一、CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS（论文文献综述）
杨瑞[1]（2020）在《表达猪圆环病毒2型Cap蛋白稳转CHO细胞系的建立及免疫增强剂的开发》文中认为猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2,PCV2）被认为是猪圆环病毒相关疾病（Porcine Circovirus Associated Disease,PCVAD）的主要传播病原体之一,每年给我国乃至全球仔猪养殖和育种业的发展造成巨大的经济损失。目前,疫苗接种是控制和预防PCVAD的主要措施。研究表明,衣壳蛋白（Cap）是PCV2的最具免疫原性的蛋白,与PCV2的感染和免疫力密切相关。因此,Cap蛋白是开发PCV2疫苗的潜在靶蛋白。为了获得高效表达PCV2 Cap蛋白的稳转细胞株,本研究首先以荧光素酶（Luciferase,Luc）为报告基因,筛选不同的启动子和信号肽对其在CHO-K1细胞中表达的影响,在此基础上,构建可表达PCV2 Cap蛋白的真核表达载体,转染CHO-K1细胞后筛选得到稳定表达Cap蛋白的细胞株。另外,为了提高Cap蛋白的免疫原性,本研究也探讨了脑膜炎球菌外膜蛋白PorB对其免疫原性的增强作用。将CMV和CAG 2种启动子和5种不同来源的信号肽（人血清白蛋白、氮杂环蛋白前体蛋白、小鼠信号肽Ig Gκ、人干扰素-α2、人白细胞介素-2）分别与Luc报告基因进行融合构建重组真核表达载体,转染CHO-K1细胞后通过化学发光仪检测Luc蛋白的表达量,最终筛选出CAG启动子及人干扰素-α2信号肽（命名为SP4）可显着增加Luc蛋白的表达,结果证明了CHO细胞高效表达体系的成功建立。最后,将经密码子优化后的Cap基因构建到p CDNA3.1-CAG-SP4-Luc真核表达载体中,构建重组质粒p CDNA3.1-CAG-SP4-Cap,通过脂质体法转染CHO-K1细胞,G418筛选获得单克隆,经有限稀释法扩大培养后得到能够高效表达Cap蛋白的细胞株SP4-1,并分离纯化该细胞株扩大培养后的蛋白,得到的重组Cap蛋白进行Western bloting鉴定。结果表明,Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中稳定表达。将收集的重组Cap蛋白通过镍柱进行纯化,使用BCA法测定蛋白浓度为637±0.165mg/L。最后,以原核表达系统制备的重组脑膜炎球菌外膜蛋白PorB为免疫增强剂免疫动物,结果证明,经CHO-K1细胞表达的Cap蛋白具备良好的免疫原性,且原核表达的重组PorB蛋白具有显着的免疫增强作用。本研究为开发新型有效防治猪圆环病毒的疫苗及相关佐剂奠定基础。
张赞[2]（2019）在《递送柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白与IL-18共表达核酸疫苗侵入型乳酸菌免疫保护效果研究》文中指出鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美耳属（Eimeria）一种或多种球虫所引发的原虫病,呈全世界性分布。该病危害性大、感染率高,是造成世界范围内家禽业严重经济损失的原因之一。目前该病的防治仍然以化学药物和活疫苗为主,但由此导致的药物残留、耐药性及新抗虫药开发困难等问题越来越严峻。活疫苗存在毒力返强、散毒等安全隐患,所以人们更加重视新型安全疫苗的研发。DNA疫苗具有安全、稳定、易制备的优点,并通常将细胞因子作为佐剂与DNA疫苗共同免疫机体,从而达到增强疫苗免疫效果的目的。乳酸菌作为益生菌具有定殖力强、易于培养、免疫调节等特点,可成为DNA疫苗的理想活载体,通过口服的方式将DNA疫苗递送到机体细胞内,从而引发局部或全身的免疫反应。为了提高乳酸菌对DNA疫苗的递送效率,本研究以新型的真核质粒pValac为表达载体,柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella,E.tenella）的微线体蛋白2（EtMIC2）为保护性抗原,以鸡白介素18（ChIL18）作为佐剂构建出重组质粒,由表达金黄色葡萄球菌纤连蛋白A（FnBPA）的侵入型乳酸菌为载体递送到鸡体内,提高DNA疫苗的递送效率,并对机体产生的免疫水平及抗E.tenella保护效果进行评价。具体研究内容及结果如下:（1）表达EtMIC2蛋白和ChIL18的DNA疫苗构建及体外验证参考GenBank登录的EtMIC2及IL18序列,优化并常规合成基因EtMIC2-IL18,通过PCR扩增EtMIC2和EtMIC2-IL18基因片段,并分别连接至pValac载体上,双酶切和碱基序列测定结果表明重组质粒pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18构建成功。转染HEK-293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测EtMIC2和IL18蛋白在细胞质中表达。（2）携带DNA疫苗的侵入型乳酸菌的构建及体外侵入能力检测将pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18两种真核质粒,转化至NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA重组乳酸菌感受态中,构建出pValac-EtMIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA四种菌株,经SPPIP诱导剂诱导表达后,通过Western blot检测FnBPA蛋白的表达情况,结果表明转入真核质粒后的侵入型乳酸菌的FnBPA蛋白成功表达。通过与分离的CEF细胞共培养2个小时,洗涤后,室温裂解10min,最后进行菌落计数并计算细胞侵袭率。结果显示pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA菌株对CEF细胞的侵袭率达到0.25%,而pValac-EtMIC2/pSIP409作为对照菌株的侵袭率仅为0.09%。同样pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA菌株对CEF细胞的侵袭率为0.15%,pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409菌株的侵袭率为0.08%。表达FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌的细胞侵袭率显着高于非侵入型乳酸菌（P<0.001）。（3）侵入型乳酸菌对雏鸡免疫水平的影响及抗E.tenella保护效果评价健康的1日龄肉雏鸡,随机分为6组,每组20只,分别为生理盐水组（GroupI）、攻虫组（GroupII）、pValac/pSIP409组（GroupIII）、pValac-EtMIC2/pSIP409组（GroupIV）、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA组（GroupV）、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA组（GroupVI）。在1、3、5、12、14、16日龄进行口服免疫,每只免疫剂量为1×109CFU/200μL,并在30日龄进行攻虫（GroupI除外）,攻虫剂量为5×104个/只。对每组雏鸡外周血CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴细胞的发育情况、外周血中淋巴细胞增殖能力、肠道刮取物分泌型抗体SIgA、血清中特异性抗体及细胞因子含量进行检测。并对感染球虫一周后雏鸡的相对增重率、卵囊排出量、盲肠病变积分及抗球虫指数等指标进行统计。动物试验结果表明,在30d（攻虫前）,与GroupI相比,GroupIV、GroupV、GroupVI雏鸡外周血中的CD3+CD4+T淋巴细胞含量显着较高（P<0.05）;在38d（攻虫后）,GroupV、GroupVI雏鸡外周血中的CD3+CD4+T淋巴细胞含量均显着高于GroupIII（P<0.01）。同样,在30d测得GroupVI雏鸡外周血中的CD3+CD8+T淋巴细胞含量约35%,显着高于GroupIII（P<0.05）;在38d测得GroupIV、GroupV、GroupVI均显着高于GroupIII（P<0.001）,其中GroupVI含量最高约为43%。对各组雏鸡外周血淋巴细胞增殖能力进行检测,结果表明,攻虫前后GroupVI增殖能力均最强,在30d时GroupVI刺激指数约为1.3,显着高于GroupIII（P<0.001）;在38d时,GroupVI刺激指数约为1.5,同样其增殖水平显着高于GroupIII（P<0.001）。本研究在攻虫前对各组雏鸡血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-18的含量进行了检测,其中GroupVI雏鸡的IFN-γ含量较其他免疫组高,显着高于GroupIII（P<0.01）。GroupVI中IL-18的含量显着高于各组（P<0.001）。GroupVI肠道刮取物中SIgA的分泌量最高,且显着高于GroupV（P<0.05）。攻虫后,GroupV、GroupVI平均体重增长水平较高,相对于GroupI相对增重率分别为79.66%、84.75%。GroupIV、GroupV、GroupVI粪便中卵囊排出量明显减少,其相对于GroupII卵囊减少率分别为67.73%、69.75%、76.16%。攻虫一周后观察发现GroupIV、GroupV、GroupVI雏鸡的盲肠病变明显减轻,平均计分分别为1.3、1.1、0.9。最后得出各组ACI值,GroupIV、GroupV、GroupVI分别为162.27、167.66、174.75,均能达到良好的抗球虫效果,GroupVI效果最佳。本研究基于表达FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌为载体,携带pValac-EtMIC2-IL18真核质粒递送到宿主体内,并能提高机体的体液免疫和细胞免疫,增强机体对球虫的抵抗能力。以侵入型乳酸菌为载体递送DNA疫苗的方式为球虫的防治提供了新思路和新方法。
李训良[3]（2018）在《猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究》文中研究指明猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）能够引发猪急性高度接触性的消化道传染病,即猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）。感染动物以呕吐、严重的腹泻、脱水为主要症状,而且经常同其他疾病混合发生,所有品种和年龄的猪对此病毒都易感,新生仔猪尤为严重,随着日龄的增大死亡率逐渐下降。猪传染性胃肠炎病毒包膜突起形状的S蛋白在病毒表面,介导粘合到宿主受体和膜融合,其可以分为S1和S2区域,S蛋白是病毒中和抗体产生的一个主要的靶点。自上世纪90年代以来,TGEV导致了全球性的严重的经济损失,一些疫苗制备技术被发展和商业化,目前国内主要为猪传染性胃肠炎病毒-猪轮状病毒-猪流行性腹泻病毒三价弱毒疫苗,但存在免疫效果不确实和返祖等缺陷,故TGEV新型高效疫苗研究尤为迫切,其中以新型基因工程疫苗的研究和开发为热点。猪白细胞介素12（Porcine interleukin 12,pIL-12）是一种重要的多功能免疫调节细胞因子,IL-12能诱导干扰素γ（Interferonγ,IFN-γ）产生并且引发CD4+T细胞分化为Th1（T辅助细胞）型细胞,IL-12有多种重要的生物学功能,它关系到早期非特异性的先天免疫和之后的特异性抗原获得性免疫,可作为免疫佐剂提高疫苗的免疫保护效果。本研究对辽宁省抚顺市60个规模猪场进行了TGEV感染分布情况的调查,对有腹泻症状的仔猪共采集了300份样品,通过RT-PCR方法对TGEV的感染情况进行了调查,并对TGEV关键基因S基因进行了生物信息学分析。通过分子生物学技术利用pVAX1载体,分别构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-（p40）-（p35）。利用脂质体转染技术将两种质粒转入BHK细胞中,通过免疫荧光试验检测其蛋白表达。选取20头7日龄无TGEV病原感染和抗体的仔猪随机分成5组,分别是pIL-12+TGEV-S1组、TGEV-S1组、pIL-12组、pVAX1组、空白组,从7日龄开始,用重组真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-（p40）-（p35）免疫,每次免疫间隔14天,共免疫3次,每间隔7天采集血液样品,并于第三次免疫后7天进行攻毒,攻毒后5天捕杀猪只并采集血液及组织学样品。采集样品通过淋巴细胞增殖试验、流式细胞检测技术、酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、组织冰冻切片荧光检测和HE染色等方法,分别对不同组别及不同日龄仔猪样品进行了细胞免疫和体液免疫及免疫保护相关指标的检测。试验结果表明,辽宁省抚顺市60个规模猪场的300份样品,共检测出阳性样品3份,通过对S基因的克隆测序、结构分析、序列同源性分析、系统进化树分析和蛋白结构分析,与其他17个参考毒株的S基因相比较,有5处核苷酸的变异,造成了4处氨基酸的变化,有1处氨基酸的变化导致了蛋白质二级结构的改变,与WH1、Almazan毒株S基因的同源性和亲源性最高,属于Purdue毒株分支,与目前普遍流行的毒株相近。