一、狂犬病病毒SRV_9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析（论文文献综述）
赵忠欣[1]（2020）在《共表达RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的重组人5型腺病毒的构建及免疫研究》文中认为背景狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引发的一种高度致死的急性人兽共患传染病。我国95%以上的狂犬病都是由犬引起的,其次是猫。该病目前尚无有效治疗方式,病死率接近100%。我国计划在2030年消除由犬传播的人类狂犬病。动物接种疫苗是预防狂犬病最有效的措施,但是传统的狂犬病疫苗成本较高,这阻碍了动物强制性免疫的实施。因此,急需开发一种廉价、安全、有效的新型狂犬疫苗。SFTS（Severe fever with thrombocytopenia syndrome）是 2011 年发现的由SFTSV（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus）引起的一种人兽共患的新发病毒传染性疾病。该病具有起病急、病死率高、分布广泛等特性。SFTSV动物感染谱广,犬、猫、牛、羊等多种家养动物及野生动物都是SFTSV的主要宿主。特别是犬、猫等伴侣动物,与人类密切接触,传播风险高,是造成人类感染的主要传染源,近年来受到密切关注。但是目前还没有批准的SFTSV的疫苗及药物,因此,急需开发SFTSV疫苗以有效控制SFTS的传播。综上所述,狂犬病和SFTS都是严重的人兽共患病,且犬、猫是RABV和SFTSV重要的共同传播宿主。在我国,家养动物需强制性免疫狂犬疫苗,因此迫切需要研制一种能够同时预防RABV和SFTSV的安全、廉价、高效的二联疫苗,切断动物传播途径,保护人与动物的免遭感染。研究表明,腺病毒载体疫苗能够在体内诱导产生较强的体液和细胞免疫,安全性高,应用广泛。本研究以复制缺陷型人5型腺病毒（Ad5）为载体,插入RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白,构建重组人5型腺病毒Ad5-G-Gn。通过体外细胞实验和动物实验分析重组病毒Ad5-G-Gn的生物学特性、免疫原性及保护性。目的1.将RABVG蛋白基因和SFTSVGn蛋白基因插入到Ad5载体中,构建共表达RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的重组人5型腺病毒Ad5-G-Gn。2.通过体外细胞实验分析Ad5-G-Gn的生物学特性;动物实验分析其免疫原性、中和抗体效价和保护率。方法1.重组病毒Ad5-G-Gn的构建及鉴定:将目的基因RABV G和SFTSV Gn通过P2A基因连接,重组至人5型腺病毒,构建重组病毒Ad5-G-Gn。与对照病毒Ad5-GFP同时接种293T细胞,通过免疫荧光实验和Western blot实验分析RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的表达情况。2.小鼠免疫及Ad5-G-Gn毒力鉴定:6-8周龄雄性C57/BL6小鼠随机分成3组,分别免疫Ad5-G-Gn,Ad5-GFP和DMEM,免疫后21天内,连续监测小鼠的饮食情况、精神状况、体重变化等。3.Ad5-G-Gn诱导特异性中和抗体的能力检测:免疫C57/BL6小鼠后第2、4、8周采集小鼠血清,分别用荧光抗体病毒中和实验（Fluorescent antibody virus neutralization,FAVN）和荧光灶减少中和实验（Fluorescent reduction neutralization test,FRNT）检测RABV和SFTSV的中和抗体效价。4.Ad5-G-Gn保护效力检测:免疫C57/BL6小鼠4周后,后肢肌内注射RABV或SFTSV。观察感染RABV后小鼠的临床症状,来检测Ad5-G-Gn对RABV致死性攻击的保护作用;并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测感染SFTSV后小鼠脾脏内的病毒载量,来检测Ad5-G-Gn清除SFTSV的速率。5.Ad5-G-Gn诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs和B细胞的能力检测:免疫BALB/c小鼠后第3、6、9天,利用流式细胞实验验证Ad5-G-Gn诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs（CD11c+CD86,+CD11c+MHCI+,CD11c+MHCII+）、B（CD19+CD40+）细胞的能力。6.Ad5-G-Gn诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞的能力检测:免疫BALB/c小鼠后第4周,利用酶联免疫斑点实验（ELISpot）分析在RABV和SFTSV特异性刺激下,Ad5-G-Gn诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞的能力。7.Ad5-G-Gn诱导小鼠产生特异性抗体的能力检测:免疫C57/BL6小鼠后第2、4、8周采集小鼠血清,通过酶联免疫吸附实验（ELISA）实验分析在RABV和SFTSV特异性刺激下,Ad5-G-Gn诱导小鼠产生特异性Ig/IgG2c/IgG1的能力。结果1.通过免疫荧光实验和Western blot实验分析,RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白在重组病毒Ad5-G-Gn感染的293T细胞中表达且大小均与预期一致。2.免疫后21天观察期内,与空白组和Ad5-GFP对照组小鼠进行比较,Ad5-G-Gn实验组小鼠体重无统计学差异,三组小鼠体重都呈现上升趋势,且生长状态良好,无异常状况出现。3.FAVN和FRNT实验结果证明,Ad5-G-Gn能诱导小鼠产生高效价的RABV和SFTSV中和抗体,免疫4周后平均抗体水平可分别达到27.72 IU/ml和1:102。4.RABV感染实验结果显示,Ad5-G-Gn能100%保护小鼠免受感染,而空白组和Ad5-GFP组均100%发病。SFTSV感染实验结果显示,Ad5-G-Gn组小鼠脾脏病毒载量显着低于空白组和Ad5-GFP组。5.流式细胞实验结果显示,与空白组和Ad5-GFP组相比,Ad5-G-Gn可在小鼠体内募集和/或激活更多的DCs、B细胞。6.ELISpot实验结果显示,免疫4周后,Ad5-G-Gn组小鼠脾细胞产生的特异性斑点形成细胞（SFCs）数目明显多于空白组和Ad5-GFP组。7.ELISA实验结果显示,Ad5-G-Gn可诱导小鼠产生较高的特异性Ig效价,在免疫4周后,小鼠产生较强的Th1型免疫反应。结论1.成功构建了共表达RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的重组人5型腺病毒Ad5-G-Gn。2.Ad5-G-Gn毒力小,免疫原性好,可激发小鼠强烈的体液免疫和细胞免疫,对RABV和SFTSV感染具有较强的保护作用,表明Ad5-G-Gn可作为RABV和SFTSV的二联候选疫苗。
张胜男[2]（2020）在《裂谷热病毒eGn蛋白重组狂犬病病毒及细菌样颗粒免疫原构建与实验免疫研究》文中研究表明裂谷热（Rift Valley Fever,RVF）是由裂谷热病毒（Rift Valley Fever virus,RVFV）引起的一种主要感染牛、羊、骆驼、野生动物等的人兽共患烈性传染病。RVFV可通过蚊虫叮咬、直接接触病畜及其畜产品以及气溶胶传播。人感染RVFV后出现高烧不退、呕吐、四肢无力、腹泻等临床症状。感染RVFV可致使100%怀孕母羊流产、90%羔羊死亡、20%成年羊死亡。1931年于肯尼亚裂谷首次发现RVF后,开始在非洲国家和地区流行、传播。2000年,沙特阿拉伯和也门出现RVF疫情,象征着RVF开始向非洲以外的国家和地区蔓延、扩散。2001年《禁止生物武器公约》的监控、核查名单中、2015年（8+3）和2018年（9+X）世界卫生组织（WHO）提出的优先研究疾病名单中均包括RVF。世界动物卫生组织（OIE）也将RVF规定为法定呈报传染病。随着世界经济全球化,各个国家联系密切,往来频繁,增加了 RVF自然感染或输入性病例发生的几率。我国于2016年7月确定首例人RVF输入性病例。RVF疫情的暴发流行不但威胁到人类、家畜和野生动物的健康,产生的贸易壁垒还严重影响着国家的经济贸易发展。介于传统的灭活疫苗及弱毒疫苗存在病毒毒力返强、病毒发生重组等弊端,使其在RVF非流行地区使用受到严格限制。目前,对于RVF尚无获批疫苗或特异性治疗方法。进行疫苗和治疗性抗体研发,对于预防控制RVF传播扩散、保护患者以及降低经济损失具有重要意义。从动物源头开展防控,可以有效控制RVFV的传播、扩散,研制安全性高和免疫原性强的兽用RVF疫苗迫在眉睫。为此本研究以狂犬病病毒SRV9株为载体,构建表达RVFV eGn蛋白的重组狂犬病病毒rSRV9-eGn,同时利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达RVFV Gn head蛋白与乳酸乳球菌蛋白锚钩（PA）的融合蛋白,将其展示在乳酸乳球菌肽聚糖（GEM）颗粒表面制备成RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs,分别进行安全性及免疫原性研究,为研制安全性高、免疫原性强的RVF新型疫苗奠定基础。