一、肝外胆管癌组织中HSP70的表达意义（论文文献综述）
高龙[1]（2021）在《GRP78在胆管癌中的表达及与预后关系的研究》文中研究表明目的探讨GRP78在胆管癌中的表达情况及其预后价值。方法收集接受手术治疗的胆管癌患者临床组织标本,利用i TRAQ技术对胆管癌组织进行差异蛋白组学分析,差异1.2倍及以上被认为存在表达差异,最终筛选出差异蛋白GRP78进行后续实验。应用q RT-PCR和western blot技术验证GRP78在胆管癌癌组织和癌旁组织中的表达情况,通过分析胆管癌组织芯片的免疫组织化学染色结果来评估GRP78和胆管癌预后之间的相关性。结果i TRAQ技术共筛选出147个差异蛋白,其中热休克蛋白70家族成员HSPA5（GRP78）、HSPA8（HSC70）和HSPA9（GRP75）差异显着,通过免疫组织化学技术对比三者在胆管癌组织中的表达水平和文献查阅结果,最终选取HSPA5（GRP78）进行进一步的研究。验证GRP78在胆管癌组织中的表达情况,western blot结果示GRP78蛋白在8例胆管癌癌组织中表达量均较高,在癌旁组织中表达水平均较低,并且在其中4例癌旁组织中表达量尤其低。q RT-PCR结果示GRP78 m RNA在8例胆管癌癌组织中的平均相对表达量为2.90,显着高于癌旁组织平均相对表达量0.89,两者相差3.26倍（t=4.834,p<0.001）。对包含60例胆管癌患者的组织芯片进行免疫组织化学分析,结果发现GRP78高表达患者中位总生存时间仅为6.83个月,明显低于GRP78低表达患者12.01个月的中位总生存时间,并且GRP78高表达患者的无病生存时间（3.74个月）亦明显低于GRP78低表达患者（11.70个月）,结合Kaplan-Meier生存曲线结果发现GRP78高表达患者不仅总生存率较低,而且很容易出现术后复发情况。GRP78蛋白和患者各临床特征之间无明显相关性,P>0.05。单因素cox分析指出GRP78高表达、肿瘤直径≥5cm、肝内胆管癌、血管侵犯阳性以及高TNM分期等与胆管癌患者生存时间以及无病生存时间密切相关（P均<0.05）,之后进行多因素cox分析,发现GRP78高表达和肝内胆管癌以及肿瘤直径≥5cm皆是胆管癌患者术后复发的独立危险因素（P均<0.05）,并且GRP78高表达是总生存时间的独立危险因素（P<0.05）。结论GRP78在胆管癌中呈异常高表达状态,并且GRP78高表达和胆管癌患者预后不良密切相关,是一个潜在的胆管癌预后指标和治疗靶标。
孙晨[2]（2021）在《HSP90通过STAT3调控不全热消融术后肝癌细胞凋亡的机制研究》文中认为研究目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第六大恶性肿瘤,死亡率排在第三位,给人民健康造成极大威胁[1]。射频消融（Radiofrequency ablation,RFA）作为一种微创的介入治疗技术,对于直径小于3 cm的HCC具有根治性治疗作用,总体疗效也与外科切除术相当,且并发症发生率更低[3]。然而,由于消融能量在肿瘤中的分布不均,对肿瘤边缘癌细胞杀伤效率不高,最后可能导致局部复发,甚至增强癌细胞侵袭性最后导致预后不良[4]。本研究通过构建肝癌体内及体外不全热消融（incomplete RFA,iRFA）模型,进一步探究iRFA后肝癌细胞存活的分子机制;明确热休克蛋白 90（Heat shock protein 90,HSP90）以及 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）在热处理条件下抵抗细胞凋亡的内在机制;同时评估新型口服HSP90抑制剂XL888增强iRFA条件下肝癌细胞的热敏感性,为射频联合小分子抑制剂治疗肝癌提供新方向。研究方法:1、采用CCK8检测热处理及药物处理后细胞活性情况;2、集落形成实验检测热处理及药物对细胞增殖的影响;3、应用Hoechst 33258检测药物与热处理后细胞核变化情况;4、蛋白免疫印迹技术（Western blotting）检测目标蛋白的表达;5、构建裸鼠体内iRFA模型用于后续实验验证;6、采用RT-qPCR方法检测目的基因的mRNA水平表达;7、免疫共聚焦检测目标蛋白细胞内表达及定位;8、采用cDNA质粒转染过表达目标蛋白;9、采用免疫共沉淀法分析蛋白质复合物的形成;10、免疫组化检测异体肿瘤组织内蛋白表达情况;结果:1.首先评估HSP90与STAT3在肝癌临床组织中的相关性。TCGA数据库临床肝癌mRNA数据分析显示,HSP90与STAT3二者相关系数为0.32,存在相关性;2.肝癌组织免疫组化结果提示HSP90及STAT3肿瘤内协同表达增高。其中在高表达HSP90的标本内STAT3表达也上调,且二者与肿瘤分期、高AFP密切相关;3.构建体外亚致死热处理模型。应用CCK8检测不同温度及时间梯度处理后细胞活性情况,在48℃及以上温度条件下,细胞活性明显受到抑制,而在46℃及以下温度时,细胞活性几乎未受影响,同理选取10min持续处理时间作为后续亚致死处理条件;4.亚致死热处理条件下HSP90与STAT3互作增强。IP结果证实生理条件下HSP90与STAT3存在相互结合,而热处理增加了二者之间的结合作用,并且Western blotting结果提示STAT3蛋白表达增高,同时其下游重要抗凋亡蛋白Mcl-1（myeloidcell lekemia-1）及Bcl-xL表达也有所升高,并且在mRNA水平也证实二者表达增高;5.热处理条件下STAT3活化情况增多并促进p-STAT3入核。提取核蛋白行Western blotting结果显示热处理诱导p-STAT3入核增加,并发挥转录因子活性;6.热处理条件下HSP90与STAT3的结合在体内发挥抗凋亡活性。我们应用裸鼠皮下成瘤方式,成功在小鼠体内移植肝癌细胞系,待肿瘤最大径长至0.8cm时,应用有效射频直径1cm的射频针穿刺至小鼠体内,按照5W、60s的条件进行不全射频消融,随后剖开肿瘤可见肿瘤内部凝固型坏死周围过渡带,并且小鼠存活良好无感染等并发症,显示成功构建体内不全射频模型;7.不全RFA刺激肿瘤向恶性表型转化。每周测量肿瘤最大径及垂直横径,结果显示在iRFA早期,肿瘤体积较对照组明显缩小,但随着喂养时间延长,肿瘤生长速度明显加快,虽然至喂养结束时体积仍小于对照组,但是增长速率已经明显增快,免疫组化结果显示Ki-67在iRFA表达增多;8.XL888对肝癌细胞杀伤呈现浓度依赖及时间依赖性。首先在体外应用不同浓度XL888及不同时间处理肝癌细胞后,CCK8检测细胞活性变化情况,结果提示随着XL888浓度升高及时间延长,对细胞活性抑制逐渐明显;9.热处理联合XL888促进肝癌细胞凋亡。在选取100nm作为处理浓度后,CCK8结果提示联合处理细胞活性较单独加药及热处理组明显减低,并且随着XL888浓度升高,联合处理组杀伤肿瘤作用更加明显,Hoechst 33258染色结果提示联合处理可诱导细胞核固缩,提示XL888可增强肝癌细胞热敏感性;10.XL888联合热处理通过活化Bcl-2通路及诱导caspase3活化促进肝癌细胞凋亡。Western blotting结果提示联合处理条件下BCL-2家族重要成员Mcl-1及Bcl-xL变化显着,同时caspase3及PARP明显活化;11.XL888通过破坏HSP90-STAT3相互结合从而促进肝癌细胞的热敏感性。IP结果提示XL888处理后HSP90与STAT3结合明显减少,同时蛋白水平检测发现STAT3及p-STAT3活性明显减低;12.联合处理抑制p-STAT3入核。提取核蛋白并检测p-STAT3表达发现其核内表达明显减少,且下游靶蛋白Mcl-1及Bcl-xL表达减低;13.XL888联合热处理通过STAT3发挥促凋亡作用。在联合处理的肝癌细胞内转染STAT3 cDNA后,CCK8检测发现细胞活性较联合处理组有所恢复,同时凋亡相关蛋白表达相应减少;14.XL888在体内增强iRFA杀伤肿瘤作用。体外构建不全RFA模型同时联合XL888灌胃处理后,定期测量小鼠肿瘤直径并于21天后处死小鼠,结果发现小鼠肿瘤体积及重量较对照组及单独处理组明显减少;15.XL888对小鼠正常肝肾组织无明显损伤。在安全性方面,分离得到小鼠肝肾组织行免疫组化,HE染色结果可见所有加药处理组小鼠未见明显组织损伤及坏死。结论:肝癌组织内HSP90与STAT3表达存在相关性,并且在肝癌细胞系内二者存在直接结合作用;此外,热处理可增强HSP90与STAT3的直接结合作用,并且这种结合作用可诱导STAT3活化并入核,增加STAT3下游抗凋亡蛋白Mcl-1及Bcl-xL的表达,从而在热激条件下抑制肝癌细胞凋亡;而联合应用新型HSP90抑制剂XL888可破坏HSP90-STAT3复合物形成,增强Bcl-2家族凋亡蛋白表达,活化caspase3及PARP蛋白,从而增加肝癌细胞的热敏感性。
