一、大鼠急性胰腺炎病理学特征与氧自由基变化的关系（论文文献综述）
文玲[1]（2020）在《安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、INOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表达影响的实验研究》文中研究表明目的:探究安胰颗粒对左旋精氨酸诱导的重症急性胰腺炎大鼠核转录因子-κBp65（nuclear factor-κBp65,NF-κBp65）、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、环氧合酶-2（cyclo-oxygenase,COX-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、白细胞介素1-β（interleukin 1-β,IL-1β）表达水平的影响,阐明安胰颗粒有效治疗重症急性胰腺炎的主要机制,丰富临床治疗重症急性胰腺炎的方法,改善重症急性胰腺炎的预后。方法:取鼠龄为42～49天的清洁级雄性成年SD（Sprague-Dawley,SD）大鼠120只,体重约200～250g,适应性喂养7天后,用电脑随机数字表随机分为4组。分别为正常组、模型组、中药组及西药组,每组30只大鼠。各组进一步分为3小时、6小时、12小时三小组,每组10只大鼠。中药组造模前连续三天以8g/kg的安胰颗粒水溶后灌胃,一天1次;正常组不做处理,自由饮水饮食;西药组造模前1小时予以人重组白介素10（Recombinant human interleukin-10,rh IL-10）10000U行腹腔注射;经以上预处理后,取模型组、中药组、西药组大鼠,造模前禁食不禁水12小时,以6%左旋精氨酸（L-arginine）溶液按150mg/100g剂量腹腔注射3次,每次间隔1小时,诱导SAP模型。用最后一次注射结束时间开始,按3小时、6小时、12小时时间点将四组大鼠分批麻醉后取腹主动脉血并处死大鼠进行解剖,观察胰腺大体形态,迅速摘取胰腺组织。采用酶联免疫吸附测定法测血清TNF-α、IL-1β水平;取胰腺组织,进行病理切片制作、用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测NF-κBp65mRNA含量、用免疫组化法测定NF-κBp65、iNOS、COX-2表达。采集所有数据进行统计学分析。结果:（1）胰腺病理切片结果:正常组电镜下胰腺小叶结构清晰,腺泡细胞、腺管、胰岛形态结构正常,腺泡细胞内见深蓝色点状细胞核。模型组随时间延长,小叶结构模糊,细胞排列紊乱,可见成片破裂细胞堆积,视野模糊,腺泡细胞大面积空泡性坏死,细胞核游出或破碎,间隙增宽,炎性细胞浸润,间质小血管破裂坏死,红细胞溢出。中药组胰腺小叶结构尚可见,炎性细胞浸润、血管破裂、细胞坏死情况与模型组对比明显改善,细胞肿胀明显,尚可见清晰细胞轮廓及在位的细胞核。西药组胰腺电镜下改变与中药组大体相似。（2）血清TNF-α、IL-1β:除正常组外,其余各组造模后各时间点血清TNF-α、IL-1β均随时间延长而显着升高,12小时间点为本实验观察时间中的峰值,同时间点与正常组两两对比差异有统计学意义（其中TNF-α水平p<0.01,IL-1β水平p<0.05）;与模型组同时间点两两对比,中药组和西药组血清TNF-α、IL-1β显着下降,差异有统计学意义（p<0.01）。中药组和西药组对比差异无统计学意义（p>0.05）。（3）胰腺组织NF-κBp65mRNA:除正常组外,其余各组造模后各时间点胰腺组织NF-κBp65mRNA均随时间延长而显着升高,12小时间点为本实验观察时间中的峰值,同时间点与与正常组两两对比差异有统计学意义（p<0.01）;与模型组同时间点两两对比,中药组和西药组胰腺组织NF-κBp65mRNA显着下降,差异有统计学意义（p<0.01）。中药组和西药组对比差异无统计学意义（p>0.05）。（4）胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2:除正常组外,其余各组造模后各时间点胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2均随时间延长显着升高,12小时间点为本实验观察时间中的峰值,同时间点与正常组两两对比差异有统计学意义（p<0.01）;与模型组同时间点两两对比,中药组和西药组胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2显着下降,差异有统计学意义（p<0.01）。中药组和西药组对比差异无统计学意义（p>0.05）。（5）SAP大鼠胰腺组织NF-κBp65的表达量与TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2表达量分别呈高度正相关（p<0.05）,而各TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2间亦存在不同程度的正相关关系（p<0.05）。结论:1、左旋精氨酸诱导的大鼠SAP模型血清TNF-α、IL-1β以及胰腺组织NF-κBp65mRNA、NF-κBp65、iNOS、COX-2水平在3小时时间点开始显着升高,于本组实验的12小时达到峰值,NF-κBp65与各因子的表达量间呈高度正相关,而各因子间亦存在不同程度的正相关关系,说明NF-κBp65mRNA基因转录诱导了NF-κBp65蛋白表达,蛋白过表达又导致下游靶基因转录或激活靶基因转录,炎症放大与微循环障碍同时发生在SAP早期,且炎症因子与微循环之间相互影响。2、安胰颗粒能够有效改善SAP大鼠胰腺组织病理损伤,说明安胰颗粒对胰腺组织具有保护作用,是有效治疗SAP的病理生理基础。3、安胰颗粒胃灌注后不仅显着降低SAP大鼠血清TNF-α、IL-1β含量,还显着降低胰腺组织NF-κBp65mRNA表达及NF-κBp65、iNOS、COX-2表达,提示安胰颗粒通过核因子-炎症因子通路,防治SAP系统性炎症反应综合征,通过核因子-微循环因子通路改善微循环,有效减轻SAP发病过程中的炎性损伤及微循环障碍,达到有效治疗SAP的目的。
廖健思[2]（2020）在《安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、ET/NO影响的实验研究》文中研究说明目的:基于核因子-κB（Nuclear Factor-κB,NF-κB）信号通路探讨安胰颗粒对重症急性胰腺炎i NOS的表达,ET、NO含量的水平及ET/NO比值的影响,阐明安胰颗粒治疗重症急性胰腺炎改善微循环障碍的作用机制,为临床治疗重症急性胰腺炎提供实验依据。方法:选取SD雄性大鼠,清洁级,体重约200-250g,按随机分配的方法分为正常对照组、SAP（模型组）组、IL-10（西药组）组、安胰颗粒（中药组）组共四个大组,每大组30只SD大鼠;每大组又分为3h、6h、12h三个亚组,每个亚组10只SD大鼠。SAP组大鼠造模前12h禁食不禁水,予左旋精氨酸（L-Arginine）溶液腹腔注射,150mg/100g,每小时一次,共三次,诱导重症急性胰腺炎大鼠;IL-10组于造模前腹腔注射10000U rh IL-10预处理后造模（方法同SAP组）;安胰颗粒组于造模前3天予安胰颗粒（8g/kg,相当于临床每天推荐剂量的5倍）灌胃处理,每天一次,共3天后造模（方法同SAP组）;正常对照组正常饮食。时间节点为SAP组最后一次腹腔注射,每组大鼠在3h、6h、12h予1%戊巴比妥（50mg/kg）麻醉后处死大鼠,摘取胰腺组织。一部分胰腺组织固定于4%甲醛溶液中,用于病理学观察及免疫组化法检测胰腺组织中NF-κBp65、i NOS的表达;另一部分胰腺组织加入适量PBS溶液充分匀浆后,迅速以3000r/min离心,取上清液保存于-20℃冰箱中,用于ELISA法检测胰腺组织中ET、NO水平。结果:（1）病理结果显示:正常对照组胰腺组织切片可见完整胰腺小叶结构,极少数切片可见少量中性粒细胞浸润;SAP组可见胰腺小叶间水肿明显,小叶结构模糊不清,可见大量中性粒细胞浸润,腺泡细胞出现广泛坏死,间质小血管壁出血坏死,红细胞溢出;安胰颗粒组及IL-10组胰腺组织病理在胰腺小叶结构完整性及小叶间水肿程度,坏死及中性粒细胞浸润程度均较SAP组减轻。（2）免疫组化法结果显示:（1）与正常组相比,SAP组NF-κBp65表达显着增加（P<0.01）;与SAP组相比,IL-10组及安胰颗粒组NF-κBp65的表达均明显降低（P<0.01）,但安胰颗粒组与IL-10组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（2）与正常组相比,SAP组i NOS表达显着增加（P<0.01）;与SAP组相比,IL-10及安胰颗粒组i NOS的表达均明显降低（P<0.01）,但安胰颗粒组与IL-10组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（3）ELISA法结果显示:与正常组相比,SAP组ET、NO含量显着增加（P<0.01）;与SAP组相比,IL-10组及安胰颗粒组ET、NO含量均显着降低（P<0.01）,但安胰颗粒与IL-10组相比,ET、NO含量在各个时间点均无统计学意义（P>0.05）。（4）ET/NO比值:与正常组相比,SAP组ET/NO比值明显升高（P<0.01）;与SAP组相比,IL-10组及安胰颗粒组ET/NO比值有明显降低（P<0.01）,但安胰颗粒组与IL-10组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.安胰颗粒可减轻重症急性胰腺炎大鼠病理损伤,起到保护胰腺组织作用;2.安胰颗粒可以通过抑制NF-κB信号通路,从而抑制i NOS的表达,以及降低血管活性物质ET、NO的含量,纠正ET/NO的失衡,起到改善胰腺微循环的作用,从而达到治疗重症急性胰腺炎的效果。
文艺[3]（2020）在《腹腔穿刺引流对重症急性胰腺炎相关心肌损伤的保护作用及机制研究》文中研究说明研究背景和目的急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是由胰腺腺泡细胞内胰酶异常激活而导致胰腺实质自我消化引起的局部炎症反应,约20%轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis,MAP）可演变为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）。不同于具有自限性的MAP,SAP是以胰腺组织广泛的炎症反应和坏死为主要特征,具有复杂化和重症化的倾向,短时间内可由局部炎症迅速进展至全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,常可造成心、肺、肾和肠道等损伤进而引发多器官功能衰竭（multiple organ failure,MOF）,病死率高达15-30%。其中,SAP相关的心肌损伤（SAP-associated cardiac injury,SACI）,又称为“胰心综合征”,是SAP重症化进程中最严重的并发症之一,可表现为心功能异常改变、中毒性心肌炎甚至心力衰竭。目前针对SACI预防和治疗尚无有效的手段,因此积极探索其发生机制以及寻找可靠的防治措施已成为亟待解决的临床问题。业已证实,在SAP病程中,机体炎症反应导致的氧化应激与SACI的发生、发展有着密切的关系。在SAP早期,胰腺腺泡细胞和激活的炎性细胞会释放大量心肌抑制因子（对心肌有毒性作用的一类细胞因子和炎症介质）,这些心肌抑制因子会促使心肌细胞释放大量氧自由基,当超过机体对自由基的清除能力时,细胞内的生物大分子（如脂质、蛋白质、DNA等）会迅速被氧化,造成心肌细胞结构和功能的损伤,进而导致心室重构及心功能异常。有学者发现,膜渗透性氧自由基清除剂（tempol）能有效减轻AP大鼠心肌损伤,进一步证实了SACI与氧化应激之间的关系。综上可见,若能减轻SAP机体全身炎症反应及其伴随的氧化应激程度有望成为治疗SACI的有效手段。在SAP早期,机体全身炎症反应可导致腹腔内积聚程度不等的胰腺炎相关性腹水（pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF）,针对PAAF,我中心前期做了大量的临床及基础研究,证实了通过腹腔穿刺引流（abdominal paracentesis drainage,APD）将PAAF及时引流至体外是SAP治疗过程中一个重要的环节。通过APD将富含多种炎症介质和有毒物质的PAAF及时清除,能够有效减轻机体炎症和氧化应激反应程度,延迟或避免出现多器官功能衰竭,发挥对重要脏器的保护作用。此外,动物实验也证实APD能显着减轻SAP相关的肺和肠粘膜损伤。基于此,我们推测SAP早期实施APD有望对SACI起到明显的治疗作用。研究表明,氧化应激与氧化激酶功能的异常密切相关。据报道,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶的过度激活不但是机体氧化应激水平升高的重要机制,同时也是病理状态下心血管系统活性氧（reactive oxide species,ROS）产生的主要来源,与心血管疾病的发生、发展密切相关。鉴于SACI与氧化应激之间的密切联系以及多种炎症介质对NADPH氧化酶均有激活作用这一事实,NADPH氧化酶的活化有可能也参与了SAP引起的心肌氧化损伤。因此,我们推测APD有可能通过减轻NADPH氧化酶的活化,减少氧自由基产生进而对心肌组织起到保护作用。如果此推测成立,那么APD又是通过何种途径来减轻NADPH氧化酶激活造成的心肌氧化损伤呢?澄清这些问题将为APD治疗SAP的机制提供新的理论依据。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）是一种高度保守的核蛋白,生理状态下主要与核内染色体结合。研究发现,在急性胰腺炎时HMGB1可通过坏死胰腺组织的被动释放以及浸润的单核/巨噬细胞主动分泌到细胞外,因此PAAF中常含有高浓度的HMGB1。而胞外HMGB1作为一种重要的损伤相关分子模式可直接参与胰腺炎炎症级联放大反应及重症化,在胰腺及远位器官损伤中发挥着重要的作用。业已证实,HMGB1能通过作用损伤相关分子模式受体激活NADPH氧化酶,引起细胞内ROS含量增加。而PAAF中高浓度的HMGB1,在被腹膜重吸收后会造成循环中HMGB1浓度的二次升高,进一步激活心肌组织NADPH氧化酶。因此,早期实施APD引流PAAF,是否可以通过减少HMGB1的重吸收降低其循环中的浓度,减轻HMGB1所介导的心肌组织NADPH氧化酶的活化进而发挥心脏保护作用呢?尚需进一步研究。