一、ADHESION INDUCES MATRIX METALLOPROTEINASE-9 GENE EXPRESSION IN OVARIAN CANCER CELLS（论文文献综述）
贾培君[1]（2021）在《溶血磷脂酸对卵巢癌细胞DNA复制的影响及其分子机理研究》文中认为溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid,LPA）是结构简单的活性磷脂小分子,由卵巢癌患者的腹水中纯化并鉴定得到的LPA具有广泛的促肿瘤活性。研究表明,LPA可以通过激活一系列G蛋白偶联受体来刺激卵巢癌细胞进行增殖、迁移、侵袭和存活等行为。然而关于LPA调控卵巢癌细胞的DNA复制的研究鲜有报道。以卵巢癌细胞系为研究对象,使用蛋白质免疫印迹、RT-q PCR、免疫沉淀、抑制剂处理、CCK-8、ELISA、流式细胞术等研究方法,来阐明卵巢肿瘤微环境中高表达的LPA对DNA复制的调控机制。实验结果表明LPA能够诱导卵巢癌细胞A2780和OVCAR5双能蛋白转录水平（GMNN）和蛋白水平（Geminin）上调。在EGFR高表达的卵巢癌细胞系中,LPA与其特异性受体LPAR3结合,通过MMPs诱导EGFR反式激活,激活的EGFR诱导下游PI3K/m TOR通路的激活,从而上调双能蛋白的表达。我们还证明LPA在短时间内结合其受体LPAR3后,通过MMPs、EGFR以及EGFR下游的PI3K/m TOR通路增加细胞内S+G2/M期的DNA含量,进而调控OVCAR5细胞的DNA复制。另一方面,LPA还可以通过促进Aurora-A激酶Thr288位点磷酸化进而稳定双能蛋白的表达。综上所述,在EGFR高表达的卵巢癌中,LPA诱导的EGFR反式激活对双能蛋白表达水平的调控可以促进卵巢癌细胞OVCAR5的DNA复制。本研究发现肿瘤微环境中LPA诱导的EGFR反式激活对卵巢癌细胞DNA复制的调控作用,并探究LPA及下游相关信号通路调控双能蛋白稳定性的机制,为卵巢癌的治疗提供新的潜在靶标,为开发信号通路和肿瘤细胞特异性的EGFR反式激活抑制剂药物提供理论基础。
易韵[2]（2021）在《DEC1通过调控Wnt/β-catenin信号通路对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响及机制研究》文中研究表明研究背景和目的:卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是妇科最常见的恶性肿瘤之一。卵巢癌中最常见的病理类型是上皮性卵巢癌（Epithelia Ovarian Cancer,EOC）,占比达80-90%。与子宫内膜癌、宫颈癌、外阴癌相比,OC死亡率居女性生殖道恶性肿瘤首位,且发病率逐年上升,严重威胁着女性的生命健康。据美国癌症协会统计数据显示2019年美国约22530例新发病例和13980例死亡病例。解剖学上由于卵巢位于盆腔深处,早期无明显临床表现,另缺乏早期筛查手段,导致病人早期难以得到诊断。临床上约70%左右的患者首次以腹胀、腹水、腹痛就诊,诊断时即为晚期。起病隐匿、发现晚、恶性程度高、易转移及预后差是OC的主要临床特点。早期OC患者的5年生存率可超过75%,晚期OC患者仅为30-40%。卵巢肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的化疗以及PARP抑制剂等是晚期OC患者的标准化治疗模式。随着诊疗水平的提高,OC患者5年生存率由1975年的36%上升至2014年的47%。然而,仍有大约70%的晚期OC患者在治疗后的前2-3年内复发,不断复发及化疗,最终导致肿瘤耐药。因此,对于卵巢难发现、高复发、难治疗、预后差的现状,迫切需要开发新的治疗策略来改善OC患者的预后。分化型胚胎软骨发育基因1（Differential embryo-chondrocyte expressed gene 1,DEC1）,属于BHLH转录因子家族,在人体大部分器官和组织中均有不同程度的表达。DEC1在机体的各种生理功能中发挥重要作用,涉及细胞分化、细胞周期和昼夜节律调节、缺氧、应激反应等过程。近年发现DEC1在多种肿瘤中异常表达,且与肿瘤的生长、凋亡有关。如DEC1对缺氧诱导的胃癌细胞生长具有积极的抗凋亡作用。DEC1对缺氧诱导的Hep G2细胞中E-钙粘蛋白的表达产生负面影响。沉默DEC1可通过诱导S期细胞周期停滞来抑制乳腺癌的增殖。Wnt/β-catenin信号通路是细胞内最重要的信号传导通路之一,在调节细胞正常生长、运动、分化和肿瘤发生中发挥重要作用。β-catenin作为wnt/β-catenin的关键分子,在细胞质中积累后转移到细胞核中,激活细胞核中下游的信号分子。现有研究表明,wnt/β-catenin通路异常激活与许多肿瘤的发生、发展密切相关。如Wang等发现基因在H1299细胞表达下调后,wnt/β-catenin信号通路受到抑制,GSK3β表达水平明显升高,而p-GSK3β、核-β-catenin、cyclin、c-Myc、MMP-7表达明显降低,致使H1299细胞增殖、侵袭能力下降。有研究显示,在正常结直肠组织中,wnt信号通路调控肠干细胞的平衡、增殖和分化。另有研究显示,OC细胞内wnt通路被激活,促进β-catenin进入细胞核内,作用于TCF和LEF转录因子,诱导OC干细胞生长、分化和转移。上述研究显示,DEC1在其他多种肿瘤中异常表达导致肿瘤细胞增殖、侵袭,然而,DEC1对卵巢癌的可能影响和潜在机制尚不清楚。本研究旨在探讨DEC1在EOC中发挥的功能及其作用机制。我们推测下调DEC1可通过wnt/β-catenin信号通路明显抑制EOC细胞增殖、迁移、侵袭,诱导细胞凋亡。我们的研究结果将为DEC1在EOC的生物学功能和潜在机制提供新的见解,并将为EOC的诊断或治疗提供新的治疗靶点。方法:1、通过q RT-PCR、免疫组化和Western blot实验方法检测106例上皮性卵巢癌组织及其癌旁组织中DEC1的m RNA和蛋白表达水平,并利用Kaplan–Meier法分析DEC1的表达与患者总生存期（OS）之间的相关性。2、采用Western blot和q RT-PCR实验方法检测人正常卵巢上皮细胞系（IOSE80）和上皮性卵巢癌细胞系（SKOV3和OVCAR3）中DEC1的蛋白和m RNA的表达情况;对SKOV3和OVCAR3细胞株转染DEC1干扰质粒构建sh DEC1稳转细胞株,利用Western blot和q RT-PCR检测转染效果;3、通过CCK-8和Ed U实验方法观察在上皮性卵巢癌细胞中下调DEC1的表达后sh DEC1上皮性卵巢癌细胞增殖能力变化;4、通过TUNEL实验观察在上皮性卵巢癌细胞中下调DEC1的表达后sh DEC1卵巢癌细胞凋亡水平变化,并采用Western blot检测凋亡相关蛋白（Caspase-3、Cleaved-caspase-3、PARP和Cleaved-PARP）的表达水平变化;5、通过Transwell和划痕实验观察在卵巢癌细胞中下调DEC1的表达后sh DEC1上皮性卵巢癌细胞侵袭迁移能力变化,并采用Western blot检测EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin和α-SMA）的表达水平变化;6、采用Western blot检测在上皮性卵巢癌细胞中下调DEC1的表达后细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白（p-GSK3β和β-catenin）的表达水平变化;检测下调DEC1的表达后上皮性卵巢癌细胞中β-catenin总蛋白和核蛋白表达及TCF4转录活性变化;通过Western blot和蛋白质免疫共沉淀实验检测上皮性卵巢癌细胞株中下调DEC1的表达后β-catenin蛋白泛素化水平变化。结果:1、上皮性卵巢癌组织中DEC1的m RNA水平显着高于癌旁组织（P<0.01）;DEC1的蛋白表达显着高于癌旁组织（P<0.01）。高表达DEC1上皮性卵巢癌患者比低表达DEC1上皮性卵巢癌患者总生存期（OS）更短（P<0.05）。2、上皮性卵巢癌细胞（SKOV3和OVCAR3）中DEC1的蛋白表达和m RNA水平均显着高于人正常卵巢上皮细胞（IOSE80）;上皮性卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞转染DEC1干扰质粒后DEC1的蛋白表达和m RNA水平均明显下调。3、下调DEC1的表达后,上皮性卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞中细胞增殖能力受到显着抑制。4、上皮性卵巢癌细胞中下调DEC1的表达后细胞凋亡水平明显增加;检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP表达减少,Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP蛋白表达增加。5、上皮性卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞中下调DEC1的表达后细胞侵袭迁移能力受到显着抑制。检测EMT相关蛋白表达发现E-cadherin蛋白表达明显增加,Vimentin和α-SMA蛋白表达减少。6、上皮性卵巢癌细胞中下调DEC1的表达后细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白GSK3β表达不变、p-GSK3β蛋白和β-catenin蛋白表达减少。Western blot和蛋白质免疫共沉淀实验检测在上皮性卵巢癌细胞（SKOV3和OVCAR-3）中下调DEC1的表达后β-catenin蛋白泛素化水平升高,β-catenin蛋白表达下调。结论:本文研究结果显示:1、DEC1在上皮性卵巢癌组织和细胞中表达均明显升高,且与患者的不良预后相关,高表达DEC1患者比低表达DEC1患者生存期更短;2、在上皮性卵巢癌细胞中下调DEC1的表达后可通过调控wnt/β-catenin信号通路显着抑制细胞增殖和侵袭迁移能力并诱导细胞凋亡。我们的结果为研究DEC1在上皮性卵巢癌中的生物学功能和潜在机制提供了新的思路,为诊断和治疗上皮性卵巢癌提供新的治疗靶点。
周春燕[3]（2021）在《miR-1271靶向Twist1对卵巢癌细胞的增殖和转移的影响及机制研究》文中指出卵巢癌是导致女性死亡的第五大恶性肿瘤,转移是导致其死亡的重要原因。因此,探讨其发病机制、寻找早期诊断和预防的方法以及寻求新的行之有效的治疗方案以提高此类患者的生存生活质量是非常必要的。近年来,有研究显示,较正常的卵巢组织,miR-1271于卵巢恶性肿瘤组织中的表达存在明显的差异,但其在卵巢恶性肿瘤中潜在的生物生理学特征及分子机制还未得到充分解释。因此本研究通过q RT-PCR法检测miR-1271的表达水平进一步验证其在卵巢癌细胞中的差异性表达,用MTT方法检测细胞活性,用Transwell法检测细胞迁移和侵袭的能力,Western Blot检测蛋白表达,拟探讨过表达miR-1271对卵巢癌细胞的增殖及转移作用的影响及过表达Twist1能否逆转这一作用;同时,用双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光活性,q RT-PCR检测miR-1271和Twist1 m RNA水平,Western Blot检测Twist1蛋白水平表达,拟探讨miR-1271是否靶向调控Twist1。研究显示,相较于人正常的卵巢上皮细胞,卵巢癌细胞CAOV-3中的miR-1271的表达下调（p<0.05）,过表达miR-1271使卵巢癌细胞CAOV-3增殖、迁移以及侵袭的能力受到抑制,细胞周期蛋白D1、基质金属蛋白酶2及白介素6的表达下降,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A及上皮钙粘蛋白的表达升高（P<0.05）;miR-1271靶向调控Twist1的表达,过表达Twist1可逆转miR-1271对卵巢癌细胞CAOV-3增殖、迁移和侵袭的抑制作用。miR-1271影响卵巢癌细胞的增殖迁移相关基因的表达,抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,其机制可能与靶向调控Twist1相关,可以给卵巢癌的诊断、预防以及治疗提供新的靶点和方向。