宋康[3]（2021）在《胆管癌外泌体整合素β5通过枯否细胞促进亲肝转移的实验研究》文中指出背景:胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）是源自胆管上皮细胞的恶性肿瘤,依据来源部位不同分为远端CCA、肝门部CCA和肝内CCA。手术切除为早期胆管癌的有效治疗方式。但胆管癌恶性程度较高,易发生淋巴结及远处转移,尤其是胆管癌的肝脏转移在临床中较为常见。胆管癌手术后十分容易复发,放射和化学治疗效果并不理想,难以获得良好的预后。胆管癌淋巴结和远端转移机制的进一步研究,尤其是胆管癌肝转移机制,对胆管癌的诊疗和预后评价有着一定的临床价值。整合素β5（Integrinβ5）是细胞膜上普遍存在的糖蛋白,与Integrinαv特异性结合形成αvβ5,有利于细胞间及细胞与细胞外基质之间的附着与识别。同时Integrinβ5在多种肿瘤中表达水平异常,与肿瘤的淋巴结及远处转移关系密切。如在胰腺导管细胞癌中,外泌体Integrinβ5介导肿瘤细胞分泌的外泌体被肝枯否细胞特异性摄取从而促进胰腺癌的亲肝脏转移。目前外泌体integrinβ5在胆管癌的肝转移中研究较少,相关机制仍不清楚。目的:研究Integrinβ5与胆管癌临床病理特征的关系,并且研究外泌体Integrinβ5在胆管癌肝转移中的作用。方法:选取胆管癌病理组织标本43例,通过免疫组化染色对integrinβ5水平进行检测,探讨临床病理特征和Integrinβ5的关系。通过Kaplan-Meier法对患者的Integrinβ5的水平与生存时间间存在的关联进行探讨与研究,并通过Cox模型,对通过手术进行治疗的胆管癌患者的术后生存时间进行分析,了解胆管癌总体预后情况。运用Western Blot和q RTPCR技术检测枯否细胞摄取胆管癌细胞（QBC939）分泌的外泌体后肿瘤转移相关因子表达水平变化;运用si RNA技术对胆管癌细胞（QBC939）中外泌体Integrinβ5表达进行干扰,观察干扰前后枯否细胞对胆管癌外泌体摄取水平的变化。结果:根据免疫组化实验结果,胆管癌细胞中的Integrinβ5含量异常,与胆管癌的分化、肝脏转移有一定的关联性,与年龄、性别、血清CA199、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤部位无关。低分化胆管癌细胞的integrinβ5含量更高。Kaplan-Meier分析显示Integrinβ5高表达组平均生存期明显短于低表达组,P<0.001,有统计差异。Cox单因素分析显示除低分化程度及较晚的TNM分期外,Integrinβ5高表达是生存期缩短的危险因素（HR=4.464;95%CI 1.947-10.234;P<0.001）。根据多因素分析结果,除TNM分期外,Integrinβ5高表达是缩短胆管癌生存期的独立危险因素（HR=3.487;95%CI 1.349-9.016;P=0.010）。Western Blot和PCR检测结果显示,枯否细胞摄取胆管癌细胞（QBC939）分泌的外泌体后SDF-1、VEGF-A及TGF-β等肿瘤转移相关因子表达水平增高,si RNA干扰胆管癌细胞（QBC939）Integrinβ5表达后,枯否细胞对QBC939外泌体摄取能力明显降低。结论:1.胆管癌组织中存在Integrinβ5异常表达,Integrinβ5的高表达与胆管癌的分化程度、肝转移相关,是胆管癌患者生存期缩短的危险因素。2.胆管癌外泌体可以促进枯否细胞SDF-1、VEGF-A及TGF-β等肿瘤转移相关因子的表达。3.胆管癌Integrinβ5的表达变化可以影响枯否细胞对外泌体的摄取。综上所述,胆管癌细胞可以通过改变Integrinβ5表达,引导其分泌的外泌体进入枯否细胞,促进肝转移的形成。
周娟[4]（2020）在《高通量测序捕获建库技术研发及其在复杂疾病分子遗传学研究中的应用》文中研究表明近年来,高通量测序技术迅猛发展,积累了大量复杂疾病相关的基因组、转录组测序数据,极大促进了疾病分子遗传学研究的发展。高通量测序技术在早期促进了孟德尔疾病新基因的发现,随后又发现大量神经发育障碍归因于基因编码区的新生突变,同时,随着乳腺癌、结直肠癌、急性髓细胞性白血病等癌症基因突变图谱的测定,揭示了癌症高度的遗传异质性和复杂的分子致病通路,并有效地定义了癌症的分子分类学。随着高通量测序技术通量的提高和成本的降低,其在科研和临床中的应用已非常广泛,特别是在复杂疾病候选基因的鉴定、胎儿染色体非整倍体的无创产前诊断、癌症的诊断、监测和精准医疗中都发挥着越来越重要的作用。但值得注意的是,高通量测序技术在实际应用中仍然存在一系列的问题,如:（1）样本的文库转化效率较低以致其灵敏度难以满足微量低丰度样本的检测需求;（2）样本处理过程复杂,构建上机文库需要耗费大量时间、人力和物力;（3）目前,高通量测序平台的测序错误率达到1%～5%,导致高异质性样本中,突变频率低于5%的变异与测序错误混杂在一起,难以特异性检出,这就需要开发操作更简单、通量、灵敏度和特异性都更高的测序方法。因此,本课题针对高通量测序目前面临的难点和痛点,对最常用的两种高通量靶向捕获建库测序技术,基于扩增子和基于液相杂交的靶向建库测序技术,进行深入的探索和优化:简化扩增子靶向测序的样本处理操作步骤,从而使其在大样本研究中的应用更为可行;提高液相杂交捕获分子标签文库构建的样本文库转化效率,从而提高检测的灵敏度和特异性;并将改进优化后的方案应用在具有代表性的复杂疾病——精神分裂症易感基因和胆道恶性肿瘤微量循环肿瘤DNA检测分析中。精神分裂症是一种代表性的复杂疾病,尽管其遗传度高达80%,且已取得大量基因组水平的遗传易感基因或区域结果,但依然鲜有通过高通量测序对功能致病变异实现高通量精细定位的报道,其主要的原因就在于全面开展全基因组测序的成本依然难以被接受,且测序文库构建流程较为复杂,难以一次性大批量处理样本。本课题的第二部分,作者自主创新了两步PCR多重扩增捕获建库技术,可以简单高效地对感兴趣的基因区域进行快速富集和建库,从而完成对精神分裂症候选基因功能位点的定位分析。该方法仅一次使用PCR酶,即可完成两次PCR扩增,中间和最终的磁珠纯化步骤被简化,节省成本的同时,操作更为简单,大大提高了建库通量,从而使其在大样本研究中的应用更为方便可行。随后作者运用自主创新的捕获建库方法对来自中国汉族的1806名精神分裂症患者和998名健康对照的EMB和BNIP3L基因外显子及UTR区域进行高通量测序。结果在病例组和对照组中,共鉴定到EMB基因的58个变异和BNIP3L基因的114个变异。其中包含EMB基因的七个及BNIP3L基因的三个罕见非同义突变,EMB:p.Ala52Thr、p.Glu66Gly、p.Ser93Cys、p.Ala118Val、p.Ile131Met、p.Gly163Arg和p.Arg238Tyr以及BNIP3L（NP＿004322）:p.Asn18Asp、p.Gly56Glu和p.Met105Leu。BNIP3L基因上发现的三个罕见非同义突变,均只在精神分裂症病例组中检出,且携带这些变异的精神分裂症患者人数与健康对照人数之间存在显着差异（P=0.035）。此外还发现,位于EMB基因3’-UTR的rs3933097(Pallele=3.82×10-6,Pgenotype=3.18×10-5),及BNIP3L基因的rs147389989位点(Pallele=0.007,Pgenotype=0.017)的等位基因和基因型频率均与精神分裂症显着相关。利用PGC2,CLOZUK和本研究的数据进行荟萃分析发现,BNIP3L基因的rs1042992和rs17310286位点,与精神分裂症显着相关,进一步验证了既往的全基因组关联研究结果。一方面,本研究为EMB和BNIP3L基因是精神分裂症的易感基因提供了更多证据,另一方面本课题首次通过高通量靶向捕获测序发现了这两个基因上潜在导致精神分裂症发生的功能突变,为后续进一步通过功能实验来揭示其在精神分裂症发病过程中的具体作用机制奠定了重要基础。除精神类疾病外,癌症是另一类重要的代表性复杂疾病。高通量测序技术的发展和成本的降低,为癌症的早期筛查、病程监控、精准医疗等开辟了新途径。特别是血浆中循环肿瘤DNA的无创检测,近年来越来越受到关注,目前已有相关试剂盒被批准应用于肺癌的临床检测。而胆道恶性肿瘤微量循环肿瘤DNA测序的工作比肺癌更困难,始终没有突破,这主要是源于此前高通量测序技术样本文库转化效率、灵敏度和特异性低的困境。