试验构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-（p40）-（p35）,将两种质粒转染BHK细胞后,所表达的蛋白通过免疫荧光试验都能够被其特异性多克隆抗体检测到明显的荧光信号。动物免疫保护试验,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1两种重组表达质粒的免疫组,在不同的免疫指标检测中,有不同程度的升高,相比较于空白组和pVAX1组有明显的差异,其中pIL-12+TGEV-S1组的结果尤为显着。在淋巴细胞增殖试验、TGEV S1特异性IgG抗体检测、TGEV中和抗体检测中,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与TGEV-S1组相比较差异显着（p<0.05）,与空白组、pVAX1组、pIL-12组相比较差异极显着（p<0.01）。在CD4+T淋巴细胞检测、CD8+T淋巴细胞检测、IFN-γ细胞因子检测、细胞毒性T淋巴细胞检测中,pIL-12组、TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组都有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与空白组、pVAX1组相比较差异极显着（p<0.01）。肠道组织病毒分布的免疫荧光检测和病理组织学检查表明,TGEV-S1组和对照组之间差异明显,其中pIL-12+TGEV-S1联合免疫组病毒含量更少,组织损伤更轻。说明pIL-12作为免疫佐剂在仔猪机体免疫应答方面有辅助增强的作用,能够提高pVAX1-TGEV-S1真核表达质粒的免疫保护效果。本研究首次将TGEV S1基因与pIL-12基因的重组真核表达质粒共同免疫仔猪,观察仔猪免疫应答水平及免疫保护效果,结果显示佐剂pIL-12与TGEV S1抗原基因的联合使用,能够明显的促进机体的细胞免疫应答,也能够在体液免疫应答中发挥一定作用,从而提高机体免疫水平对抗病毒感染。为新型核酸疫苗和细胞因子免疫佐剂免疫作用和免疫机理的深入研究进一步提供理论依据。
刘金朋[4]（2011）在《猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因DNA疫苗的构建与鼠体内免疫效力观察》文中认为猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）为圆环病毒科圆环病毒属成员,PCV分为PCV1和PCV2两种基因型。PCV2具有致病性,不仅与近年来在世界各国普遍发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）密切相关,而且还与猪皮炎肾病综合征、仔猪先天性震颤以及母猪繁殖障碍等疾病有关。PCV2除引起猪体发生原发感染甚至死亡之外,还侵害猪的淋巴系统,从而导致免疫抑制,继发感染猪猪繁殖与呼吸综合征、猪流感、猪瘟、猪伪狂犬等病毒性传染病,使疫情加重,已给全球养猪业造成相当严重的经济损失。目前国内外能有效防制本病的疫苗较少,因此,研制安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除PCV2。自从1990年出现基因免疫以来,已有许多病毒的保护性抗原基因被导入各种动物体内,产生了很好的免疫效果。DNA疫苗作为第3代疫苗,由于有着其独特的优点而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗在机体内表达量低,单独使用所诱导机体产生的抗体水平,还不足以完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击。怎样增强免疫保护效果成为目前DNA疫苗研究的关键。许多研究表明,IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-18等细胞因子能增强抗原的免疫原性。真核双表达载体pIRES是双顺反子结构,具有两个多克隆位点（MCS A和B）。本研究根据真核表达载体pIRES启动子下游的MCS A的酶切位点和PCV2临颍株（LY株）全基因组核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增PCV2 ORF2全基因。将XhoⅠ与MluⅠ双酶切获得的ORF2基因片段克隆到同样处理的真核表达载体pIRES中,构建重组真核表达质粒pIRES-ORF2。根据真核表达载体pIRES启动子下游的MCS B的酶切位点和重组质粒pGEM-T-PIL18、pGEM-T-PIL2中猪IL-18（PIL-18）、猪IL-2（PIL-2）基因核苷酸序列,设计、合成2对引物,扩增PIL-18、PIL-2全基因。将SalⅠ与NotⅠ双酶切获得的PIL-18、PIL-2基因片段分别重组到真核表达载体pIRES和pIRES-ORF2的MCS B酶切位点SalⅠ与NotⅠ之间,构建重组真核表达质粒pIRES-PIL18、pIRES-PIL2、pIRES-ORF2/PIL18和pIRES-ORF2/PIL2。为测定构建的编码PCV2衣壳蛋白ORF2基因与猪IL-18或猪IL-2基因联合免疫的试验效果,将pIRES-ORF2、pIRES-PIL18、pIRES-PIL2、pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2分别肌肉接种免疫6周龄雌性昆明小鼠,两周后加强免疫一次。二免后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鼠的体液免疫及细胞免疫水平。二免疫后第1周用PCV2强毒进行攻击。结果显示,pIRES-ORF2、pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2免疫组均能诱导鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,其中pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2免疫组的ELISA抗体水平和T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于单独pIRES-ORF2免疫组（P<0.01）,能抵抗PCV2强毒的攻击。表明细胞因子能明显增强PCV2 DNA疫苗的免疫原性。
王鹤[5]（2011）在《HPV58mE6E7融合基因疫苗构建及其免疫效果的研究》文中研究表明子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。据世界范围内统计,每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例,其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年有新发病例约13.15万,占世界宫颈癌新发病例总数的28.8%。近10余年来以大规模人群为基础的流行病学资料显示：在99%以上的宫颈癌中存在HPV DNA, HPV感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素。由于几乎所有宫颈癌细胞中都有HPV DNA和病毒转化蛋白的表达,HPV病毒蛋白可作为一种抗原刺激机体产生针对HPV的免疫反应,这就促使人们希望通过疫苗的方法来治疗和预防宫颈癌。由于各型HPV之间没有交叉保护作用而HPV基因型的分布又存在地域差异,并且目前尚无关于广西地区宫颈癌HPV感染分子流行病学的详细报道。为使本地区疫苗研制更具有针对性,我们对广西地区HPV感染情况、基因型分布以及感染率高的HPV基因型病毒负载量进行了调查,拟提供一份比较可信的的资料,为广西HPV疫苗研制提供有力的依据。我们采用以PCR测序为基础的方法检测了135例宫颈癌确诊病人的宫颈组织DNA。结果显示：133例宫颈癌病人感染了HPV,感染率98.52%。感染HPV16、18、31、33、35、45、52、58、59型的患者分别为125、76、17、0、0、1、2、63、5例,感染率分别为：93.98%、57.14%、12.78%、0、0、0.75%、1.50%、47.37%、3.76%,其中感染率排在前三位的是16、18和58型。通过real-time Q-PCR对HPV16、18和58型进行定量检测,三者的病毒负载量均值分别为7.89×109、9.55×103和2.38×10。HPV16型的病毒负载量明显高于18和58型（P值<0.05）,而HPV18型的病毒负载量与58型比较无显着差异（P值>0.05）。由于HPV58型在广西的感染率非常高,因此,研制HPV58型疫苗非常必要。HPV58 E6和E7基因作为癌转化蛋白,能在HPV58（+）肿瘤中将病毒DNA整合到细胞染色体中并持续表达E6、E7蛋白,使宿主细胞向恶性方向转化。尽管如此,E6和E7蛋白作为持续存在病毒抗原,却能刺激机体产生较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL。因此,E6、E7作为一种较理想的肿瘤相关抗原,适用于免疫治疗和预防与HPV58感染导致的宫颈癌的免疫治疗,但前提是必须消除E6、E7基因的转化活性以保证疫苗的安全性。因此,我们在构建疫苗之前,对E6和E7基因的6个转化活性位点进行了点突变,以消除转化活性而保留免疫原性。在证实已消除了HPV58mE6E7（突变后）融合基因转化活性的基础上,将其与人IgG Fc段融合在一起形成HPV58mE6E7-Fc,在其前端加上信号肽,后端加上膜锚定蛋白GPI,使上述肿瘤抗原能够锚定在细胞膜上表达。最后将sig-HPV58mE6E7Fc-GPI片段插入我室前期构建的能够融合表达GM-CSF和B7.1蛋白的真核表达载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游,构建了PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗。使该疫苗在表达上游融合抗原的同时,又能表达下游的GM-CSF和B7.1分子,以此来增进疫苗的协同免疫作用。随后,我们又构建了稳定表达HPV58E6E7融合基因的小鼠黑色素瘤B16-HPV58E6E7细胞系,原核表达并纯化了HPV58E6E7-GST融合蛋白抗原,为后续动物实验奠定基础。动物实验中,我们采用肌肉注射加在体局部电脉冲的方法,将前期构建的P VAX 1-HP V58mE6E7FcGB融合基因疫苗免疫C57BL/6小鼠。结果表明,经疫苗免疫后的小鼠,对HPV58E6E7（+）肿瘤的攻击具有免疫保护作用。在抗肿瘤移植保护实验中,疫苗组小鼠皮下接种的成瘤潜伏期时间长于对照组（P<0.05）。在肿瘤生长抑制实验中,疫苗组小鼠肿瘤生长速度较对照组明显减慢,最终使小鼠生存期延长,平均瘤重低于对照组（P<0.05）。研究结果还证实经疫苗免疫的小鼠,可诱发血清特异性抗体,抗体滴度最高可达1：25600,与对照组比较,差异有显着性（P<0.05）。ELISPOT可以检测到重组抗原HPV58E6E7-GST蛋白诱导的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞,疫苗组小鼠ELISPOT的斑点数明显多于单独抗原组（P<O.05）,说明HPV58mE6E7融合基因辅以人IgG Fc段、GM-CSF和B7.1等佐剂后,可明显增强HPV58mE6E7融合基因的免疫原性,加强其细胞免疫。通过LDH法,我们还检测到PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗杀伤B16-HPV58E6E7细胞的CTL反应最高达45%。说明经该疫苗免疫后的小鼠能够产生有效的体液免疫和细胞免疫。在一定程度上保护免疫小鼠免受B16-HPV58E6E7细胞（1～2×10。）的攻击。为提高疫苗的免疫效果,我们随后将分子佐剂更换为hIL12,构建了PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL 12疫苗并实现了真核表达,准备进行动物实验。总之,我们在对广西HPV感染分子流行病学调查的基础上构建并表达了的PVAX1-HPV58mE6E7FcGB融合基因疫苗,对免疫后小鼠能够产生有效的体液免疫和细胞免疫,可以作为HPV58（+）宫颈癌及其癌前病变的免疫治疗的候选疫苗,对于清除HPV58型感染相关的肿瘤细胞、阻止病变的发展将有一定的临床价值。