1.表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn的构建与鉴定基于本实验室现有RABV弱毒SRV9株感染性克隆,本研究通过分子生物学技术将RVFV主要抗原表位Gn胞外区基因插入到SRV9基因组中,构建了包含RVFV eGn基因的重组狂犬病病毒感染性克隆rSRV9-eGn,与辅助质粒pD-N、pD-P、pD-G、pD-L共转染BSR细胞,成功拯救了重组病毒rSRV9-eGn。直接免疫荧光结果表明重组病毒rSRV9-eGn拯救成功;RT-PCR结果表明RVFV eGn基因已经成功插入到重组病毒rSRV9-eGn中且可稳定遗传;间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western Blot结果表明RVFV eGn蛋白成功表达且与RABVG蛋白共同嵌合在病毒粒子表面,为将重组病毒rSRV9-eGn灭活使用奠定基础;电镜下观察重组病毒rSRV9-eGn具有典型的弹状形态特征;生长曲线显示重组病毒rSRV9-eGn与母本病毒rSRV9的生长动力学相似,培养72 h时为病毒的最佳收获时间;ICR乳鼠与成年鼠颅内注射不同病毒滴度的重组病毒rSRV9-eGn和母本病毒rSRV9结果表明,RVFV eGn基因的插入降低了 rSRV9毒株的神经毒性。综上所述,本部分研究成功拯救重组病毒rSRV9-eGn。2.表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn免疫原性评价为了评估重组病毒rSRV9-eGn的免疫原性,活母本病毒rSRV9与活重组病毒rSRV9-eGn单剂量免疫小鼠、灭活重组病毒rSRV9-eGn单独或辅以不同佐剂三剂量免疫小鼠。结果显示,仅灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂组可以诱导小鼠产生抗RVFV eGn特异性IgG抗体,其中以IgG1为主导亚型,IgG1/IgG2a>1表明其可触发倾向于Th2型体液免疫应答反应。利用经基于VSV系统包装的RVFV假病毒与小鼠血清进行中和抗体验证,发现含有高效价抗RVFV eGn特异性IgG抗体的小鼠血清中无抗RVFV中和抗体。取该组小鼠血清及脾细胞进行细胞因子检测发现,灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂免疫小鼠后,可诱导小鼠的Th2型细胞分泌细胞因子。除此之外,灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂还可以诱导小鼠中央型和效应型记忆T细胞数量增加。灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂免疫小鼠,可以诱导小鼠产生抗RVFV特异性IgG抗体外,还可以产生抗RABV中和抗体。RABV体内外中和实验表明一免一周、一免两周、两免一周分别有30%、70%、100%小鼠血清抗RABV中和抗体阳性;CVS-11街毒于一免一周和两免一周对免疫小鼠进行攻击,小鼠存活率分别为30%和100%。以上结果表明,rSRV9毒株具有良好的免疫原性,是一个有潜质的病毒载体。3.GEM展示RVFV细菌样颗粒的构建与鉴定基于本实验室成熟的昆虫细胞-杆状病毒表达系统,制备GEM展示RVFV细菌样颗粒。一是通过融合PCR方法将RVFV Gn head基因与乳酸乳球菌MG1363 PA基因进行融合,转染Sf9细胞进而实现RVFV Gn head-PA融合蛋白表达。将食品级乳酸乳球菌MG1363进行酸化处理,制备GEM颗粒。RVFV Gn head-PA融合蛋白与GEM颗粒相互作用,通过非共价结合方式将RVFV Gn head-PA融合蛋白展示在GEM颗粒表面。PCR扩增结果表明,HBM-His-RVFV Gn head-PA融合基因已经成功插入到重组杆状病毒基因组中;间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western Blot结果表明,RVFV Gn head-PA融合蛋白已成功分泌性表达,但此融合蛋白只能在重组杆状病毒中传至四代,第五代细胞培养物中未检测到融合蛋白;间接免疫荧光、流式细胞术、免疫电镜结果表明,RVFV Gn head-PA融合蛋白通过非共价结合已成功展示在GEM颗粒表面。电镜下观察超薄切片结果表明,未处理的乳酸乳球菌MG1363细胞壁清晰可见、内部质地均一;GEM颗粒保留乳酸乳球菌光滑形态结构的前提下去除了其自身的遗传物质及蛋白质、内部中空;RVFV Gn head-PA融合蛋白展示在GEM表面后,GEM表面附着一层絮状物。综上所述,基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达的RVFV Gn head-PA融合蛋白成功地展示在GEM颗粒表面,制备成RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs。4.GEM展示RVFV细菌样颗粒免疫原性评价为了评估RVFV-BLPs免疫原性及不同抗原量对其免疫原性的影响,设置20μg、50μg、100 μg抗原量的RVFV-BLPs免疫小鼠。结果显示,三种抗原量RVFV-BLPs均可诱导小鼠产生抗RVFV Gn head特异性IgG抗体,但特异性IgG抗体水平与免疫原量不成正比,其中以RVFV-BLPs（50 μg）组免疫效果最佳,呈现抗体出现早、持续时间长、消退慢等特点。通过检测IgG亚型发现,三种不同抗原量RVFV-BLPs刺激小鼠产生的IgG亚型也呈现不同的特点。RVFV-BLPs（20 μg）组仅检测到IgG1;RVFV-BLPs（50μg）组检测到较高效价的IgG1,之后在免疫不同时间点检测到了 IgG2a和IgG3;RVFV-BLPs（100 μg）组仅检测到以IgG1及IgG2a,其中IgG1为主导。三种不同抗原量的RVFV-BLPs免疫小鼠后产生的IgG抗体均是以IgG1亚型为主体,IgG1/IgG2a均是大于1。取三组小鼠血清进行细胞因子分析,发现不同抗原量RVFV-BLPs免疫小鼠后,可诱导小鼠产生不同种类及量的细胞因子,表明抗原量可能强烈影响免疫过程中诱导的功能效应细胞的类型。RVFV-BLPs（20 μg）组、RVFV-BLPs（50 μg）组小鼠可产生Th1型细胞因子也产生Th2型细胞因子;RVFV-BLPs（100 μg）组小鼠以Th2型细胞因子为主。综合免疫小鼠的特异性IgG亚型及血清中细胞因子种类结果分析,RVFV-BLPs免疫小鼠后,诱导小鼠产生倾向于Th2型体液免疫应答。基于抗RVFV Gn head特异性IgG抗体结果及其血清中细胞因子分析,本研究选择RVFV-BLPs（50 μg）组进行了深入研究。利用经基于VSV系统包装的RVFV假病毒与RVFV-BLPs（50 μg）组三免两周小鼠血清进行中和抗体检测,发现中和50%RVFV假病毒的小鼠血清稀释倍数为40倍。取RVFV-BLPs（50 μg）组小鼠脾细胞进行细胞免疫检测,发现RVFV-BLPs（50 μg）可促进小鼠淋巴细胞增殖,也可促进小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-4细胞因子。与PBS对照组相比,CD4+和CD8+T淋巴细胞的中央记忆T细胞数量增加,主导的效应记忆T细胞减少,表明RVFV-BLPs（50 μg）免疫小鼠后,诱导小鼠产生的中央记忆T细胞定居在外周免疫器官T细胞区,当受到抗原刺激后其分化成效应细胞及效应分子,不直接发挥效应,抗原再次刺激时重新分化为效应细胞,并快速发挥免疫效应作用。综上所述,本研究中制备的两种预防RVFV感染的免疫原,即RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn与GEM展示RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs,均是首次将RABV载体与GEM展示的细菌样颗粒方法应用于新型RVF疫苗探索研究。二者特点各有不同:二者均可刺激机体产生特异性细胞免疫与体液免疫应答;灭活重组病毒rSRV9-eGn配伍佐剂使用有望研制成既可预防RABV感染又可预防RVFV感染的二联疫苗;GEM展示RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs易于生产、保存与运输。二者均具有开发成为RVF疫苗候选株的潜能,为RVF新型疫苗研究奠定基础。