为了解决这一难题,本课题第三部分,作者对基于液相杂交捕获的双端分子标签建库测序技术进行了改进,优化了分子标签接头的制备方案及高通量测序建库过程中的连接体系,将样本的文库转化率从不足50%提高至95%以上,加之分子标签的校正功能,从而大幅提高了高通量测序技术的灵敏度和特异性,对30 ng样本中,频率为0.5%的变异位点,检测灵敏度达到100%,假阳性率仅为0.001%。同时,作者收集了51例胆道恶性肿瘤患者的血细胞、肿瘤组织进行全外显子测序,对应患者的术前血浆、术后三天血浆中的游离DNA应用本研究改进优化的捕获建库方法,进行分子标签建库和胆道恶性肿瘤相关基因的液相杂交捕获测序。结果发现,超过60%的患者,术前血浆游离DNA的变异情况与肿瘤组织存在一致性,50%的肿瘤组织变异在术前血浆中可以被检出。不同个体肿瘤组织和血浆游离DNA检测结果的一致性受到肿瘤发生部位、肿瘤分期的影响,一般肝内胆管癌、胆囊癌及以晚期患者的一致性较高。术后三天的血浆游离DNA浓度应激性增高,多数肿瘤组织中的变异在术后血浆中检出频率明显下降或清零,且术后血浆中循环肿瘤DNA的检出（P=0.0395,HR=6.315）特别是TP53基因变异（P=0.0101,HR=25.79）的检出,与患者短期复发和预后不良相关。上述的科学发现均属首次,此前未见文献报道,这些发现使本研究的临床合作者有机会开展转化应用的研究工作。本课题在作者的博士工作期间已经取得了上述重要进展,而且已经进一步获得了大量测序实验数据,对这些数据进一步挖掘、收集检测更多具有完整临床资料的样本、进一步验证目前得到的结论等工作都将延续博士论文研究继续开展。本课题通过对高通量测序技术深入的探讨、优化和应用,验证了两种复杂疾病,精神分裂症和胆道恶性肿瘤的遗传致病基因,提出了胆道恶性肿瘤无创检测准确可行的新方法,并找到了其预后评估的新依据。
石园园[5]（2020）在《PTEN缺失通过损害溶酶体功能增加外泌体分泌进而促进胆管癌转移》文中研究指明研究背景和目的胆管癌是起源于胆道上皮系统的恶性肿瘤。虽然胆管癌的整体发病率较低,但我国和东南亚国家是胆管癌的高发地区,且发病率呈现逐年上升趋势。胆管癌具有恶性程度高、临床预后差的特点,多数患者确诊时已经发生转移,且术后极易复发。因此,关于胆管癌的病因和复发转移的机制研究,对胆管癌的诊疗具有非常重要的意义。PTEN（Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）是1997年发现的一种抑癌基因,其中文名为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因。随着研究的深入,人们发现PTEN在前列腺癌、膀胱癌和肺癌等多种肿瘤中存在突变、缺失或表达减少的情况。PTEN表达的改变可以通过负向调控PI3K-AKT-m TOR信号通路,从而在肿瘤的发生进展过程中起到重要作用。本研究对PTEN在胆管癌中的作用进行初步探索时已经发现,胆管癌中存在较高比例的PTEN突变或缺失情况,且PTEN表达与胆管癌的复发转移密切相关。外泌体是由多种细胞产生的直径在30到150纳米的细胞外囊泡,可通过输送蛋白质、脂质、多糖和核酸分子等物质介导细胞间的通讯。据报道,肿瘤细胞来源的外泌体在胶质母细胞瘤、乳腺癌、白血病、鼻咽癌和胰腺癌等多种肿瘤的进展过程中起到重要作用。外泌体能够通过上调多种血管生成相关基因表达,促进肿瘤微环境中血管内皮细胞的增殖、转移和出芽。高侵袭性肿瘤细胞来源的外泌体可以介导靶细胞的上皮间质转化过程。此外,外泌体还能通过长距离的信号转导,介导转移前生态位的形成,进而促进播散肿瘤细胞的定植和存活。目前,关于肿瘤细胞来源的外泌体在胆管癌进展和转移中的作用及机制尚不清楚,重要肿瘤驱动基因对该生物学过程的精细调控也少见报道。而我们发现,抑癌基因PTEN缺失的促肿瘤转移功能与肿瘤细胞来源外泌体的生物学特性高度重合,这促使我们思考两者之间的可能关联。明确PTEN表达与胆管癌细胞外泌体分泌的关系,以及它们在胆管癌转移中的作用,将具有十分重要的科学价值。外泌体的生成源于细胞内吞途径,细胞的溶酶体功能与外泌体的分泌密切相关。已有文献报道,AKT和m TOR分子可以通过调节Mi T-TFE基因影响溶酶体的新生和功能。PTEN作为PI3K-AKT-m TORC1上游的信号分子,是否也能对溶酶体的功能产生重要调节作用,以及该作用是否能够影响外泌体的分泌,目前尚无相关研究。明确这一问题,将帮助我们更好地解释PTEN影响胆管癌复发转移的原因和机制。本课题将基于PTEN在胆管癌中的表达情况,建立PTEN差异表达的胆管癌细胞,深入探究PTEN对胆管癌细胞的溶酶体功能和外泌体分泌的影响,并通过体外细胞和动物体内实验,进一步明确其在胆管癌转移过程中的作用及具体机制,为胆管癌的诊疗提供新的思路。研究方法1、回顾性分析胆管癌临床样本中PTEN表达水平对胆管癌临床预后和复发转移的影响。2、应用慢病毒、腺病毒感染或质粒、干扰RNA转染的方法建立PTEN差异表达的胆管癌细胞,包括PTEN过表达、PTEN干扰、PTEN敲除及对照细胞。3、Transwell细胞迁移实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验和成球实验测定PTEN差异表达对胆管癌细胞生物学行为的影响。4、建立经尾静脉肺转移和经脾肝转移小鼠模型,体内验证PTEN差异表达对胆管癌转移的影响。5、超速离心法提取PTEN差异表达胆管癌细胞的外泌体,通过电镜、NTA检测、Western-blot实验检测PTEN差异表达对外泌体分泌的影响。6、检测PTEN差异表达胆管癌细胞分泌的外泌体对胆管癌细胞迁移、平板克隆形成的影响。7、回顾性分析胆管癌临床样本中外泌体特异性标志蛋白CD63与PTEN表达的相关性,以及CD63表达与胆管癌复发转移的关联。8、免疫荧光技术检测PTEN差异表达细胞中CD63和HGS的表达,明确PTEN对细胞中MVB数量的影响。9、电子显微镜观察PTEN敲除和对照胆管癌细胞中多囊泡体（Multivesicular Body,MVB）和管腔内小泡（Intraluminal vesicle,ILV）的结构和数量。10、Lysosensor和Lysotracker染色检测PTEN差异表达胆管癌细胞中溶酶体的数量和功能。11、Western-blot和RT-PCR实验检测PTEN差异表达细胞中组织蛋白酶成分的表达变化。12、探针法检测PTEN差异表达胆管癌细胞中溶酶体的p H值。13、RT-PCR检测PTEN差异表达胆管癌细胞中V-ATPase各组分表达的变化。14、免疫荧光技术检测PTEN差异表达胆管癌细胞中转录因子EB（Transcription factor EB,TFEB）的亚细胞定位情况。研究结果1、PTEN在胆管癌中存在一定比例的突变缺失,PTEN缺失的胆管癌患者临床预后较差;PTEN缺失与胆管癌的复发转移密切相关。2、降低PTEN表达促进胆管癌细胞的迁移、侵袭、克隆形成和自我更新。3、PTEN敲除促进胆管癌细胞的体内转移。4、降低PTEN表达促进胆管癌细胞的外泌体分泌,增加胆管癌细胞中MVB的数量。5、PTEN低表达胆管癌细胞来源的外泌体更能促进胆管癌细胞的生长、迁移。6、抑制溶酶体的功能可以增加细胞中MVB的数量,促进外泌体的释放。7、PTEN通过自身蛋白磷酸酶活性对TFEB进行去磷酸化,从而介导TFEB的核转位,促进溶酶体的新生和功能。8、PTEN通过介导V-ATPase组分ATP6V1A的表达上调,促进溶酶体的酸化。9、PTEN缺失可以通过抑制溶酶体功能,阻碍MVB在溶酶体中的降解代谢,促使其与质膜融合增加外泌体的释放,进而促进肿瘤细胞的转移。结论本研究发现在收集到的108例胆管癌样本中,有将近一半存在PTEN的突变或缺失,表现为PTEN的低水平表达;PTEN低表达与胆管癌的恶性进展和复发转移密切相关,并且能够预示胆管癌患者的不良预后;PTEN的表达降低不仅可以通过抑制TFEB的核转位,影响溶酶体的新生,还能通过下调V-ATPase组分,特别是ATP6V1A的表达,损害溶酶体的酸化功能;溶酶体的数目减少和功能受损能够通过抑制MVB在溶酶体中的降解代谢,促使其与质膜融合发生外排,增加外泌体的分泌,从而促进胆管癌细胞的存活、迁移和转移过程。总之,本研究通过深入探讨PTEN表达、溶酶体功能和外泌体分泌三者之间的关联,首次系统性地阐述了PTEN调节胆管癌转移的确切机制,为胆管癌的诊疗提供了新的理论依据。
