重组人肝再生增强因子可增强大鼠肝星状细胞间质胶原酶基因的表达

一、重组人肝再生增强因子可增强大鼠肝星状细胞间质胶原酶基因的表达（论文文献综述）

杨娇^[1]（2016）在《重组腺病毒ALR的构建及过表达ALR在软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变性中的作用》文中指出背景:近年来非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率明显上升,西方发达国家的年发病率高达20%-40%,在中国发病仅次于病毒性肝病,且有极大可能发展至肝硬化、肝癌以及肝功能衰竭,危及生命。报道显示,与普通人群相比,脂肪肝患者的心血管疾病死亡率较高。因此,NAFLD是人类健康的一大严重威胁。且NAFLD的临床表现轻微,无特异性表现,诊断多依赖实验室检查,也无批准的单药治疗方案,因此对NAFLD的发病机制进一步研究以寻找有效的分子标志物用于NAFLD的早期筛查,并发现新的治疗靶点予以针对性治疗,这对提高早期诊断率及改善预后意义重大。肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）,首次发现是定位于肝细胞浆,具有促进细胞增殖、抗细胞凋亡,调节免疫,逆转肝脏纤维化等作用的一种非特异性细胞因子。ALR在体内发现有三种分子片段:15KD、21KD和23KD。15KD是23KD的C′末端片断,即15KD ALR无信号肽序列,目前研究23KD ALR主要是在线粒体功能活动发挥作用。已有研究表明特异性敲除小鼠23KD的ALR基因后,肝脏的脂肪性肝炎及肝癌的发病率明显增加,而且在NAFLD的病人肝组织标本检测中发现23KD ALR的表达较正常人肝是下调的,说明23 KD ALR在NAFLD的发生发展中起重要作用,而15KD ALR作为23KDALR的剪切片段,目前国内外研究中暂无报道其在NAFLD中的生物学作用。因此,本实验主要构建重组15KD ALR腺病毒及探讨过表达ALR对软脂酸诱导Hep G2细胞脂肪变性的作用,为NAFLD的诊治提供新的思路。本研究包括两个部分:第一部分:重组Ad-m ALR和Ad-h ALR的构建和鉴定目的:重组腺病毒含肝再生增强因子（ALR）基因的构建。方法:基因重组法构建重组穿梭载体（p Ad Track-TO4-m ALR和p Ad Track-TO4-h ALR）,重组腺病毒（Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR）采用同源重组法构建,4轮扩增后获得高低度重组腺病毒。感染L02细胞,通过荧光蛋白的表达了解其感染率,ALR蛋白表达情况和其增殖活性则通过Western Blotting法和CCK-8法检测。结果:1.重组腺病毒（Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR）被构建成功。2.重组腺病毒（Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR）能高效感染并稳定表达于L02细胞。3.与非感染组和空载病毒组相比,过表达ALR均能促进L02细胞的增殖。结论:成功构建重组腺病毒Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR,细胞实验证实15KD ALR对L02细胞具有促增殖作用。第二部分:过表达ALR在软脂酸诱导Hep G2细胞脂肪变性中的作用目的:观察过表达15KD ALR在软脂酸（palmitic acid,PA）诱导Hep G2细胞脂肪变性的作用,并简要探讨其机制。方法:本实验分为5组:未感染腺病毒且无PA处理的Hep G2细胞组（G2-NC-No infection）,感染空载病毒无PA的Hep G2细胞组（G2-Ad-GFP-NC）,感染空载病毒有PA的Hep G2细胞组（G2-Ad-GFP-PA）,,感染Ad-GFP-h ALR无PA的Hep G2细胞组（G2-Ad-GFP-h ALR-NC）,感染Ad-GFP-h ALR有PA的Hep G2细胞组（G2-Ad-GFP-h ALR-PA）。甘油三酯（Triglyceride,TG）酶法和尼罗红染色法定量和定性检测胞内脂滴储积情况,Real Time-PCR和Western blotting法被应用于细胞内固醇类调节原件结合蛋白-1（SREBP-1）,脂肪分化相关蛋白（ADRP）和过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）的检测,流式细胞仪检测凋亡率,Western Blotting法检测MAPK通路相关蛋白。结果:1.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA的TG的测定是明显增加的,脂滴的红色荧光强度是显着增强的。而与G2-Ad-GFP-PA组相比,过表达ALR（G2-Ad-GFP-h ALR-PA组）后,细胞内的TG及脂滴的红色荧光强度明显下调。2.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA中SREBP-1、PPAR-α,ADRP的m RNA及蛋白的表达均显着增加。与G2-Ad-GFP-PA组相比,过表达ALR（G2-Ad-GFP-h ALR-PA组）后,胞内SREBP-1、PPAR-α,ADRP的m RNA及蛋白表达较实验组G2-Ad-GFP-PA下调。3.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA中的凋亡率是明显增加的。但与G2-Ad-GFP-PA组比较,过表达ALR（G2-Ad-GFP-h ALR-PA组）后Hep G2细胞的凋亡率明显降低。4.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-h ALR-NC相比,实验组G2-Ad-GFP-PA中的磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显增加。但与G2-Ad-GFP-PA组比较,过表达ALR（G2-Ad-GFP-PA）组中磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显下调。结论:1.软脂酸能诱导Hep G2细胞的脂肪变性。2.过表达ALR可减轻PA诱导Hep G2细胞的脂滴储积。3.过表达ALR可降低脂肪合成代谢中关键酶（SREBP-1、PPAR-α、ADRP）的表达.4.过表达ALR可减少PA诱导Hep G2细胞的凋亡的发生。5.过表达ALR可抑制MAPK通路中磷酸化蛋白（p-JNK,p-p42/p44,p-p38）的产生。

陈文,杨春,毕义亮,唐黎,吴刚,邓存良^[2]（2014）在《肝再生增强因子在HBV相关肝硬化患者中的表达及意义》文中认为目的:研究肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）相关肝硬化患者中的表达及临床意义.方法:病例来源于我科门诊及住院的慢性乙型肝炎患者,包括性慢性乙型肝炎轻度组（n=196）、代偿期肝硬化组（n=69）、失代偿期肝硬化组（n=148）;失代偿肝硬化患者根据并发症进一步分为腹水组（n=51）、消化系出血组（n=32）、肝性脑病组（n=27）和慢性肝衰竭组（n=38）,其中腹水组分为原发性腹膜炎组（n=9）与非原发性腹膜炎组（n=42）.健康对照组（n=200）来源于输血科健康献血者.收集患者血清及临床资料;采用ELISA法检测各组患者血清ALR浓度;瞬时弹性扫描（FibroScan）检测代偿期肝硬化患者肝脏硬度.比较各组间ALR浓度差异,分析ALR浓度与肝硬化及其并发症的关系.结果:ALR浓度在代偿期肝硬化组和失代偿肝硬化组均明显高于健康对照组和慢性乙型肝炎轻度组（P<0.01）.在代偿期肝硬化患者ALR浓度（1.54μg/L±0.53μg/L）与肝脏FibroScan值（16.96 kPa±5.6 kPa）负相关（r2=-0.218,F=15.736,P<0.01）.失代偿肝硬化组中慢性肝衰竭患者ALR浓度明显高于代偿期肝硬化组（1.73μg/L±0.23μg/L vs 1.54μg/L±0.53μg/L,P=0.012）,腹水组患者ALR浓度明显低于代偿期肝硬化组（1.32μg/L±0.64μg/L vs 1.54μg/L±0.53μg/L,P=0.027）,原发性腹膜炎组与非原发性腹膜炎组间ALR浓度无显着性差异.ALR血清浓度与肝硬化患者腹水的发生相关,低ALR血清浓度是肝硬化患者发生腹水的危险因素（P=0.031,OR=0.841）.结论:ALR在HBV相关肝硬化患者表达明显升高,其水平与肝脏硬度及腹水发生负相关,提示ALR在肝硬化患者增高可能是机体的一种保护机制.