阮晓凤[3]（2019）在《表达猫衣原体momp蛋白的重组病毒构建及免疫原性研究》文中指出猫衣原体（Chlamydia felis,C.felis）是猫衣原体病的病原体。与猫疱疹病毒-I型（Feline Herpeto Virus-1,FHV-1）、猫杯状病毒（Feline Calici Virus,FCV）同是引起猫上呼吸道疾病（FURTD）的主要病原。轻者引起猫结膜炎、鼻炎及咽炎,严重者表现为肺炎、关节炎和跛行等。临床病例中,感染猫衣原体的人和动物通过抗菌治疗治愈（如两性霉素）,但易复发。由于猫衣原体感染的群体广泛性以及反复性,预防人和动物感染猫衣原体疾病、控制猫衣原体传播的最佳途径是研究安全有效的疫苗。目前猫衣原体疫苗研究主要集中在新型疫苗、减毒活疫苗或全灭活生物疫苗等方面。研究过程中发现,使用全菌为基础的灭菌疫苗或者减毒活疫苗并不是很好的选择,因为全菌疫苗保存的一些特定抗原成分能够导致一定的病理反应,减毒活疫苗则存在反强的可能,对公共卫生存在潜在的威胁。新型疫苗安全、有效,不含有衣原体全菌疫苗中副作用的部分,不存在返祖造成机体持续性感染的危险,而且还可以诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,保护机体免受衣原体的感染。然而研制安全有效的新型疫苗目前面临的两大难题是保护性抗原和抗原呈递载体的选择。主要外膜蛋白（major outer membrane proteins,momp）同时含有T细胞和B细胞表位,可诱导特异性抗猫衣原体免疫反应。在不同的衣原体血清型中序列高度保守。因此,本次实验选择猫衣原体主要外膜蛋白作为保护性抗原。据文献报道重组狂犬病病毒二联疫苗作为免疫原具有安全、高效、可刺激机体产生高水平中和抗体、有效诱导T细胞免疫应答的特点。利用反向遗传技术拯救的重组狂犬病病毒因病毒产量高、外源蛋白表达水平高、易于大量制备的优势曾多次作为载体应用于不同蛋白的表达。杆状病毒表达载体近年来备受青睐,以AcMNPV为基础的杆状病毒表达载体系统发展迅速,应用十分普遍。杆状病毒表达载体具有诸多优势:利用杆状病毒表达载体表达的重组蛋白与天然蛋白具有相似的生物活性;外源基因容量大,适合较大的基因克隆和同时多个基因的克隆;生物安全性好,杆状病毒不感染包括人在内的哺乳动物;在双启动子调控下,重组蛋白具有很高的表达水平。狂犬病病毒表达载体、杆状病毒表达载体凭借自身优势成为抗原呈递载体候选。本研究采用狂犬病病毒SRV9株反向遗传载体、杆状病毒表达载体构建表达momp的重组病毒,通过血清学实验,进行免疫原性评价。重组狂犬病病毒（SRV9-MOMP）的拯救:基于RABV SRV9株反向遗传操作系统,在其P与M基因间隔区插入猫衣原体的主要外膜蛋白基因（MOMP）,构建含有MOMP结构的重组质粒pUC57-SRV9-MOMP（P/M）。经PCR鉴定、基因测序,正确的重组狂犬病病毒感染性全基因组质粒pUC57-SRV9-MOMP（P/M）与其辅助质粒共同转染至BSR-T7细胞拯救重组狂犬病病毒SRV9-MOMP。从基因组和蛋白两个方面鉴定外源基因的插入及表达情况,研究重组毒的生长动力学、遗传稳定性和致病性等特性。免疫荧光观察结果表明重组狂犬病病毒拯救成功;RT-PCR结果显示,MOMP基因已成功插入重组病毒基因组中,并在传代过程中遗传稳定;Western Blot分析证明猫衣原体momp在SRV9-MOMP中成功表达;生长动力学曲线表明重组病毒与母本病毒在BSR-T7细胞上的增值水平无显着差异,SRV9-MOMP病毒滴度可达到1×108.125TCID50/mL;乳鼠颅内攻毒实验表明,与母本病毒相比,重组病毒的致病性降低。此部分实验构建了插入猫衣原体MOMP基因的重组狂犬病病毒感染性全基因组质粒pUC57-SRV9-MOMP（P/M）,拯救了SRV9-MOMP重组病毒,病毒滴度高、外源蛋白momp遗传稳定、该重组病毒可作为疫苗候选用于进一步的免疫研究。重组杆状病毒（Ac-MOMP）构建:基于杆状病毒表达载体,将猫衣原体MOMP基因克隆至pFastBacI载体的多克隆位点,获得重组质粒pFastBacI-MOMP（pF-MOMP）。经PCR鉴定正确的重组质粒转化到DH10Bac大肠杆菌感受态中,经蓝白斑筛选后,将鉴定正确的重组杆粒Bacmid-MOMP（Bac-MOMP）转染Sf9细胞,拯救表达momp的重组杆状病毒AcMNPV-MOMP（Ac-MOMP）。细胞形态观察、荧光观察表明重组杆状病毒拯救成功;Western Blot分析,momp可在重组杆状病毒Ac-MOMP中稳定遗传。该重组病毒安全性好、易于大量制备,可作为疫苗候选用于进一步的免疫研究。为了探究重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后的免疫保护效力:将重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后按照最高剂量相同体积分别对猫进行免疫,通过肌肉注射免疫2次,相隔14 d。首免后2周、4周、6周、8周采集血清。最后,采用猫衣原体进行攻毒试验。采用中和试验检测重组病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP灭活后免疫猫刺激机体产生的抗momp中和抗体水平,评价灭活病毒的免疫保护效力;采用FAVN检测灭活病毒SRV9-MOMP免疫的猫体内抗RABV中和抗体水平。中和试验结果显示经灭活病毒SRV9-MOMP和Ac-MOMP免疫猫的血清中含有高效抗momp中和抗体,能够保护机体免受猫衣原体的感染。FAVN试验表明,灭活病毒SRV9-MOMP免疫的猫血清含有高滴度的抗RABV中和抗体。本实验结果表明,灭活病毒SRV9-MOMP与Ac-MOMP均可诱导猫产生针对于猫衣原体momp中和抗体;加强免疫后,抗体水平显着增高。与灭活重组杆状病毒相比,SRV9-MOMP诱导猫产生抗momp中和抗体滴度更高,并产生高滴度的抗RABV中和抗体,基于灭活SRV9-MOMP重组病毒具有良好的免疫原性,滴度高、高效表达外源蛋白、可大量制备等优点,为研制新型“低成本-高效”猫衣原体疫苗提供新思路。
马子鹏[4]（2019）在《不同毒力G蛋白狂犬病重组病毒的拯救及生物学特性研究》文中研究说明本课题研究以狂犬病病毒疫苗毒LBNSE株的反向遗传学系统为骨架,分别用RT-PCR扩增CVS-11株（标准攻击毒株）与SAD株（疫苗毒株）的G基因,将该基因分别与pLBNSE质粒中的的G基因进行替换,构建两株重组质粒。利用反向遗传学系统拯救出两株重组不同毒力狂犬病G蛋白的重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG,然后对两株病毒的生物学特性进行探究。应用Overlap PCR的方法,利用Snapgene生物学软件设计引物,对实验室保存的全长pLBNSE质粒的Pst I和EcoR I酶切位点进行改造,改造后质粒命名为r-pLBNSE。根据GenBank上发表的SAD株和CVS11株的全基因序列,利用Primer5生物学软件分别设计G基因引物（G基因前加信号肽和flag标签）,分别进行RT-PCR扩增出SAD株和CVS11株的G基因序列。将扩增出的G基因序列,经酶切、连接等步骤替换到改造后的r-pLBNSE质粒上,构建出重组G基因的全长质粒并命名为r-pLBNSE-SfG（带 flag 标签的 SAD 株 G 基因）和 r-pLBNSE-CfG（带 flag 标签的 CVS11株G基因）。利用反向遗传学系统,将重组全长质粒与辅助质粒pH-N、pH-P、pH-G和pH-L共转染BSR细胞,拯救出重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG。应用直接免疫荧光和RT-PCR的方法鉴定拯救的重组病毒。通过探究两株重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG的生物学特性,发现重组病毒的生长特性与亲本毒株相一致,通过对糖蛋白表达量的比较发现重组病毒糖蛋白表达量明显低于亲本毒株,而致病性由强到弱依次为rLBNSE-CfG≥rLBNSE-SfG≥LBNSE。本实验为探究狂犬病的致病机理、病毒的包装、运输、释放及病毒的神经嗜性与糖蛋白的关系等机制的研究奠定基础。
刘杰[5]（2019）在《狂犬病病毒M和L蛋白单克隆抗体的制备及应用》文中研究指明狂犬病病毒（RabiesVirus,RABV）是导致温血动物狂犬病的病原体,并且发病动物致死率几乎为100%,对公共卫生造成严重威胁。狂犬病病毒包含五个结构蛋白,其中基质蛋白（M）对于病毒的组装和出芽必不可少的,大蛋白（L）对病毒基因组的转录和复制起到重要调控作用。抗原表位的鉴定不仅有助于了解蛋白的免疫学基础,还对研发相关疫苗,建立针对不同特异性表位的病毒诊断方法有重要的指导作用。双抗体夹心ELISA法常用于RABV定量检测中,因此开发新的RABV 双抗体夹心ELISA法对于狂犬病病毒的临床诊断很有意义。本研究利用狂犬病病毒重组M蛋白制备了五株狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体:3B9、4A1、2B11、2C1和4B11;利用狂犬病病毒重组L蛋白制备了三株狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体:3F3、4D10和5A3。进一步,我们鉴定了 M蛋白的一个线性表位25PPYDDD30,并且利用本实验中制备的M蛋白的单克隆抗体建立了基于M蛋白的RABV 双抗体夹心ELISA检测方法。这不仅为RABV临床诊断提供了有力的工具,同时也为M蛋白相关功能的深入研究奠定了基础。具体研究内容如下:1.狂犬病病毒M蛋白的原核表达与鉴定采用PCR方法以实验室保存的狂犬病病毒CVS-11毒株的反转录产物为模板扩增M基因,并将其克隆至pET-28a（+）表达载体中,命名为pET-28a-M,随后将pET-28a-M转化到E.coli BL-21（DE3）感受态细胞中,实现M蛋白的原核表达,结果显示重组M蛋白的大小约为27kDa,并且M蛋白主要以包涵体的形式存在。western blotting结果显示,重组M蛋白能够与His蛋白单抗反应。试验结果表明,我们成功利用大肠杆菌原核表达系统表达了狂犬病病CVS-11的M蛋白。2.狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以纯化后His-M蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,将血清效价最高小鼠的脾细胞与的骨髓瘤细胞（SP2/0）在PEG2000的作用下进行融合,以间接ELISA和IFA进行杂交瘤的筛选,阳性克隆亚克隆3-5次。最终制备了 5株M蛋白单克隆抗体命名为:3B9、4A1、2B11、2C1和4B11。单抗亚型分析结果显示,3B9、4A1和4B11单抗亚型均为IgG2bκ,2B11亚型为IgG2aκ,2C1亚型为IgAκ。制备的单抗腹水效价为105-108。五株单克隆抗体与狂犬病病毒CVS-11毒株在免疫印迹（westernblotting,WB）和间接免疫荧光试验（IFA）上反应良好。进一步研究发现,这五株单抗能在间接免疫荧光试验和免疫印迹识别广东茂名野毒株但是不与弱毒株HEP-Flury反应,提示这五株单抗识别的抗原表位在不同狂犬病病毒株可能存在差异。本研究获得的单克隆抗体,为狂犬病病毒的检测和抗原表位分析的研究奠定了基础。3.狂犬病病毒M蛋白B细胞表位的精细鉴定利用在线预测软件预测了 M蛋白的5个可能抗原表位,将这5个截短蛋白克隆至pET-32a（+）载体后,利用原核表达系统实现这五个重组截短的蛋白的表达。利用western blotting方法,确定五株单抗识别的B细胞表位范围为23SAPPYDDDLW32,再逐步截短23SAPPYDDDLW32克隆到pGEX4T-1的原核表达载体上,表达出的GST标签的截短体蛋白结合western blotting方法,最终将M蛋白的精细表位定位到25PPYDDD30。将该片段克隆到pCMV-Flag真核表达载体上,转染细胞后进行IFA试验,最终确定五株单抗识别M蛋白的精细表位为25PPYDDD30。进一步的,我们比对不同进化分枝狂犬病病毒表位氨基酸序列后发现,25PPDGDD30只存在分枝三中的HEP-Flury及变体Flury毒株,而Y27D突变在三个进化分枝毒株中广泛存在。此外,表位序列中D28G突变消除了 5株单抗对M蛋白的反应性。M蛋白25PPYDDD30表位的鉴定丰富了 RABVM蛋白的表位图谱,并为M蛋白相关功能的研究奠定了基础。4.狂犬病病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立以纯化的狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体4A1和3B9分作为捕获抗体和检测抗体,建立检测狂犬病病毒的单克隆抗体夹心ELISA方法。优化的试验反应条件为:单克隆抗体4A1的包被浓度为2μg/mL,4℃过夜作为包被条件,10%小牛血清37℃封闭,酶标单克隆抗体的稀释度为1:4000,酶标单抗反应时间为1h时,体系最优。特异性试验表明,该夹心ELISA方法与犬细小病毒和犬流感病毒无交叉反应;敏感性试验显示,该方法检测病毒量的最低限为102 TCID 50/mL;重复性试验表明,夹心ELISA检测方法批内、批间变异系数均小于小于5%。本实验建立的单克隆抗体夹心ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,具有狂犬病病毒的临床诊断以及检测的应用前景。5.狂犬病病毒L蛋白单克隆抗体的制备采用PCR方法以实验室保存的狂犬病病毒CVS-11毒株的反转录产物为模板扩增L基因,将L蛋白基因克隆至pET-32a（+）表达载体中,命名为pET-32a-L,将pET-32a-L转化到E.coli BL-21（DE3）感受态细胞后实现L蛋白的原核表达,重组His-L蛋白的大小约为57kDa。以纯化后His-L蛋白三次免疫BALB/c小鼠,将血清效价最高小鼠的脾细胞与的骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,以间接ELISA和IFA进行杂交瘤的筛选,对阳性克隆继续亚克隆三次,每次亚克隆检测2-3次。最终获得了 3株针对L蛋白单抗命名为:3F3、4D10和5A3。3株单克隆抗体与狂犬病病毒CVS-11毒株的间接免疫荧光试验和蛋白印迹实验具有良好反应性。
文兆海[6]（2018）在《狂犬病疫苗株与减毒疫苗株的免疫及病理学研究》文中提出狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒感染引起的一种急性致死性人兽共患传染病,一旦发病死亡率几乎为100%。犬瘟热、犬细小亦是造成犬科动物发病死亡的重要传染病。目前,疫苗接种是预防狂犬病、犬瘟热、犬细小最为经济有效的方法。本研究团队利用反方向遗传学技术将狂犬病病毒的G基因提前,敲除其毒力基因,并将犬瘟热病毒和犬细小病毒的主要抗原基因CDV-N、CPV-VP2插入到狂犬病病毒基因组构建重组狂犬病病毒,有望获得基因重排减毒狂犬病疫苗株、犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的二联弱毒苗株、犬瘟热病毒N基因-犬细小病毒VP2基因重组狂犬病病毒的三联弱毒苗株。以期为将来制备狂犬病减毒口服活疫苗、犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗、犬瘟热-犬细小-狂犬病三联弱毒活疫苗奠定基础。首先,为了探究基因重排减毒狂犬病病毒、犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒（CDV-N重组狂犬病病毒）的拯救及鉴定。利用反向遗传学技术,通过脂质体转染的方法,将纯化后的全长重组质粒与4个辅助性表达质粒共转染BSR细胞;通过RT-PCR技术、间接免疫荧光试验对重组病毒进行鉴定。结果显示,RT-PCR检测出现与预期相符的目的片段;激光共聚焦显微镜观察发现,试验组出现了大量的荧光灶点,空白对照组未见绿色荧光;间接免疫荧光鉴定结果与RT-PCR检测结果相符,表明基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒拯救成功。其次,探究基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒对小鼠的免疫效果及安全性评估。利用ELISA试剂盒对狂犬病毒、犬瘟热病毒的特异性抗体进行检测。结果显示:三种重组狂犬病病毒株口服免疫产生的狂犬病毒抗体水平均显着高于亲本毒株Srv9口服免疫组。CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒均可刺激小鼠机体产生狂犬病毒抗体和犬瘟热病毒抗体;病理组织学检查结果表明口服免疫组的安全性优于注射免疫组。最后,探究了基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒对犬的口服免疫效果。利用ELISA试剂盒对狂犬病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒的特异性抗体进行定量检测。结果显示均能诱发机体产生其特异性抗体,且到第35天时各免疫组血清狂犬病毒抗体水平均高于世界卫生组织推荐的最低保护水平0.5 IU。
盖微微[7]（2018）在《马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究》文中研究说明马尔堡出血热（MHF）是由马尔堡病毒（MARV）引起的一种急性、烈性出血性人兽共患传染病,目前尚无有效的疫苗和治疗药物。此外,由于MARV属于生物安全四级病原体,进一步阻碍了其传统疫苗的研发。因此,研制安全、有效的新型疫苗对于应对MHF的暴发流行和可能的生物恐怖袭击均具有重要意义。病毒样颗粒（VLPs）不含病毒核酸,无感染或复制能力,安全性高,形态结构与天然病毒相似,可诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答反应,是当前基因工程疫苗研究的热点。基于VLP制备的乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头状瘤病毒（HPV）等多种新型疫苗均已成功上市。近年来,随着研究的深入,病毒载体疫苗在烈性传染病的防控中发挥着重要作用。狂犬病病毒（RABV）作为疫苗载体具有基因组简单、可稳定表达外源蛋白、允许插入多个大片段的外源基因且并不影响病毒自身复制、病毒基因组不会整合到宿主基因组等优点。本论文利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac/IC）构建并制备MARV VLPs,同时以狂犬病病毒SRV9株为载体,构建表达MARV GP的重组狂犬病病毒,分别以小鼠、马和非人灵长类等动物评价其安全性和免疫原性,为研制安全、高效的MARV新型疫苗奠定基础。利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建表达MARV糖蛋白（GP）和基质蛋白（VP40）的重组杆状病毒,基因组PCR、间接免疫荧光和Western Blot等方法鉴定结果表明:拯救的重组杆状病毒可成功表达MARV GP和VP40蛋白。将获得的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞成功获得了MARV VLPs,透射电镜观察表明:VLPs与MARV天然结构相似,具有典型的丝状结构,大小约为600-1000nm。