针对以上问题,我们首先采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射制备SAP大鼠心肌损伤模型,并对SAP大鼠实施APD,旨在进行下列研究:1、APD对SACI是否有保护作用;2、NADPH氧化酶激活在SACI中的作用及相关分子机制;3、APD是否能够调控心肌组织NADPH氧化酶表达,减轻氧化应激损伤。此外,在成功建立轻型胰腺炎大鼠模型的基础上,分别将SAP大鼠的PAAF以及中和了HMGB1的PAAF注入轻型胰腺炎大鼠的腹腔内,旨在进一步验证PAAF中HMGB1在SAP病程中的作用,以及APD治疗SACI的相关机制。实验目的、方法与结果第一部分:APD对SAP相关心肌损伤（SACI）的保护作用研究目的:观察APD对SAP大鼠治疗效果及对心肌损伤的保护作用研究方法1.APD对SAP大鼠死亡率的影响采用SD雄性大鼠75只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组25只。通过细针穿刺胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型。在SAP造模成功后,于右下腹置入外接负压引流球的橡胶引流管,腹腔内留置约0.5厘米并于腹壁固定,常规消毒后关腹建立APD模型。假手术组大鼠开腹后翻动胰腺组织数次,并于腹腔内留置一根0.5厘米长橡胶引流管后关腹。术后24小时记录各组大鼠死亡率,收集腹水计量并统计。2.APD对SACI的保护作用采用SD大鼠45只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组15只,造模方法同前。造模后8小时检测心电图,24小时检测心脏超声和动脉血压,完成后处死大鼠,搜集腹水、血清、心脏组织,检测:HE染色观察心肌组织病理改变并做病理评分,计算心肌组织干湿重比,Elisa法检测血清心肌酶谱、TNF-α和IL-1β浓度,Tunel法检测心肌细胞凋亡,western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果:1.造模后24小时,SAP组大鼠死亡率为40.0%,平均腹水量为9.5±1.7ml;SAP+APD组大鼠死亡率为16.0%,平均腹水量为6.5±1.4ml,显着低于SAP组。2.SAP组大鼠心电图出现明显异常,而APD组大鼠心电图偶见异常。此外,与Sham组相比,SAP大鼠心功能明显受损,动脉血压也明显降低。而SAP+APD组与SAP组相比,大鼠心功能的受损情况有明显改善。3.与Sham组相比,SAP组大鼠血清心肌酶谱、淀粉酶活性、TNF-α和IL-1β浓度显着升高;SAP+APD组大鼠上述指标较SAP组明显降低。心肌组织病理学观察及评分:与Sham组相比,SAP组大鼠可见心肌细胞浊肿,伴部分溶解变性,局部区域可见单核细胞浸润,符合早期心肌炎改变,且病理评分和干湿重比值明显增高。SAP+APD组大鼠心肌组织病理改变较SAP组明显减轻,病理评分和干湿比值明显降低。4.SAP组大鼠心肌组织出现明显的细胞凋亡,Bax和Cleaved-caspase-3表达明显升高,Bcl-2表达明显降低。而SAP+APD组大鼠心肌组织细胞凋亡明显减少,促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的失衡明显改善。结论:通过牛磺胆酸钠逆行注射胰胆管的方法能较好的制备SAP大鼠心肌损伤模型。其次,通过实施APD能明显降低SAP大鼠死亡率,减轻心肌组织的病理损伤,改善心脏功能的异常。第二部分:NADPH氧化酶在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究目的:明确NADPH氧化酶在SACI中的作用,证实APD通过调控NADPH氧化酶表达减轻心肌氧化损伤。1.NADPH氧化酶在SACI中的作用研究研究方法（1）体内实验,采用SD雄性大鼠60只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎夹竹桃麻素（apocynin）组（SAP-APO group）和apocynin对照组（APO-CON group）,每组15只。SAP-APO组和APO-CON组在造模前30分钟通过大鼠尾静脉注射用10%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）溶解的apocynin（20 mg/kg）,而Sham组和SAP组大鼠注射相同体积的DMSO,其余造模方法同前。造模后24小时检测心脏超声,完成后处死大鼠,搜集血清、胰腺和心脏组织,检测:免疫组化和western blot法检测心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达,光度法检测NADPH氧化酶活性,比色法检测氧化应激相关指标,DHE染色检测心肌组织ROS含量,HE染色观察心肌组织和胰腺组织病理变化并做病理评分,Elisa法检测血清心肌酶谱、血清炎症因子和淀粉酶活性,Tunel法检测心肌细胞凋亡,western blot法检测凋亡相关蛋白表达和MAPK信号通路（ERK1/2、JNK、p38）的蛋白表达和磷酸化水平。（2）体外模拟实验,首先用含5%和10%正常大鼠血清或SAP大鼠血清的培养基培养H9C2心肌细胞,采用CCK-8法于干预后3、6、12、24小时检测细胞活力,确定血清的最佳干预浓度和干预时间。接着,将H9C2心肌细胞分为正常大鼠血清组（normal rat serum group,NS）、SAP大鼠血清组（SAP rat serum group,SS）、SAP大鼠血清加apocynin组（SAP rat serum plus apocynin group,SA）和正常大鼠血清加apocynin组（normal rat serum plus apocynin group,NA）。检测:DHE染色检测心肌细胞ROS含量,流式细胞技术检测心肌细胞凋亡,western blot法检测心肌细胞ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平。2.APD对SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶表达的影响采用SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组10只,各造模方法同前。造模24小时后搜集心脏组织,检测:western blot法检测心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达,光度法检测NADPH氧化酶活性,DHE染色心肌组织检测ROS含量,比色法检测氧化应激相关指标。结果:1.首先与Sham组相比,SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶蛋白表达和活性均明显增高。与SAP组比较,SAP-APO组大鼠心功能异常明显减轻,血清心肌酶谱浓度、心肌组织病理评分、ROS含量和氧化应激相关指标水平均明显降低,心肌细胞凋亡也明显减少。同时SAP-APO组大鼠与SAP组相比,心肌组织促凋亡蛋白表达明显减少,抗凋亡蛋白表达明显增加,MAPK信号通路ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平也明显降低。而SAP-APO组大鼠胰腺组织病理评分与SAP组相比无显着差异,但血清炎症因子水平有一定程度降低。另外,Sham组与APO-CON组之间无统计学差异。2.在体外模拟实验中,确定用含10%SAP大鼠血清的培养基培养12小时为最佳干预条件。与NS组相比,SS组心肌细胞ROS含量明显升高,细胞凋亡比例明显增加,ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平也明显升高。SA组与SS组相比,上述指标均有不同程度降低。SS组与NA组之间无显着差异。3.SAP+APD组大鼠心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达和活性较SAP组明显降低,ROS含量明显减少,氧化应激相关指标的水平也明显降低。结论:上述实验结果表明NADPH氧化酶过度激活在SACI中发挥着重要作用,早期实施APD能抑制SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶的异常激活,减轻心肌组织的氧化损伤。第三部分:HMGB1在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究目的:明确APD通过调控HMGB1降低心肌组织NADPH氧化酶的表达研究方法1.采用SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组10只,各造模方法同前。造模24小时后搜集血清、腹水和胰腺组织,检测:Elisa法检测血清胰酶活性以及血清和腹水中HMGB1浓度,HE染色观察胰腺组织病理变化并做病理评分。2.采用SD雄性大鼠36只,通过腹腔连续注射雨蛙素的方法建立轻型胰腺炎大鼠模型,随机分为6组（每组6只）:（1）轻型胰腺炎对照组（control group,CN）;（2）PAAF注射组（PAAF injection group,PI）;（3）PAAF+抗HMGB1中和抗体50ug组（PAAF plus anti-HMGB1 neutralizing antibody 50μg injection group,PIH 50）;（4）PAAF+中和抗体100ug组（PIH 100 group）;（5）PAAF+中和抗体200ug组（PIH 200 group）;（6）PAAF+对照lgY蛋白200ug组（PAAF plus control lgY injection group,PIC）。注射后8小时搜集血清和心脏组织,检测:Elisa法检测血清HMGB1浓度,RT-PCR法检测心肌组织NADPH氧化酶mRNA水平,western blot法检测其蛋白表达。结果:1.与SAP组相比,APD治疗能显着减轻胰腺组织损伤,减少炎性细胞浸润,降低血清胰酶活性和HMGB1浓度。另外,在SAP组大鼠腹水中检测出高浓度HMGB1。2.通过对MAP大鼠腹腔注射PAAF后发现PI组血清HMGB1水平较CN组明显升高,伴Nox-2的m RNA和蛋白表达增高,Nox-4的mRNA表达增高。随着抗HMGB1中和抗体剂量逐渐增加,当中和抗体剂量达到200ug时大鼠血清HMGB1浓度明显降低,Nox-2的mRNA和蛋白表达以及Nox-4的m RNA表达也明显减少。另外,PIC组与PI组之间无明显差异。结论:早期实施APD能显着改善SAP大鼠胰腺的病理损伤,有效减少HMGB1的释放以及重吸收进入血液循环,从而抑制HMGB1介导的心肌组织NADPH氧化酶的表达。全文总结1.在SAP病程中,早期实施APD对SACI具有显着的保护作用。具体表现在降低机体血清心肌酶谱浓度,减轻心肌组织损伤程度,减少心肌细胞凋亡的发生,改善心功能的异常。2.NAPDH氧化酶的过度激活导致心肌组织产生过量ROS是SACI发生的重要机制。大量ROS的产生和堆积会引起心肌细胞凋亡以及MAPK信号通路的激活,造成心功能损害,而抑制NADPH氧化酶的活性能显着减轻SAP导致的心肌损伤程度。3.SAP时,PAAF中高浓度的HMGB1可以通过腹膜重吸收等途径进入机体的血液循环,上调心肌组织NADPH氧化酶的表达。在SAP早期实施APD,通过减少HMGB1释放以及重吸收降低其在循环中的浓度,进而可有效抑制HMGB1介导的NADPH氧化酶信号通路的激活,减轻心肌的氧化损伤,发挥对心肌保护作用（图1）。
裴丽英[4]（2020）在《基于UPLC-TOF-MS/MS技术探究L-精氨酸在急性胰腺炎大鼠体内的代谢产物变化》文中研究指明背景:急性胰腺炎（Acute pancreatitis,AP）是一种临床常见的急腹症,具有起病急骤、并发症多、病死率高等特征。为了探讨AP的病理生理、细胞生物学特性,并发症发病机制及治疗方法,学者建立了许多侵入性、非侵入性AP动物模型。但它们共同的缺点是模型欠稳定,可复性差,其中侵入性制模时易致细菌污染,不适用于AP继发感染的研究。近年来研究表明,腹腔内注射过量左旋-精氨酸（L-arg）能建立AP大鼠模型,且方法简单,价廉,可复性好,制模中避免了外源性细菌污染,是研究急性胰腺炎及防治措施较为理想的动物模型。尽管如此,L-arg诱发AP的详细机制仍不明确。特别是对经腹腔注射L-arg吸收后的体内代谢变化情况尚不清楚。因此,本研究拟采用超高效液相色谱-点喷雾电离串联质谱联用技术（UPLC-MS/MS）,对L-arg腹腔注射后大鼠体内代谢产物进行检测,以明确L-arg在AP造模过程中体内代谢变化情况,进一步阐明L-arg腹腔注射制备AP模型的形成机制。目的:探讨L-arg在AP造模过程中,血清及肝脏组织L-arg体内代谢产物变化。方法:雄性SD大鼠48只,随机分为对照组（NS组,n=24）及L-arg实验组（L-arg组,n=24）。L-arg组:腹腔注射20%L-arg 2次,每次间隔1h,每次剂量2.5g/kg大鼠体重,制作AP模型。NS组:NS以12.5ml/kg大鼠体重相同方式制作对照组模型。NS组和L-arg组大鼠按腹腔注射L-arg、生理盐水后3h、6h、12h、24h四时间点,将两组再分为4个亚组,每组6只。各亚组大鼠到达相应时间点处死。处死前,采集腹主动脉血用于检测血清淀粉酶、脂肪酶、血钙水平及L-arg代谢产物变化;观察胰腺、肝脏病理组织学变化;UPLC-MS/MS技术、metabolite pilot软件检测分析血液、肝内L-arg代谢产物变化。结果:1.血清淀粉酶、脂肪酶水平:NS组各时间点无明显差异（P>0.05）。L-arg组血清淀粉酶、脂肪酶在3h开始升高,12h达峰值,24h呈下降趋势,但仍高于对照组水平;在相同取材时间点,L-arg组较NS组血清淀粉酶、脂肪酶水平显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。2.血钙水平:NS组各时间点无明显差异（P>0.05）。L-arg组血钙6h开始下降,在相同取材时间点,L-arg组血钙水平较NS组明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）。3.HE染色观察:NS组胰腺组织完整无损害。L-arg组胰腺小叶结构紊乱,小叶间充血水肿,伴有大量炎症细胞浸润。NS组肝脏组织细胞完好无损伤,L-arg组肝脏组织肝窦充血扩张,肝细胞气球样变,伴点状坏死,大量炎性细胞浸润,细胞肿胀,肝小叶结构不完整,甚至出现肝细胞大量坏死及肝小叶片状出血。胰腺及肝脏组织病理损伤评分有统计学差异（P<0.01）。4.L-arg代谢产物:与NS组相比,在L-arg组大鼠AP发生过程中共检测出10种代谢产物。（1）血清中:检测出L-arg和8种代谢产物:3h时检测出L-arg及其5种代谢产物,分别为:M1（L-arg失去NH+脱饱和的产物）、M2（L-arg失去CH2N2+并甲基化的产物）、M3（脯氨酸）、M4（谷氨酸）、M5（瓜氨酸）;6h时检测出L-arg和8种代谢产物,分别为:M1、M2、M3（脯氨酸）、M4（谷氨酸）、M5（瓜氨酸）、M6（失去NH+并生成酮的产物）、M7（代谢过程未测出）、M8（失去CH2N2+并生成酮的产物）;12h、24h时,与NS组相比,L-arg组未检出新增产物峰。（2）肝脏中检测出L-arg的5种代谢产物:3h时检测出L-arg的5种代谢产物,分别为:M3（脯氨酸）、M5（谷氨酸）、M6、M9（失去CH2N2的产物）、M10（失去NH及NH+、脱甲基、形成羧酸的产物）;6h时检测出L-arg的3种代谢产物,分别为:M3（脯氨酸）、M5（瓜氨酸）、M6;12h、24h时,与NS组相比,L-arg组未检出新增产物峰。结论:1.腹腔注射L-arg成功诱导大鼠AP模型。2.腹腔注射L-arg后,在大鼠体内检测到10种L-arg代谢产物,其中血清8种,肝脏5种。其中,有3种代谢物（脯氨酸,谷氨酸和瓜氨酸）已明确。