郭珊珊^[3]（2011）在《重组人肝再生增强因子对5/6肾切除大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1和Ⅳ型胶原表达的影响》文中认为目的:慢性肾衰竭（Chronic renal failure,CRF）是各种病因引起的肾脏进行性的损伤和肾功能的逐渐恶化,严重威胁着病人的生命。慢性肾衰竭肾脏病理表现为肾脏纤维化。肾脏纤维化是指肾脏对慢性损伤的病理修复过程,包括肾间质纤维化与肾小球硬化。大量研究已证实,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积是肾小球硬化的主要病理特征。[1]ECM合成和降解的失衡是导致ECM过度沉积及肾小球功能损伤的主要原因。[1、2]细胞外基质（ECM）积聚主要由Ⅳ型胶原构成。国内外大量研究结果表明Ⅳ型胶原在肾小球内的过度堆积是肾小球硬化的特征性病理改变。[3、4]因此,Ⅳ型胶原已被广泛作为肾小球硬化的指标。对于ECM过度积聚,人们一直关注ECM合成的增加,近年来大量实验结果发现ECM降解酶系统异常在此过程中同样发挥重要作用。参与肾脏ECM降解的酶类主要有:丝氨酸蛋白酶系统（纤溶酶原激活物-纤溶酶系统）和基质金属蛋白酶系统（matrix metalloproteinases,MMPs）。大量研究结果已经证实:MMPs家族是降解ECM的主要酶体系,MMPs具有锌离子依赖性,其活化被认为是ECM降解的限速环节[5]。现已证实肾小球系膜细胞、毛细血管内皮细胞、脏层及壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞、浸润的单核巨噬细胞和中性粒细胞等均能不同程度地表达MMP-1、2、3、7、9、10及11。MMP-9作为人体内最重要的MMPs之一,它的主要功能是降解ECM的主要成分-Ⅳ型胶原[6]。MMPs的抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）能够特异性地封闭MMPs活性。目前已发现4种TIMPs（TIMP-1、2、3、4）,其中对TIMP-1、2研究较多。TIMP-1可与MMP-9以1:1比例不可逆结合,特异性的阻断MMP-9的活性,在ECM积聚和降解的生理平衡中发挥重要作用。所以MMP-9表达减弱,TIMP-1表达增强,上述ECM降解效应减弱,即能促进肾小球硬化发生。已有许多学者在多种肾脏病中观察到TIMP-1表达增强[6-9]。肝再生增生强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）是1994年Hagiya等[10]首次从初断乳大鼠肝脏中纯化并克隆出的一种具有热稳定性的非特异性促进肝脏细胞再生的因子。近年来国内外对ALR的研究多集中在肝脏,它可以促进肝脏再生[11]、抗肝纤维化[12、13]、抑制NK细胞活性、刺激肝癌细胞增殖等。但其mRNA在肝脏、肾脏、胸腺、睾丸等组织中均有表达,充分说明了ALR具有生物功能多样性。王爱民等[14]通过观察hALR对肝星状细胞基质分解素（MMP-3）及金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）基因表达的影响,从ECM降解代谢方面探讨hALR抗肝纤维化的作用机制。结果表明hALR可以促进肝星状细胞MMP-3的基因表达,从而促进ECM的降解,发挥其抗肝纤维化作用。同时,ALR可抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原和TIMP-1在肝组织中的表达。据国内文献报道,ALR在肾脏疾病方面的研究包括在急性肾衰竭、肾炎模型、庆大霉素损伤后的肾小管上皮细胞中的影响。已证实ALR直接或间接参与肾炎病理过程及急性肾小管损伤时刺激小管上皮细胞DNA合成等过程[15]。但目前国内外尚缺乏ALR与慢性肾衰竭的相关报道,鉴于ALR在肝脏纤维化中可以通过金属蛋白酶系统阻止肝脏纤维化的发生与进展,而金属蛋白酶系统在肾脏纤维化中有重要作用。探讨rhALR可否通过影响TIMP-1,MMP-9从而导致Ⅳ型胶原的产生发生变化,进而延缓肾小球硬化,为慢性肾衰竭的防治新方法提供理论依据。本课题拟通过重组人肝再生增强因子（rhALR）对5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭模型进行干预治疗,了解rhALR是否可以通过影响基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）及Ⅳ型胶原的表达部位和量,来延缓肾小球硬化。方法:将60只健康雄性SD大鼠随机分成假手术组（S组,n=20）,对照组（C组,n=20）,干预组（rhALR组,n=20）。C组及rhALR组大鼠行5/6肾切除,术后12周慢性肾衰竭大鼠模型制造成功,以rhALR作为干预药物对rhALR组进行干预（200μg/kg/d）,用药1周。血生化检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）值。石蜡切片行HE和Masson氏染色观察肾小球病理改变,免疫组化测定Ⅳ型胶原,MMP-9、TIMP-1的表达,Western-blot测定MMP-9,TIMP-1的表达。结果用均数±标准差（±s）表示,组间差异性比较采用单因素方差分析和q检验,显着性水平等于0.05,应用SPSS13.0软件包对所有数据进行统计学处理。结果:血生化检测结果提示:手术组血清Scr、BUN与假手术组（S组）相比,明显升高（P<0.05）。干预组（rhALR组）与对照组（C组）相比,血清Scr、BUN有显着性差异（P<0.05）,毒素水平下降。肾脏病理学结果显示:HE染色及Masson氏染色光镜下可见C组肾小球有不同程度代偿性肥大,系膜细胞及基质增生,毛细血管塌陷,球囊粘连,可见局灶节段性硬化的肾小球。肾小管肿胀、颗粒变性、偶见灶状萎缩,肾间质增宽,间质可见炎细胞浸润,间质纤维细胞增生明显。与rhALR组及S组相比肾小球硬化指数差别有统计学意义,P值<0.05。免疫组织化学结果显示:在S组,Ⅳ型胶原在肾小球基底膜有少量表达,MMP-9主要表达于肾小管上皮细胞,少量表达于肾小球系膜细胞,TIMP-1与MMP-9表达位置接近,只是量较少。在C组,可以明显的看到Ⅳ型胶原沿肾小球基底膜深棕黄色强表达,较S组表达增多,MMP-9表达明显少于S组,TIMP-1表达较S组增多。rhALR组各指标表达介于S与C组之间,经软件分析单位面积阳性染色区域平均积分光密度（MOD）,rhALR组、C组与S组之间,rhALR组与C组之间统计学处理后差异有显着性意义（P<0.05）。Western blot结果显示:于S组相比,rhALR组与C组Ⅳ型胶原、TIMP-1蛋白的表达水平较高,差别有显着意义（P<0.05）,C组Ⅳ型胶原、TIMP-1的蛋白表达水平较rhALR组高,同样有显着性意义（P<0.05）。与rhALR组、C组相比,MMP-9在S组表达量最多,差异有显着性意义（P<0.05）。在rhALR组与C组之间,MMP-9表达在rhALR组相对较高,差异有显着性意义（P<0.05）。结论:rhALR可以通过上调MMP-9,下调TIMP-1,减少Ⅳ型胶原积聚而改善肾小球硬化,为临床治疗慢性肾衰竭开拓新的思路,为了解rhALR的功能提供新线索。深入开发有良好的应用前景,其临床应用具有重要的现实意义。