孔娜[6]（2011）在《mChIL-18基因与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacTM Dual中的共表达及其免疫原性研究》文中研究指明白细胞介素18（Interleukine-18, IL-18）是一种多效细胞因子,具有强烈的IFN-γ诱生能力,对机体起着重要的免疫调节和保护作用,在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力,因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达,从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗;由于鸡IL-18（ChIL-18）基因发现得比较晚,而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道,且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能,因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTM Dual载体含有PH启动子和p10启动子,可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。His标签的引入为重组蛋白的纯化提供可能,为获得大量有生物活性的蛋白开辟了新途径。传染性法氏囊病（Infectious bursal disease, IBD）是由IBD病毒（IBDV）感染雏鸡引起的以淋巴组织,特别是中枢免疫器官-法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制,使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的,但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2是IBDV的主要保护性抗原,已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2上,并且多为构象依赖性,这意味着VP2的立体结构对其中和表位的形成至关重要,与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。禽流感（Avian influenza, AI）是由AI病毒（AIV）感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI的暴发给养禽业带来了一定的经济损失,H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失,还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位,故其完全可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。本试验分别以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18质粒为模板,以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体,将mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别插入到载体的PH启动子和P10启动子的下游,构建重组转移载体质粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。将其转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性（含卡那霉素、庆大霉素和四环素）与蓝白斑筛选,用小量法提取重组杆状病毒质粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1,通过一对通用引物M13（Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点,能够从两侧扩增LacZα互补区域内的mini-attTn7位点,有利于PCR分析）进行PCR扩增鉴定。在转染试剂CellfectinII的作用下,通过脂质体介导法将纯化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1转染至草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugiperda 9,sf9）获得P1代重组杆状病毒,用P1代病毒感染sf9来扩增病毒滴度,将达到一定滴度（107108pfu/mL）的P3代重组杆状病毒感染sf9,感染72h后收获sf9细胞及培养上清,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测和间接免疫荧光试验（IFA）检测。SDS-PAGE检测显示,mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表达,即表达的蛋白是可溶性的,表达的目的条带分子量分别约为19.5 KD, 48.4 KD, 37.4 KD。IFA检测显示mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别同时在同一细胞中独立表达。采用鸡脾淋巴细胞增殖试验（MTT法）、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒（VSV）抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明,不同浓度的pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18均能够明显促进淋巴细胞的增殖,随着蛋白浓度的增加刺激转化作用逐渐增强,均当浓度为200ng/mL时,刺激转化效果最佳,增殖指数可达4.13、4.35、4.09,但随着蛋白浓度的增大淋巴细胞的增殖指数逐渐降低。VSV病毒活性抑制试验表明,当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18浓度的增加诱导产生IFN-γ的量随之增加;将不同稀释度的IFN-γ分别作用于VSV,在IFN-γ≥1×102U/mL时,具有较强的抑制效果,当IFN-γ为10 U/mL时,只能达到约50%的保护。该结果说明pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18的抗病毒活性是通过IFN-γ实现的,且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。将含有pIL18、pVP2、pVP2-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物,14d时一免,28d时二免。I组为传统疫苗组;II组为pIL18与B78减毒疫苗联合疫苗组;III为pIL18与pVP2联合疫苗组;IV组为pVP2-IL18单独免疫组;V组一免注射B78减毒疫苗,二免注射pVP2-IL18;VI组为pVP2单独免疫组;VII组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测,从统计学意义上分析处理数据。结果表明,与免疫前和阴性对照组相比,各试验组都促进CD4+和CD8+ T细胞增殖。一免后各试验组CD4+ T细胞都呈上升趋势,但一免后7d后又呈下降趋势;二免后I、III、V呈上升趋势且持续时间比较长,其中IV组CD4+ T增殖水平最高,在一免后21d、28d、35d都与其它组差异显着（P<0.05）。一免后各试验组CD8+ T细胞都呈上升趋势,但一免后7d后又呈下降趋势;二免后各实验组仍呈不同下降趋势,其中I组CD8+ T增殖水平最高,在一免后14d、21d、28d都与其它组差异显着（P<0.05）。体液免疫水平通过使用传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒检测,从统计学意义上分析处理数据。结果表明,与免疫前相比,各试验组都有较好的促进IBD抗体生成作用,抗体水平都持续增高且维持时间也较长,都在在一免后28d抗体水平达到最高;与阴性对照组相比,IV组效果最好,抗体效价最高,V组次之,然后是II组、I组、III组、VI组。攻毒试验结果表明,IV组保护率可达90%,V组次之可达80%,然后是I组和II组75%、III组为70%、VI组50%,VII组无一幸免。将含有pIL18、pHA1、pHA1-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物,7d时一免,21d时二免。I组为传统疫苗组;II组为pIL18与传统疫苗联合疫苗组;III为pHA1单独免疫组;IV组为pHA1-IL18单独免疫组;V组pIL18与pHA1联合疫苗组;VI组为pHA1单独免疫组;VII组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测。结果表明,与免疫前和阴性对照组相比,各试验组都能够明显促进CD4+和CD8+ T细胞的增殖反应。一免后各试验组CD4+和CD8+T细胞都呈上升趋势,但一免后7d后又呈下降趋势;二免后虽呈上升趋势且持续时间比较长,但增殖幅度不大,以IV组CD4+ T增殖水平最高。体液免疫水平通过使用血凝抑制试验检测。结果表明,各试验组都有较好的促进ND、H5型AI和H9型AI抗体生成作用,都是在一免后28d抗体水平达到最高;与阴性对照组相比,IV组效果最好,抗体效价最高与其它组差异显着（P<0.05）。
张博[7]（2011）在《H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定、鉴别诊断及M2e重组质粒免疫效力研究》文中认为猪流感（swine influenza, SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）引起的急性接触性呼吸道传染病。临床症状常见发烧、精神颓废、食欲减退、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、流产,并以高发病率和低死亡率为特征。猪流感是全球猪群常见疫病,虽不直接造成猪只大面积死亡,但是能严重削弱患病猪只健康状态和生产性能,延迟其上市,影响猪只的经济效益,同时其在猪只呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）中的重要地位已得到了广泛的认同,对养猪业的危害虽不及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征,但仍不容忽视。高效、准确的检测技术和安全可靠的疫苗是防控SIV的关键,也是目前猪病研究的热点方向。本研究从四川境内某发病猪场分离鉴定了一株H1N1亚型猪流感病毒,建立了基于NSl基因编码蛋白可区别野毒和灭活疫苗的间接ELISA方法,研究了自行构建含猪流感病毒三个M2e拷贝多肽序列的相关生物活性,并分别以猪IL-18和伪狂犬病病毒VP22作为分子佐剂,研究了M2e重组质粒的免疫效力和佐剂对其的影响及其与HA融合联用时的免疫保护效果。1.H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定分别用鸡胚和MDCK细胞分离鉴定了A/Swine/Sichuan/37/2009 （H1N1）猪流感病毒,对其相关生物学特性进行了初步研究；通过对其HA及NA全基因序列的测序分析,发现分别与人源H1N1亚型流感（A/Gunma/07G002/2008和A/Guangzhou/665/2006）同源性很高,核苷酸序列同源性分别达99.4%和99.7%。遗传进化树分析该毒株很可能来自于近年来流行于人群的H1N1亚型流感病毒；基于A型流感病毒NS基因保守性序列建立的RT-PCR诊断方法,具备良好的敏感性和特异性,初步证明可以在临床上快速、准确检测猪流感病毒。2.猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立克隆猪流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006（H3N2）的NS1基因,通过对其的序列分析发现多个亚型毒株NS1基因同源性较高且存在6个较保守的抗原决定簇。利用克隆获得的NS1基因片段构建原核表达载体,经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE电泳结果显示所表达的融合蛋白大小为43.5KD;Western-blotting结果显示,该蛋白可以与SIV阳性血清发生特异性的免疫反应,以NS1融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法有较高的特异性和敏感性,并能够区别野毒感染和灭活疫苗免疫猪只,证明通过NS1蛋白作为抗原建立鉴别ELISA诊断方法进一步开发成熟的试剂盒是可行的。3.M2e原、真核表达研究及生物活性研究利用重叠PCR方法构建含A/Swine/Sichuan/01/2006（H3N2）三个M2e拷贝的基因序列,分别构建原核、真核表达质粒。原核表达融合蛋白大小约为29KD,Western-blotting结果显示该蛋白可以与H3N2和H1N1亚型流感病毒阳性血清发生免疫反应,同时以此融合蛋白免疫小鼠可制备高效价（GMT=14336）的可识别受流感病毒感染的细胞外膜上的抗原成分的抗体,此抗体不具备体外中和病毒特性但是可以在小鼠体内发挥被动免疫保护效果,帮助小鼠抵御致死剂量病毒和异源毒株的攻击；M2e*3真核表达载体在体外可以在细胞内高效表达,为后续研究重组质粒免疫效力奠定基础。4.猪白介素18（IL-18）及伪狂犬VP22作为分子佐剂的初步研究构建猪IL-18真核表达质粒,该质粒可在细胞内表达IL-18（400.6±21.88μg/L）并可更好地活化小鼠脾淋巴细胞增殖的潜力（SI=3.016±0.244）;PCR扩增伪狂犬病毒Fa株VP22基因序列,经测序分析发现该基因与Kaplan和Ea株同源性很高。