吴建磊[4]（2021）在《TIM-3在上皮性卵巢癌发生及其临床预后中的意义》文中进行了进一步梳理上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首,严重影响女性健康。由于缺乏特异性的肿瘤标志物及早期症状,超过70%的EOC患者在诊断时已经处于晚期。目前,EOC的主要治疗方法是手术+铂类为基础的化疗。近年来,虽然PARP抑制剂等辅助治疗策略也被应用于EOC,但晚期EOC患者的5年生存率仍然徘徊在30-40%之间,近40年来改善甚微。因此,迫切需要寻找能够揭示EOC发生、发展的深层次分子机制,为EOC的诊断及新的治疗方法的开发提供理论基础。随着肿瘤免疫学的发展,免疫治疗已成为与手术、化疗、放疗并列的第四种治疗方式。免疫疗法的应用已经彻底改变了一些肿瘤的治疗模式,其中针对免疫检查点分子的治疗,如CTLA-4和PD-1等,在黑色素瘤、肾癌、霍奇金病和肺癌中取得了令人兴奋的结果。但是,针对现有免疫检查点的免疫治疗的整体有效率较低。更为严重的是,包括卵巢癌、结直肠癌在内的多种肿瘤,在很大程度上对CTLA-4或PD-1阻断剂无效。因此,需要对其它的免疫检查点分子进行详细研究,以开发新的免疫检查点药物及筛选对免疫治疗有效的人群,提高免疫治疗的效果。TIM-3蛋白是T细胞免疫球蛋白-粘蛋白家族（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein,TIM）的成员,最初发现在Th1细胞上特异表达,其编码基因位于人类chr5q33,全长23kb,由7个外显子组成。后续研究发现:TIM-3可在多种免疫细胞中表达,如单核细胞、DCs、NK细胞等天然免疫细胞,并参与免疫细胞功能的调控。大量的肿瘤免疫学的研究表明:TIM-3不仅可以通过调控T细胞耗竭和抑制骨髓细胞增殖在肿瘤免疫中发挥负性调节作用,而且可以通过促进肿瘤相关巨噬细胞表型的转化来调节抗肿瘤免疫反应。正如Romero博士在综述《Immunotherapy:PD-1 says goodbye,TIM-3says hello》所说的:TIM-3在肿瘤免疫中发挥重要的免疫检查点作用。因此,TIM-3作为一种潜在的肿瘤免疫治疗候选药物靶点,已经占据了突出的地位。近年来,多项研究也表明TIM-3在肿瘤细胞中过表达,如黑色素瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、宫颈癌、肾透明细胞癌、骨肉瘤等,并通过参与IL-6/STAT3通路、TGF-β/Smad通路和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）等过程促进肿瘤侵袭转移,而且TIM-3的异常表达与患者不良预后相关。先前有学者研究发现,在卵巢癌患者外周血CD4+和CD8+T细胞中TIM-3的表达水平较正常人相比显着升高,而TIM-3高表达的患者的临床分期和肿瘤分级显着高于低表达的患者。进一步研究显示,TIM-3在卵巢癌患者的肿瘤浸润性Tregs中高表达与患者预后不良有关。因此,TIM-3可能在EOC发生发展中起重要作用,可能成为EOC的潜在治疗靶点。但是,目前关于TIM-3在EOC肿瘤细胞中表达情况及在EOC肿瘤发生发展中的作用和机制及其与EOC预后的关系仍不明确。阐明TIM-3表达与EOC肿瘤发生发展的关系及可能的作用机制,有助于加深对EOC发病机制的了解及新的治疗靶点开发,同时可以为EOC高危人群的筛查和免疫治疗疗效的预测提供新的分子标志物。本研究中,我们首先探讨TIM-3蛋白及mRNA在EOC肿瘤组织中的表达情况,并分析其与EOC临床病理特征及预后的关系。其次通过体外实验在细胞水平研究TIM-3对EOC细胞生物学行为的影响及其可能的机制。另外,我们还通过病例-对照研究,探讨TIM-3基因上rs10053538、rs10515746及rs1036199三个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）位点与EOC发病风险及预后的关系,意义在于探讨TIM-3基因上的可能的功能性遗传变异是否通过改变其表达而改变人群EOC的发病风险和患者的临床预后,这也可能为EOC高危人群筛查和免疫治疗疗效的预测提供新的分子标志物。第一部分TIM-3在上皮性卵巢癌组织中的表达及其预后关系的研究目的:探讨TIM-3在EOC组织中的表达与EOC患者临床病理特征及其预后的关系。方法:1.采用免疫组化检测46例EOC组织及21例正常卵巢组织中TIM-3蛋白的表达差异。2.RT-qPCR法检测126例EOC组织及21例正常卵巢组织中TIM-3 mRNA的表达情况,分析TIM-3 mRNA表达与EOC临床病理特征及预后的关系;并通过在线网站GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）查阅TCGA数据库中TIM-3 mRNA在卵巢癌与正常卵巢组织中的表达情况。3.采用多色免疫荧光技术检测135例EOC组织中TIM-3蛋白的表达情况,并分析TIM-3蛋白表达情况及在肿瘤区域TIM-3蛋白表达与EOC患者临床病理特征及预后的关系。结果:1.TIM-3蛋白在EOC组阳性率76.1%（35/46）明显高于正常卵巢组23.8%（5/21）,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.EOC组织中TIM-3 mRNA的相对表达量明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。TCGA数据库中卵巢癌组织中TIM-3 mRNA的表达也显着高于正常卵巢组织（P<0.05）;EOC组织中TIM-3 mRNA高表达患者肿瘤复发风险（HR=2.43,95%CI=1.47-4.04,P=0.001）和死亡风险（HR=1.84,95%CI=1.10-3.08,P=0.021）与低表达患者相比均明显增加。3.EOC组织中TIM-3蛋白的表达与EOC临床分期、分化及手术残留情况密切相关（P<0.05）;肿瘤区域（即CK+区域）TIM-3蛋白的表达与EOC临床分期、分化密切相关（P<0.05）。4.Cox多因素分析显示EOC组织中TIM-3蛋白高表达患者肿瘤复发风险（HR=1.99,95%CI=1.29-3.08,P=0.002）和死亡风险（HR=2.13,95%CI=1.37-3.30,P=0.001）与低表达患者相比均明显增加;CK+区域TIM-3蛋白高表达患者肿瘤复发风险（HR=1.64,95%CI=1.09-2.46,P=0.018）和死亡风险（HR=1.81,95%CI=1.19-2.75,P=0.006）与低表达患者相比均明显增加。结论:1.TIM-3蛋白及mRNA在EOC组织高表达。2.TIM-3表达与EOC临床分期、分化等临床病理因素相关。3.EOC组织中TIM-3 mRNA和蛋白高表达是患者肿瘤复发及死亡的独立危险因素。第二部分TIM-3对卵巢癌细胞生物学行为的影响及机制研究目的:探讨TIM-3对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其可能的机制,明确TIM-3在EOC恶性化进程中的作用及机制,为EOC的靶向治疗奠定理论基础。方法:1.筛选TIM-3高表达细胞株:RT-qPCR及western-blot技术检测人卵巢癌细胞SKOV3、A2780、OVCAR3及人正常卵巢上皮细胞IOSE80中TIM-3的表达。2.采用脂质体转染法构建TIM-3低表达卵巢癌细胞系,CCK-8法及平板克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,流式细胞技术检测细胞凋亡情况的变化,划痕实验及transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。3.Western-blot技术检测转染后EMT及TGF-β/Smad信号通路的变化。结果:1.SKOV3、A2780、OVCAR3细胞中TIM-3 mRNA及蛋白均高于IOSE80细胞（P<0.001）,其中SKOV3细胞中TIM-3 mRNA及蛋白高于A2780、OVCAR3细胞（P<0.05）。2.LVRU6GP-TIM-3-sh RNA治疗转染SKOV3细胞后,TIM-3的mRNA及蛋白表达水平显着低于转染空质粒组（P<0.05）,CCK-8及平板克隆形成实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞的增殖率显着降低（P<0.05）,流式细胞实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞凋亡率显着增加（P<0.05）,划痕实验及transwell小室实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞迁移及侵袭能力显着降低（P<0.05）。3.在SKOV3-sh组细胞中E-cadherin的表达明显高于SKOV3-NC组细胞（P=0.006）;而SKOV3-sh组细胞中N-cadherin和Vimentin的表达明显低于SKOV3-NC组细胞（P=0.014、P=0.002）。SKOV3-sh组细胞Smad7及磷酸化Smad2（p-Smad2）的表达明显高于SKOV3-NC组细胞（P<0.001、P=0.002）,而两组细胞中Smad2的表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.敲低TIM-3的表达可抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迀移,并促进其凋亡。2.敲低TIM-3表达抑制卵巢癌细胞EMT过程,可能与TGF-β/Smad信号通路有关。第三部分TIM-3基因多态性与上皮性卵巢癌遗传易感性及临床预后的关联研究目的:探讨TIM-3基因多态性与EOC遗传易感性及其患者临床预后的关系。方法:1.采用我们课题组标本库的710例EOC患者和700例健康女性的外周血DNA标本,通过聚合酶链反应/连接酶检测反应（polymerase chain reaction/ligase detection reaction,PCR-LDR）方法对TIM-3基因上的3个SNPs位点（rs10053538、rs10515746和rs1036199）进行基因分型,分析不同基因型与EOC患者发病风险及预后的关系。2.采用RT-qPCR检测分别携带TIM-3两个位于启动子区的SNPs位点（rs10053538和rs10515746）不同基因型EOC肿瘤组织中TIM-3mRNA的表达水平,分析其对TIM-3 mRNA表达的影响。3.应用Kaplan-Meier plotter数据库分析TIM-3 mRNA对EOC患者的预后价值。结果:1.TIM-3基因rs10053538、rs10515746和rs1036199的的基因型和等位基因型频率分布在病例组和对照组无统计学差异（P>0.05）。2.预后分析显示携带rs10053538 CA+AA基因型患者的PFS和OS较CC基因型患者明显减少（HR=1.49,95%CI=1.05-2.09,P=0.024;HR=1.57;95%CI=1.09-2.26,P=0.017）;而携带rs10515746CC和rs1036199AA不同基因型的患者的PFS和OS均无统计学差异（P>0.05）。3.RT-qPCR结果显示携带rs10053538 CA+AA基因型的EOC患者癌组织中TIM-3 mRNA的表达量显着高CC基因型的患者（P=0.006）,而携带rs10515746不同基因型的EOC患者癌组织中TIM-3 mRNA的表达量则无明显差异（P>0.05）。4.应用Kaplan-Meier plotter数据库分析显示TIM-3 mRNA高表达与EOC患者差的PFS和OS相关（HR=1.57,95%CI=1.29-1.91,P<0.001;HR=1.31,95%CI=1.06-1.63,P=0.013）。结论:1.TIM-3基因rs10053538、rs10515746、rs1036199 SNPs与EOC发病风险无关。2.rs10053538 SNP与EOC患者的临床预后相关,携带rs10053538CA+AA基因型是EOC患者肿瘤复发及死亡的独立危险因素。3.rs10053538可能是一个功能性的多态性位点。4.TIM-3 mRNA高表达与EOC患者的不良临床预后相关。