王学敏^[4]（2010）在《重组肝再生增强因子对5/6肾切除大鼠模型肾性贫血的影响》文中指出目的:肾性贫血是慢性肾衰竭病人常见的并发症之一, EPO是治疗肾性贫血的主要药物,但是外源性EPO有诸多不良反应（如高血压、血粘度的升高、血管通路血栓形成、透析管道凝血、高钾血症、肌痛、流感样症状等）,且尚有部分病人对rHuEPO反应低下。正常情况下成人EPO90%由肾脏产生,不到10%来自肝脏。肾脏产生EPO的部位为肾小管周围的成纤维样细胞。慢性肾衰竭时,肾性贫血与肾功能受损,EPO分泌不足相关。肾脏EPO产生减少,肾外EPO如何调整,怎样促使肾外EPO的产生是目前研究的疑点与难点[1]。肝再生增生强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）是1994年Hagiya等从新生大鼠肝脏中纯化并克隆出的一种具有热稳定性的非特异性促进肝细胞再生因子,由125个氨基酸构成的小分子蛋白质,分子量为15 Kda[2]。ALR具有非种属、非组织、非器官特异性,在肝脏、肾脏中有高表达。慢性肾衰竭时肾脏不能产生足够的EPO,此时由于肝脏Kupffer细胞也能合成分泌EPO,所以肝脏可有一定的代偿作用[3,4]。研究发现:肝脏Kupffer细胞表面有高亲和力ALR受体,ALR能促进Kupffer细胞DNA复制,蛋白合成[4,5]。但是目前尚无肝再生增强因子（ALR）在慢性肾衰竭中的研究。本课题利用5/6肾切除大鼠模型探讨ALR在慢性肾衰竭中的作用,为肾性贫血探索新的治疗方法。如果人工合成肝再生增强因子可以治疗肾性贫血,将更符合生理要求,可减少rHuEPO的用量及其带来的许多不良反应,为重组肝再生增强因子在临床上治疗肾性贫血提供实验性理论依据。有可能使其成为一种理想的治疗方案。方法:将体重150～200g的30只SD大鼠随机分为三组,假手术组（n﹦10）,仅暴露肾包膜,不做肾切除。手术组（n﹦20）,参照文献[5] [8]的方法制备模型,在严格无菌条件下,切除右肾,一周后切除左肾2/3。手术组大鼠术后饲养一周后总计成活18只,随机分为对照组（n﹦9）,rhALR组（n﹦9）。rhALR组大鼠于手术后12周给予rhALR200μg/kg/d,腹腔注射,对照组大鼠同时给予等量生理盐水腹腔注射。隔日注射1次,共2周。观察大鼠精神状态,活动度、毛发光泽度、摄食及死亡情况,每周观察一次体重,观察体重变化。各组大鼠于用药结束后24小时,氯胺酮麻醉后心脏采血,观察各项指标。应用日本SYSMEX型全自动血细胞分析仪测定血色素（Hb）,红细胞计数（RBC）,红细胞压积（Hct）;采用OLYMPUS AU400型生化仪测定血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）;采用OLYMPUS 5400型生化仪测定血清铁蛋白;采用美国ADL公司ELISA试剂盒测定血清EPO水平。Masson染色观察肾脏病理学改变,HE染色观察肝脏病理学改变。免疫组织化学法检测肝肾组织中的肝再生增强因子（ALR）、增殖细胞核抗原（PCNA）。Western印迹法检测肝肾组ALR蛋白的表达。结果:1肾脏大体外观改变,对照组大鼠术后残肾体积增大,被网膜包裹难以剥离。手术切口瘢痕处内陷,其余部分外凸,形状不规则。rhALR组亦有上述改变,但较轻。2外周血象及肾功能变化:假手术组、对照组和rhALR组小鼠血Hb（g/L）分别为137.43±0.96、68.72±15.42、113.51±5.83,RBC（×1012/L）分别为7.45±0.42、4.01±1.35、6.05±0.88,HCT（%）分别为46.92±6.33、25.31±2.61、39.42±5.45,BUN （mmol/L）分别为7.52±1.36、25.35±8.91、17.22±5.17,Scr（μmol/L）分别为49.64±6.20、97.72±15.43、68.88±6.84。对照组与假手术组相比,Hb、RBC、HCT等下降（P<0.05）,差异有统计学意义,而血Scr及BUN上升（P<0.05）,差异有统计学意义,表明肾功能损害,造成贫血。rhALR组与假手术组比较,Hb、RBC、HCT水平仍低,Scr及BUN水平仍高（P<0.05）,差异有统计学意义。rhALR组与对照组比较,Hb、RBC、HCT等显着升高（P< 0.05）,而血Scr及BUN下降（P<0.05）,差异有统计学意义,表明贫血改善,肾功能损害减轻。3血清EPO变化假手术组、对照组和rhALR组小鼠血EPO值（u/L）分别为12.19±1.87、1.77±0.72、8.64±2.35。对照组大鼠血清EPO明显下降,rhALR治疗后血清EPO升高,与对照组比较P<0.05,差异有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,EPO水平仍低,差异有统计学意义。表明rhALR处理后EPO分泌尚未恢复正常。4肾脏病理学变化肾脏大体外观改变,对照组大鼠术后残肾体积增大,被网膜包裹难以剥离。手术切口瘢痕处内陷,其余部分外凸,形状不规则。rhALR组亦有上述改变,但较轻。组织解剖学改变假手术组肾脏外观光滑,肾小球、肾小管、肾间质结构正常。对照组大鼠肾脏外观明显增大,呈苍白色,表面凸凹不平,肾盂扩张;光镜下Masson染色显示鼠肾小球代偿性肥大、系膜增生、局灶节段性肾小球硬化;肾小管萎缩,小管细胞可见变性、坏死、脱落;肾间质胶原成分增多,部分肾间质纤维化,局灶淋巴-单核细胞浸润伴有炎性细胞浸润。rhALR组肾小球、肾小管、肾间质纤维组织增生病变程度明显减轻。5肾组织ALR的表达变化:假手术组大鼠肾组织ALR仅在肾小管上皮细胞有少量表达,表现为肾小管上皮细胞包膜及胞浆均匀分布的细沙粒样着色。皮质区表达阴性。与假手术组相比,对照组ALR在肾小管上皮细胞表达增加（9.53±0.73 vs. 13.58±0.69,P <0.05）,而rALR组表达较对照组明显上调（17.05±1.23 vs. 13.58±0.69,P<0.05）,差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,（17.05±1.23 vs. 9.53±0.73,P<0.05）,差异有统计学意义。在假手术组及肾衰大鼠肾小球内未见ALR表达。6肝组织ALR的表达变化:假手术组大鼠肝组织ALR仅有少量肝细胞表达;与假手术组相比,对照组肝脏ALR阳性细胞数增多（10.00±0.89 vs. 13.56±1.33,P<0.01）;rALR组ALR阳性细胞数较对照组明显增多（23.01±1.22 vs. 13.56±1.33,P< 0.05）,差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,（23.01±1.22 vs. 10.00±0.89,P<0.05）,差异有统计学意义。7肾组织PCNA的表达变化:假手术组大鼠肾组织PCNA仅在肾小管上皮细胞有极少量表达,与假手术组相比,对照组组PCNA表达（%）增加（0.73±0.08 vs. 6.08±0.68,P <0.05）,而rALR组表达较对照组明显上调（12.30±0.74 vs.6.08±0.68,P<0.05）,差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,（12.30±0.74 vs. 0.73±0.08,P<0.05）,差异有统计学意义。8肝组织PCNA的表达变化:假手术组大鼠肝组织PCNA仅在肝细胞有少量表达,与假手术组相比,对照组PCNA表达增加（2.33±0.11 vs. 8.27±0.30,P <0.05）,而rALR组表达较对照组明显上调（12.19±0.27 vs. 8.27±0.30,P<0.05）差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,（12.19±0.27 vs. 2.33±0.11,P<0.05）,差异有统计学意义。9 Western blot实验肾组织ALR蛋白表达情况:与假手术组相比,对照组ALR蛋白表达增加（0.62±0.02 vs. 0.69±0.03,P<0.05）,而rALR组表达较对照组显着增加（0.82±0.05 vs. 0.69±0.03, P<0.05）,差异具有统计学意义。10 Western blot实验肝组织ALR蛋白表达情况:与假手术组相比,对照组ALR蛋白表达增加（0.75±0.03 vs. 0.80±0.05,P<0.05）,而rALR组表达较对照组明显增加（0.89±0.02 vs. 0.80±0.05,P<0.05）,差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,（0.89±0.02 vs. 0.75±0.03,P<0.05）,差异有统计学意义。结论:1 5/6肾切除大鼠制作慢性肾衰竭动物模型,尽管这一方法复杂,但其机理明确,即通过减少肾组织导致肾功能衰竭,进一步并发贫血,模型成功率高。从生化、病理和代谢等方面接近人类慢性肾衰竭,从而有助于探讨慢性肾性贫血的发病机制。2 5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭动物模型中,肝肾组织ALR表达增加,可能为表明肾功能损害,造成贫血,肝脏肾脏ALR反应性增加,为机体代偿机制。3外源性给予rhALR后,5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠血EPO水平升高,贫血改善。肾脏病理间质纤维化改变减轻,肝肾组织ALR、PCNA表达明显上调,与EPO升高一致。证实rhALR具有促进EPO产生的作用,对5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠肾脏有保护作用。通过本实验研究, rhALR不仅能减轻5/6肾切除慢性肾衰竭模型大鼠肾性贫血,而且能降低血清BUN和SCr含量,改善其氮质血症状况。提示rhALR对5/6肾切除慢性肾衰竭模型大鼠肾功能有一定的保护性治疗作用。有关rhALR改善肾性贫血的机制,我们将作进一步研究。