谢博文[6]（2017）在《诱导型一氧化氮合酶抑制剂对胆管癌细胞生物学行为的影响》文中认为第一部分iNOS在人类胆管癌QBC939细胞系中的表达目的:研究iNOS受体在人胆管癌QBC939细胞系细胞中的表达情况。方法:体外培养人胆管癌QBC939细胞系细胞,免疫荧光法检测iNOS在胆管癌细胞中的表达情况。结果:胆管癌QBC939细胞系中iNOS受体异常表达。结论:人胆管癌QBC939细胞中表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。证明本课题组选用QBC939细胞系来进行后续体外实验的可行性。第二部分诱导型一氧化氮合酶抑制剂对胆管癌细胞生物学行为的影响目的:探讨诱导型一氧化氮合酶抑制剂（iNOS）对胆管癌细胞生物学行为的影响。方法:不同浓度iNOS抑制剂1400W孵育人胆管癌QBC939细胞24 h后,分别用硝酸还原酶法、MTT比色法检各组细胞中NO浓度与增殖情况,并计算半抑制浓度(IC50);根据IC50值,选择合适浓度的1400W处理QBC939细胞24 h后,分别用划痕试验、Transwell小室法检测细胞迁移及侵袭情况。以上实验均以未加1400W培养基处理的QBC939细胞为空白对照。结果:与空白对照组比较,各1400W处理组QBC939细胞中NO含量及增殖率均呈浓度依赖性降低（均P<0.05）,IC50值为51。24μmol/L;用50μmol/L的1400 W处理QBC939细胞24 h后,实验组的细胞划痕愈合率（61.7%vs.92.3%）和细胞侵袭数（72.7个vs.128.0个）均较对照组明显降低（均P<0.05）。结论:iNOS抑制剂1400w能抑制胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与NO下游的信号分子变化有关。
李艾迪[7]（2016）在《TGR5在胆管癌发生发展中的作用及机制研究》文中研究说明胆管癌（Cholangiocarcinoma,CC）是指发生于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,按其发生部位分为肝内胆管癌和肝外胆管癌两大类。在世界范围内,胆管癌占所有胃肠道肿瘤的3%,是继肝细胞癌外第二常见的肝胆肿瘤,尸检资料显示胆管癌的发病率约为0.01%0.2%。近年来胆管癌的发病率逐年升高,目前手术治疗是胆管癌唯一有效的治疗,然而治疗效果尚欠佳,预后很差,只有少数患者术后能存活5年以上。胆汁酸在脂肪的摄取和脂溶性维生素的吸收方面发挥至关重要的作用,近年来,胆汁酸作为一种信号分子被许多专家和学者所关注。研究发现,胆汁淤积会加速胆管癌的发生;体外试验证明,结合胆汁酸促进胆管癌细胞的侵袭行为。胆汁酸作为配体,能够活化多种受体,包括核受体和膜受体,其中TGR5是一种以胆汁酸为配体的G蛋白偶联受体（GPCR）。TGR5在多种组织和器官中有不同水平的表达,功能多样。TGR5可以调节能量代谢,促进胰岛素的分泌和生物合成,促进B细胞增殖,抑制凋亡,减轻食欲,减缓胃排空;抑制炎症反应和炎症因子的释放,在肝脏中减轻肝脏损伤,延缓脂肪变,促进窦内皮细胞（SEC）凋亡,提高肝脏本身的代谢和微循环等等。值得关注的是,TGR5能够促进正常胆管上皮细胞增殖,抑制其凋亡。TGR5也可以通过激活各种信号通路在多种肿瘤的发生发展过程中发挥作用。研究表明,TGR5促进食管癌,结肠癌和子宫内膜癌细胞的增殖,而在肝癌和胃癌中,则通过抑制STAT3通路抑制其发生与发展,并与胃癌患者预后相关。但目前,TGR5在胆管癌中的作用及其机制研究很少。热休克蛋白（HSP）是细胞在应激状态下合成并表达的高度保守的分子伴侣蛋白,按照其分子量大小分为HSP27,HSP40,HSP60,HSP70和HSP90五个家族。HSP参与多种重要的生理过程,包括蛋白组装,分泌,运输,以及蛋白降解和转录因子的调节等等。Mortalin蛋白属于hsp70家族成员,又名csa,mot,grp75,pbp74,hspa9b,mgc4500,mthsp75等,最早由wadhwa等人在小鼠成纤维细胞中发现。研究表明,mortalin作为一种多功能分子伴侣,介导调控了诸多生理及病理过程,如细胞增殖,细胞器蛋白内稳态,凋亡,蛋白的囊泡运输以及神经退行性变等。鉴于胆汁淤积能够加速胆管癌的发生,胆汁酸受体tgr5有促进胆管上皮细胞增殖,抑制其凋亡的作用,且课题组之前实验证实,在小肠上皮细胞中,tgr5与hsp70家族蛋白mortalin相互结合并发挥作用,我们提出假设:tgr5在胆管癌组织中高表达;tgr5与mortalin相互作用参与胆管癌的发生与发展。并设计进行如下实验:1比较分析tgr5在肝外胆管癌组织和癌旁组织的表达情况,探讨其及与患者临床特征的关系;2观察tgr5对胆管癌细胞增殖,迁移,凋亡等生物学行为的影响;3通过分析tgr5与hsp家族蛋白mortalin的相互作用进一步探讨其作用机制。结果表明,tgr5在肝外胆管癌组织中表达升高,其表达水平与肝外胆管癌病理学恶性程度呈正相关;tgr5促进人胆管癌细胞的增殖与迁移,抑制其凋亡;hsp家族蛋白mortalin参与了tgr5诱导的胆管癌细胞增殖。第一部分:tgr5在肝外胆管癌组织中的表达分析及临床意义探讨目的:对比tgr5在肝外胆管癌患者和癌旁组织的表达情况并探讨其及与肝外胆管癌患者性别,年龄,淋巴结转移与否,病理学分级以及临床分期的关系。方法:收集河北医科大学第二医院肝胆外科2000-2002年胆管癌术后石蜡包埋标本87例,其中有相应癌旁对照组织20例。于河北医科大学第二医院病案室查阅患者临床资料,包括性别,年龄,肿瘤大小,淋巴结转移情况,病理学分级与临床分期。病理证实所取标本均为肝外胆管癌组织,应用免疫组织化学（ihc）的方法检测tgr5的表达水平,并且比较分析20例肝外胆管癌及癌旁组织tgr5的表达情况。检测tgr5的表达水平与肝外胆管癌患者性别,年龄,肿瘤大小,是否淋巴结转移,病理学分级与临床分期等临床数据的关系。结果:1肝外胆管癌患者的临床病理特征归纳详细记录患者临床资料,在87例肝外胆管癌患者中,男性50例（57.5%）,女性37例（42.5%）;平均年龄58岁,低于等于58岁患者46例（52.9%）,高于58岁患者41例（47.1%）;高中分化组织63例（72.4%）,低分化组织24例（27.6%）;有淋巴结转移22例（25.3%）,无淋巴结转移54例（62.1%）,不能确定有无淋巴结转移11例（12.6%）;tnm分期i期15例（17.2%）,ii期21例（24.1%）,iii期27例（31%）,iv期14例（16.1%）;其中有相应癌旁对照组织20例。2肝外胆管癌组织中tgr5表达水平高于癌旁组织所有纳入胆管癌组织经he染色证实为胆管癌。为初步判断tgr5是否在胆管癌中发挥作用,本课题用免疫组化的方法,对比了20例肝外胆管癌组织和癌旁组织tgr5的表达情况。结果显示,tgr5主要表达于肝外胆管癌细胞的细胞膜和胞浆;肝外胆管癌组织中tgr5的总体表达水平显着高于癌旁组织tgr5的总体表达水平,说明tgr5在胆管癌组织中高表达。3tgr5的表达水平与肝外胆管癌病理学恶性程度呈正相关为进一步观察tgr5的临床意义,本研究应用免疫组织化学（ihc）方法检测了87例肝外胆管癌中tgr5的表达情况,并按照tgr5在胆管癌腺体中的表达强度将所纳入标本分为1+,2+,3+,4+共4个等级。查阅患者的临床资料,包括年龄,性别,淋巴结转移与否,病理分级与临床分期,并分析tgr5表达强度与临床资料的关系。结果显示,tgr5的表达水平与患者年龄、性别、淋巴结转移以及临床分期无明显相关性。而与肝外胆管癌病理学恶性程度呈正相关,提示其表达水平对胆管癌患者的恶性程度有一定的提示作用。第二部分:tgr5对胆管癌细胞增殖,迁移,凋亡等生物学行为的影响目的:通过建立tgr5过表达和敲低细胞模型,探讨tgr5对胆管癌细胞增殖,迁移,凋亡等生物学行为的影响。方法:在人胆管癌细胞系rbe和qbc-939中过表达或者敲低tgr5,通过cck-8试验检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期变化,westernblot检测增殖标志pcna以及细胞周期蛋白cdc25c和cyclind1表达,brdu掺入实验检测细胞dna合成情况综合评估细胞增殖行为变化;创伤愈合试验检测细胞迁移行为;annexinv/pi双染染色检测细胞凋亡比例,westernblot检测活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）表达评估细胞凋亡行为。结果:1tgr5敲低及过表达胆管癌细胞模型建立应用靶向tgr5的sirna（sitgr5）分别转染胆管癌细胞系rbe和qbc-939,并转染无关对照序列（sicon）作为对照,westernblot检测结果显示,和sicon组比较,sitgr5组tgr5蛋白表达水平明显下降,表明tgr5在两种细胞中的表达均被成功敲低。应用带flag标签的tgr5过表达质粒（flag-tgr5）分别转染rbe和qbc-939细胞,并以仅带flag标签的空载体（flag-con）作为对照,westernblot结果显示,和flag-con组比较,两种细胞flag-tgr5组tgr5表达水平明显上升,表明该质粒在两种细胞中均可成功过表达tgr5。