阳帆[5]（2020）在《紫花牡荆素抑制胃癌细胞迁移与侵袭的机制研究》文中认为目的:紫花牡荆素能抑制多种肿瘤细胞的增殖,本研究旨在研究其对胃癌细胞迁移与侵袭的影响,并探讨其分子机制,从而为紫花牡荆素的抗肿瘤机制提供依据。方法:1)Casticin对胃癌细胞的影响体外培养AGS和NCI-N87细胞,加入不同浓度Casticin后进行CCK-8、克隆形成实验;Transwell小室及划痕实验检测细胞的侵袭能力及迁移能力;流式细胞仪、DAPI染色法检测细胞周期及细胞凋亡。qRT-PCR、WB检测MMP-2、9的表达,明胶酶谱检测其活性。2)Casticin抑制胃癌细胞迁移、侵袭的分子机制研究紫花牡荆素处理AGS和NCI-N87细胞后,qRT-PCR和WB检测其对RECK表达的影响,BSP实验检测Casticin对RECK甲基化状态的影响;siRECK、RECK-OV转染胃癌细胞后,qRT-PCR、WB检测MMP-2和MMP-9表达变化,以明确胃癌细胞中RECK与MMP-2、-9间的关系;PP2A抑制剂（LB-100）和PP2A激活剂（DES）处理胃癌细胞后,qRT-PCR、WB检测细胞中RECK、MMP-2和MMP-9的表达,BSP检测RECK甲基化状态变化。LB-100和DES处理胃癌细胞后,WB检测DNMT1,MEK和p-MEK表达,以明确PP2A活化/抑制引起RECK表达变化的信号通路。qRT-PCR、WB检测Casticin对PP2A、DNMT1、MEK和p-MEK表达的影响;此外采用PP2A抑制剂处理后用Casticin处理,并通过回复验证明确Casticin对PP2A表达及下游信号分子的影响。3)移植瘤裸鼠模型评价Casticin的抑癌效果分别AGS、NCI-N87细胞移植于裸鼠体内,给予不同浓度Casticin处理,并设置对照组,期间持续观察肿瘤体积变化;采用免疫组化染色、WB检测MMP-2/9、PP2A,RECK 的表达变化。结果:1)Casticin对胃癌细胞的影响通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术、DAPI染色、划痕实验、Transwell、qRT-PCR、WB和明胶谱实验的结果,发现不同浓度Casticin可以显着抑制胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭和MMP-2/9的表达及活性,且呈浓度依赖性;而对人胃平滑肌细胞影响较小。2)Casticin抑制胃癌细胞迁移、侵袭的分子机制qRT-PCR、WB和甲基化实验发现Casticin通过促进PP2A表达,进而抑制MEK活化和DNMT1的表达,削弱RECK甲基化并上调RECK表达,从而抑制MMP-2/9表达,最终使得细胞迁移和侵袭能力下降。3)利用胃癌裸鼠成瘤模型评价Casticin的抑癌效果Casticin处理后移植瘤体积明显小于对照组;免疫组化结果发现,Casticin处理后的肿瘤组织中MMP-2/9明显低表达,呈浓度依赖性;相反,PP2A和RECK的表达增高。WB检测发现Casticin处理后肿瘤组织中MMP-2/9蛋白表达量均有明显下调,PP2A,RECK蛋白表达量均有明显上调。结论:1)Casticin有效抑制胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移;2)Casticin通过促进PP2A表达来抑制MEK活化和DNMT1表达,进而上调RECK表达,导致MMP-2/9的表达下降,最终抑制胃癌细胞侵袭和转移;3)Casticin可明显抑制移植瘤小鼠皮下瘤的生长,且Casticin处理后肿瘤组织中MMP-2/9明显低表达,同时促进了肿瘤组织中PP2A和RECK的表达。
朱静[6]（2020）在《PRR11基因在卵巢癌中的生物学功能及其机制研究》文中指出背景介绍卵巢癌是严重危害女性身心健康的生殖系统肿瘤之一,其发病率相比其他的妇科恶性肿瘤（如宫颈癌、子宫内膜癌）略低。据数据统计显示,全球每年新增卵巢癌发病人数超过52万人,仅在我国每年卵巢癌新增患病人数即超过13万人。并且卵巢癌还是全球范围内致死率较高的恶性肿瘤之一,是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤,近些年来,卵巢癌的发病率与死亡率仍呈不断上升趋势。卵巢癌恶性程度很高,在发病早期并无典型的临床症状,术前也不易鉴别肿瘤的恶性程度与组织类型,因而在确诊时已往往处于晚期,错失最佳的治疗时机。同时由于卵巢癌具有易扩散、易腹腔转移、易复发、耐药率高等特点,卵巢癌患者的总体预后极差,尤其是III-IV期患者,5年生存率仅有25%～30%左右。在过去的20年,基于肿瘤根治手术、肿瘤减灭术治疗、多项辅助药物联合化疗和放射治疗等技术在临床上的应用为患者带来了新的希望,然而,总体存活率仍然较低,且化疗产生的耐药性,亦给患者带来严重的毒、副作用。因此,针对卵巢癌的恶性转移、复发、耐药等分子机制的深入研究,探索早期检测筛选的方法和更有效的晚期治疗策略,仍是当前基础肿瘤学研究的热点。近年来,随着分子生物学的发展,已发现抑癌基因突变或失活（P53、BRCA、ARID1A）、癌基因的异常激活（Ras、Her2、c-fms）以及表观遗传学的改变（甲基化水平、组蛋白修饰）与卵巢癌的恶性临床表型,肿瘤细胞的远处转移以及复发等恶性生物学行为密切相关。富含脯氨酸蛋白（Proline-rich Protein 11,PRR11）基因是新近发现的一种候选癌基因,PRR11作用靶标范围极其广泛,包括膜蛋白受体、粘附分子,生长因子和转录因子等,在肿瘤发生及恶性进展中发挥着重要作用。PRR11对恶性肿瘤影响的研究最早始于肺癌,有报道显示PRR11参与调控肿瘤细胞周期进展。靶向敲低PRR11表达后可引起核糖核苷酸还原酶RRM1和RRM2表达下调,DNA合成速率降低,导致细胞周期阻滞于S期,进而促使细胞增殖能力显着降低。PRR11广泛地表达于消化道恶性肿瘤组织标本中,表达率由高到低依次为食管鳞癌,胃癌,十二指肠癌,结直肠癌,肝癌,是判断患者预后的重要指标。此外,PRR11还可通过调节胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤上皮细胞的间质转型,促进肿瘤细胞的局部浸润和远处转移。然而,在国内外文献中,尚未发现PRR11在卵巢癌的表达以及在卵巢癌中的生物学功能的相关研究报道,为此,在本课题中,通过临床取材分别获得51例卵巢癌组织以及51例卵巢正常上皮细胞标本,在组织水平上,分析PRR11的表达与分布,并探讨其与患者临床病理参数之间的关系;此外,进一步在体外实验中对PRR11在卵巢癌发生发展中的作用及机制进行初步的探索,为卵巢癌临床治疗提供新思路和新靶点。第一部分PRR11在卵巢癌组织中的表达及其临床意义目的:本部分旨在探讨PRR11在卵巢癌临床样本中的表达及分布,并分析PRR11表达与卵巢癌临床病理参数的相关性,初步探讨PRR11在卵巢癌疾病进展中的意义。方法:1.分别采用Real-time PCR、蛋白免疫印迹检测临床收集的51例卵巢癌组织和51例正常卵巢上皮细胞中PRR11 m RNA与蛋白水平的变化;2.应用免疫组织化学法检测PRR11蛋白在卵巢癌组织中的表达及定位,根据PRR11蛋白表达强度分组,进一步分析其与患者临床特征（年龄、组织学分级、淋巴结转移、FIGO分期和组织学类型等）的相关性。3.使用Kmplotter分析PRR11表达与卵巢癌患者预后的相关性。结果:1.与正常的卵巢上皮细胞标本相比较,卵巢癌组织中PRR11在m RNA和蛋白水平呈高表达状态;2.在卵巢癌细胞中,PRR11蛋白主要定位于细胞浆中;临床病例资料分析发现PRR11表达高低与卵巢癌FIGO分期（P=0.026）、淋巴结转移（P=0.029）之间呈正相关,与患者年龄（P=0.649）、组织学分级（P=0.803）和组织学类型（P=0.869）无相关性。3.PRR11高表达卵巢癌患者的总生存期明显低于低表达组患者。结论:卵巢癌组织中高表达的PRR11水平与患者临床恶性表型（FIGO分期,淋巴结转移）呈正相关,高表达的PRR11卵巢癌患者具有较短的生存期,预后越差,PRR11可能作为一个不良预后指标,参与了卵巢癌的疾病进展。第二部分PRR11在卵巢癌细胞中的表达及对卵巢癌细胞增殖能力的影响目的:本部分旨在分析敲低或过表达PRR11基因后对卵巢癌细胞增殖能力的影响及可能机制。方法:1.采用蛋白免疫印迹法分别检测人正常卵巢上皮细胞I0SE80、人卵巢癌细胞系Caov3、SKOV3、OVCAR3和HO-8910中PRR11蛋白的表达。2.设计、合成靶向敲低PRR11的小干扰RNA,采用脂质体LipofectamineTMRNAIMAX转染入人卵巢癌HO-8910细胞中,分别采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹法观察PRR11在m RNA和蛋白水平的干扰效率。3.体外构建PRR11过表达重组载体,采用脂质体LipofectamineTM 2000转染入人卵巢癌Caov3细胞中,分别采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹观察PRR11 m RNA和蛋白水平的过表达效率。4.分别采用CCK-8、克隆形成实验分析敲低PRR11表达后对卵巢癌细胞HO-8910增殖及克隆形成能力的影响。5.分别采用CCK-8、克隆形成实验过表达PRR11基因后对卵巢癌Caov3细胞增殖及克隆形成能力的影响。6.蛋白免疫印迹法检测沉默或过表达PRR11对细胞增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响。结果:1.与人正常卵巢上皮细胞I0SE80相比,PRR11在四种卵巢癌细胞中均呈高表达趋势;其中,PRR11蛋白表达水平在Caov3细胞系中最低,在HO-8910细胞系中最高。