王清华[5]（2020）在《钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究》文中指出急性胰腺炎是一种常见的内科急腹症,发病急,病情发展快,若不及时治疗,可能会危及生命。其发病原因多种多样,多与胆结石等胆道疾病,酗酒及暴饮暴食,胃十二指肠疾病等相关联。急性胰腺炎的病理机制仍未阐明,临床上也没有特异性的治疗药物,特别是急性重症胰腺炎,目前仍是对症治疗,愈后很差。各种因素如酶原激活、炎症介质、氧化应激、微循环障碍、核因子κB（NF-κB）途径等均参与了该发病过程。尽管胰腺炎的发病机制还没有完全阐明,研究表明激活胰腺腺泡细胞内的炎症信号通路是产生急性胰腺炎至关重要的分子机制。急性胰腺炎时,胰腺本身病变及由此引起的巨噬细胞和中性粒细胞被激活,释放大量的促炎性细胞因子,引发炎症的“瀑布样级联反应”,进而引起全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征（MODS）。胰腺腺泡细胞释放的促炎症细胞因子如TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-10和ICAM-1,以及免疫细胞是影响炎症死亡率的重要因素。这些炎症介质通过复杂的信号通路促进胰腺炎的发生与发展,其中IL-6/IL-6R/STAT3信号通路在急性胰腺炎及其全身炎症反应中起十分重要的作用。跨膜蛋白16A（TMEM16A）于2008年同时被3个实验室证明为钙激活氯离子通道,并提示其功能可能与细胞分裂周期、细胞增殖有关,是一类能被细胞内钙离子激活的阴离子通道。TMEM16A表达在多种细胞上,参与唾液腺、汗腺、呼吸道、及肠道上皮细胞钙依赖性氯离子分泌,调控平滑肌收缩,控制胃肠道起搏等生理过程。另外,TMEM16A参与肿瘤、高血压、疼痛等疾病的病理生理过程。在哮喘等呼吸道炎症的发病过程中都有TMEM16A的参与。TMEM16A在胰腺导管细胞,胰岛和腺泡细胞上均有表达,参与了导管细胞癌的发生和胰岛素分泌,并且参与胰腺细胞的酸性调节作用。但是,存在于腺泡细胞上的TMEM16A在急性胰腺炎中有什么样的作用及其作用机制有哪些仍未见报道。对此我们做了以下的研究:第一部分TMEM16A在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞上高表达目的:在动物和细胞水平观察雨蛙肽引起急性胰腺炎不同时间点的TMEM16A通道蛋白的改变。方法:在体研究:全部小鼠按体重随机分组,分为对照组、雨蛙肽6h组、雨蛙肽12h组和雨蛙肽24h组,每组6只。小鼠购进后适应性饲养3天,各组小鼠实验前一天晚自由饮水条件下禁食12小时,各雨蛙肽实验组小鼠腹腔注射雨蛙肽的生理盐水溶液,剂量为50μg/kg,每间隔1小时1次,连续注射7次,对照组小鼠同法腹腔注射等体积生理盐水。于最后一次注射后6小时、12小时和24小时分批取材:小鼠眼眶内眦部位进行采血,取出血后离心,保存血清。小鼠颈椎脱臼法处死后,摘取胰腺组织,western blot方法检测胰腺组织中TMEM16A通道蛋白;另取一部分,放置于4%的多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色的方法进行验证病理形态学检测,采用免疫组织化学方法检测胰腺组织TMEM16A通道蛋白的表达。体外实验:急性分离小鼠胰腺细胞,原代培养细胞,待细胞长到培养皿90%时,加入10-8M雨蛙肽,作用不同时间后收集细胞;保留细胞培养上清液;大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J细胞进行细胞培养,用10-8M雨蛙肽作用不同时间点后收集细胞,保留细胞培养上清液。免疫荧光方法检测TMEM16A通道蛋白在AR42J上的表达;提取细胞提取蛋白,western blot方法检测TMEM16A通道蛋白的表达。结果:雨蛙肽成功诱导急性胰腺炎小鼠模型;急性胰腺炎小鼠胰腺组织中TMEM16A通道蛋白表达上调;原代培养小鼠胰腺腺泡细胞炎症模型中TMEM16A通道蛋白表达上调;TMEM16A通道蛋白在正常AR42J细胞膜上表达,炎性AR42J细胞中TMEM16A通道蛋白表达上调。结论:TMEM16A通道蛋白在胰腺腺泡细胞上表达,雨蛙肽诱导的急性胰腺炎腺泡细胞TMEM16A通道蛋白表达上调。第二部分急性胰腺炎IL-6增多激活IL-6/IL-6R/STAT3促进TMEM16A表达目的:观察急性胰腺炎时IL-6表达增多及其对IL-6/IL-6R/STAT3信号通路的激活与TMEM16A蛋白调节作用。方法:ELISA方法检测急性胰腺炎小鼠胰腺组织及血清、原代培养小鼠胰腺腺泡细胞炎性培养上清液和AR42J细胞炎性培养上清液中IL-6含量。雨蛙肽处理AR42J细胞后western blot方法检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEME16A的表达。检测IL-6对AR42J细胞TMEM16A表达的浓度曲线筛选;IL-6处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEM16A的表达;IL-6和IL-6R中和抗体同时处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEM16A的表达;IL-6和STAT3抑制剂CucurbitacinⅠ同时处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路和TMEM16A的表达。结果:急性胰腺炎小鼠胰腺及血清中IL-6含量升高;炎性急性分离小鼠胰腺腺泡细胞培养上清液中IL-6含量增多,炎性AR42J细胞培养上清液中IL-6含量增多;雨蛙肽处理的AR42J细胞引起IL-6增多,激活IL-6/IL-6R/STAT3信号通路促进TMEM16A的高表达;IL-6促进AR42J细胞TMEM16A高表达,并且具有浓度依赖性;IL-6通过与IL-6R结合促进AR42J细胞TMEM16A的高表达;IL-6通过促进STAT3磷酸化促进AR42J细胞TMEM16A的高表达。结论:雨蛙肽引起的急性胰腺炎IL-6增多,激活IL-6/IL-6R/STAT3信号通路促进TMEM16A的高表达;IL-6促进AR42J细胞TMEM16A高表达;IL-6通过IL-6/IL-6R/STAT3促进TMEM16A的高表达。第三部分TMEM16A高表达促进急性胰腺炎的发生发展目的:观察急性胰腺炎高表达TMEM16A对炎症病理进程、IL-6含量及核转录因子NF-κB的影响。方法:全部小鼠按体重随机分组,分为对照组、模型组、T16Ainh-A01预先组和T16Ainh-A01后治组,除对照组外各组小鼠腹腔注射雨蛙肽的生理盐水溶液,剂量为50μg/kg,每间隔1小时1次,连续注射7次,对照组小鼠同法腹腔注射等体积生理盐水。T16Ainh-A01预先组于第一次注射雨蛙肽前30分钟时腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01,剂量为1mg/kg。T16Ainh-A01后治组于第一次注射雨蛙肽后30分钟时腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01,剂量为1mg/kg。于最后一次注射后12小时取材:小鼠眼眶内眦部位进行采血,取出血后,离心取上清。小鼠颈椎脱臼法处死后,摘取胰腺组织,采用ELISA法检测血清和胰腺组织匀浆液中IL-6的含量;western blot方法检测胰腺组织中TMEM16A通道蛋白和胞浆胞核内NF-κB活性亚基p65表达;另取一部分,放置于4%的多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色的方法进行病理形态学检测,采用免疫组织化学方法检测胰腺组织TMEM16A通道蛋白的表达。通过质粒的转化、质粒扩增、质粒DNA提取、pEGF-TMEM16A和pEGF-TMEM16A-siRNA质粒与lipofection2000转染试剂共同转染AR42J细胞,荧光显微镜下观察转染效率,经过G418进行筛选,分别提取细胞胞浆蛋白和核蛋白,观察细胞核与胞浆中NF-κB的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-6的表达。通过免疫共沉淀方法检测TMEM16A与IP3R的相互作用,用BAPTA阻断细胞内的钙离子,观察钙离子升高对NF-κB活性的影响。结果:雨蛙肽作用于AR42J细胞12小时已经出现显着炎症反应,此时TMEM16A通道蛋白表达增多;对细胞内NF-κB活性亚基p65检测发现胞浆中的p65蛋白减少,而细胞核中的p65蛋白表达增多,p65蛋白发生了细胞核转移;而给予T16Ainh-A01后TMEM16A通道蛋白下降,胞浆中p65蛋白增加,而减少细胞核中的p65蛋白增多,抑制了p65蛋白发生了细胞核转移。腹腔注射雨蛙肽12小时的小鼠血清和胰腺组织中IL-6的含量明显增加,与雨蛙肽组小鼠相比,给予TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01后血清和胰腺组织IL-6的含量均下降;HE染色结果显示,与对照组（生理盐水）相比,雨蛙肽作用小鼠12小时,胰腺发生急性炎症表现:小叶间隙增宽、水肿、炎性细胞渗出、腺泡细胞肿胀细胞水肿。而腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01后,炎症病理变化得到改善。pEGF-TMEM16A过表达质粒和敲除质粒转染成功的AR42J细胞呈现绿色荧光,经过G418进行筛选后检测TMEM16A蛋白,转染效率约为50%;过表达TMEM16A的细胞,胞浆中p65蛋白减少,细胞核中p65蛋白增多,核p65/浆p65比值明显增大,p65发生核转移;敲除TMEM16A后,应用雨蛙肽复制急性炎症模型时发现胞浆中p65蛋白增多,细胞核中p65蛋白减少,抑制了p65发生核转移,同时细胞上清中IL-6的含量减少。TMEM16A与IP3R具有直接结合作用;BAPTA阻断细胞内的钙离子,减少了钙离子对NF-κB激活作用。结论:急性胰腺炎时TMEM16A蛋白表达,通过与胞浆内IP3R直接作用,增加细胞内的钙离子浓度,促进胰腺炎症细胞NF-κB核转移,促进IL-6的合成与释放,促进急性胰腺炎的病理进程。
赵荷[6]（2020）在《高压氧对急性胰腺炎大鼠线粒体凋亡通路的影响研究》文中研究指明目的:急性胰腺炎是消化系统的常见疾病,其起病急,病情变化较快,极易发展为重症急性胰腺炎,进而导致全身性炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征。细胞不同的死亡方式对急性胰腺炎的严重程度及病情的预后有重要影响,细胞凋亡被认为是一种轻度或无炎症反应的细胞死亡方式。在重症急性胰腺炎中,受损的腺泡细胞缺血缺氧,坏死严重,高压氧治疗或许能够改善这种受损的细胞状态。但高压氧对急性胰腺炎的治疗机制尚未完全阐明。因此,本研究主要探究高压氧在急性胰腺炎中的作用及其是否通过线粒体凋亡途径起作用。方法:将80只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为以下四个组:CON（正常对照组,8只）、SHAM（假手术组,24只）、AP（急性胰腺炎组,24只）和AP+HBO（急性胰腺炎+高压氧治疗组,24只）。AP组和AP+HBO组通过胰胆管结扎模拟胆源性胰腺炎的发病机制建立急性胰腺炎动物模型。诱导急性胰腺炎后6小时,AP+HBO组大鼠在2.5 ATA的压力下给予100%的氧气90分钟,包括加压和减压时间,分别为15分钟。各组在急性胰腺炎造模后第1、2和3天的时间点分别处死8只大鼠,用HE染色评估胰腺组织病理损伤;收集血液上清检测血清淀粉酶、脂肪酶、促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）的水平;流式细胞仪和荧光显微镜观察大鼠胰腺腺泡细胞线粒体膜电位的变化情况,以评估早期凋亡的水平;ATP分析试剂盒检测组织中的ATP水平;并使用Western Blot检测组织中BAX,Bcl-2,以及caspase-3,caspase-9和PARP的活化表达;RT-PCR检测caspase-3,caspase-9;免疫组织化学染色来评估胰腺组织中BAX,Bcl-2的表达情况。结果:高压氧治疗减轻了急性胰腺炎的严重程度,降低了组织病理学评分、血清淀粉酶、脂肪酶和炎性细胞因子（TNF-α和IL-6）的水平。与急性胰腺炎组相比,高压氧治疗在第一天增加了组织中凋亡相关蛋白BAX/Bcl-2的表达比值,提高了组织caspase-3,caspase-9和PARP的活性以及ATP的水平,降低了线粒体膜电位水平,结果第二天与第一天部分一致,而第三天没有明显差异。结论:高压氧治疗可以诱导急性胰腺炎大鼠caspase依赖性的细胞凋亡,从而减轻急性胰腺炎,这可能是通过调节Bcl-2家族成员的线粒体凋亡途径引起的,而ATP水平的维持也是重要的前提条件。
