |
| 1.3 稻瘟菌的培养及接种 |
| 1.4 水稻RNA的提取及Northern Blot验证 |
| 1.4.1 水稻样品总RNA的提取 |
| 1.4.2 Norhern Blot检测 |
| 1.5 反转录与实时荧光定量PCR |
| 1.5.1 水稻样品RNA的反转录 |
| 1.5.2 实时荧光定量PCR |
| 1.6 miR319b的人工合成 |
| 1.7 水稻OsTCP21和OsGAmyb基因的克隆 |
| 1.8 农杆菌介导的烟草瞬时表达 |
| 1.9 Western Blot检测 |
| 1.10 瞬时表达载体构建及水稻原生质体转化 |
| 1.10.1 过表达载体的构建 |
| 1.10.2 水稻原生质体的提取及转化 |
| 1.11 稻瘟菌激发子的制备 |
| 1.12 水稻原生质体过氧化氢积累量的测定 |
| 1.13 活性氧的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miRNAs差异表达文库的构建以及生物信息学分析 |
| 2.2 稻瘟菌Guy11特异性诱导水稻miR319b的表达 |
| 2.3 miR319b靶标OsTCP21和OsGAmyb |
| 2.3.1 实时荧光定量PCR验证miR319b与靶标基因关系 |
| 2.3.2 烟草瞬时表达系统验证miR319b与靶标基因关系 |
| 2.4 水稻原生质体瞬时表达体系验证miR319b/OsTCP21的功能 |
| 2.4.1 水稻原生质体中OsTCP21定位在细胞核 |
| 2.4.2 水稻原生质体中过表达OsTCP21诱导H2O2的积累 |
| 2.5 miR319b负调控水稻对稻瘟病菌抗性 |
| 2.6 miR3 19b/OsTCP21调控水稻免疫防卫反应的信号通路解析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 与Argonaute 2蛋白结合的小分子RNA文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株与植物 |
| 1.2 培养基的配置 |
| 1.3 稻瘟菌的培养及接种 |
| 1.4 实时荧光定量PCR |
| 1.5 Western Blot检测 |
| 1.6 蛋白免疫沉淀 |
| 1.7 与AGO蛋白结合的小分子RNA的分离提取 |
| 1.8 小分子RNA文库构建 |
| 1.8.1 连接3'SR Adaptor |
| 1.8.2 连接5'SR Adaptor |
| 1.8.3 反转录 |
| 1.8.4 PCR验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 OsAGO2过表达株系的验证 |
| 2.2 水稻OsAGO2蛋白的免疫沉淀富集 |
| 2.3 与水稻OsAGO2蛋白结合的小分子RNA文库的构建 |
| 2.4 小分子RNA文库的质量检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文主要创新点 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）三个转录因子在本氏烟抗疫病中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号与缩略词 |
| 引言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 植物与疫霉互作机制研究进展 |
| 1 疫霉及其危害 |
| 1.1 疫霉菌概述 |
| 1.2 疫霉菌危害严重 |
| 1.3 疫霉菌防治困难 |
| 2 植物抗病机制 |
| 2.1 由植物R基因介导的抗性 |
| 2.2 PAMPs触发的植物抗病性 |
| 2.3 由效应分子触发的植物抗病性 |
| 3 植物与卵菌互作研究进展 |
| 3.1 植物与卵菌互作的理论基础 |
| 3.2 植物与卵菌互作系统 |
| 第二章 植物抗病相关转录因子研究进展 |
| 1 植物转录因子的基本结构 |
| 1.1 DNA结合结构域 |
| 1.2 转录调控域 |
| 1.3 核定位信号区 |
| 1.4 寡聚化位点 |
| 2 植物转录因子的调控活性 |
| 2.1 翻译后修饰 |
| 2.2 细胞核定位 |
| 2.3 二聚体化作用 |
| 3 转录因子与植物抗病性 |
| 3.1 AP2/ERF类转录因子与植物抗病性 |
| 3.2 bZIP类转录因子与植物抗病性 |
| 3.3 MYB类转录因子与植物抗病性 |
| 3.4 WRKY类转录因子与植物抗病性 |
| 3.5 NAC类转录因子与植物抗病性 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 本氏烟与疫霉互作过程中的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试本氏烟和菌株的选择与培养 |
| 1.2 实时荧光定量PCR |
| 1.3 本氏烟病毒介导基因沉默 |
| 1.4 本氏烟叶片抗病性测定 |
| 1.5 bHLH转录因子的序列检索和鉴定 |
| 1.6 本氏烟bHLH转录因子保守motif分析 |
| 1.7 所选植物bHLH转录因子的进化分析 |
| 1.8 基因复制分析 |
| 1.9 RNA的提取和实时荧光定量PCR |
| 1.10 顺式作用元件分析和蛋白互作网络预测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 本氏烟转录因子的鉴定及差异表达分析 |
| 2.2 利用qRT-PCR进行转录因子表达量的验证 |
| 2.3 基因沉默本氏烟植株的获得 |
| 2.4 候选转录因子的抗性评价 |
| 2.5 本氏烟中bHLH转录因子比较富集 |
| 2.6 本氏烟中bHLH家族的扩张 |
| 2.7 bHLH转录因子保守的motif分析 |