2.RNAi敲低PRR11基因表达后,显着抑制HO-8910细胞的增殖及克隆形成能力。3.过表达PRR11基因可显着促进Caov3细胞增殖及克隆形成能力。4.RNAi沉默PRR11基因表达后,HO-8910细胞中增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1蛋白表达明显降低。5.过表达PRR11基因后,Caov3细胞中增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1蛋白表达明显增加。结论:PRR11在卵巢癌细胞中呈高表达趋势,PRR11可能通过正调控增殖相关蛋白c-myc、cyclin D1表达促进卵巢癌细胞的恶性增殖。第三部分PRR11对卵巢癌细胞侵袭及迁移能力的影响目的:本部分旨在探讨敲低或过表达PRR11基因对卵巢癌细胞侵袭及迁移能力的影响及可能机制。方法:1.分别采用Transwell侵袭与迁移实验分析敲低PRR11表达后对卵巢癌细胞HO-8910侵袭与迁移能力的影响。2.分别采用Transwell侵袭与迁移实验分析过表达PRR11基因后,对卵巢癌Caov3细胞侵袭与迁移能力的影响。3.蛋白免疫印迹法检测敲低或过表达PRR11基因,对金属基质蛋白酶MMP-2、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达的影响。结果:1.RNAi敲低PRR11基因表达后,HO-8910细胞的侵袭、迁移能力显着降低,金属基质蛋白酶MMP2表达明显下调、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达升高。2.过表达PRR11基因后,Caov3细胞的侵袭、迁移能力显着增加,金属基质蛋白酶MMP2表达明显上调、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达降低。结论:在卵巢癌中,高表达的PRR11可能通过调节MMP2/TIMP-2比率,促进卵巢癌细胞的侵袭迁移能力。第四部分PRR11调控卵巢癌细胞生物学行为的机制研究目的:本部分旨在分析PRR11调控卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移能力变化的分子机制。方法:1.蛋白免疫印迹法检测沉默PRR11后,HO-8910细胞中Akt、p-Akt、细胞总β-catenin和细胞核内β-catenin表达水平变化。2.Caov3细胞转染PRR11过表达重组载体,并添加PI3K特异性抑制剂LY294002后,蛋白免疫印迹检测Caov3细胞中Akt、p-Akt、细胞总β-catenin和细胞核内β-catenin的表达变化,并分别采用CCK8法、克隆形成实验及Transwell实验检测Caov3细胞增殖、克隆形成及侵袭迁移能力的变化。结果:1.RNAi敲低PRR11基因表达后,HO-8910细胞中Akt活性明显降低,细胞总β-catenin和细胞核β-catenin表达明显减少。2.过表达PRR11基因后,Caov3细胞中Akt活性明显增加,细胞总β-catenin表达增加,β-catenin细胞核转入增加,细胞增殖、侵袭迁移能力明显增加;当加入抑制剂LY294002后,Akt活性明显降低,细胞总β-catenin表达减少,细胞核β-catenin转入减少,Caov3细胞增殖、侵袭迁移能力受到抑制。结论:在卵巢癌中高表达的PRR11可能通过激活PI3K/Akt信号,促进β-catenin核转位继而调控肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭迁移能力。
闫欢[7]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中进行了进一步梳理研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
连烜晔[8]（2020）在《肿瘤低氧微环境下外泌体miR-199a-5p对卵巢癌转移的作用及机制研究》文中提出研究目的卵巢癌是导致妇科恶性肿瘤死亡的主要原因。虽然早期诊断预后良好,但绝大多数病例诊断为晚期,5年生存率仅为30-40%。这种低存活率主要是由于卵巢癌起始阶段常常缺乏典型的临床症状,大约75%的卵巢癌病人诊断时已经发展为中晚期,常伴远处转移和化疗抵抗,因此深入了解卵巢癌浸润和转移机制,寻找新的肿瘤标记物和治疗靶点是非常重要的。研究方法1.外泌体的提取和鉴定体外培养4种卵巢癌细胞（A2780、UWB、HEY、Anglne）。分别在常氧（5%CO2）和低氧（1%O2）环境下培养,分别收集常氧和低氧条件下的卵巢癌4个细胞系的细胞上清液,通过Exo Isolation Kit提取外泌体,通过透射电子显微镜（TEM）观察Exosomes的形态,纳米颗粒追踪分析技术检测外泌体浓度粒径。采用免疫印迹法分析外泌体（Exosomes）表面特异蛋白CD81和CD63的表达水平。2.筛选差异表达的miRNA及其验证利用高通量技术测序鉴定人类卵巢癌细胞分泌的外泌体miRNA在常氧和低氧环境下的差异表达谱。选取4条miRNA,应用Q-PCR验证测序结果。确定待研的miR-199a-5p并分别在四组卵巢癌细胞系（A2780、UWB、HEY、Anglne）及其分泌的外泌体中验证,征集卵巢癌组织（n=20）,同龄人群正常输卵管组织为对照组（n=20）,Q-PCR检测miR-199a-5p在组织中的表达。购买卵巢癌患者OC-1601组织芯片,通过荧光原位杂交分析miR-199a-5p的表达水平并与卵巢癌患者临床病理特征（年龄、肿瘤浸润、淋巴结转移、肿瘤分期）进行相关分析。3.miR-199a-5p的生物信息学分析采用包含12个数据库的生物信息学分析软件miRwalk预测miR-199a-5p的靶基因。通过DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库进行GO分析和KEGG富集分析预测miR-199a-5p靶基因的生物学功能和参与的信号通路。4.miR-199a-5p对卵巢癌细胞的侵袭转移能力的影响及分子机制将miR-199a-5p过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂分别转染至A2780常氧和低氧培养的细胞系中,通过Transwell侵袭、迁移实验和细胞划痕实验,探讨miR-199a-5p对卵巢癌细胞侵袭转移能力的影响。通过荧光素酶报告实验,验证HIF-2α 与 miR-199a-5p的相互作用,转染 miR-199a-5p 过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂于A2780细胞,Western Blot技术检测HIF-2α、Wnt3a、β-catenin蛋白的变化,检测HIF-2α、Wnt3a、β-catenin在卵巢癌组织及正常输卵管组织中的表达。免疫组化检测HIF-2α在卵巢癌组织芯片中的表达变化。5.miR-199a-5p通过外泌体传递对血管内皮细胞连接的影响FITC标记miR-199a-5p,PKH26标记卵巢癌细胞分泌的外泌体,与内皮细胞共培养,并在共聚焦显微镜下观察内皮细胞吞噬外泌体。将miR-199a-5p过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂分别转染至内皮细胞,通过Western Blot来观察miR-199a-5p对内皮细胞连接蛋白（JAM-A、VE-Cadherin）的影响。并通过免疫组化检测组织芯片中,JAM-A、VE-Cadherin的表达。研究结果1.外泌体的提取和鉴定透射电镜观察到典型的杯状圆形双层膜囊泡。纳米粒子跟踪分析（NTA）显示,这些囊泡的直径范围主要为30～170nm。Western Blot检测显示,Exosome特异性蛋白CD81、CD63阳性。2.miR-199a-5p的筛选和验证高通量测序结果,在卵巢癌细胞系常氧和低氧环境中共找到359条差异表达的miRNA,其中上调的有153条,下调的有206条（FDR<0.05）。选取的4条小RNA,相对于常氧环境,miR-199a-5p,miR-214-5P在低氧环境下相对低表达（miR-199a-5p（Z=-4.438,P=0.0030）;miR-214-5P（Z=-4.1828,P=0.0240））。而miR-216a-5p和miR-216b-5p在低氧培养下相对高表达（miR-216a-5P（Z=2.5317,P=0.0064）miR-216b-5p（Z=2.9195,P=0.0053））。Q-PCR验证结果和高通量测序结果一致。选择差异最显着的miR-199a-5p作为研究对象,发现相对于正常输卵管组织,miR-199a-5p在卵巢癌中低表达;miR-199a-5p在卵巢癌细胞系及其分泌的外泌体中,相对于常氧培养,在低氧培养中低表达。原位杂交结果显示,miR-199a-5p在正常输卵管组织显示强荧光,在卵巢癌组织显示弱荧光。miR-199a-5p的表达与卵巢癌临床病理特征关系表明miR-199a-5p的表达与肿瘤浸润（P<0.0010）、淋巴结转移（P<0.0010）、肿瘤TNM分期相关,与年龄无关（P=0.5740）。3.miR-199a-5p的生物信息学分析通过miRwalk数据库中的至少三个数据库,同时预测miR-199a-5p的靶基因,共获得70个候选靶基因,选择和低氧相关的HIF-2α作为miR-199a-5p的潜在靶基因。此外根据候选靶基因分析miR-199a-5p的生物学功能。GO注释富集靶基因的主要分子功能、生物学过程和细胞成分。KEGG信号通路富集靶基因参与了的癌症相关的多个信号通路如Wnt/β-catenin、p13K、NF-κB通路等。4.通过miR-199a-5p-HIF-2α-Wnt/β-catenin轴,来抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移转染miR-199a-5p质粒后卵巢癌细胞A2780在常氧和低氧环境下的侵袭、转移能力明显降低。加入miR-199a-5p抑制剂后,则逆转这一结果。通过生物信息学发现,HIF-2α是miR-199a-5p的潜在靶点。双荧光素酶报告显示:转染HIF-2α野生型的序列后,miR-199a-5p能显着抑制荧光素酶活性,而对HIF-2α突变型的荧光素酶活性无影响,说明了 HIF-2α是miR-199a-5p的直接靶点。免疫印迹实验表明:过表达miR-199a-5p后,可以显着抑制HIF-2α、Wnt3a和β-cateninmRNA在A2780细胞内的表达;而加入miR-199a-5p抑制后,则逆转这以效果,此外相对于正常输卵管组织,HIF-2α、Wnt3a和β-catenin表达在卵巢癌组织中高表达。免疫组化结果显示HIF-2α在卵巢癌组织中染色强阳性,在正常输卵管组织是阴性或弱阳性。相关分析显示卵巢癌组织中HIF-2α与miR-199a-5p的表达存在负性相关。5.外泌体miR-199a-5p可以增强内皮细胞紧密连接共聚焦显微镜显示,内皮细胞可以吞噬卵巢癌A2780细胞分泌的含有miR-199a-5p的外泌体;吞噬miR-199a-5p后内皮细胞的紧密连接标志VE-Cadherin和JAM-A蛋白的表达增加;相比正常输卵管组织,VE-Cadherin和JAM-A在卵巢癌组织中呈阴性或者弱阳性。结论miR-199a-5p在卵巢癌组织中低表达,miR-199a-5p在卵巢癌组织中的表达与临床分期,淋巴结转移和肿瘤浸润相关。低氧微环境下,卵巢癌细胞分泌的外泌体miR-199a-5p的下调促进了卵巢癌细胞的迁移及转移。miR-199a-5p靶基因为HIF-2α,可能通过wnt/β-catenin信号通路发挥作用。卵巢癌来源外泌体miR-199a-5p通过旁分泌作用于血管内皮细胞,其表达下调,可能抑制了内皮细胞之间的紧密连接。