石容[7]（2020）在《柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠微循环障碍的影响》文中研究表明目的:通过牛磺胆酸钠（sodium taurocholate,STC）制备重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠模型,检测柴黄清胰活血颗粒干预前后胰腺组织病理学评分变化,血清学相关指标、胰腺组织中一氧化氮（nitrieoxid,NO）、内皮素（endothelin,ET）、血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)、前列腺素I2（prostaglandin I2,PGI2）含量水平的变化,胰腺组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达情况,初步探讨柴黄清胰活血颗粒对大鼠胰腺微循环障碍的影响及其可能机制。方法:将48只SD大鼠随机分为三组:假手术组（A组）,SAP模型组（B组）,柴黄清胰活血颗粒治疗组（C组）。A组开腹后翻动腹腔脏器,5min后关腹,B组、C组通过经十二指肠乳头逆行胰胆管注射3.5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型。将柴黄清胰活血颗粒配制成浓度为0.2g/ml。C组予以配制好的柴黄清胰活血颗粒药液灌胃,每次10ml/kg,每4小时一次（0到6点停止灌胃）,A组B组予以等量生理盐水灌胃,每4小时一次（0到6点停止灌胃）。于造模后12小时、24小时每次每组分别处死8只大鼠,大体观察腹腔内腹水、皂化斑、胰腺坏死情况,腹主动脉取血5ml,离心后取上清液检测血清淀粉酶（anylase,AMY）水平。随后迅速完整提取胰腺组织,剪取胰腺组织为3份,一份固定于4%多聚甲醛溶液中,用于HE染色及病理评分;另一份胰腺组织加入适量生理盐水后捣碎,3000转离心10min取上清,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测胰腺组织ET、NO及血栓素B2（thromboxane B2,TXB2）、6酮前列腺素FIα（6-keto-prostaglandin1α,6-keto-PGF1α）的含量水平;剩余一份胰腺组织采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测胰腺组织VEGFmRNA的表达,蛋白印迹法（Western Blot）法检测VEGF的蛋白表达。结果:（1）剖腹后大体观察:A组可见部分肠道轻微粘连,胰腺组织呈均一性灰白色,未见水肿、充血、坏死,腹腔未见皂化斑;B组可见肠道粘连、胃肠胀气明显,胰腺组织明显充血、水肿,片状出血灶,腹膜后、大网膜、肠系膜根部见大量皂化斑;C组肠道粘连、胃肠胀气、胰腺组织充血水肿及出血较B组明显减轻,腹膜后、大网膜见散在皂化斑。胰腺组织病理学评分:B组和C组12h、24h胰腺组织病理评分均显着高于A组相应时点（P<0.05）,C组胰腺组织病理评分较B组相应时点显着降低（P<0.05）;组内各时间点比较,三组组内比较均无差异（t=1.027,P=0.322;t=0.197,P=0.846;t=1.998,P=0.335）。（2）血清淀粉酶水平比较:B组和C组12h、24h血清淀粉酶水平高于A组相应时点,有统计学意义（P<0.05）,C组12h血清淀粉酶水平较B组12h无显着差异（P>0.05）,C组24h血清淀粉酶水平较B组24h显着降低（P<0.05）;组内各时间点比较,A组、C组血清淀粉酶组内比较无差异（t=0.672,P=0.214;t=0.730,P=0.447）,B组24h血清淀粉酶水平较12h显着升高（t=2.249,P=0.041）。（3）胰腺组织NO、ET含量及ET/NO比值（简称E/N）变化:B组及C组胰腺组织内ET及NO含量均显着高于A组（P<0.05）;C组各时点胰腺组织ET及NO含量较B组相应时点均显着下降（P<0.05）;组内两时间点比较,A组胰腺组织ET及NO含量一直处于低水平状态,组间无显着性差异（t=0.449,p=0.667;t=0.950,p=0.347）,B组胰腺组织ET及NO含量组间无差异（t=0.485,p=0.643;t=0.466,p=0.656）,C组胰腺组织ET及NO含量24h含量较12h均显着增加（t=6.544,p<0.001;t=2.745,p=0.029）。B组及C组E/N比值在12、24h时点较A组相应时点相均显着升高（P<0.05）;C组各时点E/N比值较B组相应时点明显下降（P<0.05）;组内两时点比较,A组E/N比值组间无统计学差异（t=1.248,p=0.252）,B组及C组24h时点E/N比值均高于12h时点,差异有统计学意义（t=3.029,p=0.019;t=2.642,p=0.033）。（4）B组及C组12、24h胰腺组织TXB2、6-keto-PGF1α含量较A组相应时点均显着升高（P<0.05）,C组各时点胰腺组织TXB2、6-keto-PGF1α含量较B组对应时点均显着降低（P<0.05）;组内两时点比较,A组胰腺组织TXB2、6-keto-PGF1α含量组间无显着性差异（t=0.107,P=0.918;t=2.226,p=0.061）,B组胰腺组织TXB2、6-keto-PGF1α含量24h较12h均显着升高（t=14.639,P<0.001;t=5.072,p=0.001）,C组胰腺组织TXB2含量24h显着高于12h（t=11.982,P<0.001）、6-keto-PGF1α组间无显着差异（t=1.543,p=0.167）。B组及C组T/P比值12、24h时点较A组相应时点均显着升高（P<0.05）,C组各时点T/P比值较B组相应时点明显下降（P<0.05）;组内两时间点比较,A组T/P比值组间无统计学差异（t=0.456,p=0.662）,B组及C组24h时点T/P比值均显着高于12h时点（t=4.026,p=0.005;t=4.428,p=0.003）。（5）B组及C组各时点胰腺组织VEGFmRNA及VEGF表达量较A组均明显增加（P<0.05）;C组各时点胰腺组织VEGFmRNA及VEGF表达量较B组相应时点均显着降低（P<0.05）;三组组内比较,A组VEGFmRNA及VEGF表达量一直处于低表达水平,组间无显着性差异（t=0.883,P=0.392;t=0.334,P=0.743）,B组VEGFmRNA及VEGF表达量在12h即明显增加,随着时间推移,表达量均逐渐增加,24h与12h比较差异显着（t=2.840,P=0.013;t=2.272,P=0.039）,C组VEGF与VEGFmRNA变化一致,表达量在12h即明显增加,随着时间推移均逐渐增加,24h与12h比较差异显着（t=2.265,P=0.040;t=2.262,P=0.040）。结论:1、柴黄清胰活血颗粒能改善SAP模型大鼠胰腺组织病理损害程度。2、柴黄清胰活血颗粒能通过下调胰腺组织血管活性物质ET/NO、TXA2/PGI2比值,并抑制胰腺组织VEGF蛋白的表达,从而改善SAP模型大鼠的胰腺微循环障碍。
范开亮[8]（2019）在《HO-1和中药大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究》文中提出研究背景重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis,SAP）病情重,并发症多,常释放大量炎症介质诱发全身系统性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,导致肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和严重感染等多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）[’1,2],病死率很高。SAP的临床治疗包括保守治疗或手术治疗,大量临床研究证实,外科治疗因为手术的创伤和应激反应会加重胰腺局部和全身的炎症反应,而且会继发严重感染,引起肺、肝、肾、心等器官的功能衰竭,病死率较高[3]。近年来我国重症急性胰腺炎的发病率升高,但缺乏有效的治疗手段来提高患者治愈率及存活率,因此重症急性胰腺炎的发病机制和治疗方法是目前临床研究的国际性难题。重症急性胰腺炎是一个多因素参与的复杂的病理生理过程[4],目前的研究表明,SAP发病的主要机制是:胰酶对胰腺的自身消化、肠道细菌移位、炎症细胞过度激活、钙超载、胰腺循环障碍和高脂血症等。胰腺内各种消化酶原被激活,诱导大量炎症细胞持续释放各种细胞因子,触发连续的炎症介质瀑布样级联反应,一系列的炎症反应导致多器官功能障碍[5]。胰腺作为原发器官,往往是受损最为严重的器官。肺作为SIRS最常见的靶器官,是最容易受累的器官,肺损伤是SAP最常见并发症之一。Bonjoch Le等[6]研究发现,采用牛磺酸诱导急性胰腺炎大鼠模型,肺泡巨噬细胞激活,炎性细胞浸润,出现急性胰腺炎相关性肺损伤。近几年的研究表明,炎症因子的持续过度释放是造成SAP病情恶化的主要因素之一。因此,SAP的临床治疗的重点是降低炎症反应、控制炎症介质瀑布样级联反应、维持促炎和抗炎反应的平衡,阻断SIRS引起的MODS。所以阻断SAP的炎症信号转导通路、抑制炎症因子的表达是目前研究和治疗的关键靶点。血红素加氧酶-1（HO-1）,是血红素降解的限速酶,也被称为热休克蛋白-32（HSP-32）,具有保护细胞、减轻氧化应激对细胞损伤的作用[7]。HO-1还具有影响细胞生长、炎症反应和凋亡等作用。一些动物实验证实,HO-1具有降低炎症反应的作用,能够减少组织细胞对不同促炎因子导致的炎症反应所引起的组织损伤[8]。在一些动物实验中,给予脂多糖（LPS）建立脓毒症模型,缺乏HO-1基因的大鼠和给予HO-1抑制剂的大鼠,器官损伤增加,死亡率升高[9-10]。这些研究表明,在缺血再灌注损伤中,在降低脓毒症模型的氧化应激反应中,在低氧环境中,HO-1在调控氧化应激、炎症反应等方面发挥重要的作用,并具有器官保护作用,HO-1具有可诱导的抗炎和器官保护作用[11-14]。TNF-α和L-10是体内重要的促炎和抗炎细胞因子,IL-10可抑制IL-2、IL-3及TNF-α等细胞因子的合成,还可以抑制TNF-α释放而减轻炎症反应、保护脏器功能,具有潜在的抗炎功能,对SAP所致的MODS有保护作用。TNF-α是由淋巴细胞以及巨噬细胞所分泌的炎症因子,释放后能诱导IL-2、IL-3、IL-6、IL-8及TNF-a的表达,导致炎性因子过度的表达和释放,过度的炎症反应导致细胞损伤和组织破坏[15-17]。近几年的一些研究发现,HO-1可调控IL-10的表达,介导IL-10的抗炎效果[18]。在小鼠巨噬细胞中,IL-10可通过p38-MAPK信号传导通路诱导HO-1的表达[19]。在LPS引起的脓毒性休克小鼠模型中,IL-10介导的抗炎作用可以被HO-1抑制剂ZnPP所减弱。近年来的研究发现,诱导HO-1基因表达与多条信号转导通路有关,而且各种炎症信号刺激通过不同的炎症信号传导通路诱导HO-1基因的表达。诱导HO-1基因表达的炎症信号传导通路可分为:（1）p38/MAPK炎症信号传导通路;（2）PI3K/AKT炎症信号传导通路（转录后水平的调节）;（3）JAK/STAT炎症信号传导通路;（4）蛋白激酶途径的调节。其中促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）炎症信号传导通路被研究证实可以诱导HO-1基因的表达。但HO-1的激活对p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用未见国内外研究报道,值得进一步研究证实,以指导临床应用。图1.HO-1及其相关p38 MAPK/NF-KB信号通路示意图在SAP中,HO-1的表达对促炎因子TNF-a、抑炎因子IL-10是否具有调节作用,对胰腺和肺是否具有器官保护作用,以及HO-1是否通过p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥调节炎症反应和器官保护作用,尚无定论。如果能从炎症信号传导通路阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供有力的武器。（国家自然基金课题（81503543）项目）目的观察血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）过表达及抑制对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠血清、胰腺和肺组织HO-1、促炎因子TNF-aα抑炎因子IL-10含量的变化,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,分析血红素加氧酶-1对胰腺和肺炎症反应的器官保护作用;观察HO-1过表达及抑制对SAP大鼠胰腺和肺组织p3 8 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,探讨HO-1抗炎作用以及对胰腺和肺器官保护作用的炎症信号传导通路机制。方法60只雄性SD大鼠,6～7周龄,220～260 g,随机分为4组:对照组、SAP模型组、HO-1抑制剂组、HO-1过表达组,每组15只。1、对照组:假手术组,只开腹,然后关腹,腹腔注射生理盐水,10ml/kg。2、SAP模型组:采用开腹经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,建模后腹腔注射生理盐水,10ml/kg。3、HO-1抑制剂组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,制备SAP模型后30min腹腔注射HO-1抑制剂锌原卟啉（Zn-protoporphyrin,Zn-PP）,20μxmol/kg。4、HO-1过表达组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,制备SAP模型后30 111min腹腔注射1HO-1促进剂血晶素,75μg/kg。在制模后24 h处死大鼠,腹主动脉留取血液标本,留取胰腺、肺组织标本。制备胰腺和肺组织石蜡切片,用HE（hematoxylin-eosin）染色法观察胰、肺组织病理学改变,进行组织病理学评分。应用免疫组织化学技术（免疫荧光法）对切片进行染色,观察促炎因子TNF-α、抗炎因子IL-10的细胞内表达情况。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清TNF-α IL-10、HO-1含量。制备胰腺和肺组织匀浆,离心提前上清液,ELISA法检测其中TNF-α IL-10、HO-1的含量。提取胰腺和肺组织的总蛋白,Western Blot法检测p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白（p38 MAPK、磷酸化P38 MAPK、MAPKAPK2、NF-1κB p65）的表达水平。