一、牛病毒性腹泻-粘膜病毒作为评价抗丙型肝炎病毒药物的模拟株（论文文献综述）
赵玲洁[1]（2014）在《新型多取代2（5H）-呋喃-2-酮类化合物的合成及生物活性研究》文中指出2（5H）-呋喃-2-酮又叫γ-丁烯内酯，是一类重要的结构单元，广泛存在于天然产物或人工合成的化合物中。这类化合物大多具有良好的生物活性，在医药、农药等领域已有广泛的应用，具有良好的研究价值。在上述研究结果和本课题组对2（5H）-呋喃-2-酮类化合物研究工作的基础上，本论文主要开展了两部分的研究工作：一是发现了一种制备磺内酯的方法，并合成了一系列含2（5H）-呋喃-2-酮的磺内酯类化合物I，研究了它们的抗BVDV病毒活性；二是基于小分子活性天然产物Uncinine，设计合成了一系列新型2（5H）-呋喃-2-酮化合物II，并评价了它们对肿瘤细胞的增殖抑制活性。具体研究工作如下：1.含2（5H）-呋喃-2-酮的磺内酯类化合物I的研究开发了一条合成此类化合物的方法，本方法以苯乙酸为原料，经过酯化反应、Dieckmann缩合反应、羟基保护反应、羟醛缩合、磺酰化反应得到重要甲磺酸酯中间体I-5，其在NaOH存在下，进行分子内的环化反应（CSIC反应），得到了磺内酯类化合物；本课题首次发现了CSIC反应能够在质子碱的催化下发生，也证实了烯醇式甲氧基化合物可作为CSIC反应的底物。通过上述合成方法，设计合成了11个目标化合物，结构通过波谱学方法（NMR、HRMS、IR等）和X-单晶衍射进行了确证，均为未见文献报道的新化合物；采用MTT比色法对所得的11个化合物进行了抗牛病毒性腹泻病毒（BVDV）活性的研究，结果表明它们具有良好的抗BVDV活性，EC50在0.121.2μM，其细胞毒性较小，CC50大于20μM。其中邻溴苯基衍生物I-6f抗病毒活性EC50=0.12μM，是阳性药利巴韦林的10倍。BVDV是抗丙型肝炎（HCV）药物筛选常用的替代模型，具有抗BVDV活性的化合物通常也具有抗HCV活性，因此此类化合物具有潜在抗HCV活性。以上相关成果为抗HCV候选药物的进一步研究奠定了良好的基础。2.小分子活性天然产物Uncinine类似物II的研究借助一种方便的合成方法，合成了一系列的Uncinine类似物II。该方法以ɑ-亚甲基-γ-丁内酯为原料，先合成重要的中间体3-溴甲基-2（5H）-呋喃-2-酮，然后在3位引入含氮基团，最后在2（5H）-呋喃-2-酮的5位进行插烯反应得到Uncinine类似物。通过上述合成方法，制备了24个新型的Uncinine类似物，并通过IR、NMR等波谱学方法的确证了它们的结构。对所得化合物进行体外抗肿瘤活性研究结果表明，所合成的大部分化合物均表现出了良好的抗肿瘤活性，其中化合物II-2a-13表现出了与天然产物Uncinine相当的肿瘤细胞增殖抑制活性（EC109，IC50=3.764±2.752μM），进一步研究表明其能够诱导细胞凋亡。总之，通过上述研究工作，设计合成新型的2（5H）-呋喃-2-酮类化合物35个。其中系列I化合物11个，首次发现了它们具有良好的抗BVDV病毒活性，为进一步的抗HCV候选药物的发现和研究奠定了良好的基础。合成系列II化合物24个，大多具有较好的体外抗肿瘤活性，并筛选出了具有进一步研究价值的候选化合物。
宫晓炜,郑福英,蔺国珍,曹小安,王光华,殷宏,周继章,才学鹏[2]（2012）在《牛病毒性腹泻病毒侵染细胞机制的研究进展》文中研究表明牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是反刍动物和猪体内广泛存在的危害动物健康的重要病原体。BVDV感染牛后主要引起牛的持续性感染、免疫耐受、免疫抑制、繁殖障碍及急慢性黏膜病等临床症状,给养牛业造成重大的损失。其致病机理非常复杂,给该病的治疗和根除带来极大的困难。随着分子病毒学研究的发展以及对猪瘟病毒和黄病毒科其他成员的研究,人们在BVDV分子水平和细胞水平的研究方面也取得了一些进展。就此,作者从BVDV入侵细胞、在细胞内的复制以及与宿主蛋白分子相互作用等方面进行综述,有助于阐明BVDV致病和在体内持续存活的机制,为该病的防治和疫苗研发提供新的思路和对策。
钟发刚[3]（2008）在《牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达》文中进行了进一步梳理以抗BVDV单克隆抗体作为捕获抗体,与鸡抗BVDV IgY（检测抗体）联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品确定判定检测结果的OD490临界值。利用该方法,同时采用病毒分离和RT-PCR方法检测临床粪样23份,结果表明:该方法检测结果与病毒分离和RT-PCR方法的符合率达93.75%和83.33%。进一步优化检测体系,使其检测灵敏度达到274ng/mL;与冠状病毒及轮状病毒无交叉反应,但与猪瘟病毒存在弱交叉反应;通过引入质控血清进行质控检验,试剂盒所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求;经稳定性、重复性试验,试剂盒4℃可以保存6个月,批间和批内的变异系数分别为8.37%和4.31%。初步完成了BVDV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）检测试剂盒的标准化,为批量生产奠定了基础。利用该试剂盒,对新疆北疆6个大型集约化牛场进行BVDV感染调查,结果表明:牛场普遍存在着BVDV的感染,呈零星散发状态,看似正常的牛群也存在着一定的感染,发病牛场感染率达到100%。进一步对各牛场感染病毒进行了细胞培养特性和基因型鉴定,发现感染病毒细胞培养特性和基因型一致,均为非致细胞病变型,BVDV-1型病毒。通过系统进化分析,有两株病毒属于BVDV-1b型,1株属于BVDV-1c型,其余不属于已公布的任何亚型,初步确定属于BVDV一个新的亚型类群。