一、广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A_2的基因克隆与序列分析（论文文献综述）
刘彬[1]（2014）在《粘质沙雷氏菌磷脂酶A2基因的克隆表达及应用》文中指出粘质沙雷氏菌（S.marcescens）能够分泌一种非特异性的磷脂酶A2,磷脂酶A2主要靠Ca2+在体内分布。可分为分泌型（PLA2-Ⅰ和PLA2-Ⅱ）和胞质型（PLA2-Ⅲ和PLA2-Ⅳ）两种。本文从粘质沙雷氏菌中首次成功克隆出磷脂酶A2基因（p1A2）,与pUCm-T载体连接,构建克隆载体pUCm-T-plA2。测序正确后,构建表达载体pET-15b-plA2并测序。将重组表达质粒pET-15b-plA2,转化到BL21（DE3）,IPTG诱导表达,对表达条件进行了优化。经SDS-PAGE电泳鉴定,分子质量约为27KD,主要以包涵体形式存在。优化表达条件,确定最优条件为：pH6.5,37℃培养,转接量1：60,IPTG终浓度0.4mM,诱导6h,采用Ni纯化柱。对纯化后的样品进行了活性测定,其酶比活为137U/mg。分别以大豆卵磷脂和动物卵磷脂作为底物测定重组磷脂酶的Km值分别为：0.059mM和0.124mM,确定重组磷脂酶的最适底物为大豆卵磷脂。对不同底物浓度、PH、缓冲液离子强度的重组磷脂酶的活性进行了分析,确定底物浓度7%,PH6.0,缓冲液离子强度30Mm酶活最大.。同时利用重组酶进行了大豆油油脱胶的应用,实验表明当脱胶时间3h,酶用量15μL/Kg,脱胶温度40℃时脱胶效果最佳,本文研制的磷脂酶A2对于酶法脱胶大规模应用打下基础,成本低,克服了化工法脱胶产生的污染,脱胶过程是利用磷脂酶水解脂肪酸链生成溶血磷脂,溶血磷脂具有很好的水化性,水化的方法可以将它除去。
刘丹丹[2]（2013）在《Lactobacillus casei磷脂酶A2基因的克隆及重组表达》文中研究指明目前广泛应用的磷脂酶A2（PLA2）主要来源于哺乳动物体内，如蜂毒、蛇毒等，但相比较而言，微生物来源PLA2在规模化生产上具有更大的优势，所以本文从干酪乳杆菌中克隆得到磷脂酶A2基因，在不同载体中表达出具有活性的目的蛋白，并对重组菌的发酵产酶条件进行摇瓶发酵条件优化，以期获得较高的酶活，通过目的蛋白纯化后对其酶学性质及水解大豆卵磷脂的条件进行初步分析，研究其实际应用范围。以干酪乳杆菌染色体基因组为模板PCR扩增出编码磷脂酶A2的成熟肽基因pla2a。构建克隆质粒pMD-pla2a，测序后比对结果相似度均在99%以上。构建的重组表达质粒pET28a-pla2a转化大肠杆菌，成功构建重组大肠杆菌（pET28a-pla2a）硼砂卵黄平板检测具有磷脂酶A2活性，SDS-PAGE电泳检测分子量约为17kDa，与预期大小一致。对重组菌E.coli-pET28a-pla2a的发酵条件进行优化，在LB培养基中IPTG的最佳诱导条件：IPTG加入时间2h，诱导温度25℃，诱导剂浓度0.1mmol/L，诱导时间4h，最高酶活为2.8±0.2U/mL；LB培养基中，乳糖诱导的最佳条件为：乳糖加入时间2h，诱导温度为25℃，诱导时间为6h，酶活达到2.5±0.2U/mL；TB培养基中，乳糖诱导条件：加入时间3h，诱导温度25℃，诱导时间为10h，最大酶活为3.0±0.2U/mL。以干酪乳杆菌染色体基因组为模板PCR扩增出编码磷脂酶A2的全基因pla2b。成功构建重组表达质粒pHY-P43-pla2b和pPIC-CP-pla2a，对重组枯草芽孢杆菌（pHY-P43-pla2b）和重组毕赤酵母（pPIC-CP-pla2a）各生长阶段的酶活力测定显示，重组菌枯草芽孢杆菌（pHY-P43-pla2b）最大酶活为1.5±0.2U/mL。重组毕赤酵母（pPIC-CP-pla2a）酶活最大为2.0±0.2U/mL。通过Ni-螯合柱对重组酶进行纯化，SDS-PAGE分析得到的目的蛋白纯度在95%以上，比酶活为110U/mg。对磷脂酶A2的酶学性质分析后显示，重组酶的最适反应温度为37℃，最适pH为8.0，在50℃以下具有较好的热稳定性，并且在65℃保温1h酶活基本不变。以大豆磷脂为底物，研究了本实验发酵得到的磷脂酶A2水解磷脂的条件为：酶浓度2.5U/g，反应温度37℃，起始pH8.0，Ca2+浓度50mmol/L，反应时间8h，每克磷脂生成游离脂肪酸的量为781μmol，磷脂平均转化率为60.6%。
邓疆渝[3]（2011）在《白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究》文中提出白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）属于蝮亚科（Crotalinae）竹叶青属（Trimeresurus）,为剧毒蛇,是我国特有的毒蛇,主要分布于重庆、云南、四川、贵州、福建、海南、广东、广西和台湾等地区。蝮亚科毒蛇的蛇毒中含有多种可以影响血液系统的酶类,其中磷脂酶A2受到广泛的关注。磷脂酶A2在哺乳动物胰脏和蛇毒毒液中含量较丰富,它能专一催化3-Sn-甘油磷脂2位酰脂键的水解反应,生成溶血磷脂和脂肪酸,还表现出多种药理性质,例如,出血毒性、溶血活性、肌肉毒性、抗凝和诱导水肿等作用。正是由于其特殊的结构和丰富的生物活性,有些蛇毒的磷脂酶A2已经成为蛋白质结构和功能研究的重要模型。