利用超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心等方法纯化MARV VLPs,辅以（单独或联合使用）佐剂（茯苓多糖[PCP-II]、聚肌胞苷[PloyI/C]和铝胶[Alum]）制备免疫原,以小鼠和猴评价其免疫效果。小鼠试验结果表明:MARV VLPs成功诱导小鼠机体产生特异性中和抗体和细胞免疫应答。3种免疫佐剂中PCP-II的效果明显优于其他组,可诱导机体产生显着高的抗MARV抗体、B淋巴细胞、T淋巴细胞和细胞因子分泌。猴试验结果显示:MARV VLPs免疫恒河猴后可刺激机体产生抗MARV抗体,ELISA抗体效价可达1:1280,病毒中和抗体效价可达1:320。MARV VLPs免疫组恒河猴的外周血淋巴细胞（PBMCs）可分泌显着增多的IFN-γTh1型细胞因子和IL-4 Th2型细胞因子。以上结果表明,MARV VLPs联合PCP-II佐剂在对小鼠和恒河猴具有良好的免疫效果,可诱导机体产生特异性体液免疫应答与细胞免疫应答。抗血清疗法是治疗病毒和细菌等感染的快速、经济和有效手段,将纯化的MARV VLP辅以佐剂免疫健康马匹,成功制备了马抗MARV高免血清和精制免疫球蛋白F（ab’）2。马抗MARV高免血清的ELISA抗体效价可达1:20480,中和抗体效价可达1:640;马抗MARV IgG和精制免疫球蛋白F（ab’）2对MARV假病毒的半数效应浓度(EC50)分别为0.316 mg/mL和10 mg/mL。基于本实验室建立的狂犬病病毒SRV9株反向遗传操作平台,将MARV的G基因插入狂犬病病毒SRV9株的P-M基因之间,成功拯救获得了表达MARV G蛋白的重组狂犬病病毒rSRV9-MGP。直接免疫荧光和Western-blot鉴定结果表明:重组病毒rSRV9-MGP可成功表达MARV G蛋白。rSRV9-MGP可在BSR细胞上高效稳定复制,病毒滴度最高可达108 FFU/mL,且MARV G基因的插入不影响重组狂犬病病毒rSRV9-MGP的复制和生长。与母本毒株rSRV9相比,重组狂犬病病毒rSRV9-MGP对小鼠的致病性未增强。为评价重组病毒的免疫原性,将母本病毒rSRV9和重组病毒rSRV9-MGP灭活后,单独免疫或混合佐剂免疫成年小鼠,结果表明:重组病毒rSRV9-MGP可同时诱导机体产生抗RABV和MARV的中和抗体;PCP-II佐剂组小鼠的特异性中和抗体水平和细胞免疫应答反应均优于其他组。综上所述,本研究制备的MARV VLPs和表达MARV GP重组狂犬病病毒可成功刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制针对MARV的新型疫苗提供了技术支持和物质储备。
魏玉圆[8]（2016）在《狂犬病病毒SRV9 Ψ区缺失株的构建及拯救的研究》文中研究说明狂犬病病毒（Rabies virus,RV）是引起所有温血动物和人感染狂犬病的唯一病原体。大量研究表明该病毒的基因可在体外进行修饰、改造,并能对重组病毒进行拯救,从而为新型RV弱毒疫苗的研究奠定基础。病毒能否成功拯救,关键在于全长感染性cDNA克隆的构建。目前,全长感染性cDNA的构建多采用分步酶切连接,并利用脂质体转染至真核细胞的方法,操作过程繁琐和拯救效率低等缺点限制了新型RV弱毒疫苗的研制。本研究将HamRz和HdvRz序列合成到PCR引物中,利用PCR扩增将核酶序列添加到全基因组3’端5’端,按照Gibson Assembly连接方法的要求,设计带有一小段重叠序列的引物,扩增得到带有重叠序列的SRV9株各结构蛋白基因。首先应用Gibson Assembly连接法将6545 bp的大转录蛋白（large protein,L）基因分三段,一步组装至pcDNA3.1+载体,构建重组质粒pcDNA3.1-L,并在L基因前预留NheI酶切位点,然后将纯化后的,带有重叠序列的RV其它结构蛋白基因,组装至NheI限制性内切酶线性化后的重组质粒pcDNA3.1-L上,获得缺失Ψ区的SRV9株全长基组感染性cDNA（pcDNA-HamRz-NPMGL-HdvRz）。采用电穿孔技术将缺失Ψ区的全长感染性cDNA和辅助表达质粒共转染幼年叙利亚仓鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian kidney-21,BHK-21）,拯救缺失Ψ区的狂犬病病毒。通过RT-PCR、间接免疫荧光、Western-blotting和电镜观察等方法鉴定缺失Ψ区的狂犬病病毒SRV9株。实验结果表明,（1）经鉴定成功构建缺失Ψ区的狂犬病病毒SRV9株感染性cDNA克隆;（2）经证实与辅助表达质粒共转染BHK-21细胞,拯救获得了缺失Ψ区的狂犬病病毒SRV9株;（3）经酶切、RT-PCR、间接免疫荧光和Western-blotting检测的结果均表明拯救毒株能与狂犬病阳性血清发生特异性结合,拯救毒株G蛋白具有较好的抗原特性;（4）在电子显微镜下观察发现所拯救毒株具有典型的弹状病毒颗粒形态。Ψ区缺失株狂犬病病毒SRV9的拯救为进一步致弱狂犬病病毒毒力、构建狂犬病毒载体以及新型弱毒多联狂犬病疫苗的研究奠定基础。
王丽娜[9]（2016）在《表达西尼罗病毒囊膜蛋白重组狂犬病病毒的构建与应用研究》文中研究表明西尼罗病毒病是由西尼罗病毒（West Nile virus,WNV）感染引起的急性人兽共患传染病。近20年,WNV在全球扩散,不断引起人、畜疾病的暴发流行,成为世界性公共卫生问题。2011年,梁国栋等从我国新疆维吾尔自治区采集的蚊虫标本中分离到WNV,大量血清学结果证明当地不仅存在WNV感染所致疾病,还发生过WNV感染引发的病毒性脑炎流行。到目前为止,尚无获批的针对WNV的特效药物和有效疫苗。本研究利用狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）弱毒疫苗SRV9株反向遗传操作系统,通过PCR的方法,在SRV9株基因组的P与M基因间插入西尼罗病毒E基因（WNV‐E）,构建表达WNV‐E蛋白的全长质粒pD‐SRV9‐WNV‐E。将构建的全长质粒pD‐SRV9‐WNV‐E与表达狂犬病病毒核蛋白（N蛋白）、磷蛋白（P蛋白）、转录大蛋白（L蛋白）、糖蛋白（G蛋白）的辅助质粒通过脂质体共同传染BSR细胞,进行重组病毒的拯救。直接免疫荧光结果表明:成功拯救获得了具有感染活性的重组狂犬病病毒rSRV9‐WNVE。间接免疫荧光、Western‐blot、PCR等结果表明:重组病毒rSRV9‐WNVE可成功表达WNV‐E蛋白。此外,重组病毒的生长曲线表明:外源基因的表达不影响重组病毒的体外生长特性。分别将母本病毒SRV9和重组狂犬病病毒rSRV9‐WNVE经脑内注射途径接种小鼠,每天观察并对小鼠的精神状态、存活等情况进行记录,连续观察21天。结果表明:与母本病毒SRV9相比,重组狂犬病病毒rSRV9‐WNVE表达WNV‐E蛋白后对小鼠的致病性降低,呈现高度的安全性。分别将母本病毒SRV9和重组狂犬病病毒rSRV9‐WNVE以5×105TCID50/只和5×106TCID50/只的剂量通过肌肉注射途径免疫小鼠,初次免疫后两周,以相同的剂量和途径加强免疫一次,分别于一免和二免后2周采集小鼠血清,并测定血清中狂犬病病毒和WNV的抗体效价。结果表明:重组病毒免疫小鼠后,既可刺激机体产生狂犬病病毒中和抗体,也可刺激机体产生WNV特异性抗体,表明重组病毒具有很好的免疫原性。综上所述,表达WNV‐E蛋白的重组狂犬病病毒r SRV9‐WNVE对小鼠具有的良好的安全性和免疫原性,具有作为疫苗的潜力,为进一步研制西尼罗病毒病新型疫苗奠定了基础。
王园园,董晓琳,孙钰,李志萍,靳朝,夏志平[10]（2016）在《狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析》文中进行了进一步梳理利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。
二、狂犬病病毒SRV_9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、狂犬病病毒SRV_9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析（论文提纲范文）
（1）共表达RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的重组人5型腺病毒的构建及免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
（2）裂谷热病毒eGn蛋白重组狂犬病病毒及细菌样颗粒免疫原构建与实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 裂谷热病毒 |
| 1.2.1 病毒的结构蛋白与功能 |
| 1.2.2 病毒的生命周期 |
| 1.2.3 流行分布及其影响因素 |
| 1.2.4 临床症状 |
| 1.2.5 疫苗研究进展 |
| 1.3 重组狂犬病病毒载体疫苗 |
| 1.3.1 狂犬病病毒 |
| 1.3.2 狂犬病病毒载体的应用 |
| 1.4 基于GEM颗粒表面展示系统的细菌样颗粒疫苗 |
| 1.4.1 GEM颗粒 |
| 1.4.2 细胞壁结构域 |
| 1.4.3 GEM表面展示系统的应用 |
| 2 表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn的构建与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与菌种 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.2 重组病毒的拯救 |