应用RT-PCR方法及套式PCR克隆得到3株新疆分离株E2基因片段（shihezi148、manasi和MNS2）GenBank登录号:EU159699、EU159703和EU169937,序列分析结果表明:三株E2基因长度分别为1121bp、1122bp和1122bp,分别编码373、374和374个氨基酸残基的多肽;核酸序列同源性和系统发生分析表明,3株病毒均属于BVDV基因1型（BVDV-1）,shihezi 148株与澳大利亚Bega株亲缘关系最近,同处于BVDV-1c基因亚型群,其E2氨基酸同源性为90.11%;manasi株和MNS2株E2基因核酸序列仅有4个碱基的差别,它们与changchun 184和匈牙利VEDEVAC株亲缘关系最近,位于BVDV-1b基因亚型群,manasi和MNS2株与changchun184株E2氨基酸同源性分别高达98.66%98.93%。通过基因重组技术,将Shihezi 148株的E2基因克隆到pProEX HTa和pVAX1载体,构建得到了去除C端跨膜区的截短E2基因的原核表达载体pProEX HTa-E2和包括信号肽和全长E2蛋白的真核重组质粒pVAXl-E2；经过PCR、酶切及测序表明：pProEX HTa-E2和pVAXl-E2重组表达载体构建成功。将pProEX HTa-E2质粒转化大肠杆菌DH5、JM109和BL21并诱导表达，表达目的蛋白用SDS-PAGE检测，目的蛋白没有表达；用GenEscortTM试剂转染pVAil-E2质粒、pGFP质粒（阳性对照）、空白对照到BHK-21细胞，pGFP质粒表达检测表明，绿色荧光蛋白得到了一定的表达，间接证明目的载体转染后瞬时表达，但在pVAXl-E2质粒细胞转染后的细胞培养上清中用SDS-PAGE检测没有检测到表达的目的蛋白。对E2基因应用软件预测及序列分析，构建了含有不同抗原表位（1-118）-（144-340）-（100-300）-（1-345）的pET28a-ED1、pET28a-ED2、pET28a-ED3、pET28a-ED4四个质粒，转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达，SDS-PAGE电泳检测结果显示所表达出了E2A、E2B、E2C、E2D融合蛋白相对分子量分别为18．6KDa、28．2KDa、29．2KDa、43．8KD，与预测蛋白分子量大小一致。Western blot分析结果表明，所表达的融合蛋白E2B、E2C、E2D被牛抗BVDV阳性血清识别。选择pET28a-ED4质粒，转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达，并对表达产物进行了纯化。通过方阵滴定法初步建立了检测BVDV血清抗体的间接EllSA方法，对收集的约43份血清样品进行了检测，检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93．55％，证明了所表达的重组蛋白作为包被抗原检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体是可行的，为试剂盒的标准化奠定基础。
吴明福[4]（2007）在《牛病毒性腹泻病毒全基因克隆及核酸疫苗初步研究》文中提出牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosai disease virus，BVDV）是黄病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒属（Pestivirus）代表种（RIB Franch 1991），BVDV主要引起牛的病毒性腹泻-黏膜病（BVD-MD），表现为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产、死胎和畸胎等。在欧美等国，BVDV引发的临床症状影响或潜在影响到养牛业生产的每个环节，如产奶量下降、生长迟缓、繁殖能力下降和继发感染等，近年来通过严格的检测，及时清除持续性感染牛等综合措施，BVDV得到了有效控制。该病在我国二十几个省份存在，但由于没有量化BVDV对养牛业危害的评价系统及合适的检测方法，该病一直被忽视。本研究通过RT-PCR技术和5′末端快速扩增法（5′RACE）成功地扩增了引自中监所的BVDV Oregon C24V株全基因序列，并进行了克隆、序列的测定与分析。测序结果拼接成完整的基因组全序列，基因组结构为：基因组全长12305个碱基，5′非编码区381个碱基，3′非编码区182个碱基，5′和3′非编码区之间有一个大的开放阅读框（ORF），有11742个碱基，起始密码子和终子密码子分别为ATG和TAA，编码3914氨基酸的聚合蛋白。核苷酸同源性比较分析表明本毒株与VEDEVAC株同源性最高为99.50％，其次为Osloss株为92.00％，与Oregon C24V仅为79.41％，推导出氨基酸同源性比较同VEDEVAC株为99.11％，Osloss株为92.93％，Oregon C24V为87.22％。核苷酸和氨基酸进化树分析表明本毒株与VEDEVAC株亲缘关系最为密切。从以上事实推测本毒株并非是Oregon C24V标准株。利用序列本身单一酶切位点将相互重叠、覆盖全基因组的9个片段分别构建成5′和3′两个半长片段，5′端引入T7启动子核心序列；在2920位置通过PCR技术，沉默突变引入AsuⅡ位点作为感染性克隆的遗传标记；为了使转录反应能正确终止，在3′端引入单一酶切位点SacⅡ，通过长片段融合PCR技术将两个半长融合到一起构成完整的全基因组片段，最后连接到低拷贝载体pOK-12上，完成BVDV感染性cDNA载体的构建。PCR扩增BVDV的P14、E2和NS3基因，分别亚克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体上，构建了含3种基因的重组真核表达载体。将以上构建的3种真核表达载体转染牛鼻甲细胞进行瞬时表达，结果在转染48h后P14、E2和NS3得了表达，间接免疫荧光为阳性，而空质粒pcDNA3.1（+）和未转染质粒组的牛鼻甲细胞均呈阴性反应。体外转染实验表明含P14、E2和NS3真核表达载体均能在体外获得表达，从而为下一步的动物试验提供了前提条件。