黄枝炯[9]（2020）在《TM4SF1与DDR1相互作用通过PKCα/JAK2/STAT3信号调控卵巢癌细胞侵袭转移的机制研究》文中研究表明第一部分TM4SF1与DDR1在卵巢癌中的表达及其生物学功能预测的生物信息学分析目的探讨TM4SF1与DDR1基因在卵巢癌中的表达,及其在卵巢癌的发生、发展过程中潜在的作用及其相关机制。方法运用生物信息学分析的方法,使用Oncomine、基因表达谱交互分析（GEPIA）和Kaplan-Meier（KM）plotter公共数据库,评估TM4SF1、DDR1基因在常见癌症中的表达及其在卵巢癌患者中的差异表达和对患者预后的价值。然后,通过STRING在线工具查询与TM4SF1和DDR1互作的蛋白,并对它们进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析,以探讨TM4SF1与DDR1在癌症中的潜在生物学功能和通路。结果联合Oncomine、GEPIA数据库分析结果显示,TM4SF1基因在宫颈癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌中均存在高表达;而DDR1基因在宫颈癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌中均存在高表达。蛋白互作分析显示TM4SF1与DDR1之间存在相互作用关系。生存分析显示,TM4SF1高表达的卵巢癌患者的DFS或PFS显着低于TM4SF1低表达的卵巢癌患者（均P<0.05）。TM4SF1的表达与患者的OS无关,而DDR1的表达与患者的DFS或PFS和OS均无显着相关性。KM plotter多基因联合分析显示,TM4SF1和DDR1联合高表达与卵巢癌患者更短的PFS显着正相关（P<0.05）。富集分析结果显示,TM4SF1与DDR1及其与之直接相互作用的前50个蛋白主要参与细胞外基质、胶原蛋白和整联蛋白及其复合物、粘附斑、内质网等细胞内外组分的构成;并通过与整联蛋白、细胞粘附分子、生长因子、蛋白聚糖、神经营养因子受体、γ-连环蛋白等结合,参与细胞-基质粘附、细胞对氨基酸刺激的反应,并通过激活整联蛋白、胶原蛋白介导的相关信号通路、PI3K/Akt通路等多种癌症相关的信号通路发挥生物功能。结论TM4SF1与DDR1基因在包括卵巢癌在内的多种肿瘤中高表达,并且TM4SF1的表达与卵巢癌患者的DFS或PFS相关。TM4SF1与DDR1相互作用,可能通过多条癌症相关的信号传导通路参与癌症的发生、发展。第二部分TM4SF1与DDR1蛋白在卵巢癌组织中的表达及临床意义目的探讨人卵巢癌组织中TM4SF1、DDR1蛋白的表达情况,及其对卵巢癌病人预后的影响方法运用免疫组化染色检测94例卵巢癌病人癌组织中的TM4SF1、DDR1蛋白的表达情况,分别单独分析或联合分析TM4SF1、DDR1蛋白阳性表达与卵巢癌病人的临床病理因素之间的关系,并使用COX单因素和多因素分析卵巢癌病人TM4SF1、DDR1蛋白阳性表达与临床病理因素对卵巢癌病人预后的影响。结果在94例卵巢癌病人的癌组织中,TM4SF1蛋白阳性46例,阳性率48.94%;DDR1蛋白阳性52例,阳性率55.32%;TM4SF1和DDR1蛋白同时阳性26例,阳性共表达率27.66%。临床相关性分析显示,DDR1蛋白在Ⅲ～Ⅳ期、低分化、腹腔侵犯病人中的阳性率（60.98%、62.16%、66.67%）分别高于Ⅰ～Ⅱ期、中～高分化、无腹腔侵犯病人的阳性率（16.67%、30%、32.26%）（均P<0.05）。而TM4SF1蛋白阳性率或TM4SF1和DDR1蛋白阳性共表达率在不同年龄、组织学分级、FIGO分期、组织学类型、腹腔侵犯、新辅助化疗、淋巴结转移的病人之间无显着差异。生存分析显示,DDR1蛋白单独阳性与TM4SF1和DDR1蛋白共阳性表达的卵巢癌病人的总生存（OS）分别显着低于DDR1阴性或TM4SF1和DDR1蛋白非同时阳性的病人;对于无进展生存（PFS）,TM4SF1蛋白单独阳性或TM4SF1和DDR1蛋白同时阳性的卵巢癌病人分别显着低于TM4SF1阴性或TM4SF1和DDR1蛋白非同时阳性的病人。单因素分析提示,FIGO分期、腹腔侵犯、DDR1蛋白阳性、TM4SF1和DDR1蛋白阳性共表达是影响病人OS的因素;而FIGO分期、TM4SF1、TM4SF1和DDR1蛋白阳性共表达是影响PFS的因素。多因素分析提示,仅有TM4SF1和DDR1蛋白阳性共表达是影响病人OS和PFS的独立预后因素。结论TM4SF1和DDR1蛋白在卵巢癌组织中均具有较高的阳性表达率,部分卵巢癌病人共表达TM4SF1和DDR1蛋白,此类病人的OS和PFS很差,TM4SF1和DDR1蛋白是具有前途的生物标记。第三部分TM4SF1与DDR1相互作用影响卵巢癌细胞的侵袭转移的机制研究目的探讨TM4SF1与DDR1蛋白在卵巢癌细胞中的相互作用关系,并验证该互作信号共同参与促进卵巢癌细胞的侵袭转移。方法首先采用Western blot实验在几种卵巢癌细胞系中验证TM4SF1和DDR1蛋白的表达。然后使用细胞免疫荧光双染色检测TM4SF1和DDR1蛋白在卵巢癌细胞中的共定位情况,同时进行免疫共沉淀实验检测卵巢癌细胞中TM4SF1和DDR1蛋白的互作关系。使用TM4SF1 shRNA和DDR1shRNA慢病毒分别构建稳定沉默TM4SF1和DDR1的卵巢癌细胞株,并在稳定沉默DDR1的细胞株上分别用TM4SF1和DDR1过表达慢病毒进行回补（挽救）实验。细胞划痕和Transwell侵袭实验分别用于检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。最后,运用Western blot检测TM4SF1和DDR1不同表达情况下MMP2和MMP9蛋白的表达。结果在HO8910PM、SKOV3和A2780三种卵巢癌细胞系中,TM4SF1和DDR1蛋白在HO8910PM、SKOV3细胞中同时具有较高的表达。通过免疫荧光蛋白共定位实验发现TM4SF1和DDR1蛋白在卵巢癌细胞中具有共定位关系,免疫共沉淀证明了抗DDR1抗体可以同时将卵巢癌细胞中的DDR1和TM4SF1蛋白沉淀。用TM4SF1 shRNA和DDR1 shRNA慢病毒可以成功转染卵巢癌细胞,并分别下调TM4SF1和DDR1基因表达;敲减TM4SF1可以同时部分下调DDR1蛋白的表达;相反,敲减DDR1对TM4SF1蛋白表达影响不大。单独敲减DDR1或TM4SF1均可使卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力下降。在敲减DDR1的卵巢癌细胞上过表达DDR1可以挽救因敲减DDR1而抑制的细胞迁移、侵袭能力,以及MMP2和MMP9的表达。结论在卵巢癌细胞中存在TM4SF1与DDR1蛋白的相互作用关系,并且TM4SF1与DDR1蛋白相互作用协同参与了对卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力以及MMP2、MMP9蛋白表达的调控。第四部分TM4SF1与DDR1相互作用通过PKCα/JAK2/STAT3信号影响卵巢癌细胞的侵袭转移目的探讨在Collagen I诱导下,TM4SF1与DDR1蛋白相互作用促进PKCα/JAK2/STAT3磷酸化级联反应,并且证实该磷酸化过程对卵巢癌细胞的迁移和侵袭功能起促进作用。方法使用Collagen I处理卵巢癌细胞,并用抗DDR1抗体进行免疫荧光染色,了解DDR1在细胞中的变化情况。在Collagen I共培养条件下,使用Transwell实验和三维肿瘤球体侵袭实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力的变化。使用Western blot实验检测不同TM4SF1或DDR1表达状态下卵巢癌细胞PKCα、JAK2、STAT3磷酸化的变化情况。最后,分别用PKCα、JAK2、STAT3的抑制剂处理卵巢癌细胞以确定它们在DDR1和TM4SF1介导的磷酸化级联信号之间的关系,并用划痕和侵袭实验检测细胞迁移率和侵袭能力的变化。结果Collagen I处理卵巢癌细胞可以诱导DDR1聚集于细胞膜上并形成大的受体簇,而沉默TM4SF1使DDR1受体簇显着减少。Collagen I作用后不同时间点检测PKCα、JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,结果显示从1小时开始PKCa、JAK2、STAT3磷酸化开始逐渐增加,3～6小时达到顶峰,12小时磷酸化程度开始有所下降。沉默TM4SF1或DDR1显着抑制了PKCα、JAK2、STAT3磷酸化激活。Transwell实验结果显示:使用Collagen I共培养卵巢癌细胞,细胞的迁移、侵袭能力显着增加,沉默TM4SF1或DDR1后细胞的迁移、侵袭能力均下降;三维肿瘤球体侵袭实验也显示了类似的结果。用PKCα、JAK2、STAT3抑制剂分别处理卵巢癌细胞,结果证实了PKCa先于JAK2活化,而STAT3迟于JAK2发生磷酸化,并且PKCα/JAK2/STAT3磷酸独立于酪氨酸激酶磷酸化;各抑制剂处理卵巢癌细胞后,均显着抑制了细胞的迁移和侵袭能力。结论在TM4SF1存在的条件下,可溶性Collage I可以诱导卵巢癌细胞膜表面的DDR1聚集形成大的DDR1受体簇;TM4SF1可以介导胶原激活的DDR1信号向PKCα传递,PKCα的活化进一步促进了JAK2/STAT3信号传导从而增加卵巢癌细胞迁移和侵袭能力,并且该过程不需要DDR1酪氨酸激酶活性的参与。
刘潇涵[10]（2020）在《Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及促进其侵袭、转移机制的初步研究》文中进行了进一步梳理卵巢癌是女性生殖系统常见的一种恶性肿瘤,发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,但其死亡率却高居榜首。在女性所有恶性肿瘤中,卵巢癌的死亡率排第五。多数卵巢癌患者早期并无症状,且由于卵巢位于腹腔深处,早期筛查较困难。卵巢癌患者中,仅有15%的患者能在早期（FIGO I-II期）诊断。卵巢癌患者中,上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）占所有卵巢恶性肿瘤病理类型的75%-80%。因此,EOC的早期诊断、治疗一直是国内外的研究热点。由于EOC在腹腔内易于种植、转移的特性,探讨上皮性卵巢癌的侵袭、转移和增殖等恶性行为的机制,找寻有效的治疗靶点具有重要的科研和临床意义。Nck家族蛋白是一类重要的衔接蛋白,主要参与酪氨酸激酶信号的传导。Nck蛋白参与调控细胞骨架的重排,在细胞定向迁移运动、血管生成、T细胞受体信号和T细胞的激活等方面也起着重要作用。同时,Nck在乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的侵袭、迁移等恶性行为中也具有重要作用。提示我们,Nck蛋白在EOC的恶性侵袭行为中亦可能发挥着重要作用。第一部分Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义目的:检测Nck1蛋白在不同病理类型卵巢肿瘤组织中的表达情况,分析Nck1表达与EOC患者预后的关系。