国内外先后对五步蛇（Agkistrodom. acutus）、蝮蛇（Agkistrodom. halys Pallas）、竹叶青（Trimeresurus Stejnegeri）、烙铁头（T. mucrosquamatus）等多种蛇毒的磷脂酶A2进行过报道,而对中国产白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A2的研究未见报道。本研究以中国产白唇竹叶青蛇毒为研究对象,从中分离纯化一种磷脂酶A2,并对其性质进行研究,主要研究工作包括以下几个方面:1.利用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析,Sephadex G-75凝胶层析和Q-Sepharose FF预装柱三步色谱法进行分离纯化,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出一种分子量约为17.2 KDa的磷脂酶A2。电泳结果显示该酶在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明磷脂酶A2是仅由单一肽链组成的蛋白分子。2.对分离纯化出来的磷脂酶A2的性质进行了分析研究。测得该酶的比活力为4.625×104U/mg,酶的最适作用温度为50℃左右,最适pH值为8.0左右,热稳定性较好;Ca2+、K+、Na+对其酶活性具有增强作用,而Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+则对其酶活性具有明显的抑制作用;EDTA和EGTA对酶活性具有抑制作用,而DTT、PMSF和β-巯基乙醇对酶活性稍有影响,但是影响不大;无蛋白水解活性、精氨酸酯酶活性和类凝血酶活性;有一定的抗胰蛋白酶活性和间接溶血活性;动物实验显示没有水肿活性。
林文珍,舒雨雁,庄茂辛,林政炯,吴祥甫,周元聪[4]（2007）在《广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1在不同载体的表达》文中进行了进一步梳理目的构建广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1（APLA2-1）在不同载体的重组表达质粒,在E.coli中表达APLA2-1并比较不同表达系统对APLA2-1的表达效果。方法将广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1（AP-LA2-1）基因克隆至表达载体pBLMVL2和pET28a（+）,分别转化入大肠杆菌RR1和BL21,经过诱导表达,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及Western blot观察重组蛋白表达情况。结果成功构建了重组质粒pBLMVL2-APLA2-1和pET28a-APLA2-1。pBLMVL2-APLA2-1在SDS-PAGE上没见明显表达带,在Western blot上可见一14 kD的表达带。pET28a-APLA2-1在SDS-PAGE上有一明显的18 kD表达条带,表达产物AP-LA2-1约占细菌总量30%,并以包涵体的形式存在。结论APLA2-1可在大肠杆菌中表达,pET28a（+）对APLA2-1的表达效果优于pBLMVL2。
徐春花[5]（2007）在《金环蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化、分子克隆以及生理活性研究》文中研究指明磷脂酶A2（PLA2；EC 3．1．1．4）是一类专一性催化3-sn-甘油磷脂2位脂酰键的水解反应，生成溶血磷脂和脂肪酸的酶类（Kini，1997）。PEA2表现出多种药理活性，如促进或抑制血小板集聚、出血、溶血、促凝或抗凝、抗菌、抗肿瘤等，并参与多种细胞程序（Takagi et al．，1988；Min Zhou Huang et al．，1997；Veridiana et al．，2004；Patricia et al．，2004；Robin et al．，2003）。蛇毒中含有丰富的PEA2，通常一种蛇能分泌出具有多种药理活性的PEA2，这是蛇为了自身防卫及捕获不同猎物的需要进化产生的。目前已经分离纯化或基因克隆得到的蛇毒PLA2有三百多种，是一类研究得最为广泛的蛋白质之一。金环蛇属于眼镜蛇科环蛇属，在我国主要分布于西南部，目前还没有从金环蛇蛇毒中分离纯化磷脂酶并克隆得到核苷酸全序列的报道。本实验首次从广西产金环蛇蛇毒中分离纯化得到一种PEA2，命名为BFPA，属于IA类PEA2。分离过程包括：SephadexG-50凝胶过滤层析和SP Sephadex C-25阳离子交换层析和反向高压液相色谱（RP-HPLC），最后得到纯品蛇毒磷脂酶，测得其分子量接近14KDa，等电点为7．54。该酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用，进一步活性测定表明它还有抗凝血和抗肿瘤活性。我们测定了该磷脂酶的N-末端氨基酸序列，根据种属关系接近的蛇毒PLA2的保守的信号肽序列设计出5＇引物，以构建的金环蛇毒腺的cDNA文库为模板，通过PCR扩增得到700bp左右的产物，然后插入到PMD18-T载体中转化大肠杆菌，对得到的阳性克隆测序。分析发现其中一个克隆翻译得到氨基gear列与N-末端测序结果相吻合，该序列总长度为635bp，包括开放阅读框435bp和3＇polyA非编码区域200bp，氨基酸序列中总共含有15个半胱氨酸，除了形成7对分子内二硫键，另外一个多余的半胱氨酸推测可能是用来形成分子间的二硫桥。