结果一、各组大鼠血清HO-1、IL-10、TNF-a含量的比较1、各组大鼠的血清HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清HO-1含量明显增高（0.85±0.14vs 0.28±0.03,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清HO-1显着下降（0.75±0.11 vs 1.02±0.16,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的血清HO-1含量显着增高（1.02±0.16 vs 0.85±0.14,P<0.01）。2、各组大鼠的血清IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清IL-10含量均明显增高（71.89±8.91 vs 11.05±1.79,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清IL-10含量显着下降（64.55±7.69 vs 99.83±13.33,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的血清IL-10含量显着增高（99.83±13.33 vs 71.89±8.91,P<0.01）。3、各组大鼠的血清TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清TNF-α含量明显增高（29.26±3.69 vs 12.53±2.04,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清TNF-α含量显着升高（34.36±3.95 vs 21.69±2.95,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组TNF-α含量显着下降（21.69±2.95 vs 29.26±3.69,P<0.01）。二、各组大鼠胰腺组织中HO-1、IL-10、TNF-α含量的比较1、各组大鼠的胰腺HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺HO-1含量明显增高（0.52±0.08 vs 0.18±0.02,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺HO-1含量显着下降（0.37±0.06 vs 0.82±0.12,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺HO-1含量明显增高（0.82±0.12 vs 0.52±0.08,P<0.05）。2、各组大鼠的胰腺IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（52.63±6.02 vs 26.37±3.57,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺IL-10含量显着下降（48.09±6.22 vs 62.7±9.11,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（62.71±9.11 vs 52.63±6.02,P<0.05）。3、各组大鼠的胰腺TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺TNF-a含量明显增高（31.76±5.52 vs 14.78±2.39,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺TNF-α含量明显升高（34.17±5.16 vs 25.68±3.49,P<0.05）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺TNF-α含量明显下降（25.68±3.49 vs 31.76±5.52,P<0.05）。三、各组大鼠肺组织中HO-1、IL-10、TNF-α含量的比较1、各组大鼠的肺组织HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中HO-1含量明显增高（0.46±0.06 vs 0.09±0.01,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中HO-1含量显着下降（0.33±0.05 vs 0.79±0.11,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中HO-1含量明显增高（0.79±0.11 vs 0.46±0.06,P<0.05）。2、各组大鼠的肺组织IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（49.18±6.80 vs 19.51±2.92,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中IL-10含量显着下降（44.72±6.67 vs 58.34±7.81,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（58.34±7.81 vs 49.18±6.80,P<0.05）。3、各组大鼠的肺组织TNF-α含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显增高（29.61±3.89 vs 11.36±1.64,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显升高（35.06±4.92 vs 22.58±3.32,P<0.05）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显下降（22.58±3.32 vs 29.61±3.89,P<0.05）。四、各组大鼠胰腺组织病理学和免疫组化切片观察:1、胰腺大体标本观察:对照组胰腺组织无水肿、充血、及胰腺坏死,未见明显病理变化;SAP模型组胰腺组织水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;HO-1抑制剂组胰腺组织明显水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;HO-1过表达组胰腺组织局部水肿、苍白,未发现明显皂化斑。2、光镜下观察:对照组胰腺腺泡排列规则,腺管形态正常,未见明显变化;SAP模型组胰腺间质不同程度的充血、水肿,伴有炎症细胞浸润,胰腺部分出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱;HO-1抑制剂组胰腺间质明显充血、水肿,大量炎症细胞浸润,胰腺大片出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱,与模型组比较,病变较重;HO-1过表达组胰腺间质轻度水肿,少量炎症细胞浸润,小叶间隔增宽,与模型组比较,病变较轻。3、胰腺组织病理学评分:与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（13.50±0.76 vs 7.00±0.49,P<0.01）,与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺组织病理评分明显降低（7.00±0.49 vs 11.50±0.53,P<0.05）;有显着统计学差异。4、各组大鼠胰腺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠胰腺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-a表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内TNF-α表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。五、各组大鼠肺组织病理学和免疫组化切片观察:1、大体标本观察:对照组大鼠肺无水肿、充血,表面红润,气管内无渗出液。SAP模型组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下可见渗血,气管内较多渗出液。HO-1抑制剂组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下较多渗血,气管内大量渗出液,病变较SAP模型组大鼠重。HO-1过表达组大鼠肺可见水肿、充血,较SAP模型组大鼠轻,表面苍白,包膜下少量渗血,气管内少量渗出液。2、HE染色光镜下观察:对照组大鼠肺组织结构完整、清晰,细胞排列规整,无炎性细胞浸润;肺泡壁薄,无充血、水肿,肺泡内无渗出液。SAP模型组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,少量红细胞渗出;肺泡壁增厚,明显充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成。HO-1抑制剂组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,可见红细胞渗出;肺泡壁显着充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成,上皮细胞脱落,渗出较SAP模型组增加,病变明显加重。HO-1过表达组大鼠肺组织结构较完整,少量炎性细胞浸润,偶见红细胞渗出;肺泡壁轻度充血、水肿,肺泡内少量渗出液,富含蛋白,渗出较SAP模型组减轻,病变较轻。3、肺组织病理学评分:HO-1抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（12.28±0.83 vs 9.37±0.61,P<0.05）;与HO-1 过表达组相比,HO-1 抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（12.28±0.83 vs 5.53±0.57,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织病理评分明显降低（5.53±0.57 vs 9.37±0.61,P<0.05）,有显着统计学差异。4、各组大鼠肺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠肺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内TNF-α表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。六、各组大鼠胰腺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,HO-1抑制剂可增加胰腺组织中p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,促进NF-KB p65的表达;HO-1过表达可抑制SAP大鼠胰腺组织p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,减少NF-κB p65的表达。七、各组大鼠肺组织中p38 MAPK/NF-KB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,HO-1抑制剂可增加SAP大鼠肺组织中p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,促进NF-κκB p65的表达;HO-1过表达可抑制SAP大鼠肺组织p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,减少NF-κB p65的表达。Western Blot检测结果提示p38 MAPK/NF-KB传导通路可能是HO-1增加IL-10、降低TNF-α减轻SAP大鼠过度炎症反应的关键炎症信号传导通路。结论1、HO-1过表达可以降低SAP大鼠炎症因子的释放,减轻组织炎症反应,对SAP大鼠的胰腺和肺组织具有器官保护作用;2、HO-1对SAP大鼠胰腺和肺组织保护作用的机制可能与增加IL-10表达、降低TNF-α的表达有关。3、HO-1过表达可抑制SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK的磷酸化,减少NF-κB p65的表达。4、实验提示p38 MAPK/NF-KB传导通路可能是HO-1减轻SAP大鼠过度炎症反应的关键炎症信号传导通路。前言重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis,SAP）的临床治疗包括保守治疗或手术治疗。大量临床研究已经证实,外科治疗因为手术的创伤和应激反应会加重胰腺局部和全身的炎症反应,而且会继发严重感染,引起肺、肝、肾、心等器官的功能衰竭,病死率较高。近年来我国重症急性胰腺炎的发病率升高,但缺乏有效的治疗手段来提高患者治愈率及存活率,因此重症急性胰腺炎的治疗是国际性难题。中医药是我国传统文化的瑰宝,中西医结合治疗是我国的特色和优势所在。中医药治疗SAP具有独特的疗效,已成为SAP临床治疗方案中的重要组成部分。医圣汉代张仲景所着《伤寒杂病论》中的经典方剂大柴胡汤在胰腺炎的临床治疗中应用最多,临床疗效较为明显[1]。大柴胡汤是仲景名方,为表里双解剂,具有和解少阳,内泻热结之功效,主治少阳阳明合病W。临床常用于治疗消化性溃疡、急性胰腺炎、胆结石、急性胆囊炎等病症。近年来临床研究和动物实验发现,该方剂具有多种药理作用,可以抑制胃酸过多分泌以保护胃黏膜,还能松弛奥狄氏括约肌张力,具有利胆作用,还有保护肝细胞等作用[3]。大柴胡汤治疗SAP的临床疗效值得期待,其作用机制尚不明确,需要实验研究来加以证实和阐明,也将为临床应用提供实验证据的支持。TNF-α和IL-10是体内重要的促炎和抗炎细胞因子,IL-10可抑制IL-2、IL-3及TNF-α等细胞因子的合成,还可以抑制TNF-α释放而减轻炎症反应、保护脏器功能,具有潜在的抗炎功能,对SAP所致的多器官损伤有保护作用[4,5]。TNF-α是由淋巴细胞以及巨噬细胞所分泌的炎症因子,释放后能诱导IL-2、IL-3、IL-6、IL-8及TNF-a的表达,导致炎性因子过度的表达和释放,过度的炎症反应导致细胞损伤和组织破坏[6-8]。在第一部分SAP大鼠动物实验中已经证实,HO-1可以促进抑炎因子IL-10的表达、减少促炎因子TNF-α的表达,对胰腺和肺具有器官保护作用,HO-1调节p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路发挥抑制炎症反应和器官保护作用。大柴胡汤如果能通过调节HO-1抑制p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供新的治疗靶点。