为了评价所构建3种DNA疫苗的免疫效果，将6-8周龄的雌性昆明鼠随机分成4组，分别将它们以每只鼠100μg的剂量分两点肌肉注射接种，同时以空质粒pcDNA3.1（+）做对照。每两周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前采血ELISA法检测抗BVDV抗体，同时检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞的动态变化。结果显示：（1）pcDNA3.1（+）-P14、pcDNA3.1（+）-E2、pcDNA3.1（+）-NS3免疫组抗体为阳性。（2）IFN-γ检测pcDNA3.1（+）-P14、pcDNA3.1（+）-E2、pcDNA3.1（+）-NS3组均高于pcDNA3.1（+）空质粒组。（3）pcDNA3.1（+）-P14、pcDNA3.1（+）-E2、pcDNA3.1（+）-NS3免疫组免疫后外周血CD4+ T淋巴细胞均有升高，CD8+T淋巴细胞pcDNA3.1（+）-E2组呈上升趋势。通过本研究证实，所构建的DNA疫苗能够诱导小鼠产生一定程度的体液免疫和细胞免疫应答。本研究成功对中监所BVDV Oregon C24V株进行了全基因克隆；利用基因重组和长片段融合PCR技术构建了感染性克隆载体；分别构建了含有结构蛋白P14、E2和非结构蛋白NS33种基因的DNA疫苗，并进行了体外瞬时表达和动物体内接种试验。总之，通过本研究将为牛BVDV新型疫苗的研制提供了科学的实验依据，并奠定良好技术基础和物质储备。
邓宇[5]（2006）在《牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究》文中进行了进一步梳理通过MDBK细胞增殖BVDV,收获病毒细胞培养物,利用PEG法和蔗糖密度梯度离心法,浓缩、纯化病毒,得到纯度较高的病毒。用纯化BVDV接种家兔的方法扩增病毒,结果表明,家兔接毒后,不产生定型热,且病毒毒力减弱。用纯化BVDV分别免疫家兔和蛋鸡,制备出琼扩效价为1:32以上的兔抗BVDV高免血清与ELISA效价为1:6400的抗BVDV卵黄抗体,并分别得出这两种抗体消长的规律。复苏本实验室研制并保存的8株分泌抗BVDV单抗隆抗体杂交瘤细胞株,按常规方法制备单抗腹水。经间接ELISA检测,结果除一株（5F11）杂交瘤细胞株抗体滴度下降明显外,其余7株无明显变化,均能稳定分泌抗体。通过对抗原捕获ELISA反应条件的优化,确定了各组分的最佳工作条件,并在此基础上组装成两套检测试剂盒。通过试验确定,BBI公司生产的酶标板（变异系数为4.3%）为试剂盒所用酶标板;兔抗BVDV高免血清、抗BVDV卵黄抗体最佳包被浓度分别为1:1000和1:50;待测血清样品稀释浓度为1:20; McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。组装成了两套试剂盒,经试验,两套检测试剂盒的检测灵敏度均达到274ng/mL,其敏感性是AGP的100倍,与AGP阳性符合率是100%;与冠状病毒及轮状病毒无交叉反应,但与猪瘟病毒存在交叉反应;通过引入质控血清进行质控检验,两种检测试剂盒所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。经稳定性、重复性试验,试剂盒①批间和批内的变异系数分别为8.37%和4.31%;试剂盒②批间和批内的变异系数分别为8.94%和4.75%。试剂盒保存于4℃1个月,仍能保持检测结果稳定。试验结果表明:标准化的抗原捕获ELISA试剂盒具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国BVDV监测提供了行之有效的技术手段,为试剂盒的商品化奠定了基础。
吴立君[6]（2006）在《BVDV E～（rns）基因的真核表达与E2基因真核表达载体的构建》文中认为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV）是黄病毒科瘟病毒属（Flaviridae pestivirus）的成员，主要引起牛病毒性腹泻-黏膜病（BVD-MD），症状为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制；母畜流产、死胎和畸形态等症状。该病主要感染牛，犊牛更易感，也可以感染其他的动物。牛病毒性腹泻病是世界范围的传染性疾病，具有较高的感染率，该病在我国二十几个省份存在，且有扩大趋势。 Erns和E2基因位于BVDV基因组5’端的三分之一部分，分别编码具有抗原性的囊膜蛋白Erns和E2。两种蛋白诱导易感动物产生的中和抗体均能抵抗BVDV和CSFV感染。所以利用Erns、E2蛋白作为诊断试剂具有重要价值。 本实验将实验室已有的质粒pMD18-T-E2经BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切后，连接至杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上，构建成重组质粒pBlueBacHis2A-E2。同样利用DNA重组技术将E2基因连接至毕赤酵母转移载体pPIC9K上，构建成重组质粒pPIC9K-E2。 同样方法对实验室已有的BVDV Erns的PCR产物克隆至pMD18-T载体上，对其鉴定后，将Erns基因连接至杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上，构建成重组表达载体pBlueBacHis2A-Erns。将其与线性化杆状病毒DNA Bac-N-Blue共同转染Sf9昆虫细胞中，经过三轮的噬斑筛选，获得重组杆状病毒。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物的结果表明：Erns基因在杆状病毒表达系统中获得表达，表达产物大小约为30kDa，且具有良好的抗原性。 将重组质粒pBlueBacHis2A-Erns经EcoR Ⅰ利Not Ⅰ双酶切后，Erns基因亚克隆至表达载体pPIC9K上，经酶切和PCR鉴定，命名为pPIC9K-Erns。重组表达载体pPIC9K-Erns经Sal Ⅰ线形化后，电转化整合到毕赤酵母GS115基因组上，阳性转化子命名为GS115-pPIC9K-Erns。将GS115-pPIC9K-Erns在30℃条件下震荡培养，以1％的甲醇诱导，BVDV Erns融合蛋白在毕赤酵母表达系统中获得表达。经SDS-PAGE分析，表达蛋白的分子量大小为37kDa左右。 本实验结果表明Erns基因在昆虫杆状病毒表达系统中充分表达，且具有良好的抗原性。这为进一步的诊断试剂盒的研制和亚单位疫苗的制备奠定了基础，同时也为研究Erns蛋白生物功能提供材料。