另外，同时克隆得了14个不同核苷酸序列也同样编码PEA2，它们之间的序列同源性大于75％。这14条序列最终编码9种PEA2，全序列包含27个氨基酸的信号肽和118个氨基酸组成的成熟肽，均含有14个半胱氨酸，具有典型的Ⅰ类PEA2 11位和77位特征的二硫键，及非常保守的催化网络和Ca2+结合环。分子量为13～14kDa，等电点大部分偏碱性。为了更深入了解这些序列的同源性关系和在磷脂酶A2中的进化地位，我们进一步把这些序列与其它蛇毒来源的Ⅰ型及Ⅱ型PLA2进行比对并作了进化关系分析。通过分析这些基因同义突变和错义突变位点，推测存在中性进化现象，而且在进化过程中它们的一些活性位点都相当保守。本研究首次从金环蛇蛇毒中分离纯化得到具有抗菌作用的PLA2，通过分子克隆得到该酶的全序列，并且克隆了一系列的同源基因。研究结果为相应领域的深入研究提供资料和思路。
包永明[6]（2006）在《白眉蝮蛇新磷脂酶A2同源物的研究》文中认为长白山白眉蝮蛇（Agkisttvdon blomhoffii ussurensis）属于蝰蛇科蝮蛇亚科白眉蝮乌苏里亚种,俗名目本本蝮蛇（Manushi）,主要分布于我国东北部、朝鲜及俄罗斯的部分地区;蛇毒中的磷脂酶A2同源物（phospholipaseA2,PLA2）除了酶活性外,具有多种生物学活性,是蛋白质结构与功能研究的理想天然蛋白。 本研究以小白鼠的腹腔注射给药,无出血致死作为检测指标,采用Hitrap SP阳离子交换、Superdex 75凝胶过滤层析、Source Q阴离子交换层析三步纯化方法,从长白山白眉蝮蛇蛇毒中纯化神经毒素,得率是3.25%;同时建立的抗毒素特异性IgY配基一步亲和层析纯化神经毒素,得率可达12.9%,是三步纯化方法的4倍。该蛋白质经变性聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）检测为一条带,与凝胶过滤测定的分子量相符,是单链多肽;质谱检测分子量为13881.854±0.33 Da;等电聚焦测定等电点约为8.56。 通过对分离白眉蝮蛇神经毒素进行的氨基酸组成分析,N-端氨基酸测定,肽质谱指纹图谱分析,结合cDNA序列测定,确定了该毒素的一级结构,具有典型的第二类磷脂酶A2结构特征,第49位是Gln,是PLA2数据库中一个新的磷脂酶A2同源物,命名为Gln49-PLA2,它含有122个氨基酸残基,14个Cys,可能形成7对二硫键,与Asp49-PLA2s的同源性（93%-61%）高于Lys49-PLA2s（60%-56%）,进化树分析结果表明,Gln49-PLA2和Asp49-PLA2s的亲缘关系要近于Lys49-PLA2s。 Gln49-PLA2的体外卵磷脂为底物的PLA2酶活性检测、红细胞的直接和间接溶血活性检测、寓含血小板血浆的抗凝血活性检测,大肠杆菌的抑菌实验,结果表明该蛋白质没有PLA2活性、溶血活性、抑菌活性,但具有抗凝血作用,浓度高于0.2mg/ml时,随物浓度的增加,复钙时间显着延长;氨基酸序列分析和三级结构模拟结果表明一级结构氨基酸残基序列的变化,特别是49位Gln残基取代Asp是PLA2水解活性丧失的主要原因,同时证明抗凝血活性位点与水解活性位点相互独立。
卜鹏程[7]（2004）在《长白山白眉蝮蛇磷脂酶A2的基因工程研究》文中研究指明根据实验室从长白山白眉蝮蛇中纯化的磷脂酶A2的N端氨基酸测序和肽质谱分析结果，设计特异性引物，通过3′-RACE和RT-PCR分离出了编码该蛋白的基因。该基因含有366个核苷酸，编码122个氨基酸。 氨基酸序列分析和三级结构模拟表明，分离得到的磷脂酶A2具有第Ⅱ类磷脂酶A2的典型结构；分离得到的磷脂酶A2位氨基酸残基是Gln，是一种新的磷脂酶A2，命名为Gln49-PLA2：Gln49-PLA2没有磷脂酶A2的活性，可能是Gln残基与钙离子的电荷不相容而干扰了钙离子的结合所致。 磷脂酶A2的序列对比分析结果表明，Gln49-PLA2和Asp49-PLA2s的同源性（93％-61％）要高于Lys49-PLA2s（60％-56％）；进化树分析结果也表明，Gln49-PLA2和Asp49-PLA2s的亲缘关系要近于Lys49-PLA2s。 将Gln49-PLA2基因克隆到表达载体pET-32a（+）中，经热激转化大肠杆菌BL21（DE3），通过IPTC诱导，Gln49-PLA2基因在大肠杆菌中得到了可溶性表达。Western blot显示，纯化后的目的蛋白能与天然Gln49-PLA2免疫得到的鸡抗Gln49-PLA2免疫球蛋白（IgY）产生抗原-抗体反应。优化培养条件表明在30℃诱导6小时，Gln49-PLA2得到了较高水平的可溶性表达，目的蛋白在可溶组分中相对含量达到19.6％。通过固定化金属亲和层析、阴离子交换、疏水层析融合蛋白得到了纯化，其纯度可达91％。重组Gln49-PLA2具有明显的抗凝血活性，并对Hela细胞的生长有抑制作用，其IC50为2.8 μmol/L。