将VP22插入pEGFP-N3载体中EGFP基因上游,构建真核表达质粒,转染细胞后发现其能够转录及表达,继而将其与HA以融合形式构建真核表达重组质粒免疫小鼠,pVP22-HA免疫组HI抗体水平（230.4+57.24）显着高于pCI-HA免疫组（102.4+35.05）。5.M2e重组质粒免疫效力及IL-18和VP22作分子佐剂对其影响的研究分别构建pCI-M2e*3、pM2e*3-IRES-IL 18和pVP22-M2e*3真核表达重组质粒,并将它们在体外转染Vero细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光法证明它们均可转录表达。三种质粒免疫小鼠后均不同程度激发了小鼠体液免疫和细胞免疫水平,其中pM2e*3-IRES-IL18和pVP22-M2e*3多项指标均显着高于pCI-M2e*3,说明IL-18和VP22均针对M2e发挥了佐剂作用；小鼠遭受致死剂量攻毒后,三组免疫组从体重丢失率和存活保护率来看所诱导的免疫保护效果均不理想,特别是存活保护率也只有pVP22-M2e*3组仅达到了30%,而其它两组均为10%。在遭受中等剂量攻毒后,pVP22-M2e*3组相对于对照组不能减轻肺部病理损害程度；另外pVP22-M2e*3有一定异源保护能力。6.M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究将M2e*3的C端与HA基因融合构建真核表达重组质粒pM2e*3-HA,该质粒可在细胞内转录表达；pM2e*3-HA免疫小鼠后,所激发的M2e特异性抗体水平显着高于pCI-M2e83组,HI抗体水平与pCI-HA组几无差异,而中和抗体稍高于后者但不显着；小鼠经致死剂量病毒攻击后,pM2e*3-HA在体重丢失率表现理想,存活保护率达100%,在遭受中等剂量攻毒后能减轻肺脏病理损害程度；同是对于异源病毒攻击的保护也较理想。M2e与HA的联合应用为新型猪流感疫苗的研究提供了一条新的思路。
李鹏冲[8]（2011）在《IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究》文中研究说明本研究首先对IBV S1、IBDV VP2基因进行亚克隆,并利用一段linker将IBV S1、IBDV VP2基因连接后,利用真核表达载体pVAX-1,通过基因重组分别构建真核重组表达质粒pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2和pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2。体外瞬时转染实验表明,外源基因能够在细胞内进行表达,并且表达后的蛋白可以被相应的IBV S1多克隆抗体和IBDV VP2多克隆抗体识别,说明了插入的外源基因具备各自的免疫反应性,为动物体内试验提供了基础。将试验鸡分为8组,即S1组（免疫pVAX-IBV S1真核重组质粒）、VP2组（免疫pVAX-IBDV VP2真核重组质粒）、SV组（免疫pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2真核重组质粒）、SV18组（免疫pVAX-IBV S1真核重组质粒和pVAX-ChIL-18真核重组质粒）、18组（免疫pVAX-ChIL-18真核重组质粒）、YM组（免疫IBVH120疫苗和IBDV疫苗）、PBS组（免疫PBS）、pVAX组（免疫pVAX空载体质粒）。免疫过程中利用淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附试验、中和抗体试验以及利用流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞动态变化,对不同日龄的试验动物进行检测,最后用病毒攻击试验比较免疫不同质粒组别之间保护率。实验结果表明,二联核酸疫苗对两种病毒的攻击有一定的保护作用,添加了ChIL-18作为免疫佐剂增强了二联核酸疫苗的免疫效果,同时增加了核酸疫苗对病毒攻击的保护力。
王学强[9]（2010）在《鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白酵母表达条件的优化及生物活性研究》文中研究说明白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是近年发现的一种细胞因子,具有诱生IFN-γ、促进T细胞增殖分化等生物学功能,在宿主防御、抗变态反应、抑瘤抗瘤等方面具有重要作用。同时IL-18作为天然的免疫调节剂和疫苗佐剂克服了使用传统药物成本高,副作用大等缺点,是一种可以替代传统疗法的新型免疫调节剂,具有很大的应用前景。目前国内外对IL-18的研究主要集中在人和鼠等哺乳动物,而对鸡IL-18的研究,特别是增强免疫方面的报道较少。故此,本研究在对酵母表达系统中表达的鸡IL-18与新城疫病毒HN基因融合蛋白进行表达条件优化、纯化的基础上,分别对不同形式IL-18和HN联合免疫雏鸡的免疫应答情况进行了比较检测,为进一步研究鸡IL-18的生物学功能及其在疫苗中的应用奠定基础。本研究对已构建好的携带有IL-18与HN融合基因的重组酵母菌遗传稳定性进行了分析,筛选优化了其最佳表达条件,实现了融合基因在酵母中高效表达;表达蛋白经纯化、定量后分别用Western bloting、MTT等方法在体外对其生物学活性进行分析。结果表明,该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18-HN融合蛋白。其在培养液pH6.5、甲醇诱导浓度1.5%、诱导温度30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高,为400mg/L。纯化后的体外活性检测试验表明,其表达的鸡IL-18-HN融合蛋白具有明显的刺激淋巴细胞增殖的活性。同时将含有鸡IL-18-HN融合基因的重组质粒PSK-HN-IL18,应用KpnⅠ和NotⅠ双酶切,切出HN-IL18融合基因,回收并连接经相同酶切的真核表达载体pcDNA3,成功构建了含有HN和IL-18融合蛋白基因的pcDNA3-HN-IL18真核表达载体。在上述工作基础上,对鸡IL-18-HN融合蛋白免疫效果通过实验鸡进行了检测。试验共分6组,即融合蛋白组、HN蛋白组、真核表达的ChIL-18组、HN蛋白+真核表达的ChIL-18组、pcDNA3-HN-IL18组和空白对照组,每组50只,正常饲养程序饲养至8日龄时各组进行免疫接种,试验组在用颈部皮下注射方式分别进行不同类型的新城疫免疫,每只剂量50μg,空白对照组注射相同剂量的生理盐水,pcDNA3-HN-IL18组每只剂量20μg,12日龄用同样方式进行二免,分别于免疫后的第4d,7d,14d,21d,28d对其血清的抗体效价、外周血的T淋巴细胞转化水平及其NO分泌、免疫器官指数及免疫器官T淋巴细胞数和免疫器官IgG抗体生成细胞进行测定,并在26日龄时每组取20只用于动物攻毒保护试验。结果表明:IL-18和HN蛋白联合使用可以明显增强新城疫的免疫效果。与单独的HN组相比,联合免疫组试验雏鸡血清中抗体水平、T淋巴细胞转化水平和巨噬细胞分泌NO的能力显着提高,较好促进了免疫器官的生长发育和成熟,免疫器官T淋巴细胞数量和IgG抗体生成细胞数量明显增多,融合蛋白的使用进一步强化了这种作用。
邵攀峰[10]（2010）在《鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫试验》文中进行了进一步梳理鸡传染性喉气管炎（ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起鸡的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病,呈全球性流行,是危害养禽业的重要疫病之一。目前国内外防制本病普遍采用弱毒疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强,可以在鸡体内潜伏感染,而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此,研制更安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除ILT。自从1990年出现基因免疫以来,许多病毒的不同基因导入各种动物体内,产生了很好的免疫效果。DNA疫苗作为第3代疫苗,因其既有亚单位疫苗的安全性,又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低,还不能完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击。怎样增强免疫保护效果显得尤为紧迫。许多研究已经表明,细胞因子具有明显的免疫增强作用,包括IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-18等。本研究根据已发表的ILTV SA2疫苗株gB基因序列（M64927）设计、合成了1对引物,以ILTV CG株基因组DNA为模板扩增gB基因,并进行克隆和测序。根据真核表达载体pcDNA3.1（+）和ILTV gB全基因核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增ILTV gB全基因。将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切获得的gB基因片段克隆到经同样处理的真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB。根据pGEM-ChIL-18设计1对引物,上、下游引物分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,扩增IL-18全基因核苷酸序列,将该基因片段重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18。为测定构建的编码ILTV糖蛋白gB基因的重组DNA疫苗与鸡IL-18联合免疫的试验效果,将pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/IL-18分别或联合免疫21日龄SPF雏鸡,两周后加强免疫。首免后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免疫后第3周用100ELD50 ILTV强毒进行攻击。结果显示,pcDNA3.1/gB和pcDNA3.1/gB与pcDNA3.1/IL-18联合免疫组均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,其中以pcDNA3.1/gB与pcDNA3.1/IL-18联合免疫组的T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于单独pcDNA3.1/gB免疫组（P<0.01）,87%抵抗ILTV强毒的致死性攻击。本试验采用的真核双表达载体plRES,是双顺反子结构,具有两个多克隆位点。将鸡传染性喉气管炎病毒（ ILTV）的gB基因和鸡白介素18（ IL-18）基因分别或同时插入双顺反子质粒pIRES中,在启动子下游的MCS A的酶切位点Xho I与Mlu I之间插入鸡传染性喉气管炎病毒gB基因片段,在MCS B的酶切位点Sal I与Not I之间插入鸡白介素-18基因片段,获得表达ILTV gB基因的pIRES/gB质粒、表达鸡白介素-18基因的pIRES/ IL-18质粒及共表达质粒pIRES/gB/IL18。
二、CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS（论文提纲范文）
（1）表达猪圆环病毒2型Cap蛋白稳转CHO细胞系的建立及免疫增强剂的开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1 PCV2的研究进展 |
| 1.1 PCV2的基因组结构 |
| 1.2 PCV2疫苗研究现状 |
| 1.2.1 减毒疫苗和灭活疫苗 |
| 1.2.2 亚单位疫苗 |
| 1.2.2.1 DNA疫苗 |
| 1.2.2.2 嵌合PCV1-2疫苗 |
| 1.3 PCV2作用机制 |
| 2 CHO细胞表达系统简介 |
| 3 脑膜炎球菌外膜蛋白PorB免疫增强作用 |
| 3.1 脑膜炎球菌外膜蛋白PorB的结构 |
| 3.2 外膜蛋白PorB免疫增强作用 |
| 第二章 研究方案设计 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 CHO细胞高效表达体系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂耗材 |
| 2.3 相关实验试剂的制备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 CMV和 CAG启动子的筛选 |
| 3.1.1 pcDNA3.1-Luc、pcDNA3.1-CAG-Luc重组载体的构建 |
| 3.1.1.1 目的基因的扩增 |
| 3.1.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.1.1.3 连接产物的转化 |