古长庆,李君文,晁福寰[7]（2004）在《牛病毒性腹泻-粘膜病毒作为评价抗丙型肝炎病毒药物的模拟株》文中进行了进一步梳理筛选和研制抗丙型肝炎病毒药物的病毒模型是很重要的。丙型肝炎病毒 （HCV）颗粒在体外培养增殖是很困难的。建立HCVRNA的复制系统可以评价药物抑制HCV复制的效果 ,但由于HCV病毒粒子不能完成一个完整的复制过程 ,目前不能鉴定药物抗HCV是作用于病毒复制周期的早期阶段还是晚期阶段。牛病毒性腹泻 粘膜病毒 （BVDV）和HCV有许多相似地方 ,因此 ,BVDV是HCV理想的模型病毒株。
二、牛病毒性腹泻-粘膜病毒作为评价抗丙型肝炎病毒药物的模拟株（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛病毒性腹泻-粘膜病毒作为评价抗丙型肝炎病毒药物的模拟株（论文提纲范文）
（1）新型多取代2（5H）-呋喃-2-酮类化合物的合成及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 2(5H)-呋喃-2-酮化合物的研究概况 |
| 1.1 3 或 4 及 3，4 取代 2(5H)-呋喃-2-酮类化合物 |
| 1.2 5-取代 2(5H)-呋喃-2-酮类化合物 |
| 1.3 本课题组前期关于 2(5H)-呋喃-2-酮类化合物开展的部分研究工作 |
| 参考文献 |
| 2 含 2(5H)-呋喃-2-酮的磺内酯类化合物合成及抗 BVDV 活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 丙型肝炎及其替代病毒模型 BVDV |
| 2.1.2 磺内酯类化合物的研究概况 |
| 2.1.3 研究思路 |
| 2.2 含 2(5H)-呋喃-2-酮的磺内酯类化合物的合成 |
| 2.2.1 中间化合物 I-1 的合成 |
| 2.2.2 中间化合物 I-2 的合成 |
| 2.2.3 中间化合物 I-3 的合成 |
| 2.2.4 中间化合物 I-4 的合成 |
| 2.2.5 关键中间化合物 I-5 的合成 |
| 2.2.6 目标化合物 I-6 的合成 |
| 2.3 化合物的体外活性 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 3 Uncinine 类似物的合成及抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 目标化合物的设计、合成和抗肿瘤活性 |
| 3.2.1 目标化合物的合成 |
| 3.2.2 关键中间体 II-1 的合成 |
| 3.2.3 中间体 II-2 的合成 |
| 3.2.4 5-异丙亚基目标化合物的合成及抗肿瘤活性研究 |
| 3.2.5 3-吗啉胺基-5-亚基-2(5H)-呋喃-2-酮目标化合物的合成及抗肿瘤活性研究 |
| 3.2.6 抗肿瘤机制初步研究 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 4 实验部分 |
| 4.1 化学实验 |
| 4.1.1 主要实验仪器和试剂 |
| 4.1.2 含磺酸内酯环的 2(5H)-呋喃-2-酮的合成合成实验及数据 |
| 4.1.3 Uncinine 类似物的合成实验及数据 |
| 4.2 活性评价实验 |
| 4.2.1 体外抗肿瘤活性 |
| 4.2.2 体外抗病毒活性评价 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 4.2.4 荧光显微镜检测细胞凋亡小体 |
| 附图 |
| 个人简历及攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）牛病毒性腹泻病毒侵染细胞机制的研究进展（论文提纲范文）
| 1 病毒基因组 |
| 2 病毒侵染细胞 |
| 2.1 病毒的黏附和进入 |
| 2.2 病毒的翻译和复制 |
| 3 病毒蛋白和宿主蛋白相互作用的研究现状 |
| 3.1 结构蛋白的研究现状 |
| 3.2 非结构蛋白的研究现状 |
（3）牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分:文献综述 |
| 第一章:牛病毒性腹泻病毒研究进展 |
| 1.BVD的临床表现和致病机理 |
| 1.1 持续性感染与免疫耐受 |
| 1.2.粘膜病与慢性型BVD |
| 1.3 急性BVD |
| 1.4.免疫抑制 |
| 1.5.血小板减少症和出血综合征 |
| 2.流行病学 |
| 3.BVDV的免疫防制 |
| 第二章牛病毒性腹泻病毒检测与防制技术研究进展 |
| 1.牛病毒性腹泻病毒检测技术 |
| 1.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2 血清学检测技术 |
| 1.2.1 琼脂扩散试验 |
| 1.2.2 血清中和试验(SNT) |
| 1.3 免疫学检测技术 |
| 1.3.1 免疫过氧化物酶(IP)技术 |
| 1.3.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4 PCR检测方法 |