叶勇[8]（2003）在《江浙蝮蛇毒镇痛C4组分提取纯化及其对内阿片肽调控机理研究》文中认为本论文的研究源于中药戒毒制剂冰茶栓，它是导师王泽时教授经过多年研制的，以江浙蝮蛇毒为君药的中药复方制剂，能显着控制以疼痛为主的戒断症状。探索江浙蝮蛇毒在戒毒镇痛中所起的作用，对于阐明冰茶栓的作用机理具有十分重要的意义。但江浙蝮蛇毒是一种复杂蛋白，其中每一种蛋白均有不同的药理作用，因此需要从中分离出一种具有良好戒毒镇痛效果的蛋白质，明确其性质，才能进行相关的机理研究。本论文基于此目的，分离筛选出一种江浙蝮蛇毒碱性蛋白质，揭示了它的理化性质、作用途径及对中枢神经递质的调控机理，从而为江浙蝮蛇毒的新药开发奠定了理论基础。 第一部分 冰茶栓靶基因及靶药物的筛选研究 通过冰茶栓药物靶作用的研究，发现冰茶栓能显着控制海洛因依赖猴的戒断症状，同时通过猴大脑中枢纹状体组织的基因芯片研究，找到其有显着性差异表达的基因。用剂量递增法形成海洛因依赖性猴，并进行等级评分，判定猴对海洛因的依赖程度。当形成依赖后，撤药期间，取正常组、阴性组和冰茶栓治疗组猴，从心脏直接注入空气处死，立即取下大脑纹状体，液氮保存。通过总RNA抽提，预杂交和探针标记，将对照组和实验组分别标记Cy3和Cy5荧光，通过荧光信号强度和比值，判断差异表达基因。 戒断评分结果显示：冰茶栓治疗组的分值与阴性对照组有显着差异，但与阳性可乐定组无差异，海洛因依赖猴大脑纹状体基因表达在戒断期和冰茶栓治疗期出现了二个显着性差异基因，分别为前脑啡肽原（Preproenkephalin）和白细胞抗原（HLA-SB（DP）alpha）基因。当猴形成海洛因依赖后，其前脑啡肤原基因表达下调，而经冰茶栓治疗后，其前脑啡肤原基因表达上调，白细胞抗原基因表达下调。提示冰茶栓一方面促进了前脑啡肤原基因的表达，另一方面抑制了白细胞抗原基因的表达，然后达到控制戒断症状的疗效。用均匀设计方法对冰茶栓进行拆方研究，结果提示:江浙蝮蛇毒是冰茶栓中起镇痛作用的靶药物。 第二部分江浙蝮蛇毒组分的分离纯化和镇痛C4组分的筛选及其理化性质研究 探索冰茶栓的主要镇痛活性物质一一江浙蝮蛇毒中可能存在着相关蛋白。采用AKTA一ExPlorer100蛋白质纯化平台，对江浙蝮蛇毒各蛋白质组分进行了提取、分离和纯化，结合镇痛药效和毒性实验筛选最佳镇痛组分;并采用SDS一PAGE、等电聚焦、HPLC等方法获得分子量、等电点和纯度，用紫外光谱及氨基酸序列等进一步明确其理化性质。 分离实验中用阳离子交换柱、阴离子交换柱、分子筛和不同型号的分离介质，对江浙蝮蛇毒的分离效果进行了考察。采用正交设计L，（3’）考察了缓冲液pH、流速、盐浓度等分离参数对分离效果的影响;并用SCoLlting进行方法学考察。确定了先后以离子交换，两种型号分子筛的三步法，最终可获得蛋白质分离纯度为97.5%以上的纯品。 江浙蝮蛇毒经分离纯化，分离出14个蛋白组分，其中酸性组分5个，碱性组分5个，中性组分4个。进行分子筛纯化时，小流速洗脱分离效果最佳。 对分离出的各蛋白组分以小鼠热板法和醋酸扭体法进行E氏，和L氏，的测定。发现一种碱性蛋白质具有较强的镇痛作用和较低毒性，腹腔给药的LD。。为13.33mg/Kg，ED。，为0.63mg/Kg，该组分静脉注射30分钟起效，镇痛强度在5小时达高峰，并持续10小时以上，具有较好的应用价值。编号为C4（为阳离子交换柱分离的4号峰）。 C4组分测定分子量为16.6KD，等电点为8.8，在波长214.16n:和302.Osnm处有最大吸收，在273.09nrn处有最小吸收。H尸LC测定其纯度为92%，具有热不稳定性。该蛋白质N端的前10个氨基酸序列为:H一L一L一Q一F一R一K一M一I一K，经同源性比较，发现它与磷脂酶A2有同源性，但其分子量、HPLC保留时间、热不稳定性均不同于磷脂酶A2。 经大鼠催促戒断试验、大鼠自然戒断试验和C4组分的耐受性试验均表明，C4组分在长期用药过程中不产生身体耐受性和依赖性。 第三部分江浙蝮蛇毒镇痛C4组分的中枢作用研究 江浙蝮蛇毒镇痛C4组分具有镇痛作用，但它是否是中枢镇痛作用?其作用的部位又在哪里?是对其作进一步研究必须回答的问题。因此本实验研究了药物作用之靶区，及其C4组分对大脑中枢镇痛作用之靶点。 通过纳络酮、利血平、阿托品药物对江浙蝮蛇毒C4组分镇痛作用影响的实验，结果表明:阿托品对江浙蝮蛇毒C4组分的镇痛作用无影响，它不作用于乙酞胆碱受体;利血平对C4组分具有提高痛闲的作用;纳络酮对C4组分的镇痛作用具有部分拮抗效应，说明该组分与阿片受体有一定相关性。小鼠侧脑室给药1/400ED5。即表现良好的镇痛效果，说明C4组分具有中枢性作用。脊髓化鼠模型及大鼠足踢定压刺激法试验也表明C4组分是通过中枢起效的。在停药24小时取吗啡依赖大鼠的各脑区组织，测定发现大脑尾状核、壳核、丘脑、红核、苍白球和中脑导水管灰质等组织的亮氨酸脑啡肤含量明显下降，多数脑区的日内啡肤和P物质含量也有所下降。给予C4组分后，多数脑区的亮氨酸脑啡肤含量增加，尤其以尾状核、丘
舒雨雁,林文珍,庄茂辛,林政炯,吴祥甫,周元聪[9]（2003）在《广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1的表达》文中进行了进一步梳理将广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2 - 1（APLA2 - 1）基因克隆至表达载体pET2 8a（+） ,转化入大肠杆菌BL2 1,经过诱导 ,SDS -PAGE检测 ,重组质粒pET2 8a-APLA2 - 1在 18KD有一明显的表达条带 ,表达产物APLA2 - 1约占细菌总量 3 0 % ,并以包涵体的形式存在 ,将产物变复性后用SephadexG - 75纯化 ,产物经过SDS -PAGE检测只有单一条带 ,通过Western -blot检测 ,证实纯化产物是酸性磷脂酶A2 .对表达的APLA2 进行酶活性和药理活性的测定 .至此我们在大肠杆菌中表达了广西眼镜王蛇毒APLA2 ,这将为以后对PLA2 的结构与功能的研究打下了良好的基础 .