方法:采用免疫组化和Western blot检测Nck1蛋白在289例EOC患者的石蜡切片标本和95例新鲜手术标本中表达情况;通过免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察Nck1在卵巢癌细胞中的定位;对EOC患者的Nck1的表达情况和生存时间、复发时间进行生存分析;建立Cox单因素和多因素回归模型分析影响EOC患者预后的因素。结果:（1）通过免疫组化观察到在多数正常卵巢和输卵管组织（77.5%）、交界性上皮性卵巢肿瘤组织（51.28%）和良性上皮性卵巢肿瘤组织（71.88%）中,Nck1蛋白表达呈阴性。在176例EOC组织中Nck1均有表达,其中73.3%（n=129）为高表达,26.7%（n=47）为低表达。通过分析EOC组中Nck1高表达和临床病理特征之间的关系,发现Nck1高表达与患者FIGO分期、病理等级、术后残余肿瘤体积、血清Ca125水平显着相关（P<0.05）。（2）通过Western blot共检测95例样本,结果显示,EOC组Nck1蛋白表达水平（1.351±0.494）明显高于正常卵巢（0.395±0.110）,良性上皮性卵巢肿瘤（0.392±0.143）和交界性上皮性卵巢肿瘤（0.531±0.170,P<0.05）。此外,通过分析42例EOC患者中临床病理特征与Nck1表达水平的关系发现,Nck1高表达与FIGO分级、病理级别、术后残余肿瘤大小以及血清CA-125水平有关,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）为了分析Nck1高表达与患者临床预后之间的关联,作者对176名EOC患者进行了10年的随访。通过Kaplan-Meier方法分析显示,Nck1低表达组患者总生存时间和无瘤生存时间均高于Nck1高表达组（P<0.05）。（4）通过单因素Cox分析发现,年龄≥50岁,FIGO分期III-IV期,病理高级别,腹水≥100ml,残余肿瘤大小≥1cm,血清CA-125水平≥900U/ml和Nck1高表达的患者总生存时间较短。多因素Cox分析显示,Nck1高表达,FIGO分期III-IV期,术后残留肿瘤大小≥1cm以及血清CA-125水平≥900U/ml是总体生存率差的独立预后因素。（5）Nck1在三种人卵巢癌细胞系（SKOV3、OVCAR-3和ES-2）中均有较高的表达水平。通过免疫荧光实验发现Nck1表达主要定位于SKOV3和OVCAR-3细胞的细胞质和细胞膜。结论:（1）Nck1蛋白在EOC组织和细胞中呈高表达。（2）Nck1高表达,FIGO分期III-IV期,术后残留肿瘤大小≥1cm以及血清CA-125水平≥900U/ml是总体生存率差的独立预后因素。第二部分Nck1慢病毒表达载体的构建及稳转人卵巢癌细胞系的建立目的:构建带有Zs Green荧光标记和嘌呤霉素抗性基因的Nck1重组干扰慢病毒载体及带有NEO抗性基因的Nck1过表达慢病毒载体,筛选并建立Nck1显着低表达及高表达的稳转人卵巢癌细胞系,为后续实验奠定基础。方法:（1）针对Nck1基因序列,设计并合成3对特异性人Nck1基因干扰序列;将扩增的PCR产物和慢病毒载体进行双酶切,然后将干扰片段连接入表达载体并转入细菌感受态细胞;转化子送测序验证。测序验证正确的克隆,进行高纯度质粒抽提。（2）将构建成功的重组质粒和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集病毒上清液,通过超速离心获得慢病毒超离液后测定滴度。（3）将获得的慢病毒载体转染人卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞,通过荧光显微镜和药物筛选出稳定转染的细胞株。（4）通过Werstern blot和RT-PCR验证转染的细胞中Nck1的表达情况,获得Nck1显着低表达及过表达的稳转细胞系。结果:（1）根据Nck1基因的转录本设计了三个si RNA靶点并合成引物,双酶切实验和DNA测序证实阳性克隆序列正确,成功构建了带有Zs Green荧光标记和puro抗性基因的Nck1重组干扰及过表达慢病毒载体,转染293T细胞后在荧光显微镜下可观察到强烈的荧光,并测定滴度为2×108TU/ml;同时成功构建Nck1过表达慢病毒载体。（2）根据慢病毒转染操作方法,向SKOV3和OVCAR3细胞中分别加入Nck1-NC、Nck1-sh RNA1、Nck1-sh RNA2、Nck1-sh RNA3及Nck1过表达的病毒。感染后再用药物筛选出感染效率>90%的稳转细胞。（3）通过Western blot和Real time-PCR的方法验证了卵巢癌细胞系中Nck1蛋白和m RNA抑制效率,筛选出Nck1低表达及过表达的稳转细胞进行后续实验。结论:课题组成功构建了Nck1 sh RNA慢病毒干扰及过表达载体,筛选并建立了Nck1显着低表达及高表达的稳转人卵巢癌细胞系,为后续实验奠定了基础。第三部分Nck1基因沉默对上皮性卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响目的:通过体内实验和体外实验探讨Nck1对EOC细胞恶性生物学行为的影响,进一步探讨Nck1参与了EOC的发生、发展过程的可能机制。方法:通过免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察Nck1基因沉默对SKOV3细胞形态学的影响;通过Transwell侵袭、迁移实验和细胞粘附实验检测Nck1基因对卵巢癌细胞侵袭、迁移以及粘附能力的影响;通过CCK-8增殖实验和软琼脂克隆形成实验检测Nck1基因对卵巢癌细胞增殖能力的影响;通过构建裸鼠皮下成瘤和腹腔成瘤动物模型,观察Nck1基因沉默对卵巢癌细胞体内成瘤能力的影响。结果:（1）与对照组（SKOV3-NC）相比,Nck1沉默组（SKOV3/Nck1-）形成的片状伪足和丝状伪足明显减少,细胞形态变圆、变钝。（2）Transwell侵袭实验及迁移实验均显示Nck1沉默组（SKOV3/Nck1-和OVCAR3/Nck1-）穿过包被了Matrigel胶的聚碳酸酯膜的细胞数较对照组显着减少;Nck1过表达细胞（SKOV3/Nck1+和OVCAR3/Nck1+）穿过膜的细胞数显着增加。（3）CCK-8增殖实验显示,与对照组相比,在共培养4h、24h、48h、72h和96h后,Nck1沉默组（SKOV3-sh RNA3和OVCAR3-sh RNA1）细胞增殖速率显着减缓,Nck1过表达细胞（SKOV3/Nck1+和OVCAR3/Nck1+）增殖速率显着增加。软琼脂克隆形成实验显示细胞克隆形成数目显着减少。（4）皮下成瘤动物模型显示,与对照组相比,Nck1沉默组（SKOV3/Nck1-）皮下成瘤率更低,瘤体直径更小,瘤体表面新生血管更少。腹腔成瘤模型显示Nck1沉默组形成的肿瘤结节的体积明显小于对照组,形成的肿瘤结节数量明显少于对照组。结论:抑制Nck1基因表达可以改变卵巢癌细胞形态,抑制卵巢癌细胞体外迁移、侵袭和增殖能力,同时抑制卵巢癌细胞体内成瘤的能力。第四部分Nck1通过调节下游磷酸化激酶活性影响上皮性卵巢癌恶性生物学行为的机制探讨目的:探讨Nck1参与EOC恶性生物学行为可能的分子机制。方法:HE染色观察Nck1沉默后裸鼠皮下移植瘤组织形态学的变化;通过Western blot检测Nck1沉默后裸鼠皮下移植瘤组织中与血管生成、侵袭转移相关蛋白VEGF、MMP-2、MMP-9变化;采用人磷酸化激酶抗体芯片检测Nck1沉默后对下游相关磷酸化激酶信号通路的变化的影响。结果:（1）通过HE染色发现,与对照组相比,Nck1沉默组的肿瘤细胞排列相对整齐,细胞大小、形态较接近,病理性核分裂相更少。（2）Nck1沉默组的Nck1蛋白明显下调,且随着Nck1的表达下降,MMP-2、MMP-9以及VEGF的表达也明显下降,差异具有统计学意义。（P<0.05）（3）通过人磷酸化蛋白激酶抗体芯片,共检测到11种磷酸化激酶在Nck1基因沉默后表达显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）Nck1主要通过增强PI3K/AKT/p70S6K信号参与调控卵巢癌细胞增殖、侵袭的能力。结论:（1）Nck1可能通过调节MMP2、MMP-9和VEGF的表达促进卵巢癌细胞侵袭、转移等恶性行为。（2）Nck1可能通过增强PI3K/AKT/p70S6K信号参与调节EOC细胞的恶性行为。全文总结:通过Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及促进其侵袭、转移机制的初步研究,得到研究结论如下:（1）Nck1蛋白在EOC组织和细胞中呈高表达。（2）Nck1高表达,FIGO分期III-IV期,术后残留肿瘤大小≥1cm以及血清CA-125水平≥900U/ml是总体生存率差的独立预后因素。（3）课题组成功构建了Nck1 sh RNA慢病毒干扰载体,筛选并建立了Nck1显着低表达的稳转人卵巢癌细胞系,为后续实验奠定了基础。（4）干扰Nck1基因表达可以改变卵巢癌细胞形态,抑制卵巢癌细胞体外迁移、侵袭和增殖能力。（5）干扰Nck1基因表达可以抑制卵巢癌细胞体内成瘤的能力。（6）Nck1可能通过调节MMP2、MMP-9和VEGF的表达参与了血管形成,促进卵巢癌细胞侵袭、转移等恶性行为。（7）Nck1可能通过增强PI3K/AKT/p70S6K信号参与调节EOC细胞的恶性行为。
二、ADHESION INDUCES MATRIX METALLOPROTEINASE-9 GENE EXPRESSION IN OVARIAN CANCER CELLS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ADHESION INDUCES MATRIX METALLOPROTEINASE-9 GENE EXPRESSION IN OVARIAN CANCER CELLS（论文提纲范文）
（1）溶血磷脂酸对卵巢癌细胞DNA复制的影响及其分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 肿瘤微环境和溶血磷脂酸 |
| 1.1 肿瘤微环境的主要成分 |
| 1.1.1 细胞外基质 |
| 1.1.2 基质细胞 |
| 1.2 肿瘤微环境与溶血磷脂酸 |
| 1.2.2 溶血磷脂酸在肿瘤微环境中的作用 |
| 1.3 卵巢肿瘤微环境 |
| 1.3.1 卵巢肿瘤微环境的关键组分及其作用 |
| 1.3.2 溶血磷脂酸的研究进展 |
| 1.3.3 溶血磷脂酸在卵巢肿瘤微环境的作用 |
| 1.4 结语 |
| 第二章 溶血磷脂酸对卵巢癌细胞DNA复制的影响及其分子机理的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 真核细胞DNA复制调控研究概况 |
| 2.1.2 LPA信号在卵巢癌发展中的作用概述 |
| 2.1.3 研究目的与意义 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞材料 |
| 2.2.2 实验试剂及抗体 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 LPA处理 |
| 2.3.3 转染实验 |
| 2.3.4 抑制剂实验 |
| 2.3.5 蛋白质免疫印迹反应 |
| 2.3.6 mRNA水平表达检测 |
| 2.3.7 CCK-8增殖实验 |
| 2.3.8 ELISA-Brdu检测细胞DNA合成 |