| 2.2.3 重组病毒鉴定 |
| 2.2.4 重组病毒生长特性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组病毒rSRV9-eGn感染性克隆的构建及鉴定 |
| 2.3.2 重组病毒rSRV9-eGn的拯救与鉴定 |
| 2.3.3 一步生长曲线 |
| 2.3.4 重组病毒rSRV9-eGn的稳定性鉴定 |
| 2.3.5 重组病毒rSRV9-eGn的安全性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn免疫原性评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞与质粒 |
| 3.1.2 血清与病毒 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 溶液配制 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 293F真核细胞表达RVFV Gn head蛋白 |
| 3.2.2 免疫原的制备 |
| 3.2.3 小鼠分组及免疫 |
| 3.2.4 间接ELISA方法检测特异性IgG抗体及IgG抗体亚型 |
| 3.2.5 Western Blot方法检测特异性抗体 |
| 3.2.6 抗RVFV eGn中和抗体检测 |
| 3.2.7 抗RABV中和抗体检测 |
| 3.2.8 RABV攻毒实验 |
| 3.2.9 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 3.2.10 小鼠脾脏T淋巴细胞增殖试验 |
| 3.2.11 ELISpot方法检测小鼠脾细胞分泌IFN-γ、 IL-4水平 |
| 3.2.12 流式细胞术法检测CD4~+、CD8~+淋巴细胞及其亚型检测 |
| 3.2.13 记忆性淋巴细胞检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 293F真核细胞表达RVFV Gn head蛋白 |
| 3.3.2 间接ELISA方法检测RVFV eGn特异性IgG抗体 |
| 3.3.3 Western Blot方法检测特异性抗体 |
| 3.3.4 抗RVFV eGn中和抗体检测 |
| 3.3.5 抗RABV中和抗体检测 |
| 3.3.6 RABV攻毒实验 |
| 3.3.7 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 3.3.8 脾脏T淋巴细胞体外增殖能力检测 |
| 3.3.9 抗原刺激下脾T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的ELISpot检测结果 |
| 3.3.10 脾脏T淋巴细胞亚型分析 |
| 3.3.11 记忆性T淋巴细胞分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小节 |
| 4 GEM展示RVFV细菌样颗粒的构建与鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞与菌种 |
| 4.1.2 质粒 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 溶液配制 |
| 4.1.6 DH10 Bac感受态制备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组质粒构建与鉴定 |
| 4.2.2 重组杆粒的制备与鉴定 |
| 4.2.3 重组杆状病毒拯救 |
| 4.2.4 重组杆状病毒的鉴定 |
| 4.2.5 RVFV Gn head-PA融合蛋白的鉴定 |
| 4.2.6 GEM颗粒制备 |
| 4.2.7 RVFV Gn head-PA融合蛋白与GEM颗粒结合及鉴定 |
| 4.2.8 RVFV Gn head-PA融合蛋白锚定结合量测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的基因扩增结果 |
| 4.3.2 重组质粒鉴定 |
| 4.3.3 重组杆粒鉴定 |
| 4.3.4 观察Sf9细胞病变 |
| 4.3.5 重组杆状病毒基因组的PCR鉴定 |
| 4.3.6 RVFV Gn head-PA融合蛋白的间接免疫荧光鉴定 |
| 4.3.7 RVFV Gn head-PA融合蛋白表达形式鉴定 |
| 4.3.8 重组杆状病毒传代次数的确定 |
| 4.3.9 负载RVFV Gn head-PA融合蛋白的GEM颗粒的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小节 |
| 5 GEM展示RVFV细菌样颗粒免疫原性评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 溶液配制 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 免疫原的制备 |
| 5.2.2 小鼠分组及免疫 |
| 5.2.3 间接ELISA方法检测特异性IgG抗体及IgG抗体亚型 |
| 5.2.4 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 5.2.5 抗RVFV Gn head中和抗体检测 |
| 5.2.6 小鼠脾脏T淋巴细胞增殖试验 |
| 5.2.7 ELISpot方法检测脾细胞分泌IFN-γ、IL-4水平 |
| 5.2.8 流式细胞术法检测CD4~+、CD8~+淋巴细胞及其亚型检测 |
| 5.2.9 记忆性淋巴细胞检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 间接ELISA方法检测RVFV Gn head特异性IgG抗体 |
| 5.3.2 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 5.3.3 抗RVFV Gn head中和抗体检测 |
| 5.3.4 脾脏T淋巴细胞体外增殖能力检测 |
| 5.3.5 抗原刺激下脾脏T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的ELISpot检测结果 |
| 5.3.6 脾脏T淋巴细胞亚型分析 |
| 5.3.7 记忆性T淋巴细胞分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小节 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）表达猫衣原体momp蛋白的重组病毒构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 衣原体的研究概况 |
| 1.1 衣原体的概述 |
| 1.2 衣原体的分类 |
| 1.3 衣原体流行特点 |
| 1.4 衣原体疫苗研究进展 |
| 1.5 momp的研究进展 |
| 第二章 抗原呈递载体 |
| 2.1 狂犬病病毒载体概述 |
| 2.2 杆状病毒表达载体 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 表达猫衣原体momp蛋白的重组狂犬病病毒的构建与鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 猫衣原体momp蛋白在BEVS中的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组狂犬病毒和重组杆状病毒免疫原性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）不同毒力G蛋白狂犬病重组病毒的拯救及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 狂犬病的特征及其流行状况 |
| 1.2 狂犬病病毒的基本形态、构成和物理化学特性 |
| 1.2.1 病毒的基本形态 |
| 1.2.2 病毒的构成 |
| 1.2.3 病毒理化特性 |
| 1.3 狂犬病病毒的血清型分类 |
| 1.4 狂犬病病毒G蛋白的结构与生物学功能 |
| 1.4.1 狂犬病病毒G蛋白的结构 |
| 1.4.2 狂犬病病毒G蛋白的生物学功能 |
| 1.5 狂犬病病毒的复制 |
| 1.6 狂犬病的发病机理 |
| 1.7 狂犬病的防控 |
| 1.8 狂犬病病毒反向遗传学技术的发展 |
| 1.9 研究的目的与意义 |
| 2 实验一狂犬病病毒LBNSE株反向遗传学系统的改造及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物 |
| 2.2.2 RV全长克隆质粒pLBNSE的改造策略 |
| 2.2.3 目的基因rEP的扩增 |
| 2.2.3.1 分别扩增出组成rEP基因的3个片段 |
| 2.2.3.2 未加引物初步扩增出rEP基因 |
| 2.2.3.3 特异性引物扩增出rEP基因 |
| 2.2.4 pLBNSE质粒的大量制备 |
| 2.2.5 改造质粒r-pLBNSE的构建及鉴定 |