林文珍,舒雨雁,庄茂辛,林政炯,吴祥甫,周元聪[10]（2002）在《广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2的基因克隆与序列分析》文中提出目的 研究广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2 （APLA2 ）的基因克隆与序列分析 .方法 从广西眼镜王蛇毒腺中提取总RNA ,根据种属关系接近的台湾眼镜蛇毒APLA2 两端非翻译区的保守序列设计引物 ,利用RT -PCR进行体外扩增 ,获得磷脂酶A2 基因 ,克隆至pMD18-T载体 ,经测序筛选出APLA2 - 1,APLA2 - 2及一个新的酸性磷脂酶A2 （命名为APLA2 - 3 ） .根据测序结果确定了APLA2 - 3基因的全序列 ,并由此推导编码的氨基酸序列 .结果 利用Antheprot4 3c蛋白质序列分析软件包计算它的等电点为 4 885 ,相对分子质量为 16 5 43kD ,并预测了它的二级结构和部分理化性质 .同源性比较表明 ,APLA2 - 3的 1～ 3 9位氨基酸残基序列与APLA2 - 2相同 ,其同源性为 64 % ,而 40～ 10 8位氨基酸残基序列与APLA2 - 1相同 ,其同源性为 69% ,10 9位氨基酸残基序列皆不同于这两种APLA2 .结论揭示了APLA2 具有基因多样性 ,可能与物种进化和生物活性有关 ,并为进一步研究PLA2 的结构与功能的关系提供更多的信息
二、广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A_2的基因克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A_2的基因克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）粘质沙雷氏菌磷脂酶A2基因的克隆表达及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.3 论文研究的目的与意义 |
| 第二章 磷脂酶基因的克隆及克隆载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组表达载体pET-15b-PLA2的构建及重组酶表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验内容 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组磷脂酶表达条件的优化及纯化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 结果讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 重组磷脂酶的酶学性质及应用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验内容 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 结果讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（2）Lactobacillus casei磷脂酶A2基因的克隆及重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 磷脂简介 |
| 1.2 溶血卵磷脂简介 |
| 1.2.1 在食品行业中的应用 |
| 1.2.2 在饲料行业的应用 |
| 1.2.3 在化妆品中的应用 |
| 1.2.4 在医学领域的应用 |
| 1.2.5 溶血磷脂的安全性 |
| 1.3 磷脂酶A_2 |
| 1.3.1 磷脂酶A_2的分类及生理功能 |
| 1.3.2 磷脂酶A_2的实际应用 |
| 1.3.3 PLA_2的生产开发现状 |
| 1.4 课题研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 |
| 2.1.3 常用溶液剂试剂的配制 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 干酪乳杆菌染色体DNA的提取 |
| 2.2.2 引物的设计及目的基因的克隆 |
| 2.2.3 感受态的制备及转化 |
| 2.2.4 重组蛋白SDS-PAGE分析及酶活鉴定 |
| 2.2.5 重组菌发酵条件的优化 |
| 2.2.6 PLA_2的纯化及酶学性质分析 |
| 2.2.7 PLA_2水解大豆卵磷脂条件优化 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 L.casei和D.desertiPLA_2基因克隆 |
| 3.2 重组质粒pET28a-pla2a和pET28a-pla2c在大肠杆菌中的表达 |
| 3.2.1 质粒pET28a-pla2a和pET28a-pla2c的构建 |
| 3.2.2 重组大肠杆菌的酶活验证 |
| 3.2.3 重组菌各生长阶段的酶活测定 |
| 3.3 重组菌E.coli-pET28a-pla2a发酵条件优化 |
| 3.3.1 IPTG诱导表达条件优化 |
| 3.3.2 乳糖诱导重组菌表达条件优化 |
| 3.3.3 重组菌在TB培养基中的诱导表达条件优化 |
| 3.4 重组质粒pHY-P43-pla2b在枯草芽孢杆菌中的表达 |
| 3.4.1 质粒pHY-P43-pla2b的构建 |
| 3.4.2 重组枯草芽孢杆菌的硼砂卵黄平板验证 |
| 3.4.3 重组枯草芽孢杆菌各生长阶段的酶活验证 |
| 3.5 重组质粒pPIC-CP-pla2a在毕赤酵母中的表达 |
| 3.5.1 重组质粒pPIC-CP-pla2a的构建 |
| 3.5.2 重组毕赤酵母的酶活验证 |
| 3.5.3 重组毕赤酵母各生长阶段的酶活验证 |
| 3.6 PLA_2的纯化及酶学性质分析 |
| 3.6.1 PLA_2的纯化 |
| 3.6.2 PLA_2的最适温度以及温度稳定性 |
| 3.6.3 PLA_2的最适pH |
| 3.7 PLA_2改性大豆卵磷脂 |
| 3.7.1 PLA_2加量的影响 |
| 3.7.2 起始pH的影响 |
| 3.7.3 不同浓度Ca~(2+)的影响 |
| 3.7.4 温度的影响 |
| 3.7.5 时间的影响 |
| 3.7.6 正交实验 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写一览表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.2.1 粗毒的制备 |
| 1.2.2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的分离纯化 |
| 1.2.3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的性质研究 |
| 1.3 本技术的研究路线 |
| 2 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的分离纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器与设备 |
| 2.1.2 主要材料与试剂 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 层析结果 |
| 2.2.2 纯度鉴定及分子量测定 |
| 2.3 讨论 |