王爱民,向英,耿焱,杨晓明,马志杰,楚瑞珏,王宝恩^[5]（2009）在《重组人肝再生增强因子可抑制大鼠肝星状细胞c-fos基因的表达》文中提出目的观察重组人肝再生增强因子（hALR）对大鼠肝星状细胞c-fos基因表达的影响。方法在培养的肝星状细胞株中加入高（200μg/L）、中（20μg/L）、低（2μg/L）3种浓度的hALR,于8、24、48、72 h四个时间点收集细胞,提取总RNA;用逆转录定量聚合酶链反应（PCR）方法测定c-fos的基因表达。结果高、中、低浓度的hALR 3组肝星状细胞c-fos基因的表达水平在8、24、48、72 h四个时间点均明显低于对照组;低剂量组为对照组的50%～53%,中剂量组为对照组的38%～43%,高剂量组为对照组的26%～30%。结论重组人肝再生增强因子对大鼠肝星状细胞c-fos基因的表达有明显抑制作用。

付德才^[6]（2008）在《甲珠防治肝纤维化基础及临床研究》文中提出肝纤维化是各种病因所致慢性肝病的共同病理过程,也是肝硬化发生的前奏和必经中间环节。其可逆性为临床防治肝硬化提供了良好契机,防治和逆转肝纤维化是延缓或阻止肝硬化发生的重要手段,为肝病患者延长寿命、提高生命质量提供了可能,是治疗各种慢性肝炎的远期目标。肝纤维化的防治和逆转已成为该领域国内外同行的研究热点。目前的研究认为,肝纤维化的病理改变是细胞外基质（ECM）的增生和降解失衡所致,近年来研究显示许多中医方药对肝纤维化有很好的治疗效果,并已展示良好的应用前景。从祖国医学辩证,认为肝纤维化是由于气滞、血瘀、络阻所致,肝纤维化初期主要为气滞,进而血瘀,最后络阻,气机不畅,肝纤维化、肝硬化形成。甲珠为穿山甲的鳞片,主归肝经,具有软坚、通络、散结的功效,是历代医家治疗症、瘕、集、聚的常用药,近来,被广泛用治肝硬化取得了较好的临床效果。本实验利用CCl4建立急性肝损伤和慢性肝纤维化的实验鼠动物模型,造模两周后采用中药甲珠不同剂量灌胃,干预肝纤维化的形成,观察实验效果,探讨其抗肝纤维化的机制,结果发现甲珠通过提高机体对自由基的清除能力,保护肝细胞,改善肝功能,减少肝纤维化发生发展的始动因素,对治疗组各肝纤维化指标有明显改善;通过临床病例治疗观察,进一步证实甲珠对肝纤维化的有一定的防治作用。为临床甲珠抗肝纤维化提供了理论基础。