| 3.1.1.4 重组质粒的鉴定 |
| 3.1.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.1.2 CHO-K1细胞的复苏、培养及冻存 |
| 3.1.3 重组质粒的提取和转染 |
| 3.1.3.1 无内毒素重组质粒的提取 |
| 3.1.3.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.1.4 蛋白表达的鉴定 |
| 3.2 信号肽的筛选 |
| 3.2.1 含有5 种不同信号肽的pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc重组载体的构建 |
| 3.2.1.1 基因序列及相关引物设计与合成 |
| 3.2.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.2.1.3 连接产物的转化 |
| 3.2.1.4 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.2.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.2.1 无内毒素重组质粒的提取 |
| 3.2.2.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.3 鉴定Luc蛋白表达的情况 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 含CMV和 CAG启动子的重组表达载体的鉴定 |
| 4.1.1 pcDNA3.1-Luc、pcDNA3.1-CAG-Luc重组表达载体的鉴定 |
| 4.1.2 检测Luc蛋白的表达 |
| 4.2 含有5 种不同信号肽重组表达载体pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc的相关鉴定 |
| 4.2.1 5 种不同信号肽pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc重组表达载体的鉴定 |
| 4.2.2 检测Luc蛋白的表达 |
| 5 讨论 |
| 第四章 稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白CHO细胞的建立 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap真核表达载体的构建 |
| 3.1.1 基因序列及相关引物设计与合成 |
| 3.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.1.3 连接产物的转化 |
| 3.1.4 重组质粒的鉴定 |
| 3.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.2 无内毒素重组质粒的提取 |
| 3.3 筛选稳定表达的单克隆细胞株 |
| 3.3.1 用G418方法筛选细胞株 |
| 3.3.1.1 确定CHO-K1细胞中G418最佳筛选浓度 |
| 3.3.1.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.3.1.3 单克隆细胞株筛选 |
| 3.3.2 Western bloting检测Cap蛋白表达 |
| 3.3.3 CHO-K1 细胞的总RNA提取及反转录 |
| 3.3.3.1 从细胞提取总RNA |
| 3.3.3.2 RT-PCR |
| 3.3.4 MTT检测单克隆细胞株的活力 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap重组表达载体的相关鉴定 |
| 4.1.1 PCR扩增产物鉴定 |
| 4.1.2 重组质粒的相关鉴定 |
| 4.2 Cap蛋白表达的鉴定及分析 |
| 4.2.1 CHO-K1细胞G418最佳筛选浓度确定 |
| 4.2.2 重组质粒转染CHO-K1 细胞后Cap蛋白的表达鉴定 |
| 4.2.3 CHO-K1 细胞总RNA提取及PCR鉴定 |
| 4.3 筛选高表达的单克隆细胞株 |
| 4.3.1 筛选单克隆细胞株 |
| 4.3.2 筛选后阳性细胞增殖检测 |
| 4.3.3 重组Cap蛋白的纯化 |
| 5 讨论 |
| 第五章 脑膜炎球菌外膜蛋白PorB免疫增强作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.1.3 相关实验试剂的制备 |
| 2.2 基因序列及相关引物设计与合成 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 PorB重组表达质粒的构建 |
| 3.1.1 目的基因的扩增 |
| 3.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.1.3 连接产物的转化 |
| 3.1.4 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.2 PorB蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.3 PorB蛋白表达的鉴定 |
| 3.4 小鼠免疫实验分析 |
| 3.4.1 BALB/c小鼠的免疫 |
| 3.4.2 淋巴细胞增殖试验 |
| 3.4.3 特异性抗体检测 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 重组表达载体的鉴定 |
| 4.2 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.3 不同剂量PorB蛋白在动物体内对Cap蛋白的免疫效应 |
| 4.3.1 特异性抗体的检测 |
| 4.3.2 淋巴细胞增殖水平检测 |
| 4.4 PorB蛋白在动物体内对Mhp的免疫作用 |
| 4.4.1 特异性抗体的检测 |
| 4.4.2 淋巴细胞增殖水平检测 |
| 5 讨论 |
| 第六章 PCV2 Cap蛋白免疫原性分析 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂耗材 |
| 2.3 相关实验试剂的制备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 免疫样品的制备 |
| 3.2 小鼠免疫实验分析 |
| 3.2.1 BALB/c小鼠的分组和免疫 |
| 3.2.2 免疫小鼠的血清滴度检测 |
| 3.2.3 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 特异性抗体的检测 |
| 4.2 淋巴细胞增殖水平检测 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间学术成果 |
| 致谢 |
（2）递送柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白与IL-18共表达核酸疫苗侵入型乳酸菌免疫保护效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 鸡球虫种类及生活史 |
| 1.2 鸡体抗球虫的相关免疫保护机制 |
| 1.3 鸡球虫病疫苗的种类 |
| 1.4 细胞因子作为鸡球虫DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 1.5 E.tenella微线体蛋白的研究 |
| 1.6 乳酸菌作为DNA疫苗载体的研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 携带DNA疫苗的侵入型乳酸菌的构建及体外验证 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 侵入型乳酸菌抗柔嫩艾美耳球虫保护效果评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎病毒概述 |
| 1.1.1 猪传染性胃肠炎病毒的致病机制 |
| 1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒的流行特点 |
| 1.1.3 猪传染性胃肠炎病毒的形态特征 |
| 1.1.4 猪传染性胃肠炎病毒的分类 |
| 1.1.5 猪传染性胃肠炎病毒的理化性质 |
| 1.1.6 猪传染性胃肠炎病毒的培养特性 |
| 1.1.7 猪传染性胃肠炎病毒的抗原特性 |
| 1.1.8 猪传染性胃肠炎病毒引起的机体免疫应答 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒的分子特征 |
| 1.2.1 猪传染性胃肠炎病毒的基因组结构 |
| 1.2.2 猪传染性胃肠炎病毒结构蛋白基因 |
| 1.2.3 猪传染性胃肠炎病毒的非结构蛋白基因 |
| 1.2.4 猪传染性胃肠炎病毒蛋白的表达和生物学功能 |
| 1.3 猪传染性胃肠炎疫苗 |
| 1.3.1 常规疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 1.4 白细胞介素12研究进展 |
| 1.4.1 白细胞介素12的分子结构和信号传导途径 |
| 1.4.2 白细胞介素12的生物学活性 |
| 1.4.3 白细胞介素12在疾病感染中的治疗作用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 分子生物学试剂 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 试剂的配制和贮存 |
| 2.1.5 主要实验仪器设备 |
| 2.1.6 细胞株、毒株、载体及质粒 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪传染性胃肠炎病毒分布情况调查和S基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2 重组真核表达质粒pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)和pVAX1-TGEV-S1的制备 |
| 2.2.3 重组真核表达质粒pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)和pVAX1-TGEV-S1在BHK细胞中的体外瞬时表达 |
| 2.2.4 重组真核表达质粒pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)和pVAX1-TGEV-S1的仔猪免疫保护实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪传染性胃肠炎病毒感染分布情况的调查和S基因的生物信息学分析 |
| 3.1.1 TGEV感染的RT-PCR调查 |
| 3.1.2 TGEVS基因的生物信息学分析 |
| 3.2 pVAX1-TGEVS1和pVAX1-pIL-12(p40)-linker-pIL-12(p35)真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 3.2.1 内毒素检测 |
| 3.2.2 pVAX1-TGEVS1真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 3.2.3 pVAX1-pIL-12(p40)-linker-pIL-12(p35)真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 3.3 免疫仔猪TGEV攻毒后外周血中T淋巴细胞的增殖变化 |
| 3.4 免疫仔猪TGEV攻毒后外周血中不同亚型T淋巴细胞的动态变化 |
| 3.4.1 仔猪外周血中CD4+T淋巴细胞的动态变化 |
| 3.4.2 仔猪外周血中CD8+T淋巴细胞的动态变化 |
| 3.5 免疫仔猪TGEV攻毒后外周血中细胞毒性T淋巴细胞的含量 |
| 3.6 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中抗TGEVS1IgG抗体含量的动态变化 |
| 3.7 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中TGEV中和抗体的效价 |
| 3.8 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中TGEV-IgA抗体的含量 |
| 3.9 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中IL-4和IFN-γ含量的动态变化 |
| 3.10 免疫仔猪TGEV攻毒后肠道组织内的病毒分布 |
| 3.11 免疫仔猪TGEV攻毒后肠道组织内病理组织学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TGEV感染分布情况的调查和S基因的生物信息学分析 |
| 4.2 TGEVS1核酸疫苗和免疫佐剂pIL-12的设计 |
| 4.3 重组真核表达质粒的体外瞬时转染 |