2tgr5促进胆管癌细胞增殖2.1tgr5促进胆管癌细胞中pcna表达westernblot分析结果显示,sitgr5转染细胞72h后,两种细胞系中sitgr5组pcna相对表达水平明显低于sicon组。转染tgr5过表达质粒72h后,两种细胞系中flag-tgr5组pcna相对表达水平明显高于flag-con组。表明在胆管癌细胞系中,tgr5的表达水平与pcna呈正相关。2.2tgr5表达水平与胆管癌细胞活力呈正相关cck-8试验结果表明,转染72h后两种细胞系中sitgr5组od450值较sicon组明显降低。flag-tgr5组细胞活力则较flag-con组明显升高。表明在两种胆管癌细胞系中,tgr5的表达水平与细胞活力呈正相关。2.3过表达tgr5促进胆管癌细胞有丝分裂通过流式细胞术检测tgr5对胆管癌细胞周期的影响。结果显示在rbe细胞中,与flag-con组相比,flag-tgr5组s期细胞所占比例上升,g2期细胞所占比例减少,g1期细胞比例无明显变化,表明tgr5可以促进rbe细胞有丝分裂。在qbc-939细胞中,与flag-con组相比,flag-tgr5组s期细胞所占比例上升,g1期细胞所占比例减少,g2期细胞所占比例减少,表明tgr5可以促进qbc-939细胞有丝分裂。2.4过表达tgr5促进细胞周期蛋白的表达westernblot分析结果显示,在qbc-939细胞系中,与flag-con组相比,flag-tgr5组细胞周期蛋白cdc25c及cyclind1表达显着升高。在rbe细胞中,与flag-con组相比,flag-tgr5组cdc25c蛋白表达升高,而cyclind1表达无明显变化,上述结果表明tgr5可能通过上调促分裂周期蛋白的表达促进细胞增殖。2.5过表达tgr5促进胆管癌细胞dna合成brdu掺入实验结果显示,在两种胆管癌细胞系中,flag-tgr5组较flag-con组dna合成均明显增多。提示过表达tgr5能够促进胆管癌细胞dna合成。以上结果综合提示tgr5可以促进胆管癌细胞的增殖。3tgr5抑制胆管癌细胞凋亡在tgr5被成功敲低以及过表达的基础上,应用annexinv/pi双染染色检测细胞凋亡比例,westernblot检测活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleavedcaspase-3）表达评估细胞凋亡行为。westernblot分析结果显示,两种胆管癌细胞系中sitgr5组细胞较sicon组cleavedcaspase-3表达水平明显增加,flag-tgr5组较flag-con组cleavedcaspase-3蛋白表达水平降低,提示tgr5表达水平与胆管癌细胞cleavedcaspase-3表达呈负相关。annexinv/pi双染染色结果显示,两种胆管癌细胞系中sitgr5组细胞凋亡率较sicon组明显增加。上述结果综合提示tgr5可以抑制胆管癌细胞的凋亡。4tgr5促进肝内胆管癌细胞rbe迁移在成功敲低以及过表达tgr5的基础上,应用创伤愈合实验评估细胞迁移行为。结果显示,在rbe细胞系中,sitgr5组细胞较sicon组划痕愈合明显减慢,flag-tgr5组较flag-con组划痕愈合速度加快。但qbc-939细胞系本身迁移性能较差,无论实验组和对照组细胞均未见明显创伤愈合。以上结果提示tgr5可能促进胆管癌细胞系迁移。第三部分:tgr5通过结合并上调mortalin促进胆管癌细胞增殖目的:通过研究tgr5与mortalin的相互作用,探讨tgr5促进胆管癌细胞增殖的作用机制。方法:在两种胆管癌细胞系中敲低tgr5,从蛋白水平以及mrna水平检测mortalin的表达:将细胞分为以下4组,对照组（flag-con+sicon）;tgr5过表达组（flag-tgr5+sicon）;mortalin敲低组（flag-con+simortalin）,tgr5过表达同时mortalin敲低组（flag-tgr5+simortalin）。通过cck-8试验检测细胞活力,克隆形成试验检测克隆形成率,westernblot检测pcna表达,以确定mortalin是否参与tgr5诱导的胆管癌细胞增殖;并通过免疫共沉淀及免疫细胞荧光双染检测tgr5和mortalin的结合情况。结果:1tgr5促进mortalin蛋白及mrna的表达在两种胆管癌细胞系中敲低tgr5,应用westernblot分析和pcr的方法检测mortalin在mrna水平和蛋白水平的表达。westernblot结果表明,sitgr5组较敲sicon组mortalin明显减少,表明敲低tgr5降低了mortalin的蛋白水平。但敲低mortalin并不影响tgr5表达水平。pcr结果显示,与sicon组相比,sitgr5组的mortalinmrna表达下降,表明敲低tgr5下调了mortalin的mrna水平。2tgr5通过mortalin诱导胆管癌细胞增殖2.1敲低mortalin抑制tgr5诱导的pcna表达增加westernblot分析结果显示,利用靶向mortalin的sirna转染两种胆管癌细胞,可在在两种胆管癌细胞中成功敲低mortalin蛋白,且较flag-con+sicon组相比,flag-tgr5+sicon组的pcna表达明显升高,即上调tgr5可促进细胞增殖,与第二部分结果相一致。而flag-tgr5+simortalin组的pcna表达则显着低于flag-tgr5+sicon组,表明敲低mortalin抑制了tgr5诱导的pcna表达增加。2.2敲低mortalin抑制tgr5诱导的胆管癌细胞活力增加cck-8实验结果显示,与第二部分结果一致,在两种胆管癌细胞中,较flag-con+sicon组,flag-tgr5+sicon组的细胞活力明显升高,提示tgr5可以有效升高胆管癌细胞活力。而较flag-tgr5+sicon组,flag-tgr5+simortalin组的细胞活力显着降低,表明敲低mortalin抑制了tgr5诱导的胆管癌细胞活力的增加。2.3敲低mortalin抑制tgr5诱导的克隆形成增加克隆形成实验结果显示,在两种胆管癌细胞中,较flag-con+sicon组,Flag-TGR5+siCon组的克隆形成数目明显增多,表明TGR5上调可促进胆管癌细胞的克隆成能力;而较Flag-TGR5+siCon组,Flag-TGR5+simortalin组克隆形成数目减少,表明敲低mortalin抑制了TGR5诱导的克隆形成数目增加。以上实验结果综合表明,在胆管癌细胞中,mortalin参与了TGR5诱导的促增殖作用。3 TGR5与mortalin存在相互结合。本研究通过免疫共沉淀和免疫细胞荧光的方法验证TGR5与mortalin是否存在相互结合。在免疫共沉淀实验中,分别在胆管癌细胞系RBE和QBC-939中转染带Flag标签的TGR5质粒（Flag-TGR5）,并以带Flag标签的空载体（Flag-Con）作为对照,用抗Flag的抗体进行沉淀,并进行Western Blot分析,用抗mortalin的抗体进行检测,结果显示,mortalin条带仅特异性出现于Flag-TGR5组,表明TGR5和mortalin存在相互结合。免疫细胞荧光染色结果表明,在胆管癌细胞系RBE中,红色荧光标记的TGR5弥散分布于细胞质,绿色荧光标记的mortalin主要定位于核周,核周部分荧光密度较高,两者荧光部分重叠（黄色区域）,表明TGR5与mortalin存在部分共定位。上述结果表明,TGR5和mortalin蛋白在胆管癌细胞中存在相互作用。结论:1 TGR5在肝外胆管癌组织中表达升高,其表达水平与胆管癌组织病理学恶性程度呈正相关,TGR5可能参与了胆管癌的发生并对其恶性程度有提示作用。2 TGR5促进人胆管癌细胞的增殖与迁移,抑制其凋亡。3 HSP家族蛋白mortalin参与了TGR5诱导的胆管癌细胞增殖。
王鹤令,周品一,陈安杰,刘鹏,张宇[8]（2014）在《Bcl-2和Bag-1在肝外胆管癌中的表达及意义》文中提出目的:研究B细胞淋巴瘤-2（B-cell leukemia-2,Bcl-2）和Bcl-2结合抗凋亡基因-1（Bcl-2associated athanogene-l,Bag-1）在肝外胆管癌组织中的表达情况,探讨其表达强度与胆管癌临床病理特征的关系。方法:采用免疫组化法检测50例肝外胆管癌组织及30例胆囊管组织中Bcl-2和Bag-1蛋白的表达情况,结合临床病理特征进行统计学分析。结果:Bcl-2和Bag-1蛋白在胆管癌组织中的表达阳性率（88.0%、70.0%）均高于胆囊管组织（43.3%、50.0%）（P<0.05）,差异有统计学意义。Bcl-2和Bag-1的表达程度与胆管癌的分化程度、临床分期及有无淋巴结转移有关,Bcl-2和Bag-1的表达呈一致性。结论:Bcl-2和Bag-1与胆管癌的发生发展有密切关系,Bag-1可能协同Bcl-2参与胆管癌的发生、发展,两者的表达程度密切相关,可作为胆管癌患者预后的预测因素。