| 3 白唇竹叶青蛇毒磷脂酶A_2 的性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器与设备 |
| 3.1.2 主要材料与试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 蛋白质含量测定 |
| 3.2.2 酶活力测定 |
| 3.2.3 不同温度对酶活力的影响 |
| 3.2.4 pH 对酶活力的影响 |
| 3.2.5 金属离子对酶活力的影响 |
| 3.2.6 抑制剂对酶活力的影响 |
| 3.2.7 热稳定性 |
| 3.2.8 精氨酸酯酶活力的测定 |
| 3.2.9 蛋白水解酶活性的测定 |
| 3.2.10 抗胰蛋白酶作用的测定 |
| 3.2.11 类凝血酶活性测定 |
| 3.2.12 溶血活性测定 |
| 3.2.13 水肿活性测定 |
| 3.3 讨论 |
| 4 全文小结 |
| 5 文献综述 |
| 5.1 磷脂酶A_2 的概述 |
| 5.2 磷脂酶A_2 的分类 |
| 5.3 磷脂酶A_2 的理化性质和结构特征 |
| 5.4 蛇毒磷脂酶A_2 的分类 |
| 5.5 蛇毒磷脂酶A_2 的理化性质 |
| 5.6 蛇毒磷脂酶A_2 的结构特征及催化机理 |
| 5.7 蛇毒磷脂酶A_2 的毒理作用及其机制 |
| 5.7.1 对血液循环系统的作用 |
| 5.7.2 肌毒性作用 |
| 5.7.3 诱导水肿形成作用 |
| 5.7.4 突触前神经毒性作用 |
| 5.7.5 其他作用 |
| 5.8 蛇毒磷脂酶A_2 生物信息学研究 |
| 5.9 蛇毒磷脂酶A_2 基因工程的研究 |
| 5.10 竹叶青属蛇毒中磷脂酶A_2 的研究进展 |
| 5.11 蛇毒磷脂酶A_2 的研究展望 |
| 参考文献 |
| 附：作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况 |
| 致谢 |
（5）金环蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化、分子克隆以及生理活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.蛇毒磷脂酶A_2的理化性质及结构 |
| 1.1 来源及分类 |
| 1.2 理化性质 |
| 1.3 分子结构 |
| 2.蛇毒磷脂酶A_2的生理活性 |
| 2.1 抗菌作用 |
| 2.2 对血液循环系统的作用 |
| 2.3 抗肿瘤作用 |
| 2.4 突触前神经毒性 |
| 2.5 对肌肉的毒性 |
| 2.6 神经元保护作用 |
| 2.7 致炎症作用 |
| 2.8 其它作用 |
| 3.蛇毒磷脂酶A_2抗菌作用机理 |
| 3.1 Ⅱ型PLA_2的酶活性与抗菌活性的关系 |
| 3.2 sPLA_2的正电荷性及相对等电点值与抗菌的关系 |
| 3.3 细菌细胞壁对Ⅱ型PLA_2抗菌活性的影响 |
| 3.4 自溶菌素对Ⅱ型PLA_2抗菌活性的影响 |
| 3.5 sPLA_2对G-菌的作用 |
| 4.磷脂酶A_2的应用前景 |
| 4.1 医疗卫生 |
| 4.2 酶、脂和生物膜研究 |
| 4.3 生产溶血磷脂和不饱合脂肪酸 |
| 4.4 植物油脱胶 |
| 4.5 动物饲料生产 |
| 参考文献 |
| 第二章 金环蛇蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化和生理活性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料、生化试剂及仪器设备 |
| 1.2 分离纯化 |
| 1.3 磷脂酶A_2活性检测 |
| 1.4 抗菌活性检测 |
| 1.5 MTT法抗肿瘤活性检测 |
| 1.6 溶血及血浆凝固活性检测 |
| 1.7 血小板聚集或抑制活性检测 |
| 1.8 结构研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 分离纯化 |
| 2.2 磷脂酶A_2活性检测 |
| 2.3 抗菌活性检测 |
| 2.4 抗肿瘤活性检测 |
| 2.5 溶血活性检测 |
| 2.6 血浆凝固活性检测 |
| 2.7 血小板聚集或抑制活性检测 |
| 2.8 分子量与N-末端氨基酸序列 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 金环蛇蛇毒磷脂酶A_2的分子克隆及进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料、生化试剂及仪器设备 |
| 1.2 金环蛇毒腺cDNA文库的构建 |
| 1.3 分子克隆 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cDNA文库构建 |
| 2.2 分子克隆 |
| 2.3 序列的分析比对 |
| 2.4 进化遗传学分析 |
| 2.5 同义突变与错义突变分析 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 创新之处 |
| 攻读学位期间发表的论文、发明专利以及奖项 |
| 已发表和即将发表的文章 |
| 发明专利 |
| 获奖情况 |
| 致谢 |
（6）白眉蝮蛇新磷脂酶A2同源物的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 蛇毒的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 蛇毒的成分及毒理作用 |
| 1.2.1 有机小分子化合物 |
| 1.2.2 酶类 |
| 1.2.3 蛇毒中的毒素及其活性因子 |
| 1.3 蛇毒磷脂酶A_2的研究 |
| 1.3.1 PLA_2的分类 |
| 1.3.2 蛇毒磷脂酶A_2的结构特征 |
| 1.3.3 PLA_2的催化机理 |
| 1.3.4 蛇毒PLA_2的功能 |
| 1.3.5 PLA_2的药理作用机制 |
| 1.4 本研究的选题依据和研究内容 |
| 参考文献 |
| 2 白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的筛选及纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 长白山白眉蝮蛇神经毒素的分离纯化 |
| 2.3.2 蛋白质定量分析 |
| 2.3.3 蛋白质分子量测定 |
| 2.3.4 蛋白质等电点测定 |
| 2.3.5 蛋白质毒性测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 蛇毒神经毒素的筛选及纯化 |
| 2.4.2 白眉蝮蛇神经毒素的电泳检测 |
| 2.4.3 白眉蝮蛇神经毒素的质谱检测 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 3 白眉蝮蛇神经毒素的结构分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 氨基酸组成分析 |
| 3.3.2 N末端序列分析 |
| 3.3.3 肽谱分析 |
| 3.3.4 基因克隆及cDNA序列分析 |
| 3.3.5 Gln49-PLA_2的三级结构模拟 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 氨基酸组成分析 |
| 3.4.2 N末端序列分析 |
| 3.4.3 肽谱序列分析 |
| 3.4.4 cDNA序列分析 |