| 4.4 免疫仔猪TGEV攻毒后细胞免疫应答的动态变化 |
| 4.5 免疫仔猪TGEV攻毒后体液免疫应答的动态变化 |
| 4.6 免疫仔猪TGEV攻毒后血清中细胞因子IL-4和IFN-γ的水平 |
| 4.7 免疫仔猪TEGV攻毒后肠道组织中的病毒分布和病理变化 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（4）猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因DNA疫苗的构建与鼠体内免疫效力观察（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 试验一 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-18 基因真核共 表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-2 基因真核共 表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验三 猪圆环病毒II型病毒ORF2基因与猪白介素-18基因免疫保 护试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验四 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-2 基因免疫保 护试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 发表论文 |
（5）HPV58mE6E7融合基因疫苗构建及其免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文略写缩语列表 |
| 第一章 宫颈癌人乳头瘤病毒感染研究现况(文献综述) |
| 综述参考文献 |
| 第二章 广西地区宫颈癌患者HPV感染情况的分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 PVAX1-HPV58ME6E7FCGB融合基因疫苗的构建及真核表达 |
| 第一节 点突变前、后的HPV58型E6E7融合基因的获得 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第二节 HPV58E6E7融合基因突变前(E6E7)后M(E6E7)转化活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第三节 PVAX1-HPV58mE6E7FcGB融合基因疫苗的构建及真核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第四节 稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第五节 HPV58E6E7融合蛋白抗原的原核表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第四章 PVAX1-HPV58ME6E7FCGB融合基因疫苗抗肿瘤免疫作用的动物实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 PVAX1-HPV58ME6E7FC-HIL12融合基因疫苗构建及真核表达初步探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结 |
| 本论文的创新处 |
| 博士学习期间发表的论文题录 |
| 论文参考文献 |
| 致谢 |
（6）mChIL-18基因与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacTM Dual中的共表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 白细胞介素18 的研究进展 |
| 1.1.1 IL-18 的发现 |
| 1.1.2 IL-18 的分子结构 |
| 1.1.3 IL-18 的分布及产生 |
| 1.1.4 IL-18 的生物学功能 |
| 1.2 鸡IL-18 的研究进展 |
| 1.2.1 鸡IL-18 的发现 |
| 1.2.2 鸡IL-18 的研究 |
| 1.3 传染性法氏囊病 |
| 1.3.1 传染性法氏囊病概述 |
| 1.3.2 IBD 的结构和分子生物学特性 |
| 1.3.3 IBD 的免疫 |
| 1.3.4 亚单位疫苗的研制 |
| 1.4 禽流感研究进展 |
| 1.4.1 禽流感概述 |
| 1.4.2 AI 在世界范围内的流行 |
| 1.4.3 AI 对其它动物甚至人类的影响 |
| 1.4.4 AIV 的分子病毒学 |
| 1.4.5 HA 的生物学功能 |
| 1.4.6 AI 的免疫 |
| 1.4.7 亚单位疫苗的研制 |
| 1.5 杆状病毒表达系统研究进展 |
| 1.5.1 杆状病毒的细胞病理效应 |
| 1.5.2 杆状病毒表达载体的分类 |
| 1.5.3 杆状病毒表达载体的构建 |
| 1.5.4 重组杆状病毒的构建和筛选 |
| 1.5.5 杆状病毒表达载体系统的优越性 |
| 1.5.6 His 标签的引入 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、细胞、受体菌、菌株及实验动物 |
| 2.1.2 所用试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要培养基及试剂的配制方法 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计及合成 |
| 2.2.2 m ChIL-18 基因重组转移载体的构建 |
| 2.2.3 VP2 基因重组转移载体的构建 |
| 2.2.4 HA1 基因重组转移载体的构建 |
| 2.2.5 m ChIL-18 和VP2 基因共表达重组转移载体的构建 |
| 2.2.6 m ChIL-18 和HA1 基因共表达重组转移载体的构建 |
| 2.2.7 重组质粒的转座（即重组Bacmid 的构建） |
| 2.2.8 重组Bacmid DNA 的提取及鉴定 |
| 2.2.9 重组Bacmid 转染sf9 昆虫细胞及收获重组杆状病毒 |
| 2.2.10 m ChIL-18、VP2 及HA1 在sf9 昆虫细胞中的单独或同时表达 |
| 2.2.11 sf9 昆虫细胞表达蛋白的鉴定 |
| 2.2.12 重组mChIL-18 蛋白促进鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT 法) |
| 2.2.13 重组m ChIL-18 蛋白蛋白诱导鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ |
| 2.2.14 重组mChIL-18 蛋白诱导的IFN-γ对VSV 的抑制活性 |
| 2.2.15 蛋白的纯化 |
| 2.2.16 油乳剂疫苗的制备 |
| 2.2.17 动物免疫 |
| 2.2.18 细胞免疫检测（流氏细胞术） |
| 2.2.19 抗体检测试剂盒 |
| 2.2.20 血凝血抑 |
| 2.2.21 攻毒试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组转移载体的构建与鉴定 |
| 3.1.1 m ChIL-18 基因的克隆、序列测定及其分析 |
| 3.1.2 VP2 基因的克隆、序列测定及其分析 |
| 3.1.3 HA1 基因的克隆、序列测定及其分析 |
| 3.1.4 pF-IL18-VP2 共表达重组杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.5 pF-IL18-HA1 共表达重组杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.2 重组Bacmid 的筛选与鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒的DNA 鉴定 |
| 3.4 目的片段在sf9 昆虫细胞中的表达 |
| 3.4.1 重组杆状病毒的细胞病变观察 |
| 3.4.2 表达产物的SDS-PAGE 检测 |
| 3.4.3 表达产物的IFA 检测 |
| 3.5 表达产物的生物学活性检测 |
| 3.5.1 蛋白促进鸡脾淋巴细胞增殖试验 |
| 3.5.2 蛋白诱导鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ |
| 3.5.3 蛋白诱导的IFN-γ对VSV 的抑制作用 |
| 3.6 表达蛋白的免疫原性研究 |
| 3.6.1 pIL18、pVP2 与pVP2-IL18 促进细胞免疫水平检测 |
| 3.6.2 pIL18、pHA1 与pHA1-IL18 促进细胞免疫水平检测 |
| 3.6.3 pIL18、pVP2 与pVP2-IL18 促进抗体水平检测 |
| 3.6.4 pIL18、pHA1 与pHA1-IL18 促进抗体水平检测 |
| 3.6.5 pIL18、pHA1 与pHA1-IL18 攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（7）H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定、鉴别诊断及M2e重组质粒免疫效力研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流感病毒概述 |
| 1.1 流行病学特点 |
| 1.2 公共卫生意义 |
| 1.3 猪流感病毒病原学及生物学特性 |
| 1.4 猪流感分子生物学特征 |
| 1.4.1 血凝素基因HA |
| 1.4.2 神经氨酸酶基因NA |
| 1.4.3 核蛋白基因NP |
| 1.4.4 聚合酶基因PA、PB1、PB2 |
| 1.4.5 基质蛋白基因M |
| 1.4.6 非结构蛋白基因NS |
| 1.5 猪流感病毒的抗原性变异 |
| 1.6 猪流感病毒免疫学机制 |
| 1.7 猪流感实验室诊断技术 |
| 1.7.1 病毒分离 |
| 1.7.2 血清学诊断 |
| 1.7.3 分子生物学诊断 |
| 1.8 猪流感新型疫苗的研究进展 |
| 2 M2疫苗研究进展 |
| 2.1 M2e蛋白类疫苗 |
| 2.2 M2e核酸疫苗 |
| 2.3 M2e疫苗目前仍存在的机制争论及有待解决的问题 |
| 2.3.1 广谱性的大小 |
| 2.3.2 免疫反应类型的问题 |
| 3 核酸疫苗佐剂研究进展 |
| 3.1 细胞因子佐剂 |
| 3.2 蛋白转导类佐剂VP22 |
| 4 本研究的意义及目的 |
| 第二章 H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病料及参考毒株 |
| 1.1.2 鸡胚、细胞及载体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病毒的分离及纯化 |
| 1.2.2 病毒分离物的鉴定 |
| 1.2.3 病毒特性研究 |
| 1.2.4 动物回归试验 |
| 1.2.5 流感病毒RT-PCR检测方法 |
| 1.2.6 HA和NA基因序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒分离及传代 |
| 2.2 外源病毒检测 |
| 2.3 病毒血凝特性、特异性及亚型初步鉴定 |
| 2.4 病毒命名 |
| 2.5 病毒致MDCK细胞病变进程及病毒感染动力学 |
| 2.6 病毒特性研究 |
| 2.6.1 EID_(50)测定结果 |
| 2.6.2 TCID_(50)测定结果 |
| 2.7 病毒理化特性研究 |
| 2.7.1 病毒感染力热稳定性试验结果 |
| 2.7.2 乙醚敏感性试验结果 |
| 2.7.3 氯仿敏感试验结果 |
| 2.7.4 病毒核酸类型实验 |
| 2.8 动物回归实验结果 |
| 2.9 流感病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.9.1 RT-PCR检测反应体系的建立及优化 |
| 2.9.2 RT-PCR检测反应特异性研究 |
| 2.9.3 RT-PCR检测反应敏感性研究 |
| 2.9.4 临床样品的检测及与其它流感检测方法的比较 |
| 2.10 HA和NA的RT-PCR扩增测序及序列分析 |
| 2.10.1 HA和NA扩增测序 |
| 2.10.2 HA和NA序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.2 病毒生物学特性 |
| 3.3 病毒遗传进化及分子特征 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病毒及血清 |
| 1.1.2 菌株及质粒 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 目的片段扩增及克隆 |
| 1.2.2 NS1基因的生物信息学分析 |
| 1.2.3 重组质粒的诱导表达及表达产物的检测 |
| 1.2.4 表达产物的纯化及复性 |