| 1.5 核酸探针检测 |
| 2.BVDV防制 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒流行病学研究进展 |
| 第四章 牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展 |
| 1.BVDV基因组结构 |
| 2.BVDV的5′-UTR和3′-UTR |
| 3.BVDB的大开放阅读框架 |
| 4.BVDV的结构蛋白 |
| 4.1 核心蛋白P14 |
| 4.2 病毒囊膜结构蛋白 |
| 4.2.1 囊膜蛋白gp48 |
| 4.2.2 囊膜蛋白gp25 |
| 4.2.3 囊膜蛋白gp53 |
| 5.BVDV非结构蛋白 |
| 5.1 P20(N~(?)) |
| 5.2 P7 |
| 5.3 P125(NS2-3)、NS2和NS3 |
| 5.4 P10(NS4A)和P30(NS4B) |
| 5.5 P58(NS5A) |
| 5.6 P75(NS5B) |
| 6.小结与展望 |
| 第二部分:实验研究 |
| 第五章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞和酶标抗体 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 BVDV抗原制备 |
| 1.4 病毒的纯化-蔗糖密度梯度离心 |
| 1.5 单克隆抗体的制备与纯化 |
| 1.6 鸡抗BVDV IgY的制备 |
| 1.7 待检样品的处理 |
| 1.7.1 病毒细胞培养液的制备 |
| 1.7.2 组织样品的制备 |
| 1.7.3 粪样的制备 |
| 1.8 AC-ELISA方法的建立 |
| 1.9 AC-ELISA中单抗和多抗最佳工作浓度的筛选 |
| 1.10 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定 |
| 1.11 AC-ELISA重复性试验 |
| 1.12 AC-ELISA在实验感染和临床BVDV样品检验中的应用 |
| 2.结果 |
| 2.1 单抗的制备与特性鉴定 |
| 2.2 AC-ELISA中单抗和多抗最佳浓度的筛选 |
| 2.3 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定 |
| 2.4 AC-ELISA方法重复性试验 |
| 2.5 AC-ELISA在BVDV抗原检测中的临床应用 |
| 3.讨论 |
| 第六章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 样品 |
| 1.4 引物设计及合成 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 质控血清的制备 |
| 1.7 酶标板均一性检测 |
| 1.8 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 1.9 抗原与单克隆抗体最佳结合浓度的确定 |
| 1.10 抗原与抗体IgY与最佳结合浓度的选择 |
| 1.11 封闭液及封闭时间的选择 |
| 1.12 酶标抗体作用时间的选择 |
| 1.13 底物显色时间的选择 |
| 1.14 试剂盒的组装 |
| 1.15 试剂盒敏感性检验及其对比试验 |
| 1.16 试剂盒特异性检验 |
| 1.16.1 阻断试验 |
| 1.16.2 交叉试验 |
| 1.17 试剂盒质量控制试验—Levey-Jennings质控图的绘制 |
| 1.18 试剂盒的重复性和稳定性试验 |
| 1.18.1 批内试验 |
| 1.18.2 批间试验 |
| 1.18.3 保存期试验 |
| 2.结果 |
| 2.1 酶标板均一性检测 |
| 2.2 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 抗原与单抗最佳结合浓度的确定 |
| 2.4 抗BVDV IgY与抗原最佳结合浓度的确定 |
| 2.5 封闭液及封闭时间的确定 |
| 2.6 酶标抗体作用时间 |
| 2.7 底物显色时间的选择 |
| 2.8 试剂盒特异性检验 |
| 2.8.1 阻断试验 |
| 2.8.2 交叉试验 |
| 2.9 试剂盒敏感性测定 |
| 2.10 BVDV特异性引物RT-PCR扩增结果 |
| 2.11 质控血清检测结果 |
| 2.12 试剂盒稳定性检测 |
| 2.13 试剂盒保存期试验结果 |
| 2.14 试剂盒操作步骤 |
| 3.讨论 |
| 第七章 新疆北疆集约化奶牛场牛病毒性腹泻病毒病原学调查 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 样品采集、处理 |
| 1.4 引物设计合成 |
| 1.5 主要溶液 |
| 1.5.1 消化液(EDTA-胰酶) |
| 1.5.2 细胞培养液(含20%胎牛血清替代剂的RPMI-1640) |
| 1.5.3 维持液(含5%胎牛血清替代剂的RPMI-1640) |
| 1.6 牛病毒性腹泻病毒抗原检测 |
| 1.7 牛病毒性腹泻病毒阳性样品细胞培养 |
| 1.7.1 MDBK细胞培养 |
| 1.7.2 病毒接种细胞 |
| 1.8 牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定 |
| 1.8.1 病毒RNA的提取 |
| 1.8.2 病毒型鉴定RT-PCR |
| 1.9 不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析 |
| 1.9.1 反转录体系 |
| 1.9.2 PCR反应体系 |
| 1.9.3 PCR产物的回收、连接、转化、克隆和测序 |
| 1.9.4 序列分析比对 |
| 2.结果 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒抗原检测 |