| 3.4.5 Gln49-PLA_2的空间结构分析 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 4 白眉蝮蛇磷脂酶A_2同源物的生物活性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 长白山白眉蝮蛇磷脂酶A_2同源物的制备 |
| 4.3.2 蛋白质含量的测定 |
| 4.3.3 PLA_2酶活性测定 |
| 4.3.4 抗凝血活性测定 |
| 4.3.5 溶血活性测定 |
| 4.3.6 抑菌活性的测定 |
| 4.3.7 神经毒性鉴定及止痛活性分析 |
| 4.3.8 肌肉毒性分析 |
| 4.3.9 细胞毒性分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 PLA_2的活性 |
| 4.4.2 抗凝血活性 |
| 4.4.3 溶血活性 |
| 4.4.4 抑菌活性 |
| 4.4.5 神经毒性及止痛活性 |
| 4.4.6 肌肉毒性分析 |
| 4.4.7 细胞毒性分析 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 主要研究成果和结论 |
| 5.2 前景与展望 |
| 论文创新点 |
| 作者在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 肽指纹质谱图1 |
| 肽指纹质谱图2 |
| 肽指纹质谱图3 |
| 肽指纹质谱图4 |
| 肽指纹质谱图5 |
| 肽指纹质谱图6 |
| 肽指纹质谱图7 |
| 肽指纹质谱图8 |
| 肽指纹质谱图9 |
| N端氨基酸测序图谱 |
（7）长白山白眉蝮蛇磷脂酶A2的基因工程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstranct |
| 0 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 磷脂酶A_2的一般性质 |
| 1.3 磷脂酶A_2结构特征 |
| 1.4 蛇毒PLA_2的功能 |
| 1.4.1 PLA_2的酶活性 |
| 1.4.2 PLA_2的药理活性 |
| 1.5 催化机理 |
| 1.6 磷脂酶A_2的应用 |
| 1.6.1 用PLA_2研究酶学、脂代谢和生物膜结构与功能 |
| 1.6.2 用PLA_2生产溶血磷脂和不饱和脂肪酸 |
| 1.6.3 用PLA_2进行植物油脱胶 |
| 1.6.4 PLA_2在动物饲料中的应用 |
| 1.6.5 PLA_2在医疗方面应用 |
| 1.7 蛇毒PLA_2的基因工程研究 |
| 1.7.1 蛇毒PLA_2的基因工程研究现状 |
| 1.7.2 可溶性表达策略 |
| 1.7.3 表达载体的选择 |
| 1.7.4 优化培养及表达条件 |
| 1.8 生物大分子分离纯化方法 |
| 1.8.1 凝胶过滤层析 |
| 1.8.2 离子交换层析 |
| 1.8.3 疏水作用层析 |
| 1.8.4 金属离子亲和层析 |
| 1.9 本论文的工作 |
| 参考文献 |
| 2 Gln49-PLA_2基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 材料、培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 总RNA提取 |
| 2.3.2 3'-RACE扩增磷脂酶A_23'端序列 |
| 2.3.3 RT-PCR扩增磷脂酶A_2编码区序列 |
| 2.3.4 PCR产物的回收 |
| 2.3.5 目的基因的A-T克隆 |
| 2.3.6 感受态细胞的制备 |
| 2.3.7 转化 |
| 2.3.8 阳性克隆的筛选 |
| 2.3.9 DNA测序和序列分析 |
| 2.3.10 Gln49-PLA_2的三级结构模拟 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 Gln49-PLA_2基因的克隆 |
| 2.4.2 Gln49-PLA2的序列分析 |
| 2.4.3 Gln49-PLA_2的空间结构分析 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 3 Gln49-PLA_2基因在大肠杆菌中的表达和条件优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 引物的设计与合成 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 长白山白眉蝮蛇碱性PLA_2表达载体的构建 |
| 3.3.2 碱性PLA_2在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.3 蛋白表达的条件优化 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.4.2 蛇毒碱性PLA_2的表达与鉴定 |
| 3.4.3 表达条件的优化 |
| 3.4.4 诱导温度的影响 |
| 3.4.5 诱导时间对蛋白表达的影响 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 4 融合蛋白的分离纯化与性质 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试验仪器 |
| 4.2.2 试验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白组分的制备 |
| 4.3.2 固定化金属亲和层析 |
| 4.3.3 阴离子交换层析 |
| 4.3.4 疏水层析 |
| 4.3.5 蛋白浓度的确定 |
| 4.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.3.7 蛋白质免疫印记 |
| 4.3.8 抗凝血活性的测定 |
| 4.3.9 细胞毒活性的测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 可溶组分的纯化 |
| 4.4.2 重组蛋白的生化性质 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 硕士期间发表的论文及专利申请情况 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
（8）江浙蝮蛇毒镇痛C4组分提取纯化及其对内阿片肽调控机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 冰茶栓靶基因及靶药物的筛选研究 |
| 一、 冰茶栓差异表达基因的筛选研究 |
| (一) 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| (二) 结果 |
| 1 冰茶栓治疗后戒断症状评分 |
| 2 总RNA抽提及纯化结果 |
| 3 基因芯片的扫描结果 |
| 4 差异表达基因筛选结果 |
| 5 空白组猴与海洛因依赖猴戒断时基因表达差异 |
| 6 冰茶栓治疗后与海洛因依赖猴戒断时基因表达差异 |
| (三) 分析与讨论 |
| 1 冰茶栓对海洛因依赖猴的治疗作用 |
| 2 受体与相关基因芯片的作用 |
| 3 内源性阿片肽与吗啡依赖内在基因差异 |
| 4 冰茶栓治疗对基因表达的影响 |
| 二、 均匀设计对靶药物的确定 |
| (一) 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| (二) 结果 |
| 1 不同组方的镇痛时效关系 |
| 2 配方优化 |
| (三) 分析与讨论 |
| 三、 小结 |
| 四、 参考文献 |