| 2.2.6 转染及病毒的拯救 |
| 2.2.7 重组病毒rLBNSE的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 通过Overlap PCR获取rEP目的基因结果 |
| 2.3.2 全长pLBNSE质粒酶切结果 |
| 2.3.3 全长r-pLBNSE质粒和辅助质粒酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 全长r-pLBNSE质粒测序结果 |
| 2.3.5 直接免疫荧光鉴定拯救的rLBNSE病毒 |
| 2.3.6 RT-PCR鉴定拯救的rLBNSE病毒 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二狂犬病重组质粒的构建及重组病毒的拯救 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物 |
| 3.2.2 RV全长重组克隆质粒的构建策略 |
| 3.2.3 pcDNA3.1-SfG和pcDNA3.1-CfG质粒的构建 |
| 3.2.4 重组质粒r-pLBNSE-SfG和r-pLBNSE-CfG的构建 |
| 3.2.5 转染及病毒的拯救 |
| 3.2.6 重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PCR扩增CVS11-flag-G和SAD-flag-G目的基因 |
| 3.3.2 pcDNA3.1质粒酶切结果 |
| 3.3.3 pcDNA3.1-SfG和pcDNA3.1-CfG质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3.4 PCR扩增PB-CfG和PB-SfG目的基因 |
| 3.3.5 改造后的全长r-pLBNSE质粒酶切处理 |
| 3.3.6 重组质粒r-pLBNSE-SfG和r-pLBNSE-CfG的酶切鉴定结果 |
| 3.3.7 重组质粒r-pLBNSE-SfG和r-pLBNSE-CfG的测序结果 |
| 3.3.8 直接免疫荧光鉴定重组病毒 |
| 3.3.9 RT-PCR鉴定重组病毒及测序结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 实验三重组狂犬病病毒生物学特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组病毒的传代 |
| 4.2.2 重组病毒的滴度测定 |
| 4.2.3 重组病毒BSR细胞传代稳定性测定 |
| 4.2.4 重组病毒体外生长曲线测定 |
| 4.2.5 重组病毒糖蛋白表达量测定 |
| 4.2.6 重组病毒致病性测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒BSR细胞传代稳定性 |
| 4.3.2 重组病毒体外生长曲线 |
| 4.3.3 重组病毒糖蛋白表达量 |
| 4.3.4 重组病毒致病性 |
| 4.4 讨论 |
| 5 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（5）狂犬病病毒M和L蛋白单克隆抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 RABV概述 |
| 2 RABV病原特性 |
| 3 RABV基因组结构及编码的蛋白 |
| 3.1 RABV基因组的结构 |
| 3.2 狂犬病病毒的复制和转录 |
| 3.3 编码的病毒蛋白及其功能 |
| 4 RABV的检测 |
| 4.1 病原学检查 |
| 4.2 荧光抗体病毒中和实验检测方法(FAVNT) |
| 4.3 直接免疫荧光检测(FAT) |
| 4.4 酶联免疫实验(Enzyme-Linked Immunoassay) |
| 4.5 核酸检测 |
| 4.6 狂犬病的快速酶免疫诊断(RREID) |
| 4.7 直接快速免疫组化法 |
| 5 单克隆抗体技术 |
| 5.1 单克隆抗体技术概述 |
| 5.2 单克隆抗体对RABV抗原表位研究 |
| 5.3 单克隆抗体在RABV分型研究 |
| 5.4 单克隆抗体在RABV治疗研究 |
| 5.5 M蛋白单克隆抗体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 狂犬病病毒M蛋白的原核表达与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 M基因的扩增与克隆 |
| 2.2 his-M蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.3 his-M蛋白的抗原性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与试剂 |
| 1.2 免疫动物 |
| 1.3 间接ELISA法检测小鼠抗体效价 |
| 1.4 细胞融合 |
| 1.5 杂交瘤细胞的建立 |
| 1.6 腹水制备 |
| 1.7 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 免疫小鼠血清中抗体水平检测 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.3 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 RABV M蛋白抗原表位的精细鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒与试剂 |
| 1.2 M蛋白基因截短体引物设计及合成 |
| 1.3 截短体原核表达载体的构建 |
| 1.4 目的蛋白的表达与分析 |
| 1.5 Western blotting鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 1.6 IFA鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 1.7 不同分枝RABV M蛋白表位序列氨基酸的比对 |
| 1.8 氨基酸突变对表位抗原性的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 M蛋白截短 |
| 2.2 截短体蛋白的表达 |
| 2.3 western blotting鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 2.4 IFA鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 2.5 基于M蛋白的RABV进化树 |
| 2.6 M蛋白氨基酸比对 |
| 2.7 M蛋白氨基酸突变 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 狂犬病病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒与试剂 |
| 1.2 单克隆抗体的纯化 |
| 1.3 单抗的辣根过氧化物酶(HRP)标记 |
| 1.4 双抗体夹心ELISA检测方法的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单抗纯化 |
| 2.2 双抗体夹心ELISA检测方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 狂犬病病毒L蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与试剂 |
| 1.2 抗原的制各 |
| 1.3 免疫动物 |
| 1.4 间接ELISA法检测小鼠抗体效价 |
| 1.5 细胞融合 |
| 1.6 杂交瘤细胞的建立 |
| 1.7 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 L基因的扩增与克隆 |
| 2.2 his-L蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.3 免疫小鼠血清中抗体水平检测 |
| 2.4 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录：常用试剂的配制 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果目录 |
（6）狂犬病疫苗株与减毒疫苗株的免疫及病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 狂犬病病毒的基因组结构及基本特性 |
| 1.2 狂犬病流行病学 |
| 1.3 狂犬病发病机理 |
| 1.4 狂犬病的临床症状 |
| 1.5 狂犬病疫苗的研究 |
| 1.6 犬瘟热病毒概述 |
| 1.7 犬瘟热流行病学 |
| 1.8 犬瘟热发病机理 |
| 1.9 犬瘟热的临床症状 |
| 1.10 犬瘟热疫苗的研究 |
| 1.11 犬细小病毒概述 |
| 1.12 犬细小流行病学 |
| 1.13 犬细小发病机理 |
| 1.14 犬细小的临床症状 |
| 1.15 犬细小疫苗的研究 |
| 1.16 本论文研究目的及意义 |