| 2.2 牛病毒性腹泻病毒阳性样品基因型鉴定 |
| 2.3 不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析 |
| 3.分析讨论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 讨论 |
| 第八章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆及序列分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 菌种和质粒 |
| 1.1.3 主要试剂与工具酶 |
| 1.1.4 引物设计与合成 |
| 1.1.5 培养基与抗生素 |
| 1.1.6 主要生化试剂与溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞毒BVDV总RNA的制备 |
| 1.2.2 RT-PCR扩增目的基因 |
| 1.2.3 RT-PCR产物的检测 |
| 1.2.4 DNA目的片段的回收 |
| 1.2.5 连接反应 |
| 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.7 细菌的转化 |
| 1.2.8 重组质粒的小量制备 |
| 1.2.9 E2基因的鉴定及测序 |
| 1.2.10 E2基因序列分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增结果 |
| 2.2 目的基因的重组质粒鉴定结果 |
| 2.3 E2基因序列测定及分析 |
| 2.4 E2基因的同源性分析 |
| 2.5 E2基因的进化分析 |
| 3.分析与讨论 |
| 3.1 BVDV新疆分离株E2基因的克隆 |
| 3.2 manasi、MNS分离株E2基因同CC-184株的进化关系 |
| 3.3 新疆分离株E2基因的抗原表位分析 |
| 3.4 新疆分离株E2基因的来源分析 |
| 第九章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆表达 |
| 实验一 BVDV石河子株E2表达载体的构建及表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株质粒、菌株和细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物的设计及合成 |
| 1.4 RT-PCR |
| 1.5 基因的克隆和鉴定 |
| 1.6 基因序列分析及潜在抗原表位比较分析 |
| 1.7 原核表达质粒的构建 |
| 1.8 真核表达质粒的构建 |
| 1.9 重组蛋白的诱导表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 E2基因的克隆 |
| 2.2 E2基因核苷酸及氨基酸序列分析 |
| 2.3 潜在抗原表位比较分析 |
| 2.4 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.5 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.6 E2基因的表达及检测 |
| 2.6.1 E2蛋白在原核系统中的表达及检测 |
| 2.6.2 E2蛋白在真核系统中的表达及检测 |
| 3 讨论 |
| 实验二 BVDV玛纳斯株E2基因主要抗原表位区域的分段表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株与BVDV阳性和阴性血清 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物的设计及合成 |
| 1.4 RT-PCR及基因的克隆和鉴定 |
| 1.5 序列分析及二级结构预测 |
| 1.6 分段表达质粒的构建 |
| 1.7 目的蛋白的诱导表达 |
| 1.8 表达产物的SDS-PAGE电泳 |
| 1.9 重组蛋白的Western blot检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增结果与鉴定 |
| 2.2 序列分析 |
| 2.3 二级结构及抗原表位预测 |
| 2.4 表达重组载体的构建与鉴定 |
| 2.5 诱导表达SDS-PAGE电泳结果 |
| 2.6 Western blotting分析 |
| 3 讨论与结论 |
| 第十章:BVDV -E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 1.4 重组蛋白的特异性检测 |
| 1.5 重组蛋白的纯化及纯化蛋白活性检 |
| 1.6 重组蛋白质的包被及定量 |
| 1.7 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.结果 |
| 2.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2 重组蛋白的特异性检测 |
| 2.3 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE及Western-blot检测 |
| 2.4 方阵滴定试验 |
| 2.5 样品检测结果 |
| 3.分析讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文、获奖情况 |
| 论文 |
| 获奖 |
| 资助项目 |
（4）牛病毒性腹泻病毒全基因克隆及核酸疫苗初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 BVDV生物学特性 |
| 1.1.1 BVDV形态和理化学特性 |
| 1.1.2 BVDV分类位置 |
| 1.1.3 BVDV的分型 |