大柴胡汤治疗SAP的临床疗效及其作用机制尚需实验研究来加以证实和阐明,本实验应用大柴胡汤来治疗SAP大鼠模型,观察其对大鼠血清、胰腺和肺组织炎症因子HO-1、TNF-α、IL-10含量的影响,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,探讨大柴胡汤对胰腺和肺保护作用;观察大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,分析大柴胡汤治疗SAP是否通过介导HO-1/p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥抗炎作用以及器官保护作用。如果能阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供有力的武器,具有重要的临床意义。目的观察中药大柴胡汤（Dachaihu Decoction）对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠血清、胰腺和肺组织HO-1、TNF-α、IL-10的影响,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,探讨大柴胡汤对胰腺和肺炎症反应的保护作用;观察大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,分析大柴胡汤治疗SAP是否通过介导HO-1/p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥抗炎作用以及器官保护作用。方法45只雄性SD大鼠,6～7周龄,220～260 g,随机分为3组:对照组、SAP模型组、大柴胡汤组,每组15只。1、对照组:假手术组,只开腹,然后关腹。术后给予2ml生理盐水灌胃,每天两次,自由饮水。2、SAP模型组:采用开腹经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,建模后大鼠给予2ml生理盐水灌胃,每天两次,自由饮水。3、大柴胡汤组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/1OOg）方法制备SAP模型,制备SAP模型后给予大鼠中药大柴胡汤灌胃（2ml/200g,BID,剂量按公式计算）。大柴胡汤配方:柴胡15g,黄芩9g,芍药9g,枳实9g,半夏9g,大黄6g,大枣5枚（约10g）,生姜15g,总计82g。大柴胡汤由山东中医药大学附属医院中药房煎药室煎制,熬成200ml药液,大鼠以200g为标准体重计算,给予2ml中药灌胃,每天两次,给药量相当于含生药8.2g/（kg·d）。大鼠的用药剂量计算公式:dB=dA× RB/RA×（WA/WB）1/3。公式中dA为人每公斤体重给予的剂量,dB为大鼠每公斤体重给予的剂量,单位为mg/kg,RA=100,为人的体型系数,RB=59,为大鼠的体型系数,WA、WB分别为人和大鼠的体重值,单位为kg。人的标准体重以60kg计算,大鼠标准体重以200g计算,求得所给予剂量[9]。在制模后72h腹主动脉穿刺留取血液标本,放尽血液处死大鼠,然后留取胰腺、肺组织标本。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清TNF-α、IL-10、HO-1含量。制备胰腺和肺组织匀浆,离心提前上清液,ELISA法检测其中TNF-α、IL-10、HO-1的含量。制备胰腺组织石蜡切片,用HE（hematoxylin-eosin）染色法观察胰、肺组织病理学改变,进行组织病理学评分。应用免疫组织化学技术（免疫荧光法）对切片进行染色,观察促炎因子TNF-α、抗炎因子IL-10的细胞内表达情况。提取胰腺和肺组织总蛋白,Western Blot法检测p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白（p38 MAPK、磷酸化P38 MAPK、MAPKAPK2、NF-KB p65）的表达水平。结果一、各组大鼠的血清HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠的血清HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清HO-1含量显着增高（0.82±0.17 vs 0.26±0.05,P<0.01）;与SAP模型相比,大柴胡汤组血清HO-1 明显增高（0.99±0.15 vs 0.82±0.17,P<0.05）。2、各组大鼠的血清IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清IL-10含量均显着增高（74.62±7.28 vs 12.37±1.94,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的血清IL-10含量明显增高（91.67±10.53 vs 74.62±7.28,P<0.05）。3、各组大鼠的血清TNF-α含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清TNF-α含量明显增高（31.49±4.67 vs 11.73±1.88,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组TNF-α含量明显下降（23.81±3.29 vs 31.49±4.67,P<0.05）。二、各组大鼠的胰腺HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠胰腺的HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠胰腺的HO-1含量显着增高（0.49±0.07 vs 0.17±0.04,P<0.01）;与SAP模型相比,大柴胡汤组胰腺HO-1 明显增高（0.78±0.14 vs 0.49±0.07,P<0.05）。2、各组大鼠的胰腺IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（50.37±4.56 vs 25.93±2.86,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（59.82±6.35 vs 50.37±4.56,P<0.05）。3、各组大鼠的胰腺TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺TNF-a含量明显增高（31.76±5.52 vs 14.78±2.39,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺TNF-α含量明显下降（25.68±3.49 vs 31.76±5.52,P<0.05）。三、各组大鼠的肺组织HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠肺组织的HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠肺组织的HO-1含量显着增高（0.42±0.07 vs 0.13±0.02,P<0.01）;与SAP模型相比,大柴胡汤组肺组织HO-1 明显增高（0.65±0.09 vs 0.42±0.07,P<0.05）。2、各组大鼠的肺组织IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（48.51±3.94 vs 20.63±1.89,P<0.05）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（57.26±6.07 vs 48.51±3.94,P<0.05）。3、各组大鼠的肺组织TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中TNF-a含量明显增高（28.43±2.92 vs 10.67±0.94,P<0.05）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显下降（10.67±0.94 vs 28.43±2.92,P<0.05）。四、各组大鼠胰腺形态学观察:1、胰腺大体标本观察:对照组胰腺组织无水肿、充血、及胰腺坏死,未见明显病理变化;SAP模型组胰腺组织水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;大柴胡汤组胰腺组织局部水肿、苍白,未发现明显皂化斑。2、光镜下观察:对照组胰腺腺泡排列规则,腺管形态正常,未见明显变化;SAP模型组胰腺间质不同程度的充血、水肿,伴有炎症细胞浸润,胰腺部分出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱;大柴胡汤组胰腺间质轻度水肿,少量炎症细胞浸润,小叶间隔增宽,与模型组比较,病变较轻。3、胰腺组织病理学评分:与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺组织病理评分明显降低（8.50±0.78 vs 12.30±1.26,P<0.05）;与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（12.30±1.26vs0,P<0.01）。4、各组大鼠胰腺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠胰腺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。五、各组大鼠肺组织病理学观察:1、大体标本观察:对照组大鼠肺无水肿、充血,表面红润,气管内无渗出液。SAP模型组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下可见渗血,气管内较多渗出液。大柴胡汤组大鼠肺可见水肿、充血,较SAP模型组大鼠轻,表面苍白,包膜下少量渗血,气管内少量渗出液。2、HE染色光镜下观察:对照组大鼠肺组织结构完整、清晰,细胞排列规整,无炎性细胞浸润;肺泡壁薄,无充血、水肿,肺泡内无渗出液。SAP模型组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,少量红细胞渗出;肺泡壁增厚,明显充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成。大柴胡汤组大鼠肺组织结构较完整,少量炎性细胞浸润,偶见红细胞渗出;肺泡壁轻度充血、水肿,肺泡内少量渗出液,富含蛋白,渗出较SAP模型组减轻,病变较轻。3、肺组织病理学评分:与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织病理评分明显降低（5.35±0.49 vs 8.93±0.85,P<0.05）;与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（8.93±0.85 vs 0,P<0.01）。4、各组大鼠肺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠肺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-a表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。六、各组大鼠胰腺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,对照组大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-KB p65的表达正常。SAP组大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达明显增加。大柴胡汤可抑制SAP大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-κB p65的表达。七、各组大鼠肺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,对照组大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达正常。SAP组大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达明显增加。大柴胡汤可抑制SAP大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-KB p65的表达。结论1、大柴胡汤治疗SAP大鼠可增加HO-1表达,减轻炎症反应,明显减轻胰腺及肺组织病理改变。2、大柴胡汤可抑制SAP大鼠胰腺和肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-κB p65的表达。3、大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织保护作用的机制可能与诱导HO-1表达升高IL-10、降低TNF-a有关。4、p38 MAPK/NF-κB通路可能是大柴胡汤诱导HO-1表达发挥抗炎和器官保护作用的关键炎症信号传导通路。