郑着家^[7]（2008）在《中药红景天对大鼠肝组织HA、LN、ALR表达的影响及可能的抗纤机制》文中研究表明背景与目的:肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的中间病理阶段,目前的研究认为肝纤维化病变经过适当的积极治疗有希望延缓甚至逆转,而发展到肝硬化阶段则难以逆转。令人遗憾的是,目前临床上还缺乏公认的、确切有效的抗肝纤维化药物问世,肝纤维化的防治研究在今后一定时期内仍是国内外的热点与难点课题。我国的研究者在肝纤维化的防治研究领域经过数十年的悉心探索,逐步发现我国的许多传统中草药具有比较好的抗纤维化疗效,中药防治肝纤维化的研究显示出比较光明的发展前景。红景天在我国产量十分丰富,主产于东北、华北、西南、西北和华中等地,在抗高原病、抗辐射损伤以及抗衰老等方面广为应用,我们经过大量文献查阅,在理论上,证实红景天对四氯化碳诱导的实验大鼠具有保护肝细胞,抑制肝脏炎症反应,减少肝脏胶原沉积等良好的抗肝纤维化作用,但其具体机制目前尚不清楚。为了进一步探讨红景天抗肝纤维化的可能分子机理,本实验采用四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型,研究中药红景天对肝纤维化模型大鼠血清中AST、ALT、HA、LN含量和ALR表达的影响,观察红景天在动物整体环境下干预肝纤维化的疗效,初步探讨红景天干预大鼠实验性肝纤维化的可能分子机理,为将来进一步研发、开发红景天制剂用于临床防治肝纤维化提供初步的基础理论与动物实验依据。方法:取体重（200±20）g健康SD大鼠30只雌雄各半随机等分三组:空白组、模型和红景天组。用四氯化碳皮下注射法诱导大鼠肝纤维化模型,同时给与中药红景天灌胃进行干预性治疗。末次给药24h后,所有实验动物均行颈静脉穿刺采血3ml,置于预冷的抗凝EDTA试管中,即刻离心分离血浆,-70℃冰柜中保存待测。肝组织标本以10%甲醛固定24h,常规HE染色观察肝细胞变化,VG染色观察肝纤维化变化。AST、ALT测定采用全自动生化分析仪检测;HA、LN测定采用放射免疫法, ALR表达采用ELISA法。结果:（1）四氯化碳成功诱导大鼠肝纤维化,红景天显着改善肝组织病理学损害:四氯化碳成功诱导大鼠肝纤维化,HE染色光镜下可见模型组大鼠肝正常组织结构消失,肝细胞呈现广泛的脂肪变性、坏死。VG胶原染色可见模型组大鼠肝脏胶原纤维明显增生,汇管区、中央静脉区纤维间隔宽大,包绕分隔肝小叶,形成大量大小不等的假小叶。红景天组大鼠肝小叶结构清晰,细胞索排列整齐,肝细胞变性、坏死明显减轻,汇管区及小叶间仅有少量纤维组织增生,红景天干预性治疗使治疗组大鼠肝细胞的变性、坏死明显减轻。（2）四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清AST、ALT水平显着增强:在血清学指标方面,模型组及红景天组血清中AST、ALT均高于空白对照组（P<0.01）,但红景天组的AST、ALT升高幅度比模型组明显降低（P<0.01）,红景天干预性治疗能够明显降低肝纤维化大鼠血清中AST、ALT表达。（3）四氯化碳诱导的肝纤维化指标HA、LN水平显着增强:在肝纤维化指标方面,模型组及红景天组HA、LN均高于空白对照组（P<0.01）,但红景天组升高的幅度较模型组明显低（P<0.01）,红景天抑制肝纤维化大鼠HA、LN表达,显着减少大鼠肝脏胶原纤维沉积,减轻化学毒物引起的肝脏病理学损害,有效地防治四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化。（4）血清ALR表达检测结果在血清ALR表达方面,模型组及红景天组的ALR均高于空白对照组（P<0.05）,而红景天组升高的幅度较模型组明显高（P<0.01）,红景天可能通过增加ALR含量,抑制肝纤维化的形成。结论:（1）四氯化碳皮下注射法诱导大鼠肝纤维化具有操作简便、模型成功率高、病变典型、方法稳定等优点,可作为肝纤维化防治研究的首选动物模型。（2）四氯化碳皮下注射法诱导的大鼠肝纤维化伴有AST、ALT、HA、LN、ALR表达显着增高,可能参与肝纤维化的发生。（3）红景天干预性治疗能够明显降低实验大鼠血清AST、ALT、HA、LN表达水平,而促进ALR的表达,可能红景天通过促进ALR合成从而减少胶原纤维合成等机制,有效干预大鼠肝纤维化的发生。