| 1.2 BVDV基因组及其编码蛋白 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的蛋白及功能 |
| 1.3 BVDV的临床症状 |
| 1.3.1 繁殖障碍与持续感染 |
| 1.3.2 黏膜病 |
| 1.3.3 急性BVD |
| 1.3.4 免疫抑制及呼吸道并发症 |
| 1.3.5 血小板减少症 |
| 1.4 BVDV引起黏膜病的分子机制 |
| 1.4.1 病毒基因与宿主细胞基因的重组 |
| 1.4.2 病毒基因的重复复制及重排 |
| 1.4.3 病毒基因重复复制和插入序列同时存在 |
| 1.4.4 病毒基因的缺失 |
| 1.5 对BVDV控制的研究 |
| 1.5.1 BVDV检测技术 |
| 1.5.2 BVDV免疫的研究 |
| 1.5.3 新型BVDV疫苗的研究 |
| 1.6 BVDV全长cDNA感染性克隆研究进展 |
| 1.6.1 BVDV病毒感染性克隆技术 |
| 1.6.2 BVDV感染性克隆的研究 |
| 1.7 本试验研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 病毒与细胞 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 BVDV全基因的克隆 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 BVDV基因组RNA的提取 |
| 2.2.3 反转录合成cDNA |
| 2.2.4 PCR反应扩增目的基因 |
| 2.2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 PCR产物的克隆与转化 |
| 2.2.7 重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 2.2.8 序列测定和比较 |
| 2.3 全长cDNA的连接 |
| 2.3.1 5′端引入T7启动子核心序列 |
| 2.3.2 T7-5′片段反转录扩增 |
| 2.3.3 T7-5′片段克隆、转化及鉴定 |
| 2.3.4 全长cDNA克隆的构建 |
| 2.3.5 融合PCR构建BVDV全长cDNA |
| 2.4 P14、E2、NS3真核表达载体的构建 |
| 2.4.1 PCR扩增引物设计 |
| 2.4.2 P14、E2、NS3基因的扩增 |
| 2.4.3 PCR产物的克隆与转化 |
| 2.4.4 重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 2.4.5 序列测定和比较 |
| 2.4.6 真核表达载体的构建及体外表达 |
| 2.5 DNA疫苗对小鼠免疫效果的研究 |
| 2.5.1 DNA疫苗质粒的大量制备及其纯化 |
| 2.5.2 小鼠的免疫接种实验 |
| 2.5.3 抗体的检测 |
| 2.5.4 小鼠淋巴细胞IFN-γ分泌水平检测 |
| 2.5.5 外周血T淋巴细胞亚类动态变化的监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 BVDV病毒全基因克隆及序列分析 |
| 3.2 重组质粒鉴定 |
| 3.3 基因结构 |
| 3.4 与参考毒株基因核苷酸序列比较和同源性分析 |
| 3.5 参考毒株基因氨基酸序列比较和同源性分析 |
| 3.6 BVDV全长cDNA的构建 |
| 3.6.1 5′端和3′端半长的构建 |
| 3.6.2 长片段融合PCR |
| 3.7 重组真核表达载体的构建 |
| 3.7.1 目的基因的扩增 |
| 3.7.2 重组质粒鉴定 |
| 3.7.3 重组真核表达载体的构建 |
| 3.7.4 重组真核载体表达产物的荧光检测 |
| 3.8 核酸疫苗对小鼠的免疫效果研究 |
| 3.8.1 抗体检测 |
| 3.8.2 小鼠淋巴细胞IFN-γ分泌水平检测 |
| 3.8.3 T细胞亚类检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BVDV的全基因克隆 |
| 4.1.1 病毒繁殖与基因扩增 |
| 4.1.2 序列比较 |
| 4.2 BVDV全长cDNA的构建 |
| 4.2.1 获得真实的cDNA片段 |
| 4.2.2 关于cDNA的稳定性 |
| 4.2.3 长片段融合PCR在构建BVDV cDNA的应用 |
| 4.2.4 启动子的选择 |
| 4.3 瞬时表达载体及细胞的选择 |
| 4.4 核酸疫苗对小鼠免疫功能的影响 |
| 4.4.1 ELISA法对抗体的检测 |
| 4.4.2 体液免疫 |
| 4.4.3 重组真核表达载体对小鼠INF-γ的影响 |
| 4.4.4 关于T细胞亚型分类 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英语缩写 |
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 |
| 1 材料 |
| 2 细胞培养、病毒增殖与提纯 |
| 3 BVDV 人工感染家兔试验 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 试验二 抗BVDV 卵黄抗体和兔抗BVDV 高免血清的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 抗BVDV 卵黄抗体的制备 |
| 3 兔抗BVDV 高免血清的制备 |
| 4 结果分析 |
| 5 讨论 |
| 试验三 单抗腹水的制备 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 抗原捕获ELISA 检测试剂盒的标准化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究资助 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（6）BVDV E～（rns）基因的真核表达与E2基因真核表达载体的构建（论文提纲范文）