孟勇[9]（2019）在《高压氧和清胰汤治疗重症急性胰腺炎作用机制的实验和临床研究》文中进行了进一步梳理目的:重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）因其病情凶险、发病机制复杂、并发症多、死亡率高等原因,其针对性治疗一直以来都是世界性的难题。清胰汤通过多途径多靶点的方式治疗SAP,其疗效在临床上已得到验证,但是清胰汤在SAP不同时期具体的干预机制和靶点尚不完全清楚。高压氧（hyperbaric oxygen,HBO）治疗虽已广泛应用于一些急慢性疾病的治疗,但其在SAP治疗方面并未获得深入研究。本实验旨在通过建立大鼠重症急性胰腺炎模型,并分别给予高压氧、清胰汤以及两者联合治疗,通过检测相应指标,观察不同治疗方式对大鼠重症急性胰腺炎模型病情严重程度的影响,从多方面、多角度探讨高压氧和清胰汤治疗SAP的作用机制。在临床研究中,对中度重症急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis,MSAP）、SAP感染期病人采用高压氧联合其他常规治疗,探究该疗法的临床作用效果及未来应用价值。方法:1、将清洁级健康雄性Wistar大鼠适应性饲喂1周后随机分为5组:正常对照组（N组）;重症急性胰腺炎模型组（SAP组）;清胰汤治疗组（Z组）;高压氧治疗组（H组）及高压氧和清胰汤联合治疗组（HZ组）。采用胰胆管逆行注射3.5%牛黄胆酸钠的方法诱导建立大鼠SAP模型,Z组及HZ组首次给予中药治疗的时间为建模手术关腹后30分钟（1次/天,1ml/100g）,连续3天。H组及HZ组首次进行高压氧治疗的时间为建模手术关腹后6小时,每次治疗时间为100分钟,高压氧动物实验舱内的压力为2ATM,每天1次,共3天。实验结束后,记录各组大鼠的生存情况,留取存活大鼠胰腺、回肠、血清、腹水及回肠内容物,用于实验后期相关指标检测。检测大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平;酶联免疫吸附法检测血清中白介素-6（IL-6）,白介素-8（IL-8）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平;苏木素-伊红染色方法检测胰腺、回肠组织病理损害程度并做组织病理学评分。RT-PCR方法检测回肠潘氏细胞抗菌肽-溶菌酶的表达量。16S rDNA V3-V4区测序方法分析肠道微生物群落的物种复杂度和组间物种差异。2、临床研究中设立高压氧治疗组和常规治疗对照组,高压氧治疗组52例,其中MSAP 47例,SAP感染期5例;常规治疗对照组50例,其中MSAP46例,SAP感染期4例。两组患者给予抑制胰酶分泌、纠正电解质紊乱、抗炎、静脉及肠内营养、中药方剂以及下鼻胃管、腹腔穿刺引流术、微创化胰腺坏死清除术等治疗。高压氧治疗组患者除上述治疗措施外,另给予高压氧治疗,每天1次,每次120分钟,7次为1疗程。两组患者C反应蛋白入院24h以内测定,每3次高压氧治疗后测定;APACHE II评分在入院24h以内、第3次及第7次高压氧治疗后评定;Balthazar CT分级评分在入院24h以内和每7次高压氧治疗后评定。结果:1、N组、SAP组、Z组、H组及HZ组大鼠死亡率依次为:0.00%、60.00%、53.33%、53.33%、40.00%。SAP组腹水量、血清淀粉酶、血清脂肪酶、IL-6、IL-8、TNF-α水平明显高于N组（P<0.05）,H组、Z组、HZ组以上指标与SAP组相比均出现不同程度的下降,其中HZ组下降最明显。2、与N组相比,SAP组胰腺和回肠组织出现明显的病理损害,H组、Z组、HZ组胰腺和回肠组织的病理损害程度较SAP组明显改善,组织病理学评分显着降低（P<0.01）,且HZ组改善最为显着,组织病理评学分具有统计学差异（P<0.001）。3、SAP组回肠潘氏细胞-溶菌酶的表达量明显低于N组（P<0.001）,HZ组、H组、Z组表达量均高于SAP组,其中HZ组最高且具有统计学差异（P<0.001）。与N组相比,SAP组肠道微生物群落的多样性和丰度发生显着变化;HZ组、H组、Z组与SAP组相比微生物群落的多样性和丰度均有恢复,其中HZ组恢复效果最明显,且与N组最为接近。4、临床实验结果显示,高压氧治疗组和常规治疗组相比,在入院时两组患者APACHEII评分无明显差异（P>0.05）,在第3天和第7天均存在统计学差异（P<0.05）,两组C反应蛋白水平在第7天具有统计学差异（P<0.05）。Balthazar CT评分组间未见明显差异（P>0.05）。结论:1、采用胰胆管逆行注射3.5%牛黄胆酸钠的方法诱导建立大鼠重症急性胰腺炎模型,病理学检测证实:胰腺组织出现不同程度的胰腺实质坏死、出血、水肿及炎性细胞的浸润。模型可重复性好,相对稳定。2、高压氧治疗和清胰汤治疗对降低重症急性胰腺炎模型大鼠死亡率,减轻器官组织病理损害程度,降低促炎因子水平,减少肠屏障损伤,恢复肠道菌群物种的丰度和多样性,维护肠道微生态的稳定性等方面均有效果,且高压氧和清胰汤联合治疗的效果最为显着。3、从临床研究结果来看,高压氧治疗在改善APACHEII评分和降低C反应蛋白水平等方面有效果,在改善Balthazar CT分级评分方面未显示出效果。
商琼琼[10]（2019）在《人参皂苷C-K对重症急性胰腺炎大鼠作用的实验研究》文中研究说明研究目的:1.优化人参皂苷C-K制备工艺条件,以生物转化技术完成人参皂苷C-K的批量制备。2.借助雨蛙素联合脂多糖诱导成立重症急性胰腺炎大鼠模型,研究人参皂苷C-K对重症急性胰腺炎大鼠胰腺病理学改变、血清淀粉酶、血清脂肪酶、NF-κBp65表达、胰腺水肿指数及炎性因子影响。3.通过基础实验证明人参皂苷C-K具有抗重症急性胰腺炎作用,为后续人参皂苷C-K被应用于临床实验抗重症急性胰腺炎、为免疫调节治疗与护理提供循证基础依据。研究方法:1.人参皂苷C-K的制备流程的优化以富含原人参二醇类皂苷的三七总皂苷为原料,经蜗牛酶处理,把原人参二醇类皂苷Rb1转化获得人参皂苷C-K,而后采纳大孔吸附树脂柱层析技术处理,通过工艺优化,从而获得高质量的人参皂苷C-K。2.人参皂苷C-K对重症急性胰腺炎大鼠作用的实验研究2017年7月-2018年10月,校医药研究中心、抗衰老研究所、烟台某生物科技有限公司。该实验严格按照某医学院实验动物保护和使用指南,某医学院实验动物使用和保护委员会批准该实验。取SD雄性大鼠60只,按体重随机选择10只为A组（空白对照组）,另外50只大鼠腹膜内注射雨蛙肽和脂多糖,建立重症急性胰腺炎模型,随机分成B组（SAP模型组）、C组（地塞米松0.15mg.ml-1）、D组（人参皂苷C-K高剂量4.Omg.ml-1）、E组（人参皂苷C-K中剂量2.0mg.ml-1）和F组（人参皂苷C-K低剂量1.0mg.ml-1）。腹腔注射脂多糖溶液后的1h、3h、6h,C组灌胃给予地塞米松混悬液,每次4ml,D-F组灌胃分别给予人参皂苷C-K高中、低剂量混悬液每次4ml,A、B组每次灌胃同等量的5%的羧甲基纤维素钠溶液。建模24h后各组处死10只大鼠,切除胰腺组织用HE染色察看其病理变化,用干湿法检测胰腺的水肿指数;ELISA法检测IL-1β、TNF-α、IL-6、超氧化物歧化酶、髓过氧化物酶等水平变化,全自动生化分析仪测定血清淀粉酶、血清脂肪酶的水平,免疫组化观察NF-κBp65的表达水平。研究结果:1.以水为溶剂,每500L溶液中含三七总皂苷25kg和蜗牛酶2.5kg,调pH值为4.5,45℃搅拌酶解48h,过滤,沉淀物溶于40%乙醇,用AB-8大孔吸附树脂处理,上样量相当于三七总皂苷量与树脂用量的比例为15:1（g/L）。上样后,先用65%乙醇洗涤3个柱体积,然后用70%乙醇洗脱4个柱体积,收集后者的洗脱液,在减压下浓缩和除去乙醇,过滤后,将沉淀物真空干燥,获得高转化率的人参皂苷C-K。2.雨蛙素结合脂多糖诱导大鼠重症急性胰腺炎模型建立,造模后24h,与B组（SAP模型组）比较,C-F各组在病理学改变、水肿指数、炎性因子表达、血清淀粉酶和血清脂肪酶进行比较,人参皂苷C-K各剂量组能降低血清淀粉酶和血清脂肪酶水平、减轻胰腺水肿、抑制炎性因子表达、抑制NF-ΚBp65活性,其中人参皂苷C-K高剂量组与人参皂苷C-K中、低剂量组比较,有显着疗效（P<0.01）。研究结论:1.以蜗牛酶水解三七总皂苷,优化大孔吸附树脂层析技术,可完成人参皂苷C-K的批量制备,工业化生产的适应性较好,成品得率、人参皂苷C-K含量较为稳定,C-K纯化过程中转移率较好。2.人参皂苷C-K高剂量组与人参皂苷C-K中、低剂量组比较,降低了炎症因子IL-1β、TNF-α及IL-6的过分表达,可能与抑制NF-κBp65的表达水平有关。3.人参皂苷C-K高剂量组与人参皂苷C-K中、低剂量组比较,显着降低了血清淀粉酶和血清脂肪酶活性,减轻胰腺水肿,人参皂苷C-K具有抗重症急性胰腺炎作用。
二、大鼠急性胰腺炎病理学特征与氧自由基变化的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠急性胰腺炎病理学特征与氧自由基变化的关系（论文提纲范文）
（1）安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、INOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表达影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学文献研究 |
| 1.1 SAP概述 |
| 1.2 SAP病因 |
| 1.3 SAP发病机制 |
| 1.4 SAP诊断 |
| 1.5 SAP非手术治疗进展 |
| 2 传统医学文献研究 |
| 2.1 中医对AP的大体认识 |
| 2.2 SAP中医辨证论治 |
| 2.3 中医对SAP的治疗 |
| 第二部分 动物实验 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 造模前处理 |
| 2.3 造模 |
| 2.4 标本采集 |
| 2.5 HE染色及病理切片制作 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 实验大鼠胰腺大体观察结果 |
| 3.2 胰腺组织病理结果 |
| 3.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β检测结果 |
| 3.4 各组大鼠胰腺组织NF-κBp65mRNA检测结果 |
| 3.5 各组大鼠胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2表达结果 |
| 3.6 相关性分析 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 白介素10与SAP |
| 2 NF-κB/TNF-α-IL-1β信号通路与SAP |
| 2.1 NF-κB与SAP |
| 2.2 TNF-α、IL-1β与SAP |
| 2.3 NF-κB、TNF-α、IL-1β与SAP |
| 3 NF-κB/iNOS-COX-2信号通路与SAP |
| 4 SAP炎症通路与微循环通路的关系 |
| 4.1 TNF-α、IL-1β均可诱导iNOS的表达 |
| 4.2 TNF-α、IL-1β均可诱导C0X-2 的表达 |
| 4.3 NF-κB、TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2与SAP |
| 4.4 实验小结 |
| 第四部分 结语 |
| 1 结论 |
| 2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 重症急性胰腺炎微循环障碍中西医发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（2）安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、ET/NO影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对SAP的认识 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 致病因素 |
| 1.3 发病机制 |
| 1.4 诊断标准 |
| 1.5 治疗 |
| 2 中医学对SAP的认识 |
| 2.1 古代医家对SAP认识 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 辨证论治与分期 |
| 2.4 中医治疗 |
| 第二部分 动物实验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 大鼠一般情况观察 |
| 2.2 大鼠胰腺组织HE染色后切片观察 |
| 2.3 大鼠胰腺组织免疫组化法检测NF-κBp65表达结果 |
| 2.4 大鼠胰腺组织免疫组化法检测iNOS表达结果 |
| 2.5 大鼠胰腺组织ET、NO含量水平及ET/NO比值结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 安胰颗粒组方分析 |
| 1 SAP模型的选择 |
| 1.1 SAP实验动物的选择 |
| 1.2 SAP大鼠造模方法的选择 |
| 2 安胰颗粒拟方依据 |
| 4 IL-10对SAP的影响 |
| 5 NF-κB信号通路对SAP微循环的影响 |
| 5.1 ET、NO对微循环的影响 |
| 6 实验小结 |
| 6.1 安胰颗粒对SAP大鼠病理改变的影响 |
| 6.2 安胰颗粒对SAP大鼠微循环因子的影响 |
| 7 本研究不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 基于 NF-κB 信号通路中医药治疗重症急性胰腺炎微循环障碍研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读硕士学位期间科研成果 |
（3）腹腔穿刺引流对重症急性胰腺炎相关心肌损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 APD对 SAP相关心肌损伤保护作用的研究 |
| 2.1 材料和实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 NADPH氧化酶在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究 |
| 3.1 材料和实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 HMGB1在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究 |
| 4.1 材料和实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述NADPH氧化酶在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 攻读博士期间获奖情况 |
| 致谢 |
（4）基于UPLC-TOF-MS/MS技术探究L-精氨酸在急性胰腺炎大鼠体内的代谢产物变化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 结果 |
| 1.动物一般情况 |
| 2.血清淀粉酶水平的变化 |
| 3.血清脂肪酶水平的变化 |
| 4.血钙水平的变化 |
| 5.胰腺和肝脏组织学观察及病理学评分 |
| 6.血清及肝脏中L-精氨酸代谢物的确定 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 L-精氨酸与急性胰腺炎关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :TMEM16A在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞上高表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.4 小鼠分组及急性胰腺炎模型的建立 |