田力^[8]（2007）在《超声造影剂携基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA阻逆大鼠肝纤维化的实验研究》文中研究表明基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重要酶类，几乎能降解ECM的所有成分，已发现26种，按作用底物不同分为胶原酶、明胶酶、基质溶素、膜型基质金属蛋白酶等。而基质金属蛋白酶抑制因子（Tissue inhibitor of Matrixmetalloproteinase，TIMP）是近年发现的MMPs的天然抑制剂，迄今发现有4种，TIMP-1、2、4为可溶性分泌蛋白，TIMP-3是一种结合ECM的非可溶性蛋白。TIMP主要功能是通过对MMPs的抑制作用，调节ECM代谢，抑制新生血管生成，阻碍MMPs介导的内皮细胞移动，抑制基质中促血管生成因子的释放，防止ECM降解，在ECM改建和肝纤维化的病理过程中发挥重要作用。肝纤维化是肝脏对慢性持续性损伤的一种“愈合反应”，是纤维增生和降解不平衡的结果。其中心环节是使胶原纤维沉积增多、降解减少，而决定纤维合成—降解平衡的关键又在于MMPs与TIMP之间的调节失衡。肝脏在各种损伤性因素的始动作用下激活肝星形细胞（hepatic stellate cells，HSC），使HSC由静息细胞转变为移行细胞，然后转分化为肌成纤维样细胞，转化后其重要功能之一是使TIMP合成及分泌增加。TIMP-1从2个方面抑制MMPs活性：1)在酶原活化阶段，TIMP与MMPs可形成稳定复合体，阻碍MMP的酶原自我激活：2)在活化的酶原阶段，TIMP可直接与活化的MMPs形成1：1复合体，抑制其活性。肝组织中主要来源于HSC的TIMP-1，能结合除MMP-14、19以外的所有MMPs而减低其表达活性，特别是与能特异性分解Ⅰ、Ⅲ型胶原的间质胶原酶MMP-1的结合，使大量间质胶原及纤维连接蛋白（FN）取代Disse氏腔内Ⅴ、Ⅳ、Ⅵ、ⅩⅣ胶原成分，在基质重构形成Disse氏腔纤维化中起重要作用。抗肝纤维化研究，一方面积极抑制胶原过度产生，另一方面应设法促进肝窦周过度沉积ECM胶原纤维的降解，抑制TIMP-1的表达可释放MMPs对ECM胶原纤维的降解，改善肝纤维化结构，为阻止甚或逆转肝纤维化提供条件。比较现代基因抑制研究中反义寡聚核苷酸（antisenseoligonucleotides，ODNs）技术、核酶（ribozymes）技术、DNA酶（DNAzymes）技术、RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，以RNAi技术设计构建目的基因的小干扰RNA（smoll interference RNA，siRNA）抑制效果明显优于对应的单链反义RNA和反义DNA，抑制效果高出上百倍，并且siRNA在很低浓度即显示较高活性而没有毒性；剂量反应曲线显示siRNA的IC50值比同一靶序列的反义寡核苷酸低100倍；RNAi高度特异性，siRNA中间位置单个碱基改变就可使RNAi失效，而针对同源基因共有序列的siRNA则导致同源基因共同失活：具有高度稳定性，siRNA在胎牛血清中的半衰期大约为24h，而反义寡核苷酸仅仅几分钟内就被降解。本课题利用RNAi技术设计TIMP-1的siRNA真核表达载体，以降解TIMP-1的mRNA，使TIMP-1在翻译过程中断，阻止其蛋白表达，解除对MMPs抑制。然而如何将所构建的TIMP-1 siRNA表达载体高效、安全转达肝组织并能在相应细胞中持续表达其抑制效果仍是所有基因治疗得以实现的关键问题。细胞膜是治疗基因进入细胞需要克服的屏障，其通透性改变是基因转染的前提。超声造影剂微泡技术研究并应用于临床，起初仅适用于超声诊断。新近研究发现，超声微泡表面所带负电荷能结合药物及基因大分子形成微泡—基因复合体。超声照射可使组织和体液内存在的微泡-基因复合体发生空化效应，使微泡破裂并释放所携基因药物。微泡破裂所形成的休克波使局部毛细血管通透性增加，并使细胞膜产生声孔（当声强为0.8W／cm-1.0W／cm时，用电子显微镜观察到内皮细胞膜出现缝隙），利于药物进入细胞间隙及细胞，实现目的基因在靶组织及细胞中的转染和表达。本课题应用RNAi技术构建抑制TIMP-1的真核表达载体TIMP-1 pRNAT-U6.2siRNA（TIMP-1 siRNA），并应用超声造影剂微泡技术携带TIMP-1 siRNA转染肝纤维化大鼠，观察其对大鼠血清学、肝组织结构形态学的影响，为肝纤维化基因治疗提供高效、特异基因及安全、有效基因转载途径。本实验分为以下四个部分。第一部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表达载体的构建及鉴定方法1．根据siRNA设计原则，在TIMP-1 mRNA序列中选择2个特异性靶序列（447-465nt、552-540nt）及1条无关对照序列。2．体外合成对应发卡样DNA片段，将其克隆入pGEM-T连接载体，BamH I和Xho I分别双酶切pGEM-T及表达载体pRNAT-U6.2，胶回收粘末端将特异序列定向亚克隆构建TIMP-1 pRNAT-U6.2／siRNA真核表达质粒并测序3．Lentivirus病毒包装构建TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA慢病毒表达载体。4．用脂质体包裹TIMP-1 siRNA质粒、单纯慢病毒表达载体分别转染T6细胞，荧光显微镜观察TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA质粒及病毒载体在T6中表达，RT-PCR及FQ-PCR检测T6细胞TIMP-1 mRNA在TIMP-1 siRNA干扰下的表达水平。5．统计学处理：所有数据均经SPSS10.0软件进行统计分析。计量资料用采用（?）±S表示；两组均数的比较用t检验（t-test）；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）。结果1．所构建的TIMP-1 pRNAT-U6.2／siRNA表达质粒，经酶切鉴定与测序，结果显示特定位点靶序列与设计序列完全一致。2．Lentiverus病毒包装的TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA病毒表达载体滴度1.2～2.8x06-7IU／ml。3．慢病毒载体转染T6细胞较脂质体包裹质粒效率高，si-447序列较si-552序列沉默效应高，P＜0.05。4．转染T6细胞后，细胞TIMP-1 mRNA表达显着降低，si-447质粒沉默效率（78±8.72）％，si-552沉默效率（54.3±5.51）％；病毒表达载体si-447的沉默效率（81.3±7.61）％，si-552（66.3±8.37）％；si-C与T6细胞内TIMP-1 mRNA无显着差异，P＞0.05。第二部分建立肝纤维化大鼠模型方法1．SPF级雄性Wistar大鼠，体质量（150±10）g，1％二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）按10 mg／kg，腹腔内注射，第1周连续3次，第2、3、4、5、6周各连续2次；对照组同时间、同剂量生理盐水腹腔注射。2．第1次注药后第1、2、4、6、8各周随机取5只大鼠，取血及肝组织，Elisa方法测血清TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；HE染色观察肝组织结构，按1995年肝纤维化分类标准鉴定；Masson染色观察肝组织胶原纤维含量，免疫组化检测肝组织内TIMP-1蛋白表达，原位杂交鉴定在肝组织内TIMP-1 mRNA表达。3．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积x 100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显着性，P＜0.05有统计学意义。结果1．一般状况：模型组大鼠于注射DMN 16天后开始出现尿黄，进食和饮水减少；第32天始大鼠陆续出现目黄，好斗，皮毛皱而不洁，渐嗜睡；第45天始4只大鼠出现腹水，第8周时，均见臌胀腹水，2只死亡。2．造模大鼠血清TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ动态变化：注药一周，TIMP-1即开始升高，后持续增强，4周后维持高值；MMP-1含量2周处高峰，随后缓慢降低，8周时含量最低，然而仍高出正常对照组；HA含量注药后一周升幅达2倍，后持续增高，至6周时处高峰；LN注药后小幅增长至6周达高峰；CP-Ⅰ含量注药后1周始较对照组升高，6周处高峰；CP-Ⅲ含量用药后小幅升高，6周处于高峰。3．原位杂交及免疫组化评价肝组织内TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达及Masson染色观察肝胶原纤维含量：TIMP-1 mRNA及蛋白在肝纤维化造模早期1周时表达均增高，较对照组有显着性差异，P＜0.001；随用药次数及时间表达持续增高，6周、8周TIMP-1 mRNA呈高表达，但其两者差异不明显；肝胶原纤维百分含量4周前表达量较对照组虽有显着性差异，P＜0.05，但增幅不大；4周后，肝胶原纤维显着持续增高，8周时达：17.3±1.95。4．大鼠肝组织病理学变化：模型组大鼠用药后1周即可见肝细胞变性及小点状坏死灶，汇管区炎症，窦周及小叶内少量纤维沉积；2w时，部分小叶内点片状坏死灶，部分大鼠肝组织汇管区周围纤维沉积，纤维间隔形成；4 w时，大部分大鼠肝组织见肝细胞变性及融合坏死灶，纤维间隔伴小叶结构紊乱，符合肝纤维化3级，至6 w后停用DMN时，大鼠肝纤维化达到2～3级，大部分在3级，偶有4级片子；至8 w，所有大鼠肝纤维化达到3～4级，大部分4级。第三部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表达载体转染肝纤维化大鼠对大鼠血清学、肝形态学的影响方法1．分组：造模成功大鼠分为TIMP-1 siRNA病毒载体组（T-si组：24只肝纤维化大鼠，20μl病毒载体＋200μl生理盐水），模型对照组（对照组：24只肝纤维化大鼠，220μl生理盐水），正常组(24只未经特殊处理Wister大鼠220μl生理盐水，以上药物均经大鼠阴茎静脉快速注射。注药后分别在2d、1w及2w处死，取血及肝组织（一部分4％多聚甲醛处理石蜡包埋，另部分-80℃冷冻切片y荧光纤维镜下观察及免疫组化等）。2．标本处理：双抗体夹心ABC-ELISA法测TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量（浓度：ng／ml）；HE染色观察肝组织结构及损伤分级；Masson染色测定肝组织胶原纤维含量；原位杂交、免疫组化法观察肝内TIMP-1 mRNA及蛋白分布；荧光显微镜下观察肝组织内TIMP-1 siRNA慢病毒表达载体肝组织内转染效率。3．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积×100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显着性，P＜0.05有统计学意义。结果1．488 nm激发光荧光显微镜观察，507 nm的荧光照像，软件分析视野中绿色荧光强度值。2 d后，T-si组肝、肾、心肌组织切片中均有散在TIMP-1 siRNA慢病毒表达载体的绿色荧光表达，2．肝组织内免疫组化、原位杂交及Masson染色显示：2 d处死的大鼠肝组织胶原纤维、TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达均较造模组百分含量无显着性差异，P＞0.05；1 w后，肝组织TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达、胶原纤维含量均较造模组减低，P＜0.05；2 w后，肝组织TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达均较造模组减低，P＜0.05，肝组织内胶原纤维含量较第1 w组有显着性差异（P＜0.05），较造模组差异显着，P＜0.001。3．ELISA方法检测血清：2 d，TIMP-1、MMP-1及LN较对照组有显着性差异（P＜0.05），HA、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量较造模组差异不明显，P＞0.05；2 w，TIMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量均较对照组有显着降低，P＜0.001，MMP-1含量较对照组显着增高，P＜0.001；2 w后各参数改变较1w后有显着差异（P＜0.05），但幅度减缓。第四部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA在超声造影剂及超声辐照干预下对纤维化大鼠的影响方法1．超声造影剂及基因载体混合：SonoVue是单分子层磷脂外壳的六氟化硫粉末，额定生理盐水注入后形成亲水端朝外、疏水链在内的六面体结构微泡，平均直径2.5μm，浓度（1～5）×108／ml。TIMP-1 siRNA及造影剂以1：10混匀，置4℃冰箱30 min，使2者混合充分。2．分组：TIMP-1 siRNA病毒组（Ⅴ组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl生理盐水：TIMP-1 siRNA病毒混合超声微泡组（V＋B组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl造影剂；TIMP-1 siRNA病毒混合超声微泡＋肝区超声辐照组（V＋B＋U组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl造影剂，同时机械指数（MI） 1.0超声辐照肝区5 min；造模对照组（C组）：220μl生理盐水，以上药物均经大鼠阴茎静脉快速注射。分别于2 d、1 w及2w后各组随机处理8只：取血、无菌取肝肾及心肌组织，两份保存，一份入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，另一份迅速冻存。3．标本处理：ELISA方法测TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；各组织快冷冻切片，荧光显微镜观察组织内TIMP-1 siRNA的荧光表达；HE、Masson染色观察肝组织结构及胶原含量；提取肝组织总RNA，逆转录做荧光定量RT-PCR检测肝组织内TIMP-1 mRNA表达量。4．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积x 100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显着性，P＜0.05有统计学意义。结果1．转染2 d后，V＋B＋U组肝组织内TIMP-1 siRNA绿色荧光表达量显着高于其它各组（P＜0.001），V组、V＋B组各组织见散在绿色TIMP-1 siRNA表达，组间差异不明显（P＞0.05）；V＋B＋U组可见荧光表达呈树枝状强化。2．肝组织内胶原纤维含量：用药后2d，V＋B＋U组TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白及肝内胶原纤维含量均有降低，较对照组差异显着，P＜0.05；V组及V＋B组较对照组差异不明显，P＞0.05；1w及2w后，V＋B＋U组TIMP-1mRNA及蛋白、胶原纤维含量减低，均较对照组及V组、V＋B组差异显着（P均＜0.001），V组、V＋B组组间差异不明显（P＞0.05）。3．ELISA方法检测测大鼠血清显示：2d时，V组、V＋B组各测值除TIMP-1 MRNA较对照组减低外（P＜0.05），其余各测值均较对照组无显着差异，P＞0.05；V＋B＋U组MMP-1较对照组显着增高，余测值均较对照组减低，差异显着（P均＜0.05）；1w及2w后，V＋B＋U组各测值均较对照组及V组、V＋B组差异显着（P均＜0.001），V组、V＋B组各测值组间无显着差异（P均＞0.05）。4．FQ-PCR检测肝组织内TIMP-1 mRNA表达量：1w后，V＋B＋U组对TIMP-1mRNA抑制效率为73.1％，V＋B组及V组抑制效率分别为47.1％，40.3％；2 w后，V＋B＋U组抑制效率为85.5％，V组抑制效率为68.4％，V＋B组抑制效率为66.4％。结论1．成功筛选构建了TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA真核表达质粒及Lentivirus病毒包装的TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA慢病毒表达载体。2．首次将TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA质粒及TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA／LentisiRNA慢病毒载体转染肝星形细胞（T6），鉴定其对TIMP-1表达的沉默效应，TIMP-1基因447-470bp做为siRNA插入序列的表达载体沉默效应最显着。3．应用肝毒性药物DMN成功建立大鼠肝纤维化模型，系统观察造模各时期肝组织结构形态学变化及血清学相关指标的改变，为研究肝纤维化病理及治疗肝纤维化提供实验依据。4．首次将TIMP-1 siRNA静脉注射于活体肝纤维化大鼠体内，在体抑制TIMP-1表达显着，血清MMP-1含量增高，TIMP-1及HA、CP-1等相关肝纤维指标降低，纤维化肝组织内胶原纤维含量减少、肝组织结构有一定改善。5．首次应用超声造影剂混合TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA共同输注肝纤维化大鼠体内，应用高机械指数超声辐照肝组织，使TIMP-1 pRNAT-U6.2／LentisiRNA表达载体在肝脏高浓度表达，起到将目的基因定位释放于肝组织作用，为安全、靶向基因治疗肝纤维化提供有效转载途径。本项目的特色与创新之处：（1）肝星形细胞（HSC）激活是肝细胞外基质过度沉积形成肝纤维化的基础，而基质金属蛋白酶及其抑制因子的调节失衡是核心，以往研究多在抑制肝星形细胞的激活，而肝星形细胞的激活呈多因素，难以充分抑制。本课题针对核心中基质金属蛋白酶抑制因子-1，应用基因抑制先进的RNA干扰技术及新的pRNAT-U6.2／Lenti表达载体系统，首次将其应用在肝纤维化研究中，为肝纤维化基因治疗提供有效靶基因及工具。（2）首次将TIMP-1小干扰RNA表达载体应用超声造影剂携带，在高机械指数超声辐照条件下探索将目的基因定向释放于靶器官肝组织的的方法，提高基因转染效率、减低基因对非目的器官干扰，为肝纤维化基因治疗提供高效、安全转运途径。