| 第二部分 江浙蝮蛇毒组分的分离纯化和镇痛C4组分的筛选及其理化性质研究 |
| 一、 江浙蝮蛇毒的分离纯化 |
| (一) 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| (二) 结果 |
| 1 不同分离介质分离效果比较 |
| 2 江浙蝮蛇毒主峰纯化条件筛选 |
| (三) 分析与讨论 |
| 1 江浙蝮蛇毒组分复杂性与可分离性 |
| 2 分离参数的优化及相对性 |
| 二、 C4组分的筛选及理化性质研究 |
| (一) 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| (二) 结果 |
| 1 江浙蝮蛇毒各组分的镇痛效果 |
| 2 镇痛组分的理化性质 |
| 3 镇痛组分的耐受性和依赖性 |
| (三) 分析与讨论 |
| 1 镇痛组分的确定 |
| 2 C4组分与磷脂酶的性质比较 |
| 三、 小结 |
| 四、 参考文献 |
| 第三部分 江浙蝮蛇毒镇痛C4组分的中枢作用研究 |
| 一、 材料和方法 |
| (一) 材料 |
| 1 动物 |
| 2 江浙蝮蛇毒C4组分 |
| 3 药品 |
| 4 仪器 |
| (二) 方法 |
| 1 阿托品实验 |
| 2 利血平实验 |
| 3 纳络酮实验 |
| 4 侧脑室给药实验 |
| 5 脊髓化鼠模型 |
| 6 大鼠足跖定压刺激法 |
| 7 不同脑区药物作用实验 |
| 二、 结果 |
| (一) 阿托品对C4组分镇痛效果的影响 |
| (二) 利血平对C4组分镇痛效果的影响 |
| (三) 纳络酮对C4组分镇痛效果的影响 |
| (四) 侧脑室给药C4组分的镇痛效果 |
| (五) 大鼠脊髓化鼠实验结果 |
| (六) 大鼠足跖定压刺激法实验结果 |
| (七) 不同脑区内源性阿片肽的分布 |
| 三、 分析与讨论 |
| (一) C4组分与药物相互作用对神经递质的影响 |
| (二) 江浙蝮蛇毒C4组分的中枢作用 |
| (三) 江浙蝮蛇毒C4组分的中枢作用部位 |
| 四、 小结 |
| 五、 参考文献 |
| 第四部分 应用微透析技术探索江浙蝮蛇毒镇痛C4组分对中枢内阿片肽的调控机理 |
| 一、 材料与方法 |
| (一) 材料 |
| 1 动物造模所需材料 |
| 2 血液采集所需材料 |
| 3 微透析实验所需材料 |
| 4 测定所需材料 |
| (二) 方法 |
| 1 动物造模 |
| 2 分组 |
| 3 麻醉 |
| 4 探针定位 |
| 5 透析液收集 |
| 6 给药方法 |
| 7 取血 |
| 8 测定 |
| 二、 结果 |
| (一) 吗啡造模大鼠体重变化 |
| (二) 透析膜回收率 |
| (三) 吗啡依赖大鼠脑组织间液神经肽的改变 |
| (四) 江浙蝮蛇毒C4组分对组织间液神经肽的影响 |
| (五) 单次给药与多次给药的比较 |
| (六) 脑透析液在不同时间神经肽的动态变化 |
| (七) 血浆放免测定的标准曲线 |
| (八) 血液中内阿片肽的含量变化 |
| 三、 分析与讨论 |
| (一) 吗啡依赖对内阿片肽的影响 |
| (二) 江浙蝮蛇毒C4组分对内阿片肽的作用 |
| (三) 江浙蝮蛇毒C4组分对外周血的内阿片肽的作用 |
| 四、 小结 |
| 五、 参考文献 |
| 全文讨论 |
| (一) 论证了中医药理论对阿片成瘾认识的科学性 |
| (二) 江浙蝮蛇毒中靶成分的确定 |
| (三) C4组分主要通过对脑啡肽调控发挥镇痛作用 |
| 全文小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 论着 |
| 附: |
| 文献综述(一) |
| 文献综述(二) |
（9）广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1的表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种和载体 |
| 1.1.2 工具酶 |
| 1.1.3 其他试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组表达质粒的构建 |
| 1.2.2 APLA2-1基因在大肠杆菌中的表达 将 |
| 1.2.3 包涵体的洗涤与变复性[15] |
| 1.2.4 重组表达产物的纯化 |
| 1.2.5 APLA2-1多克隆抗体的制备 |
| 1.2.6 Western blot分析 |
| 1.2.7 PLA2酶活性的测定[15] |
| 1.2.8 抑制血小板聚集活性的测定[15] |
| 2 结果 |
| 2.1 APLA2-1的PCR扩增 |
| 2.2 重组表达质粒的构建 |
| 2.3 APLA2-1基因在大肠杆菌中的表达 |
| 2.4 重组表达的融合蛋白pET28a-APLA2-1的变复性与纯化 |
| 2.5 融合蛋白pET28a-APLA2-1酶活性测定 |
| 2.6 抑制血小板聚集活性的测定 |
| 3 讨论 |
（10）广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2的基因克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 (Materials and Methods) |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 寡核苷酸的合成 |
| 1.2.2 蛇毒总RNA的提取 |
| 1.2.3 cDNA的合成和PCR体外扩增 |
| 1.2.4 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.5 DNA测序 |
| 2 结果 (Results) |
| 2.1 广西眼镜王蛇毒杂合性酸性PLA2基因的克隆及序列 |
| 2.2 序列分析 |
| 2.3 理化性质和二级结构预测利用Antheprot |
| 3 讨论 (Discussion) |
四、广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A_2的基因克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]粘质沙雷氏菌磷脂酶A2基因的克隆表达及应用[D]. 刘彬. 长春理工大学, 2014(08)
- [2]Lactobacillus casei磷脂酶A2基因的克隆及重组表达[D]. 刘丹丹. 江南大学, 2013(02)
- [3]白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及性质研究[D]. 邓疆渝. 重庆师范大学, 2011(08)
- [4]广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1在不同载体的表达[J]. 林文珍,舒雨雁,庄茂辛,林政炯,吴祥甫,周元聪. 蛇志, 2007(03)
- [5]金环蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化、分子克隆以及生理活性研究[D]. 徐春花. 南京农业大学, 2007(05)
- [6]白眉蝮蛇新磷脂酶A2同源物的研究[D]. 包永明. 大连理工大学, 2006(08)
- [7]长白山白眉蝮蛇磷脂酶A2的基因工程研究[D]. 卜鹏程. 大连理工大学, 2004(04)
- [8]江浙蝮蛇毒镇痛C4组分提取纯化及其对内阿片肽调控机理研究[D]. 叶勇. 浙江中医学院, 2003(03)
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