张凝乐[9]（2013）在《肝外胆管癌中p15和HSP70基因表达的关系及意义》文中研究说明目的通过观察p15和HSP70基因在肝外胆管癌组织、肝外胆管癌癌旁组织和正常胆管组织中的表达水平，探讨两者之间的相互关系及其临床病理意义，为肝外胆管癌的临床治疗提供实验依据。方法采用免疫组织化学（SP法）检测p15和HSP70基因在肝外胆管癌组织、肝外胆管癌癌旁组织和正常胆管组织中的表达水平；western blotting检测在正常肝外胆管组织和肝外胆管癌组织中的p15和HSP70蛋白水平。结果（1）经过实验，在本研究中发现40例肝外胆管癌组织中p15蛋白阳性表达9例，阳性率为22.5%，其中弱阳性6例（15%）、中等阳性3例（7.5%），无强阳性表达。40例胆管癌癌旁组织中，阳性表达27例，阳性率（67.5%），其中弱阳性2例（5%），中等阳性16例（40%），强阳性9例（22.5%）。在20例正常胆管组织中，阳性表达14例，阳性率（70%），其中弱阳性2例（10%），中等阳性5例（25%），强阳性7例（35%）。通过2检验分析组间差异，最后的结果清楚地显示出，癌组织与癌旁组织、正常组织中的p15表达均有统计学差异（P＜0.05），p15蛋白的表达低于正常胆管组织和胆管癌癌旁组织（P＜0.05），而癌旁组织与正常胆管组织的p15表达无统计学差异（P＞0.05）。p15蛋白阳性呈棕黄色染色，胞核染色比胞浆深。（2）在40例肝外胆管癌组织中HSP70蛋白表达30例，阳性率为75%，其中弱阳性6例（15%），中等阳性10例（25%），强阳性14例（35%）。40例肝外胆管癌癌旁组织中，阳性表达13例，阳性率32.5%，其中弱阳性表达4例，中等阳性表达6例，强阳性表达3例。在20例正常胆管组中，阴性13例，阳性7例，阳性率35%，其中弱阳性表达2例，中等阳性表达4例，强阳性表达1例。通过2检验分析组间差异，最后的结果清楚地显示出，肝外胆管癌组织与癌旁组织、正常组织中的HSP70表达均有统计学差异（P＜0.05），肝外胆管癌组织中HSP70蛋白的表达高于正常胆管组织和胆管癌癌旁组织（P＜0.05）。而癌旁组织与正常胆管组织的HSP70表达无统计学差异（P＞0.05）。HSP70蛋白阳性呈深黄色染色，胞浆染色比胞核要深。（3）p15阳性表达率与肿瘤分级相关（P＜0.05），HSP70阳性表达率与肿瘤分级相关（P＜0.05）。（4）p15蛋白和HSP70蛋白的Western blotting检测结果显示：40例肝外胆管癌组织p15蛋白均呈低表达，明显低于正常胆管组织和癌旁组织；则在40例肝外胆管癌组织中，HSP70蛋白均呈高表达状态，明显高于正常胆管组织和癌旁组织。在p15阳性表达的肝外胆管癌组织中，HSP70表达率较低，经Person相关分析计算，结果表明肝外胆管癌组织中p15的表达与HSP70的表达呈负相关性，有统计学意义。结论（1）p15蛋白在肝外胆管癌组织中呈低表达，HSP70蛋白在肝外胆管癌组织中呈高表达；（2）p15和HSP70的异常表达与肝外胆管癌组织的肿瘤分化程度相关；（3）p15和HSP70在肝外胆管癌组织中的表达呈负相关性。
邓小峰[10]（2013）在《空心硅纳米粒子光敏剂在光动力治疗胆管癌中的作用及机制》文中认为目的：1、制备负载光敏剂Photosan的空心氧化硅纳米粒子（以下简称纳米化Photosan）,并初步探讨纳米化Photosan的药物安全性。2、探索并比较Photosan及纳米化Photosan介导的光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）在体外试验中对胆管癌的疗效。3、探索并比较Photosan及纳米化Photosan介导的PDT在体内试验中对胆管癌的疗效。4、探索并比较Photosan及纳米化Photosan介导的PDT抑制胆管癌生长的可能途径。方法：1、采用一步湿化学方法制备负载Photosan的空心氧化硅纳米粒子。2、体外实验中,用MTT法检测Photosan及纳米化Photosan介导的PDT对人胆管癌QBC939细胞的杀伤作用。观察不同的光敏剂孵育时间、光敏剂浓度,及光照剂量对PDT效果的影响,并了解这两种光敏剂的暗毒性,比较其药效差异。用流式细胞计数实验进一步观察两种光敏剂应用于PDT的效果,并比较它们之间的差异。光学显微镜下观察PDT前后细胞的形态学改变。3、建立裸鼠人胆管癌移植瘤模型,观察Photosan及纳米化Photosan介导的PDT对肿瘤的抑制作用及它们之间的差异。观察光敏剂对动物有无毒副作用。病理切片下观察PDT后肿瘤组织细胞的形态学改变。4、检测裸鼠肿瘤PDT治疗后对其血管生成、侵袭能力及细胞凋亡的影响,并对比两种光敏剂间的区别。所用方法为用PCR、 western-blot、免疫组化等检测相关基因在mRNA和蛋白表达的水平的区别。结果：1、成功制备了负载Photosan的空心氧化硅纳米粒子,实现了光敏剂Photosan的纳米化。2、MTT法结果显示Photosan及纳米化Photosan介导的PDT均对胆管癌细胞有明显的杀伤作用（P<0.05）,而后者的杀伤作用更强（P<0.05）。光动力作用在一定范围内与光敏剂的孵育时间、光敏剂的浓度及光照剂量均呈正相关的关系。两种光敏剂均无明显的暗毒性,但两者具有不同的最佳作用参数。纳米化Photosan的最佳作用参数中,其所需的光敏剂浓度更低,孵育时间更短。Photosan及纳米化Photosan的流式细胞计数实验显示,使用各自的最佳作用参数时,后者的细胞杀伤效果明显强于前者（P<0.05）。两者对细胞杀伤的途径均以诱导凋亡为主,而后者中细胞坏死的比例高于前者。光学显微镜下亦可观察到纳米化Photosan对肿瘤细胞的杀伤作用更强,且坏死细胞的比例更高。3、动物实验结果显示,在使用各自的最佳作用参数时,Photosan与纳米化Photosan介导的PDT均对胆管癌有明显的抑制作用（P<0.05）,而后者作用更强（P<0.05）。病理切片结果亦显示,后者对肿瘤的杀伤效果更为明显。4、Photosan及纳米化Photosan介导的PDT作用于胆管癌后,与肿瘤血管生成、侵袭能力相关的基因在mRNA及蛋白水平的表达均下调（P<0.05）,与细胞凋亡相关的基因表达上调（P<0.05）。且后者相较于前者,对肿瘤侵袭能力及细胞凋亡的影响更为强烈（P<0.05）。结论：1、采用一步湿化学方法可制备出负载Photosan的空心氧化硅纳米粒子,实现光敏剂Photosan的纳米化,且纳米化Photosan无明显毒性。2、Photosan及纳米化Photosan介导的PDT均对胆管癌细胞具有明显的杀伤作用,而后者的杀伤作用更强。光动力作用在一定范围内与光敏剂的孵育时间、光敏剂的浓度及光照剂量均呈正相关的关系。纳米化Photosan较之于普通Photosan,带来的光动力效应更强,达到有效治疗浓度的速率更快。3、Photosan及纳米化photosan介导的PDT均在裸鼠人胆管癌移植瘤模型上证实具有明显的治疗作用,且Photosan纳米化后可缩短给药——光照时间间隔,增强光动力效应。4、Photosan及纳米化Photosan介导的PDT治疗肿瘤的机制至少包括了三个方面,即抑制肿瘤的血管生成、降低肿瘤的侵袭能力以及诱发肿瘤细胞的凋亡。且纳米化Photosan减轻肿瘤的侵袭性以及诱发肿瘤细胞凋亡的能力均明显强于Photosan。
二、肝外胆管癌组织中HSP70的表达意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝外胆管癌组织中HSP70的表达意义（论文提纲范文）
（1）GRP78在胆管癌中的表达及与预后关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 生物信息学验证 |
| 2.2 同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ) |
| 2.2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2.2 实验流程 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 胆管癌组织微阵列(tissue microarray,TMA) |
| 2.3.1 实验仪器及试剂 |
| 2.3.2 实验流程 |
| 2.4 免疫组织化学染色 |
| 2.4.1 实验仪器及试剂 |
| 2.4.2 实验流程 |