| 2.3.9 免疫沉淀实验 |
| 2.3.10 流式细胞术 |
| 2.3.11 显着性分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 LPA调控双能蛋白的表达 |
| 2.4.2 LPA调控Aurora-A激酶表达的研究 |
| 2.4.3 LPA诱导EGFR的反式激活 |
| 2.4.4 MMPs参与LPA诱导的EGFR反式激活 |
| 2.4.5 LPA诱导的EGFR反式激活调节双能蛋白表达的信号通路 |
| 2.4.6 LPA诱导的EGFR反式激活调节DNA复制的信号通路 |
| 2.4.7 LPA在卵巢癌细胞A2780中的探究 |
| 2.4.8 shRNA-Geminin小鼠成瘤实验 |
| 2.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）DEC1通过调控Wnt/β-catenin信号通路对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1部分 DEC1 在上皮性卵巢癌组织中的表达及与患者预后相关性 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 主要材料 |
| 1.1 标本的收集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 自配试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 上皮性卵巢癌及癌旁组织标本处理 |
| 2.2 上皮性卵巢癌组织和癌旁组织RNA的提取及qRT-PCR |
| 2.3 免疫组化(IHC)染色 |
| 2.4 组织蛋白提取及蛋白免疫印迹反应(Western blot) |
| 3 数据统计分析 |
| 结果 |
| 1.DEC1 在上皮性卵巢癌及癌旁组织中表达情况 |
| 2.DEC1 在上皮性卵巢癌组织中的表达及与患者生存期之间的相关性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第2部分 DEC1 在上皮性卵巢癌细胞中的表达及转染效果 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 主要材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 自配试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞RNA提取和荧光定量PCR |
| 2.4 蛋白免疫印迹反应(Western blot) |
| 3 数据分析及统计方法 |
| 结果 |
| 1.DEC1 在上皮性卵巢癌细胞株中的表达情况 |
| 2.上皮性卵巢癌细胞中转染shDEC1 质粒后干扰DEC1 的表达效果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第3部分 下调DEC1 的表达对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 第一节 下调DEC1 的表达对上皮性卵巢癌细胞增殖能力及凋亡的影响 |
| 材料和方法 |
| 1.主要材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 自配试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 CCK-8 实验 |
| 2.4 Ed U实验 |
| 2.5 TUNEL实验 |
| 2.6 蛋白免疫印迹反应(Western blot) |
| 3.数据分析及统计方法 |
| 结果 |
| 1.下调DEC1 的表达对上皮性卵巢癌细胞增殖能力影响 |
| 2.下调DEC1 的表达对上皮性卵巢癌细胞凋亡的影响 |
| 第二节 下调DEC1 的表达对卵巢癌细胞侵袭迁移能力及EMT的影响 |
| 材料和方法 |
| 1.主要材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 自配试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞划痕实验 |
| 2.4 细胞侵袭实验 |
| 2.5 蛋白免疫印迹反应(Western blot) |
| 3.数据分析及统计方法 |
| 结果 |
| 1.下调DEC1 的表达对上皮性卵巢癌细胞侵袭迁移能力的影响 |
| 2.下调DEC1 的表达对上皮性卵巢癌细胞EMT的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第4部分 DEC1 影响上皮性卵巢癌细胞生物学行为的机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.主要材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 自配试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 蛋白免疫印迹反应(Western blot) |
| 2.4 蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP) |
| 3.数据分析及统计方法 |
| 结果 |
| 1.下调DEC1 的表达后上皮性卵巢癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达变化 |
| 2.下调DEC1 的表达后上皮性卵巢癌细胞中β-catenin总蛋白和核蛋白表达及转录活性变化 |
| 3.下调DEC1 的表达后上皮性卵巢癌细胞中β-catenin蛋白泛素化水平变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 Wnt/β-catenin 信号通路在卵巢肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）miR-1271靶向Twist1对卵巢癌细胞的增殖和转移的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 MicroRNA在卵巢癌中的作用机制及应用前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕期间撰写发表的论文 |
（4）TIM-3在上皮性卵巢癌发生及其临床预后中的意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 TIM-3在上皮性卵巢癌组织中的表达及其预后关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TIM-3对卵巢癌细胞侵袭转移的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TIM-3基因多态性与上皮性卵巢癌遗传易感性及临床预后的关联研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TIM-3与肿瘤发生发展关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）紫花牡荆素抑制胃癌细胞迁移与侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 Casticin对胃癌发展的影响 |
| 1.1 绪论 |
| 1.1.1 胃癌 |
| 1.1.2 胃癌的发生与转移 |
| 1.1.3 紫花牡荆素(Casticin) |
| 1.2 主要实验材料 |
| 1.2.1 细胞株 |
| 1.2.2 主要实验试剂 |
| 1.2.3 主要实验仪器 |
| 1.2.4 药物配制 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.3.1 CCK-8检测 |
| 1.3.2 细胞克隆检测 |
| 1.3.3 DAPI染色检测 |
| 1.3.4 FITC-Annexin V/PI染色检测 |
| 1.3.5 细胞周期检测 |
| 1.3.6 细胞划痕检测 |
| 1.3.7 Transwell侵袭实验 |
| 1.3.8 qRT-PCR检测Casticin对MMP-2/9表达的影响 |
| 1.3.9 Western blotting检测Casticin对MMP-2/9蛋白表达的影响 |
| 1.3.10 明胶酶谱检测Casticin对MMP-2/9活性的影响 |
| 1.3.11 统计与分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 Casticin抑制胃癌细胞增殖 |
| 1.4.2 Casticin抑制胃癌细胞克隆形成 |
| 1.4.3 Casticin诱导胃癌细胞凋亡 |
| 1.4.4 Casticin诱导胃癌细胞周期阻滞 |
| 1.4.5 Casticin抑制胃癌细胞迁移 |
| 1.4.6 Casticin抑制胃癌细胞侵袭 |
| 1.4.7 不同浓度Casticin抑制胃癌细胞MMP-2/9 mRNA表达 |
| 1.4.8 不同浓度Casticin抑制胃癌细胞MMP-2/9蛋白表达 |
| 1.4.9 不同浓度Casticin抑制胃癌细胞MMP-2/9活性 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 Casticin通过下调MMP-2/9的表达抑制胃癌细胞侵袭转移的分子机制 |
| 2.1 绪论 |
| 2.1.1 基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs) |
| 2.1.2 MMPs和RECK的关系 |
| 2.1.3 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase 1,DNMT1) |
| 2.1.4 蛋白磷酸酶2A (Protein Phosphatase 2A,PP2A) |
| 2.1.5 丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(Mitogen-activated extracellularsignal-regulated kinase,MEK) |
| 2.2 主要实验材料 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 药物配制 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 si-RECK瞬时转染 |
| 2.3.2 过表达RECK瞬时转染 |
| 2.3.3 Western blotting检测 |
| 2.3.4 qRT-PCR检测 |
| 2.3.5 BSP检测基因启动子甲基化状态 |
| 2.3.6 统计与分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 Casticin通过消除胃癌细胞中RECK甲基化抑制MMP-2/9表达 |
| 2.4.2 PP2A表达增强可削弱RECK甲基化状态,进而促进RECK表达 |