| 独创声明 |
| 学位论文版权使用授权书 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 BVD-MD的历史 |
| 1.2 BVDV生物学特性 |
| 1.2.1 BVDV形态和理化特性 |
| 1.2.2 瘟病毒及BVDV分型 |
| 1.3 BVDV的主要蛋白功能 |
| 1.4 目前对BVDV E2的研究 |
| 1.5 BVDV的持续性感染 |
| 1.5.1 持续性感染的原因 |
| 1.5.2 持续性感染的危害 |
| 1.6 目前国内外对BVD的防治情况 |
| 1.7 本实验研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BVDV E~(rns)基因的克隆及鉴定 |
| 2.2.2 BVDV E~(rns)、E2基因真核表达转移载体的构建 |
| 2.2.3 E~(rns)在昆虫细胞中的表达 |
| 2.2.3 E~(rns)和E2基因重组酵母转移载体的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 含有E~(rns)基因的杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.1 重组质粒pMD-18T-E~(rns)的鉴定 |
| 3.1.2 重组质粒pBlueBacHis2A-E~(rns)的鉴定 |
| 3.2 含有E2的杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.3 E~(rns)基因在杆状病毒系统中的表达 |
| 3.3.1 转染及重组病毒的纯化 |
| 3.3.2 重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.4 表达产物SDS-PAGE分析和Western-blotting检测 |
| 3.4.1 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 3.4.2 表达产物的western-blotting检测 |
| 3.5 含有E~(rns)基因的毕赤酵母转移载体的构建 |
| 3.5.1 E~(rns)基因的扩增 |
| 3.5.2 重组质粒pMD18-T-E~(rns)的鉴定 |
| 3.5.3 重组质粒pPIC9K-E~(rns)的鉴定 |
| 3.5.4 E~(rns)基因的核苷酸序列的测定分析 |
| 3.6 含有BVDV E2基因的毕赤酵母转移载体的构建 |
| 3.6.1 BVDV E2基因的扩增 |
| 3.6.2 pMD18-T-E2的鉴定 |
| 3.6.3 重组质粒pPIC9K-E2的鉴定 |
| 3.6.4 E2基因的核苷酸序列测定分析 |
| 3.7 含有E~(rns)、E2基因重组酵母转化子的鉴定 |
| 3.7.1 pPIC9K-E~(rns)、pPIC9K-E2的线性化鉴定 |
| 3.7.2 高拷贝转化子的筛选 |
| 3.7.3 重组毕赤酵母表型的鉴定 |
| 3.7.4 重组转化子的PCR鉴定 |
| 3.8 P.Pastoris GS115表达BVDV E~(rns)蛋白SDS-PAGE电泳结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目的片段的选择 |
| 4.2 巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)表达系统对目的基因的要求 |
| 4.3 选用猪瘟血清作为检测BVDV抗体的原因 |
| 4.4 E2基因的构建 |
| 4.5 E~(rns)基因的表达 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表学位论文 |
（7）牛病毒性腹泻-粘膜病毒作为评价抗丙型肝炎病毒药物的模拟株（论文提纲范文）
| 一、 BVDV和HCV的联系和区别 |
| (一) 基因组结构和编码蛋白的相似性 |
| (二) 在各自宿主体内相似的持续性感染特征 |
| 二、 抗病毒重要靶点的相似性 |
| (一) 通过相似的细胞受体吸附和侵入细胞 |
| (二) 通过功能相似的IRES进行翻译 |
| (三) 使用相似的NS3蛋白水解蛋白 |
| (四) 使用相似的NS5B酶进行复制 |
| (五) 病毒成熟、装配和修饰 |
| 三、 展望 |
四、牛病毒性腹泻-粘膜病毒作为评价抗丙型肝炎病毒药物的模拟株（论文参考文献）
- [1]新型多取代2（5H）-呋喃-2-酮类化合物的合成及生物活性研究[D]. 赵玲洁. 郑州大学, 2014(02)
- [2]牛病毒性腹泻病毒侵染细胞机制的研究进展[J]. 宫晓炜,郑福英,蔺国珍,曹小安,王光华,殷宏,周继章,才学鹏. 畜牧兽医学报, 2012(04)
- [3]牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达[D]. 钟发刚. 四川农业大学, 2008(02)
- [4]牛病毒性腹泻病毒全基因克隆及核酸疫苗初步研究[D]. 吴明福. 东北农业大学, 2007(02)
- [5]牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究[D]. 邓宇. 石河子大学, 2006(11)
- [6]BVDV E～（rns）基因的真核表达与E2基因真核表达载体的构建[D]. 吴立君. 东北农业大学, 2006(02)
- [7]牛病毒性腹泻-粘膜病毒作为评价抗丙型肝炎病毒药物的模拟株[J]. 古长庆,李君文,晁福寰. 国外医学.病毒学分册, 2004(06)
标签：elisa试剂盒论文; 重组蛋白论文; 基因合成论文; 质粒载体论文; 科学论文;