| 2.4.3 结果分析 |
| 2.5 实时定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5.1 实验仪器及试剂 |
| 2.5.2 实验流程 |
| 2.6 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting) |
| 2.6.1 实验仪器及试剂配制 |
| 2.6.2 实验流程 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 胆管癌癌组织和癌旁组织间的差异表达蛋白 |
| 3.2 GRP78在胆管癌组织中的表达 |
| 3.3 GRP78蛋白表达与胆管癌患者预后的关系 |
| 3.4 单因素和多因素cox分析-GRP78蛋白及临床特征与生存时间的关系 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）HSP90通过STAT3调控不全热消融术后肝癌细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:亚致死热处理促进HSP90与STAT3 结合并抑制肝癌细胞凋亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞培养及热处理 |
| 2.4 Hoechst33258 染色 |
| 2.5 细胞活力测定 |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 蛋白质印迹 |
| 2.8 免疫组织化学染色 |
| 2.9 患者样本 |
| 2.10 免疫共聚焦 |
| 2.11 RNA提取和实时逆转录PCR |
| 2.12 细胞转染cDNA用于过表达STAT3 蛋白 |
| 2.13 体内实验 |
| 2.14 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝癌组织内HSP90与STAT3 存在相关性 |
| 3.2 构建体外热处理模型 |
| 3.3 热处理诱导HSP90-STAT3 结合增加, |
| 3.4 热处理条件下促进抗凋亡蛋白表达 |
| 3.5 热处理后p-STAT3 入核增加 |
| 3.6 裸鼠不全RFA后 HSP90与STAT3 结合增加 |
| 3.7 裸鼠iRFA后促进肿瘤进展 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:亚致死热处理条件下HSP90 抑制剂XL888 通过破坏HSP90-STAT3 结合增强肝癌细胞热敏感性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞培养和热处理 |
| 2.4 Hoechst33258 染色 |
| 2.5 细胞活力测定 |
| 2.6 流式细胞仪 |
| 2.7 蛋白质印迹 |
| 2.8 IHC染色 |
| 2.9 免疫共聚焦 |
| 2.10 集落形成试验 |
| 2.11 RNA提取和实时逆转录PCR |
| 2.12 细胞转染cDNA用于过表达STAT3 蛋白 |
| 2.13 体内实验 |
| 2.14 免疫共沉淀 |
| 2.15 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 XL888 分子结构 |
| 3.2 XL888 诱导肝癌细胞凋亡 |
| 3.3 热处理后XL888 增强肿瘤杀伤作用 |
| 3.4 热处理联合XL888 诱导BCL-2 通路活化 |
| 3.5 XL888 破坏HSP90-STAT3 结合,抑制STAT3 磷酸化 |
| 3.6 热处理联合XL888 抑制p-STAT3 入核 |
| 3.7 热处理条件下XL888 通过STAT3 发挥抗肿瘤作用 |
| 3.8 体内实验证实不全RFA后联合XL888 抑制肿瘤生长 |
| 3.9 评估XL888 对肝肾功能的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 热休克蛋白与肝癌 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）胆管癌外泌体整合素β5通过枯否细胞促进亲肝转移的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 胆管癌组织中integrinβ5 的表达情况及其与临床病理特征的关系 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 胆管癌细胞外泌体对枯否细胞肿瘤转移相关因子表达的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 integrinβ5 对枯否细胞摄取外泌体的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体、整合素β5 在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）高通量测序捕获建库技术研发及其在复杂疾病分子遗传学研究中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文中常用缩写中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 高通量测序技术发展及现状 |
| 1.1.1 测序技术的发展 |
| 1.1.2 高通量测序技术原理 |
| 1.1.3 高通量捕获建库技术 |
| 1.1.4 高通量测序技术的应用 |
| 1.1.5 高通量测序技术的优势和挑战 |
| 1.2 复杂疾病分子遗传学研究 |
| 1.2.1 基于大样本的复杂疾病群体遗传学研究 |
| 1.2.1.1 病例-对照研究的关联分析 |
| 1.2.1.2 全基因组关联分析 |
| 1.2.1.3 高通量测序技术的应用和局限 |
| 1.2.2 基于微量样本的复杂疾病精准检测分析 |
| 1.2.2.1 循环肿瘤DNA的发现和特性 |
| 1.2.2.2 循环肿瘤DNA在癌症诊疗中的应用 |
| 1.2.2.3 高通量测序技术在循环肿瘤DNA检测中的应用及局限 |
| 1.2.3 两种代表性复杂疾病 |
| 1.2.3.1 精神分裂症 |
| 1.2.3.2 胆道恶性肿瘤 |
| 1.3 本章小结 |
| 第二章 扩增子靶向测序技术的研发及在精神分裂症分子遗传学研究中的应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 扩增子靶向测序技术 |
| 2.1.2 EMB基因与精神分裂症 |
| 2.1.3 BNIP3L基因与精神分裂症 |
| 2.1.4 研究目的 |
| 2.2 研究材料 |
| 2.2.1 捕获引物设计 |
| 2.2.2 研究对象 |
| 2.2.3 实验试剂与仪器 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 扩增子靶向测序技术的优化 |
| 2.3.2 样本DNA提取和质控 |
| 2.3.3 靶基因扩增捕获建库和测序 |
| 2.3.4 Sanger测序验证 |
| 2.3.5 数据分析方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 EMB基因分析结果与讨论 |
| 2.4.1.1 变异识别 |
| 2.4.1.2 关联分析结果 |
| 2.4.1.3 阳性SNP位点功能预测结果 |
| 2.4.1.4 错义突变验证及功能预测结果 |
| 2.4.1.5 讨论 |
| 2.4.2 BNIP3L基因分析结果与讨论 |
| 2.4.2.1 变异识别 |
| 2.4.2.2 外显子罕见变异分析 |
| 2.4.2.3 关联分析结果 |
| 2.4.2.4 荟萃分析结果 |
| 2.4.2.5 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 分子标签测序技术的研发及在胆道恶性肿瘤ctDNA分析中的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 分子标签与高通量测序技术 |
| 3.1.2 胆道恶性肿瘤ctDNA研究进展 |
| 3.1.3 研究目的 |
| 3.2 研究材料 |
| 3.2.1 实验样本 |
| 3.2.2 试剂与仪器 |
| 3.2.3 捕获panel设计 |