陈俊杰^[9]（2007）在《重组人肝再生增强因子的表达和活性研究》文中提出人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration，hALR）是从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子，除促进肝细胞增殖外，还能保护肝脏，预防肝纤维化。本实验采用毕赤酵母表达系统，以分泌方式高效表达重组hALR（rhALR），通过色谱法分离纯化获得高纯度rhALR，并对rhALR的生物学活性进行了研究。设计引物从pBV220-hALR上扩增hALR基因片断，构建重组酵母表达质粒pPICZαA-hALR；经验证正确后，表达质粒pPICZαA-hALR线形化浓缩，转化P．pastoris GS115形成重组转化子；重组酵母菌经PCR鉴定、高浓度Zeocin抗性筛选得多拷贝子，经0.5％甲醇诱导培养后，在培养上清中发现rhALR；Western-blot分析表明，在酵母培养上清中rhALR以二聚体形式存在，分子量为30kD；扫描分析结果表明，酵母培养上清中rhALR占总蛋白的66％，总量约为100mg／L。酵母培养上清经70％饱和硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐和低盐透析两种方法处理，用Sepharose DEAE Fast Flow柱和Sephadex G75柱两步纯化，可得纯度约为90％的rhALR，回收率约为26％。体外细胞活性实验表明，rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞增殖；在大鼠1／3肝切模型中，rhALR明显促进肝细胞再生，使有丝分裂指数（MI）、细胞增殖核抗原（PCNA）增多；在大鼠D-氨基半乳糖急性肝损伤模型中，100μg／L rhALR能提高D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠的存活率。通过上述实验，成功构建了人肝再生增强因子重组毕赤酵母表达菌，并获得高纯度有活性的rhALR。