| 2.4.3 Casticin通过促进PP2A的表达来抑制MEK活化和DNMT1的表达,进而抑制MMP-2/9表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 利用胃癌裸鼠成瘤模型评价Casticin的抑癌效果 |
| 3.1 绪论 |
| 3.1.1 肿瘤 |
| 3.1.2 胃癌 |
| 3.1.3 Casticin的抗肿瘤作用 |
| 3.2 主要实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 主要实验方法 |
| 3.3.1 皮下成瘤 |
| 3.3.2 免疫组化检测 |
| 3.3.3 Western blotting检测 |
| 3.3.4 统计与分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Casticin对体内胃癌肿瘤的抑制作用 |
| 3.4.2 Casticin可增强移植瘤小鼠体内PP2A/RECK的表达,抑制MMP-2/9表达 |
| 3.4.3 Casticin可增强移植瘤小鼠体内PP2A/RECK蛋白表达,抑制MMP-2/9蛋白表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 RECK基因与侵袭性癌的发展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
| 致谢 |
（6）PRR11基因在卵巢癌中的生物学功能及其机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 PRR11在卵巢癌临床组织中的表达及其意义 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 PRR11在卵巢癌细胞中的表达及对其卵巢癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 PRR11对卵巢癌细胞侵袭及迁移能力的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四部分 PRR11促进卵巢癌细胞增殖和转移的分子机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 浆液性卵巢肿瘤的细胞起源 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 信号通路在卵巢癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（7）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（8）肿瘤低氧微环境下外泌体miR-199a-5p对卵巢癌转移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人类卵巢癌细胞及其分泌的外泌体在常氧和低氧培养下miRNA的筛选及验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 外泌体miR-199a-5p对卵巢癌细胞的生物学行为影响及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 外泌体miR-199a-5p对血管内皮细胞的生物学行为的初步探索 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 低氧对肿瘤转移的促进作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）TM4SF1与DDR1相互作用通过PKCα/JAK2/STAT3信号调控卵巢癌细胞侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TM4SF1与DDR1在卵巢癌中的表达及其生物学功能预测的生物信息学分析 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 GEPIA数据库分析 |
| 1.2 Oncomine数据库分析 |
| 1.3 STRING分析 |
| 1.4 功能富集分析 |
| 1.5 Kaplan-Meier(KM)plotter数据库分析 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TM4SF1和DDR1分别在多种癌症中高表达 |
| 2.2 TM4SF1和DDR1在卵巢癌中高表达 |
| 2.3 TM4SF1和DDR1相互作用 |
| 2.4 TM4SF1和DDR1互作蛋白的GO功能和KEGG通路富集分析 |
| 2.5 TM4SF1和DDR1表达对卵巢癌预后的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TM4SF1与DDR1蛋白在卵巢癌组织中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要方法和步骤 |
| 1.3 对照组设置 |
| 1.4 结果判断 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TM4SF1、DDR1蛋白在卵巢组织中的表达情况 |
| 2.2 TM4SF1、DDR1蛋白表达对卵巢病人预后的影响 |
| 2.3 卵巢癌病人预后的单因素和多因素COX分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TM4SF1与DDR1相互作用影响卵巢癌细胞的侵袭转移的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TM4SF1与DDR1蛋白在卵巢癌细胞系中的表达情况 |
| 2.2 TM4SF1和DDR1在卵巢癌细胞中相互作用 |
| 2.3 稳定沉默TM4SF1基因的卵巢癌细胞株的构建 |
| 2.4 稳定沉默DDR1基因的卵巢癌细胞株的构建 |
| 2.5 RNAi干扰TM4SF1后mRNA表达验证 |
| 2.6 RNAi干扰DDR1后mRNA表达验证 |
| 2.7 RNAi干扰TM4SF1后蛋白表达验证及其对DDR1表达的影响 |
| 2.8 RNAi干扰DDR1后蛋白表达验证及其对TM4SF1表达的影响 |
| 2.9 TM4SF1、DDR1对卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响 |
| 2.10 TM4SF1、DDR1对卵巢癌细胞基质金属蛋白酶表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 TM4SF1与DDR1相互作用通过PKCα/JAK2/STAT3信号影响卵巢癌细胞的侵袭转移 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要实验方法及步骤 |
| 2 结果 |
| 2.1 TM4SF1参与Collagen I介导的DDR1聚集 |
| 2.2 Collagen I对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响 |
| 2.3 Collagen I对卵巢癌细胞PKCa/JAK2/STAT3磷酸化的影响 |
| 2.4 TM4SF1、DDR1对PKCa/JAK2/STAT3信号通路的影响 |
| 2.5 PKCα/JAK2/STAT3级联信号之间的关系 |
| 2.6 抑制PKCa/JAK2/STAT3信号通路对卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胶原蛋白及其受体 |
| 3.2 DDRs的结构特征 |
| 3.3 DDR1的功能及其与TM4SF1的互作关系 |
| 3.4 CollagenI和TM4SF1共同参与DDR1的活化并促进卵巢癌的侵袭 |
| 3.5 JAK2/STAT3通路及其潜在的生物学功能 |
| 3.6 PKCα参与JAK2/STAT3通路的活化 |
| 3.7 TM4SF1和DDR1通过PKCα/JAK2/STAT3通路促进卵巢癌侵袭转移 |
| 3.8 STAT3活化的信号调控MMPs促进卵巢癌侵袭转移 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞外基质环境对卵巢癌侵袭转移的影响 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及促进其侵袭、转移机制的初步研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Nck1慢病毒表达载体的构建及稳转人卵巢癌细胞系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Nck1基因沉默对上皮性卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Nck1通过调节下游磷酸化激酶活性影响上皮性卵巢癌恶性生物学行为的机制探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:衔接蛋白Nck在机体发育和恶性肿瘤发展过程中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读研究生期间学术成果 |
四、ADHESION INDUCES MATRIX METALLOPROTEINASE-9 GENE EXPRESSION IN OVARIAN CANCER CELLS（论文参考文献）
- [1]溶血磷脂酸对卵巢癌细胞DNA复制的影响及其分子机理研究[D]. 贾培君. 内蒙古大学, 2021(12)
- [2]DEC1通过调控Wnt/β-catenin信号通路对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响及机制研究[D]. 易韵. 南昌大学, 2021(01)
- [3]miR-1271靶向Twist1对卵巢癌细胞的增殖和转移的影响及机制研究[D]. 周春燕. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]TIM-3在上皮性卵巢癌发生及其临床预后中的意义[D]. 吴建磊. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]紫花牡荆素抑制胃癌细胞迁移与侵袭的机制研究[D]. 阳帆. 南方医科大学, 2020(06)
- [6]PRR11基因在卵巢癌中的生物学功能及其机制研究[D]. 朱静. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [7]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [8]肿瘤低氧微环境下外泌体miR-199a-5p对卵巢癌转移的作用及机制研究[D]. 连烜晔. 山东大学, 2020(02)
- [9]TM4SF1与DDR1相互作用通过PKCα/JAK2/STAT3信号调控卵巢癌细胞侵袭转移的机制研究[D]. 黄枝炯. 广西医科大学, 2020
- [10]Nck1在上皮性卵巢癌组织中的表达及促进其侵袭、转移机制的初步研究[D]. 刘潇涵. 重庆医科大学, 2020(01)