| 2.8 基因复制促进本氏烟bHLH转录因子家族的扩张 |
| 2.9 本氏烟bHLH转录因子的差异表达分析 |
| 2.10 寄生疫霉侵染诱导NbbHLH转录因子的顺式元件分析 |
| 2.11 qRT-PCR分析寄生疫霉侵染时NbbHLHs的表达水平 |
| 2.12 本氏烟NbbHLH蛋白互作网络预测 |
| 3 讨论 |
| 第二章 本氏烟NBERF1转录因子的抗病功能研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料和试剂 |
| 1.2 载体构建 |
| 1.3 农杆菌介导的本氏烟VIGS |
| 1.4 实时荧光定量PCR |
| 1.5 农杆菌介导的烟草稳定转化 |
| 1.6 本氏烟叶片的接种实验 |
| 1.7 RNA-Seq分析 |
| 1.8 酵母单杂交验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 本氏烟NbERF1在疫霉侵染阶段的表达分析 |
| 2.2 NbERF1转录因子序列的分离和鉴定 |
| 2.3 过表达NbERF1提高了本氏烟对寄生疫霉的抗性 |
| 2.4 过表达NbERF1抑制了本氏烟的生长 |
| 2.5 NbERF1沉默植株对寄生疫霉的抗性分析 |
| 2.6 NbERF1沉默植株RNA-Seq分析 |
| 2.7 NbERF1沉默后影响Receptor-like protein kinase基因的表达 |
| 2.8 NbERF1可以结合RLKs基因的启动子 |
| 3 讨论 |
| 第三章 本氏烟NBERF173转录因子的抗病功能研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料和菌株的选择 |
| 1.2 载体构建 |
| 1.3 农杆菌介导的本氏烟VIGS |
| 1.4 实时荧光定量PCR |
| 1.5 本氏烟叶片的接种实验 |
| 1.6 农杆菌介导的本氏烟瞬时转化 |
| 1.7 共聚焦荧光显微观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 本氏烟NbERF173在疫霉侵染阶段的表达分析 |
| 2.2 NbERF173转录因子的鉴定 |
| 2.3 本氏烟NbERF173的亚细胞定位 |
| 2.4 过表达NbERF173转录因子正调控本氏烟的抗性 |
| 2.5 NbERF173沉默植株的抗性分析 |
| 2.6 NbERF173沉默植株的RNA-Seq分析 |
| 2.7 NbERF173沉默后抑制2个蛋白酶抑制子基因的表达 |
| 2.8 NbERF173对PI基因的调控作用 |
| 3 讨论 |
| 第四章 本氏烟NBMYB57转录因子的抗病功能研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 载体构建 |
| 1.2 VIGS和病原菌接种试验 |
| 1.3 实时荧光定量PCR |
| 1.4 拟南芥原生质体转化 |
| 1.5 原核表达 |
| 1.6 体外ChIP-DNA |
| 1.7 筛选酵母单杂交文库 |
| 1.8 NbMYB57沉默植株RNA-Seq分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 本氏烟中MYB57在疫霉侵染阶段的表达分析 |
| 2.2 NbMYB57转录因子序列的分离和鉴定 |
| 2.3 过表达NbMYB57转录因子增强本氏烟的抗性 |
| 2.4 NbMYB57沉默植株的抗性分析 |
| 2.5 本氏烟NbMYB57的亚细胞定位 |
| 2.6 染色体免疫共沉淀鉴定转录因子NbMYB57的调控基因 |
| 2.7 转录因子NbMYB57的调控靶标基因的鉴定 |
| 2.8 NbMYB57调控下游基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 主要结论与创新点 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表或待发表的论文 |
| 致谢 |
四、转基因植物中RNA介导的病毒抗性机制（论文参考文献）
- [1]转录因子BoaMYB51和BoaBIM1调控芥蓝吲哚族芥子油苷代谢机理及其功能研究[D]. 王梦雨. 浙江大学, 2021
- [2]红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化[D]. 蒲小剑. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [3]基于Pro-BIUTNT启动子的苹果原生质体高效表达体系的建立及其免疫研究应用[D]. 王宪璞. 山东农业大学, 2021
- [4]小麦抗赤霉病基因PFT互作基因TaRBL的克隆及功能分析[D]. 张露凡. 河南科技学院, 2021(07)
- [5]NPR和抗菌基因对柑橘黄龙病的抗性研究[D]. 彭爱红. 西南大学, 2021(01)
- [6]马铃薯小G蛋白基因StRab5b的克隆及其调控晚疫病抗性的功能研究[D]. 田再民. 内蒙古农业大学, 2020(06)
- [7]蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用[D]. 刘敏. 浙江师范大学, 2020(01)
- [8]番茄E3泛素连接酶CTI1和RHE分别在南方根结线虫抗性及镉胁迫抗性的功能研究[D]. 商艺纷. 浙江大学, 2019(04)
- [9]Os-miR319b调控水稻对稻瘟病抗性的机制研究及与Argonaute2蛋白结合的小分子RNA文库的构建[D]. 王智慧. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]三个转录因子在本氏烟抗疫病中的功能与机制研究[D]. 于静. 南京农业大学, 2018(07)