| 3.3 分子标签高通量测序建库技术研发 |
| 3.3.1 技术研发方案及测试方法 |
| 3.3.1.1 分子标签接头的制备 |
| 3.3.1.2 分子标签接头测试 |
| 3.3.1.3 ctDNA标准品测试 |
| 3.3.1.4 测序数据的分子标签校正 |
| 3.3.2 研发方案测试结果 |
| 3.3.2.1 分子标签接头质控结果 |
| 3.3.2.2 单一片段DNA连接效率测试结果 |
| 3.3.2.3 随机打断DNA样本测试结果 |
| 3.3.2.4 ctDNA标准品测试结果 |
| 3.3.3 研发方案结果讨论 |
| 3.4 优化方案在胆道恶性肿瘤ctDNA分析中的应用 |
| 3.4.1 研究方法 |
| 3.4.1.1 胆道恶性肿瘤样本DNA提取 |
| 3.4.1.2 全外显子测序文库构建 |
| 3.4.1.3 游离DNA测序文库构建 |
| 3.4.1.4 Illumina平台上机测序 |
| 3.4.1.5 二代测序数据分析方法 |
| 3.4.1.6 统计作图 |
| 3.4.2 胆道恶性肿瘤ctDNA分析结果 |
| 3.4.2.1 游离DNA样本及文库质控结果 |
| 3.4.2.2 测序数据质控结果 |
| 3.4.2.3 肿瘤组织与血浆的变异检测结果及对比 |
| 3.4.2.4 ctDNA术前术后动态变化及临床资料分析 |
| 3.4.3 胆道恶性肿瘤ctDNA分析结果讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表或成文的学术论文 |
（5）PTEN缺失通过损害溶酶体功能增加外泌体分泌进而促进胆管癌转移（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、PTEN缺失促进胆管癌的复发转移 |
| 二、PTEN差异表达影响胆管癌细胞的外泌体释放 |
| 三、PTEN缺失增加胆管癌细胞内MVB的数量 |
| 四、溶酶体功能的抑制可以促进胆管癌细胞的外泌体分泌 |
| 五、PTEN差异表达可以调节胆管癌细胞的溶酶体功能 |
| 六、PTEN调控溶酶体功能的机制研究 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体在肿瘤进展和诊疗中的作用 |
| 一、外泌体的发现和内容物组成 |
| 二、外泌体的生物发生和释放过程 |
| 三、外泌体在肿瘤发生进展中的作用 |
| 四、外泌体促进肿瘤化疗抵抗 |
| 五、外泌体在肿瘤治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）诱导型一氧化氮合酶抑制剂对胆管癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 iNOS在人类胆管癌QBC939 细胞系中的表达 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 第二节 结果 |
| 1 人胆管癌细胞系QBC939 的培养及i NOS受体的表达 |
| 第三节 讨论 |
| 第二章 诱导型一氧化氮合酶抑制剂对胆管癌细胞生物学行为的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 iNOS抑制剂1400W的配制 |
| 2.2 胆管细胞癌 QBC939 细胞的培养与扩增 |
| 2.3 硝酸还原酶法检测 QBC939 细胞 NO 含量 |
| 2.4 MTT 比色法检测 QBC939 细胞增殖 |
| 2.5 划痕试验检测 QBC939 细胞迁移能力 |
| 2.6 Transwell 小室检测 QBC939 细胞侵袭能力 |
| 2.7 统计学处理 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1:英文缩略词索引 |
| 附录2:综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（7）TGR5在胆管癌发生发展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 TGR5在肝外胆管癌组织中的表达分析及临床意义探讨 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TGR5对胆管癌细胞增殖、迁移、凋亡等生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TGR5通过结合并上调mortalin促进胆管癌细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 分子伴侣mortalin在肿瘤发生发展中的作用研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 胆汁酸受体及其相关药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）Bcl-2和Bag-1在肝外胆管癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 标本选择 |
| 1.2 检测方法 |
| 1.3 结果判断 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Bcl-2和Bag-1在肝外胆管癌中表达的相关性 |
| 2.2 Bcl-2和Bag-1的表达与胆管癌临床病理特征的关系 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞凋亡通路 |
| 3.2 Bcl-2 |
| 3.3 Bag-1 |
（9）肝外胆管癌中p15和HSP70基因表达的关系及意义（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）空心硅纳米粒子光敏剂在光动力治疗胆管癌中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 负载Photosan的空心氧化硅纳米粒子的制备与表征 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Photosan和纳米化Photosan介导的PDT对体外培养人胆管癌QBC939细胞的光动力灭活作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Photosan与纳米化Photosan介导的PDT治疗裸鼠人胆管癌移植瘤作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 Photosan与纳米化Photosan介导的PDT作用后对肿瘤血管生成、侵袭性及凋亡途径影响的探讨 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
| 致谢 |
四、肝外胆管癌组织中HSP70的表达意义（论文参考文献）
- [1]GRP78在胆管癌中的表达及与预后关系的研究[D]. 高龙. 兰州大学, 2021(12)
- [2]HSP90通过STAT3调控不全热消融术后肝癌细胞凋亡的机制研究[D]. 孙晨. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]胆管癌外泌体整合素β5通过枯否细胞促进亲肝转移的实验研究[D]. 宋康. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]高通量测序捕获建库技术研发及其在复杂疾病分子遗传学研究中的应用[D]. 周娟. 上海交通大学, 2020(01)
- [5]PTEN缺失通过损害溶酶体功能增加外泌体分泌进而促进胆管癌转移[D]. 石园园. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]诱导型一氧化氮合酶抑制剂对胆管癌细胞生物学行为的影响[D]. 谢博文. 湖南师范大学, 2017(01)
- [7]TGR5在胆管癌发生发展中的作用及机制研究[D]. 李艾迪. 河北医科大学, 2016(08)
- [8]Bcl-2和Bag-1在肝外胆管癌中的表达及意义[J]. 王鹤令,周品一,陈安杰,刘鹏,张宇. 现代肿瘤医学, 2014(11)
- [9]肝外胆管癌中p15和HSP70基因表达的关系及意义[D]. 张凝乐. 南华大学, 2013(01)
- [10]空心硅纳米粒子光敏剂在光动力治疗胆管癌中的作用及机制[D]. 邓小峰. 中南大学, 2013(02)