| 1.2.5 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 NS1的扩增与克隆、表达载体的构建 |
| 2.2 NS1生物信息学分析 |
| 2.3 诱导表达产物的SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定 |
| 2.4 间接ELISA方法的建立 |
| 2.4.1 抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度 |
| 2.4.2 临界值的确定 |
| 2.4.3 交叉反应 |
| 2.4.4 竞争性抑制试验 |
| 2.4.5 敏感性试验 |
| 2.4.6 重复性试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NS1蛋白的血清学诊断 |
| 3.2 原核表达及ELISA |
| 4 小结 |
| 第四章 M2e原、真核表达及生物活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、细胞、菌株及载体 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 猪流感病毒M2基因的扩增及TA克隆 |
| 1.2.2 含3个MZe拷贝的MZe*3基因的获得 |
| 1.2.3 M2e*3的原核表达 |
| 1.2.4 原核表达M2e*3融合蛋白免疫原性研究 |
| 1.2.5 M2e*3融合蛋白高免血清生物活性研究 |
| 1.2.6 M2e*3的真核表达研究 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 M2基因的克隆 |
| 2.1.1 M2基因的RT-PCR扩增 |
| 2.1.2 pMD19-T simple+M2的酶切鉴定 |
| 2.1.3 M2基因测序鉴定 |
| 2.2 M2e*3基因的获得 |
| 2.2.1 M2e*2片段的扩增 |
| 2.2.2 M2e*3片段的扩增 |
| 2.2.3 pMD19-T simple+M2e*3 TA克隆的酶切及测序鉴定 |
| 2.3 M2e*3基因的原核表达研究 |
| 2.3.1 pET32-M2e*3质粒的鉴定 |
| 2.3.2 M2e*3原核表达产物分析 |
| 2.3.3 表达产物的纯化及Western-blotting分析 |
| 2.4 M2e*3融合蛋白免疫原性研究 |
| 2.4.1 Dot-ELISA测定M2e*3融合蛋白高免血清效价 |
| 2.4.2 M2e*3融合蛋白高免血清识别M2天然蛋白的研究 |
| 2.5 M2e*3融合蛋白高免血清生物活性研究 |
| 2.5.1 M2e*3融合蛋白高免血清体外抑制病毒增殖生物活性检测 |
| 2.5.2 M2e*3融合蛋白高免血清体内生物活性研究 |
| 2.6 M2e*3真核表达研究 |
| 2.6.1 M2e*3真核表达质粒pCI-M2e*3的构建 |
| 2.6.2 M2e*3基因转录的RT-PCR检测 |
| 2.6.3 M2e*3真核表达蛋白间接免疫荧光检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 M2基因的扩增及M2e*3的构建 |
| 3.2 三个M2e拷贝的选择 |
| 3.3 原核表达M2e*3蛋白的免疫原性 |
| 4 小结 |
| 第五章 猪白介素18(IL-18)及伪狂犬VP22基因作为分子佐剂的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 载体、菌株、细胞及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 pCI-IL18真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 pCI-IL18的真核转录表达研究 |
| 1.2.4 pCI-IL18小鼠体内生物活性研究 |
| 1.2.5 VP22的PCR扩增、克隆及序列分析 |
| 1.2.6 pEGFP-N3+VP22E真核表达载体的构建及表达研究 |
| 1.2.7 VP22作为分子佐剂的初步研究 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pCI-IL18真核表达载体的构建 |
| 2.2 pCI-IL18真核转录及表达研究 |
| 2.3 pCI-IL18小鼠体内生物活性 |
| 2.4 VP22的扩增、克隆及序列分析 |
| 2.5 pEGFP-N3+VP22E真核表达载体的构建及表达研究 |
| 2.5.1 pEGFP-N3+VP22E的构建 |
| 2.5.2 pEGFP-N3+VP22E的转录及表达 |
| 2.6 VP22对HA重组质粒免疫效力的影响 |
| 2.6.1 pCI-HA、pVP22-HA的构建 |
| 2.6.2 pCI-HA、pVP22-HA的转录及表达研究 |
| 2.6.3 pCI-HA、pVP22-HA诱导小鼠免疫反应 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 M2e重组质粒免疫效力及工L-18和VP22作分子佐剂对其影响的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、菌株及载体 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组真核表达载体在Vero细胞中的瞬时表达研究 |
| 1.2.4 H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠的培育 |
| 1.2.5 H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠株TCID_(50)及LD_(50)的测定 |
| 1.2.6 重组质粒免疫效力及IL-18、VP22佐剂效应研究 |
| 1.2.7 攻毒保护实验 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pM2e*3-IRES-IL18、pVP22-M2e*3的构建 |
| 2.2 pM2e*3-IRES-IL18、pVP22-M2e*3的转录及表达研究 |
| 2.3 H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠的培育 |
| 2.4 H3N2亚型猪流感病毒小鼠适应株TCID_(50)和LD_(50)的测定 |
| 2.5 重组质粒免疫效力研究 |
| 2.5.1 体液免疫 |
| 2.5.2 细胞免疫 |
| 2.6 重组质粒免疫保护研究 |
| 2.6.1 攻毒后存活率及体重变化 |
| 2.6.2 免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 |
| 2.6.3 对异源病毒攻击的保护 |
| 3 讨论 |
| 3.1 双基因共表达载体的选用 |
| 3.2 构建M2e*3序列的基础 |
| 3.3 疫苗效果的评估标准 |
| 3.4 pCI-M2e*3免疫效果的评估 |
| 3.5 佐剂对免疫效果的影响 |
| 4 小结 |
| 第七章 M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、菌株及载体 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组真核表达载体在Vero细胞中的转录表达研究 |
| 1.2.4 重组质粒免疫效力研究 |
| 1.2.7 攻毒保护实验 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pM2e*3-HA的构建 |
| 2.2 pM2e*3-HA的转录及表达研究 |
| 2.4 重组质粒免疫效力研究 |
| 2.4.1 体液免疫 |
| 2.4.2 细胞免疫 |
| 2.5 重组质粒免疫保护研究 |
| 2.5.1 攻毒后存活率及体重变化 |
| 2.5.2 免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 |
| 2.5.3 对异源病毒攻击的保护 |
| 3 讨论 |
| 3.1 HA基因的选择 |
| 3.2 HA和M2e基因的联用 |
| 3.3 重组质粒的表达及免疫效果 |
| 4 小结 |
| 全文总结论 |
| 本研究的创新点 |
| 本研究的展望与建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎研究进展 |
| 1.1.1 IBV 的生物学分类地位 |
| 1.1.2 IBV 粒子结构 |
| 1.1.3 IBV 结构蛋白及其生物学功能 |
| 1.1.4 IBV 理化特性 |
| 1.1.5 IBV 疫苗研究进展 |
| 1.2 鸡传染性法氏囊研究进展 |
| 1.2.1 IBDV 生物学分类 |
| 1.2.2 IBDV 粒子结构 |
| 1.2.3 IBDV 的结构蛋白及生物学功能 |
| 1.2.4 IBDV 理化特性 |
| 1.2.5 IBDV 疫苗研究进展 |
| 1.3 鸡白细胞介素（INTERLEUKIN）研究进展 |
| 1.3.1 鸡白介素1（ChIL-1） |
| 1.3.2 鸡白介素2（ChIL-2） |
| 1.3.3 鸡白介素6（ChIL-6） |
| 1.3.4 鸡白介素15（ChIL-15） |
| 1.3.5 鸡白介素18（ChIL-18） |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 细胞株、菌株、载体及质粒 |
| 2.1.4 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒 |
| 2.1.5 主要生化试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 IBV S1 基因、IBDV VP2 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建 |
| 2.2.2 IBV S1、IBDV VP2 融合基因真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 抗IBDV VP2 蛋白多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 2.2.4 pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2、pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2 重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测 |
| 2.2.5 pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 重组质粒稳定表达细胞系的建立和鉴定 |
| 2.2.6 实验动物分组、免疫及各组免疫效果的检测 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 IBV S1 基因、IBDV VP2 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.1 pVAX-IBV S1 重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.2 pVAX-IBDV VP2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 PVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.2.1 IBV S1、IBDV VP2 片断的亚克隆 |
| 3.2.2 pVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的PCR 及双酶切鉴定 |
| 3.2.3 pVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.3 抗IBDV VP2 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.3.1 pGEX-IBDV VP2 原核表达质粒的单双酶切鉴定 |
| 3.3.2 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测多抗效价 |
| 3.3.3 western blot 检测多抗特异性 |
| 3.4 PVAX-IBV S1、PVAX-IBDV VP2、PVAX-IBV S1-LINKER-IBDV VP2 重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测 |
| 3.4.1 pVAX-IBV S1 真核表达质粒体外转染及其检测 |
| 3.4.2 pVAX-IBDV VP2 真核表达质粒体外转染及其检测 |
| 3.4.3 pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2 真核表达质粒体外转染及其检测 |