| 2.4.1 分组及给药 |
| 2.4.2 取材 |
| 2.5 小鼠胰腺腺泡细胞的分离培养及细胞炎症模型建立 |
| 2.5.1 小鼠胰腺腺泡细胞的分离培养 |
| 2.5.2 急性分离腺泡细胞炎症模型建立 |
| 2.6 AR42J细胞传代培养及炎症模型的建立 |
| 2.6.1 AR42J细胞传代培养 |
| 2.6.2 AR42J细胞炎症模型的建立 |
| 2.7 观察指标及检测方法 |
| 2.7.1 胰腺病理学检测—苏木素/伊红(HE)染色 |
| 2.7.2 免疫组织化学技术 |
| 2.7.3 western blot |
| 2.7.4 细胞免疫荧光技术 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎病理模型 |
| 3.2 TMEM16A在急性胰腺炎小鼠胰腺中高表达 |
| 3.3 TMEM16A在小鼠胰腺原代培养腺泡细胞的急性炎症中高表达 |
| 3.4 炎性AR42J细胞中TMEM16A表达结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :急性胰腺炎IL-6 增多激活IL-6/IL-6R/STAT3 促进TMEM16A表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3.1 IL-6不同浓度的配制 |
| 2.3.2 CucurbitacinⅠ液体 |
| 2.3.3 含Ig G抗体1μg/ml的培养液 |
| 2.3.4 含IL-6R中和抗体的培养液 |
| 2.3.5 TMEM16A抗体稀释液 |
| 2.4 IL-6--酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 2.4.1 标准品的配置 |
| 2.4.2 标准品曲线的制备 |
| 2.4.3 待测样品IL-6含量检测 |
| 2.5 不同浓度IL-6处理AR42J细胞 |
| 2.6 IL-6和IL-6R中和抗体共同处理AR42J细胞 |
| 2.7 IL-6和STAT3 抑制剂CucurbitacinⅠ共同处理AR42J细胞 |
| 2.8 IL-6R抗体和CucurbitacinⅠ分别处理AR42J炎性细胞 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 急性胰腺炎小鼠胰腺及血清中IL-6增加 |
| 3.2 炎性AR42J细胞上清液中IL-6增加 |
| 3.3 炎性细胞中激活 IL-6/IL-6R/STAT3 信号通路促进 TMEM16A 的高表达 |
| 3.4 IL-6对AR42J细胞TMEME16A影响浓度筛选 |
| 3.5 IL-6与IL-6R相互作用促进AR42J细胞TMEM16A的高表达 |
| 3.6 IL-6 通过激活STAT3 信号促进腺泡细胞TMEM16A的高表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IL-6急性胰腺炎早期升高 |
| 4.2 STAT3在急性胰腺炎中被激活 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :TMEM16A高表达促进急性胰腺炎发生发展 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 常用试剂的配制 |
| 2.4 动物实验 |
| 2.5 质粒的基因表达 |
| 2.5.1 质粒的转化 |
| 2.5.2 质粒扩增 |
| 2.5.3 单个菌落培养 |
| 2.5.4 质粒DNA提取 |
| 2.5.5 转染 |
| 2.5.6 细胞基因表达及细胞处理 |
| 2.5.7 细胞核蛋白提取 |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 western blot |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TMEM16A高表达促进急性胰腺炎的病理进程 |
| 3.1.1 T16Ainh-A01 抑制急性胰腺炎病理进程 |
| 3.1.2 T16Ainh-A01 抑制急性胰腺炎胰腺细胞TMEM16A蛋白表达 |
| 3.2 T16Ainh-A01 减少胰腺炎症中IL-6 含量 |
| 3.3 TMEM16A高表达激活小鼠胰腺炎腺泡细胞NF-κB信号通路 |
| 3.4 TMEM16A高表达激活AR42J细胞NF-κB信号通路 |
| 3.4.1 TMEM16A质粒在AR42J细胞过表达 |
| 3.4.2 TMEM16A质粒过表达促进AR42J细胞NF-κB核转移 |
| 3.4.3 敲除TMEM16A抑制胰腺炎细胞NF-κB核转移及减少IL-6 的释放 |
| 3.4.4 T16Ainh-A01 能抑制AR42J炎症细胞TMEM16A表达 |
| 3.4.5 TMEM16A增加钙离子释放促进急性胰腺炎病理进程 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1.急性胰腺炎病因 |
| 2.急性胰腺炎发病机制 |
| 3.细胞因子与急性胰腺炎 |
| 3.1 促炎性细胞因子 |
| 3.1.1 白细胞介素1β(IL-1β) |
| 3.1.2 白细胞介素6(IL-6) |
| 3.1.3 白细胞介素8(IL-8) |
| 3.1.4 白细胞介素17A(IL-17A) |
| 3.1.5 白细胞介素18(IL-18) |
| 3.1.6 白细胞介素33（IL-33） |
| 3.1.7 肿瘤坏死因子（TNF-α） |
| 3.2 抗炎性细胞因子 |
| 3.2.1 白细胞介素-10(IL-10) |
| 3.2.2 白细胞介素-22(IL-22) |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）高压氧对急性胰腺炎大鼠线粒体凋亡通路的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要抗体 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 动物模型建立 |
| 2.3.2 高压氧处理 |
| 2.3.3 标本的收集 |
| 2.3.4 标本检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠胰腺病理学变化 |
| 3.2 大鼠血清学变化 |
| 3.2.1 血清淀粉酶和脂肪酶变化 |
| 3.2.2 血清细胞因子变化 |
| 3.3 线粒体膜电位和ATP水平变化 |
| 3.4 线粒体凋亡通路蛋白和mRNA水平变化 |
| 3.5 线粒体凋亡通路上游蛋白变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 对本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠微循环障碍的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 重症急性胰腺炎与胰腺微循环障碍研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）HO-1和中药大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 HO-1对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的SCI论文目录 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
| 外文论文三 |
| 外文论文四 |
| 外文论文五 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（9）高压氧和清胰汤治疗重症急性胰腺炎作用机制的实验和临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、高压氧和清胰汤治疗重症急性胰腺炎作用机制的实验研究 |
| 1.1 实验对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验设备 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 统计学方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 各实验组大鼠生存情况分析 |
| 1.3.2 各实验组大鼠血清淀粉酶、血清脂肪酶统计分析 |
| 1.3.3 各实验组大鼠腹水量统计分析 |
| 1.3.4 各实验组大鼠胰腺病理变化及组织病理学评分统计分析 |
| 1.3.5 各实验组大鼠回肠病理变化及组织病理学评分统计分析 |
| 1.3.6 各实验组大鼠促炎因子水平统计分析 |
| 1.3.7 各实验组大鼠潘氏细胞抗菌肽-溶菌酶表达量统计分析 |
| 1.3.8 16SrDNA V3-V4 区肠道菌群检测结果分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 高压氧和清胰汤对大鼠死亡率、腹水、组织病理学的影响 |
| 1.4.2 高压氧和清胰汤对血清淀粉酶和血清脂肪酶的影响 |
| 1.4.3 高压氧和清胰汤对细胞促炎因子的影响 |
| 1.4.4 高压氧和清胰汤对肠屏障和肠道菌群的影响 |
| 1.5 小结 |
| 二、高压氧治疗重症急性胰腺炎的临床研究 |
| 2.1 一般资料和治疗方法 |
| 2.1.1 一般资料 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.2 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 两组治疗前后APACHEII评分比较分析 |
| 2.3.2 两组治疗前后Balthazar CT评分比较分析 |
| 2.3.3 两组治疗前后C反应蛋白水平比较分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文和参加科研情况说明 |
| 综述 重症急性胰腺炎的治疗现状及研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）人参皂苷C-K对重症急性胰腺炎大鼠作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 人参皂苷C-K的制备工艺优化 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 工艺研究方法 |
| 结果 |
| 1 原料的选择 |
| 2 酶解工艺条件选择 |
| 3 大孔吸附树脂层析纯化工艺的探索和优化 |
| 4 浓缩与干燥工艺研究 |
| 5 工艺验证 |
| 6 人参皂苷C-K的制备工艺优化 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人参皂苷C-K对重症急性胰腺炎大鼠作用的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验指标检测和步骤 |
| 4 统计学处理 |
| 5 质量控制 |
| 6 伦理原则 |
| 结果 |
| 1 大鼠一般状态观察 |
| 2 人参皂苷C-K对SAP大鼠胰腺病理改变的影响 |
| 3 人参皂苷C-K对SAP大鼠血清淀粉酶(AMS)水平的影响 |
| 4 人参皂苷C-K对SAP大鼠胰腺水肿指数的影响 |
| 5 人参皂苷C-K对SAP大鼠血清脂肪酶水平的影响 |
| 6 人参皂苷C-K对SAP大鼠NF-κBp65表达的影响 |
| 7 人参皂苷C-K对SAP大鼠炎症因子IL-1β、TNF-α及IL-6表达的影响 |
| 8 人参皂苷C-K对SAP大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)的影响 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 人参皂苷C-K对重症急性胰腺炎大鼠作用的实验研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表文章 |
四、大鼠急性胰腺炎病理学特征与氧自由基变化的关系（论文参考文献）
- [1]安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、INOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表达影响的实验研究[D]. 文玲. 广西中医药大学, 2020(02)
- [2]安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、ET/NO影响的实验研究[D]. 廖健思. 广西中医药大学, 2020(02)
- [3]腹腔穿刺引流对重症急性胰腺炎相关心肌损伤的保护作用及机制研究[D]. 文艺. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [4]基于UPLC-TOF-MS/MS技术探究L-精氨酸在急性胰腺炎大鼠体内的代谢产物变化[D]. 裴丽英. 大连医科大学, 2020(03)
- [5]钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究[D]. 王清华. 中国医科大学, 2020(01)
- [6]高压氧对急性胰腺炎大鼠线粒体凋亡通路的影响研究[D]. 赵荷. 中国医科大学, 2020(01)
- [7]柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠微循环障碍的影响[D]. 石容. 西南医科大学, 2020(12)
- [8]HO-1和中药大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究[D]. 范开亮. 山东大学, 2019(03)
- [9]高压氧和清胰汤治疗重症急性胰腺炎作用机制的实验和临床研究[D]. 孟勇. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]人参皂苷C-K对重症急性胰腺炎大鼠作用的实验研究[D]. 商琼琼. 滨州医学院, 2019(02)