| 第2章 基因重排减毒狂犬病病毒的拯救及遗传稳定性的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救及其毒力的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 狂犬病毒减毒苗、二联苗、三联苗对小鼠的免疫效果及病理学评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 狂犬病毒减毒苗、二联苗、三联苗对犬口服免疫效果的初步研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 常用试剂的配制 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 马尔堡病毒及马尔堡出血热 |
| 1.1 马尔堡病毒分类及形态结构 |
| 1.2 马尔堡病毒的基因组 |
| 1.3 马尔堡出血热流行病学 |
| 1.4 马尔堡出血热疫苗 |
| 1.5 马尔堡出血热防控与治疗 |
| 第2章 病毒样颗粒研究进展 |
| 2.1 病毒样颗粒 |
| 2.2 VLPs结构分类 |
| 2.3 病毒样颗粒生产系统 |
| 2.4 丝状病毒属病毒样颗粒的研究进展 |
| 第3章 狂犬病病毒载体概况 |
| 3.1 狂犬病病毒载体 |
| 3.2 以狂犬病病毒为载体的其他传染性疾病疫苗 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 马尔堡病毒病毒样颗粒的构建与鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 马尔堡病毒病毒样颗粒免疫原性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 马抗马尔堡病毒精制抗体的制备与评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）狂犬病病毒SRV9 Ψ区缺失株的构建及拯救的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 狂犬病概述 |
| 1.2 狂犬病病毒概述 |
| 1.3 RV载体概述 |
| 1.4 反向遗传学操作技术的概述 |
| 1.5 Gibson Assembly连接法概述 |
| 1.6 常用细胞转染技术的概述 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 第2章 利用Gibson Assembly法构建狂犬病病毒SRV_9 Ψ区缺失株的感染性cDNA |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 狂犬病病毒SRV_9 Ψ区缺失株的拯救及鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 常用试剂及配制 |
| 附录Ⅱ 质粒构建图谱 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）表达西尼罗病毒囊膜蛋白重组狂犬病病毒的构建与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 西尼罗病毒病概况 |
| 第二章 狂犬病病毒概述及狂犬病病毒载体的应用 |
| 2.1 狂犬病病毒概述 |
| 2.2 狂犬病病毒反向遗传学概述 |
| 2.3 狂犬病病毒载体的研究进展及应用 |
| 2.3.1 狂犬病病毒载体的安全性问题 |
| 2.3.2 狂犬病病毒结构蛋白作为携带外源抗原的载体 |
| 2.3.3 狂犬病病毒载体疫苗在预防其他疾病中的应用 |
| 2.3.3.1 狂犬病病毒载体在HIV-1 疫苗研究中的应用 |
| 2.3.3.2 狂犬病病毒载体在SARS疫苗研究中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 表达WNV E蛋白的重组狂犬病病毒全长质粒的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 WNV E基因PCR扩增结果 |
| 1.2.3 重组质粒pD-SRV9-WNV-E双酶切结果 |
| 1.2.4 测序结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 重组狂犬病病毒的拯救及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 表达外源基因的选择 |
| 2.3.2 影响转染效率的因素 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 重组狂犬病病毒的安全性及免疫原性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
（10）狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、质粒、菌株、细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 RT-PCR引物设计及合成 |
| 1.4 SRV9株细胞毒基因组RNA的提取及SRV9 G蛋白基因的RT-PCR扩增 |
| 1.5 SRV9株G蛋白基因的克隆与鉴定 |
| 1.6 昆虫细胞表达重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual的构建 |
| 1.7 昆虫细胞表达重组穿梭质粒SRV9G-Bac-mid的构建 |
| 1.7.1 重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual电转化DH10Bac细胞 |
| 1.7.2 重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid的鉴定 |
| 1.8 重组杆状病毒的拯救及鉴定 |
| 1.9 Western Blot检测SRV9 G蛋白的表达 |
| 1.1 0 SRV9 G蛋白氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SRV9 G蛋白基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 重组克隆质粒SRV9G-p MD18T的鉴定 |
| 2.3 重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual的鉴定 |
| 2.4 重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid的鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒的获得及鉴定 |
| 2.6 SRV9 G蛋白表达的Western blot鉴定 |
| 2.7 SRV9 G蛋白基本性质分析 |
| 2.7.1 G蛋白理化性质 |
| 2.7.2 G蛋白跨膜螺旋、信号肽及亚细胞定位预测 |
| 2.7.3 G蛋白中蛋白质相互作用位点及功能位点预测 |
| 2.7.4 G蛋白的亲水性和疏水性区域分析 |
| 3 讨论 |
四、狂犬病病毒SRV_9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析（论文参考文献）
- [1]共表达RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的重组人5型腺病毒的构建及免疫研究[D]. 赵忠欣. 山东大学, 2020(02)
- [2]裂谷热病毒eGn蛋白重组狂犬病病毒及细菌样颗粒免疫原构建与实验免疫研究[D]. 张胜男. 东北林业大学, 2020(01)
- [3]表达猫衣原体momp蛋白的重组病毒构建及免疫原性研究[D]. 阮晓凤. 吉林农业大学, 2019(03)
- [4]不同毒力G蛋白狂犬病重组病毒的拯救及生物学特性研究[D]. 马子鹏. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [5]狂犬病病毒M和L蛋白单克隆抗体的制备及应用[D]. 刘杰. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]狂犬病疫苗株与减毒疫苗株的免疫及病理学研究[D]. 文兆海. 新疆农业大学, 2018(05)
- [7]马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究[D]. 盖微微. 吉林大学, 2018(12)
- [8]狂犬病病毒SRV9 Ψ区缺失株的构建及拯救的研究[D]. 魏玉圆. 新疆农业大学, 2016(06)
- [9]表达西尼罗病毒囊膜蛋白重组狂犬病病毒的构建与应用研究[D]. 王丽娜. 吉林农业大学, 2016(02)
- [10]狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析[J]. 王园园,董晓琳,孙钰,李志萍,靳朝,夏志平. 吉林农业大学学报, 2016(02)
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