| 3.5 PVAX-IBV S1、PVAX-IBDV VP2 重组质粒稳定表达细胞系的建立 |
| 3.5.1 RT-PCR 方法检测pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 基因的表达 |
| 3.5.2 间接免疫荧光检测pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 重组质粒在两种稳定表达细胞系中的表达 |
| 3.6 雏鸡外周血及免疫器官T、B 淋巴细胞增殖的动态变化 |
| 3.6.1 雏鸡血液T 淋巴细胞增殖的动态变化 |
| 3.6.2 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖的动态变化 |
| 3.6.3 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖的动态变化 |
| 3.6.4 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖的动态变化 |
| 3.6.5 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖的动态变化 |
| 3.7 雏鸡外周血及免疫器官CD4+、CD8+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.7.1 雏鸡外周血及免疫器官CD4+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.7.2 雏鸡外周血及免疫器官CD8+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.8 雏鸡外周血抗IBV、IBDV 抗体含量动态变化 |
| 3.8.1 雏鸡外周血抗IBV 抗体含量动态变化 |
| 3.8.2 雏鸡外周血抗IBDV 抗体含量动态变化 |
| 3.9 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞的检测 |
| 3.9.1 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）杀伤分泌IBVS1 靶细胞的检测 |
| 3.9.2 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞杀伤分泌IBDV VP2 靶细胞的检测 |
| 3.10 中和抗体 |
| 3.11 攻毒后雏鸡病变的观察结果 |
| 3.12 保护率计算结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 融合基因真核载体表达质粒的设计与构建 |
| 4.2 多克隆抗体的制备及其效价鉴定结果分析 |
| 4.3 融合基因真核载体表达质粒体外瞬时转染鉴定结果及分析 |
| 4.4 融合基因真核载体表达质粒体外稳定转染及CTL 活性测定 |
| 4.5 雏鸡进行核酸免疫的讨论与分析 |
| 4.6 雏鸡免疫后淋巴细胞增殖功能变化结果分析 |
| 4.6.1 雏鸡免疫后血液及免疫器官T 淋巴细胞增殖活性分析 |
| 4.6.2 雏鸡免疫后血液及免疫器官B 淋巴细胞增殖活性分析 |
| 4.7 雏鸡免疫后不同亚型T 细胞动态变化结果分析 |
| 4.7.1 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD4~+T 细胞动态变化结果分析 |
| 4.7.2 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD8~+T 细胞动态变化结果分析 |
| 4.8 外周血液抗IBV 和IBDV IGG 抗体含量动态变化结果分析 |
| 4.9 病毒攻击试验雏鸡后病理学观察结果、感染率及保护率计算结果的讨论与分析 |
| 4.10 免疫效果比较分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白酵母表达条件的优化及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 IL-18 的分子生物学研究进展 |
| 1.1.1 IL-18 的来源 |
| 1.1.2 IL-18 的分子结构 |
| 1.1.3 IL-18 的生物学活性 |
| 1.1.4 IL-18 的受体及信号传递 |
| 1.1.5 ChIL-18 的应用前景 |
| 1.2 HN 基因在新城疫疫苗中的应用研究 |
| 1.2.1 新城疫HN 基因的分子结构 |
| 1.2.2 新城疫HN 基因的分子生物学特性 |
| 1.2.3 新城疫HN 基因在疫苗中的应用 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统的特点及研究前景 |
| 1.3.1 不同诱导时间对重组菌表达目的蛋白的影响 |
| 1.3.2 不同pH 值的培养液对重组菌表达目的蛋白的影响 |
| 1.3.3 不同诱导剂剂量即甲醇浓度对重组菌表达目的蛋白的影响 |
| 1.3.4 不同诱导温度对重组菌表达目的蛋白的影响 |
| 1.3.5 毕赤酵母表达系统的优势 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 鸡 IL-18 与新城疫 HN 基因融合蛋白的表达条件优化、纯化与体外活性检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体、菌株及抗体 |
| 2.1.2 主要酶和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组酵母菌的诱导表达及SDS-PAGE |
| 2.2.2 表达产物的Western blotting 分析 |
| 2.2.3 CHMIL-18-HN 的重组表达载体在酵母中的遗传稳定性试验 |
| 2.2.4 重组菌表达条件的优化 |
| 2.2.5 酵母表达ChMIL-18-HN 蛋白的纯化和定量 |
| 2.2.6 Bradford 法测定蛋白质含量 |
| 2.2.7 ChIL-18-HN 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞转化试验 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 融合菌进行诱导表达及Western blot 分析 |
| 2.3.2 CHMIL-18-HN 重组表达载体在酵母中的遗传稳定性试验 |
| 2.3.3 不同诱导时间下ChMIL18-HN 融合蛋白的表达情况 |
| 2.3.4 ChMIL18-HN 在不同pH 值的培养液中诱导表达的情况 |
| 2.3.5 ChMIL18-HN 在不同诱导剂剂量即甲醇浓度条件下表达的情况 |
| 2.3.6 温度对ChMIL18-HN 表达量的影响 |
| 2.3.7 重组菌在优化条件下表达目的蛋白的情况 |
| 2.3.8 蛋白含量的测定 |
| 2.3.9 鸡淋巴细胞转化试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 pcDNA3 与 HN-IL18 融合基因真核载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒和菌株 |
| 3.1.2 主要酶和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒PSK-HN-IL18 大量提取及纯化 |
| 3.2.2 质粒pcDNA3 和PSK-HN-IL18 的Kpn I 和Not I 双酶切及酶切产物的纯化 |
| 3.2.3 连接反应 |
| 3.2.4 连接产物原核宿主菌JM109 感受态细胞的转化 |
| 3.2.5 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒pcDNA3-HN-IL18 的构建及鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒pcDNA3-HN-IL18 大量提取 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 重组鸡 IL-18 与新城疫 HN 基因融合蛋白的免疫效果研究 |
| 4.1 |
| 4.1.1 疫苗和毒株 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 |
| 4.1.5 主要试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 0.5%鸡红细胞悬液的制备 |
| 4.2.2 抗原效价的检测 |
| 4.2.3 血清抗体效价的检测 |
| 4.2.4 试验鸡的分组及免疫 |
| 4.2.5 血清中抗体效价的测定 |
| 4.2.6 外周血T 淋巴细胞转化试验 |
| 4.2.7 巨噬细胞分泌NO 的测定 |
| 4.2.8 试验组的生长增重情况及免疫器官生长发育情况的测定 |
| 4.2.9 非特异性酯酶染色法检测鸡的T 淋巴细胞变化 |
| 4.2.10 免疫器官IgG 生成细胞数量测定-石蜡组织切片及免疫酶组织化学法 |
| 4.2.11 攻毒试验 |
| 4.2.12 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 血清中抗体效价的测定结果 |
| 4.3.2 外周血T 淋巴细胞转化试验 |
| 4.3.3 巨噬细胞分泌NO 的测定 |
| 4.3.4 试验鸡免疫器官指数的测定 |
| 4.3.5 试验鸡免疫器官中T 淋巴细胞数量变化测定 |
| 4.3.6 试验鸡免疫器官中IgG 抗体生成细胞数量变化测定 |
| 4.3.7 攻毒试验 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录病例解剖图和组织切片图 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（10）鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫试验（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 试验一 鸡传染性喉气管炎病毒gB 基因与鸡白介素-18 基因真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验二 鸡传染性喉气管炎病毒gB 基因与鸡白介素-18 基因免疫保护试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验三 鸡传染性喉气管炎病毒gB 基因与鸡白介素-18 基因真核共表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 发表论文 |
四、CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS（论文参考文献）
- [1]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白稳转CHO细胞系的建立及免疫增强剂的开发[D]. 杨瑞. 浙江理工大学, 2020
- [2]递送柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白与IL-18共表达核酸疫苗侵入型乳酸菌免疫保护效果研究[D]. 张赞. 吉林农业大学, 2019
- [3]猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究[D]. 李训良. 东北农业大学, 2018(02)
- [4]猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因DNA疫苗的构建与鼠体内免疫效力观察[D]. 刘金朋. 河南农业大学, 2011(07)
- [5]HPV58mE6E7融合基因疫苗构建及其免疫效果的研究[D]. 王鹤. 广西医科大学, 2011(08)
- [6]mChIL-18基因与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacTM Dual中的共表达及其免疫原性研究[D]. 孔娜. 山东农业大学, 2011(08)
- [7]H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定、鉴别诊断及M2e重组质粒免疫效力研究[D]. 张博. 四川农业大学, 2011(02)
- [8]IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究[D]. 李鹏冲. 东北农业大学, 2011(04)
- [9]鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白酵母表达条件的优化及生物活性研究[D]. 王学强. 河南科技大学, 2010(02)
- [10]鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫试验[D]. 邵攀峰. 河南农业大学, 2010(03)