缪锡民^[10]（2006）在《肝纤维化发生机制研究进展》文中研究表明一、概述肝纤维化是机体对肝脏损伤所表现出来的一种正常生理反应,它对保持肝脏组织细胞完整和功能发挥重要作用。当肝脏慢性持续损伤时,细胞外基质（ECM）合成和降解失去平衡时, 才会造成ECM过度沉积这一病理改变。肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理过程,进一步发展,肝小叶改建,假小叶、结节再生则成为肝硬化。以下对2000年来有关参与肝纤维化发生机制研究作一综述。二、肝纤维化发生的病因包括病毒性肝炎,酒精性肝病,药物和毒物引起的中毒性肝炎,血吸虫肝病,胆汁淤积、自身免疫及代谢异常性疾病（Wilson病,血色病）等。

二、重组人肝再生增强因子可增强大鼠肝星状细胞间质胶原酶基因的表达（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、重组人肝再生增强因子可增强大鼠肝星状细胞间质胶原酶基因的表达（论文提纲范文）

（1）重组腺病毒ALR的构建及过表达ALR在软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变性中的作用（论文提纲范文）

（2）肝再生增强因子在HBV相关肝硬化患者中的表达及意义（论文提纲范文）

（3）重组人肝再生增强因子对5/6肾切除大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1和Ⅳ型胶原表达的影响（论文提纲范文）

（4）重组肝再生增强因子对5/6肾切除大鼠模型肾性贫血的影响（论文提纲范文）

（6）甲珠防治肝纤维化基础及临床研究（论文提纲范文）

（7）中药红景天对大鼠肝组织HA、LN、ALR表达的影响及可能的抗纤机制（论文提纲范文）

（8）超声造影剂携基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA阻逆大鼠肝纤维化的实验研究（论文提纲范文）

（9）重组人肝再生增强因子的表达和活性研究（论文提纲范文）

四、重组人肝再生增强因子可增强大鼠肝星状细胞间质胶原酶基因的表达（论文参考文献）

• [1]重组腺病毒ALR的构建及过表达ALR在软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变性中的作用[D]. 杨娇. 重庆医科大学, 2016(02)
• [2]肝再生增强因子在HBV相关肝硬化患者中的表达及意义[J]. 陈文,杨春,毕义亮,唐黎,吴刚,邓存良. 世界华人消化杂志, 2014(03)
• [3]重组人肝再生增强因子对5/6肾切除大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1和Ⅳ型胶原表达的影响[D]. 郭珊珊. 河北医科大学, 2011(10)
• [4]重组肝再生增强因子对5/6肾切除大鼠模型肾性贫血的影响[D]. 王学敏. 河北医科大学, 2010(04)
• [5]重组人肝再生增强因子可抑制大鼠肝星状细胞c-fos基因的表达[J]. 王爱民,向英,耿焱,杨晓明,马志杰,楚瑞珏,王宝恩. 中华实验外科杂志, 2009(07)
• [6]甲珠防治肝纤维化基础及临床研究[D]. 付德才. 吉林大学, 2008(11)
• [7]中药红景天对大鼠肝组织HA、LN、ALR表达的影响及可能的抗纤机制[D]. 郑着家. 吉林大学, 2008(10)
• [8]超声造影剂携基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA阻逆大鼠肝纤维化的实验研究[D]. 田力. 郑州大学, 2007(06)
• [9]重组人肝再生增强因子的表达和活性研究[D]. 陈俊杰. 沈阳药科大学, 2007(05)
• [10]肝纤维化发生机制研究进展[A]. 缪锡民. 第九次浙江省中西医结合肝病学术会议论文汇编, 2006

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