一、缓衰方对5/6肾切除大鼠细胞外基质的影响（论文文献综述）
周学锋[1]（2021）在《糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究》文中研究说明背景糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）的一种严重的微血管并发症,是导致终末期肾脏疾病（end stage renal disease,ESRD）的主要原因之一。2019年,全球糖尿病患病率约为9.3%（4.63亿人）,这一数字预计将在2045年上升到10.9%（7亿人）,大约40%左右的糖尿病患者会变成DKD患者。DKD已经成为危害人类健康的严重疾病。肾脏纤维化是DKD发展过程中的一个重要的病理进程,目前针对DKD肾脏纤维化缺乏行之有效的治疗方案。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGFβ1）在肾脏纤维化的发生发展中具有重要的作用。相关研究证明,TGFβ1/Smad3通路能够通过调节长链非编码RNA（long non-coding RNAs,LncRNA）调节肾脏纤维化。相关研究发现,LncRNA MEG3（GENEID:55384）的过表达加重了细胞增殖,并诱导了细胞凋亡。LncRNA MEG3可以通过调节miR-181a/Egr-1/TLR4轴调节DKD大鼠的肾脏纤维化和炎症反应。氧化应激在DKD的发生和发展中也起着至关重要的作用。活性氧的过量产生可引起DKD患者早期系膜细胞肥大、系膜扩张、细胞外基质蛋白积聚、肾小球硬化、内皮细胞损伤、足细胞凋亡、蛋白尿、肾脏功能障碍。Keap1/Nrf2是非常重要的内源性抗氧化途径。DKD属于中医学“水肿”、“肾消”、“消渴”、“关格”等病证范畴。DKD肾脏纤维化属于典型的“久病入络”、“肾络瘀阻”。DKD之气阴两虚、肾络亏虚,产生痰浊、瘀血等产物阻滞肾络,痰瘀互结日久则络脉淤塞成积,治疗应该益气养阴,通络祛邪。糖肾方是本课题组负责人李平教授研制的治疗DKD的中药复方,由黄芪、生地黄、山茱萸、卫矛、三七、熟大黄、枳壳共七味药组成,具有益气养阴、活血通络的功效。前期多中心、随机、双盲和安慰剂对照试验证实糖肾方能够显着降低DKD患者的蛋白尿水平,并且改善肾小球滤过率（estimated Glomerularfiltrationrate,eGFR）。但是糖肾方治疗DKD肾脏纤维化以及氧化应激损伤的潜在机制仍未被深入探索。因此本课题利用网络药理学方法结合体内外实验验证糖肾方治疗DKD肾脏纤维化、氧化应激损伤的分子机制。目的1.基于网络药理学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在机制;2.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,明确不同剂量糖肾方的治疗作用。3.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤模型,探索糖肾方对DKD肾脏纤维化和氧化应激损伤的作用机制。方法1.利用网络药理学生物信息学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的主要活性化合物、作用靶点、参与活动以及作用通路。利用Cytoscape软件绘制可视化网络结构图、PPI图,并进行数据分析。2.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,观察糖肾方低剂量、糖肾方中剂量、糖肾方高剂量的疗效。8周龄Wistar大鼠,适应性喂养3天,测量基础数据:体重、血糖、尿量、尿蛋白定量。然后根据血糖和体重随机分组,Sham组和DKD组,DKD组进行单侧肾切除以及STZ注射造模手术;造模成功后,随机分为以下5组:DKD组、DKD+糖肾方低剂量组（1.2 g/kg/d）、DKD+糖肾方中剂量组（2.4g/kg/d）、DKD+糖肾方高剂量组（4.8g/kg/d）、福辛普利钠组（1.33mg/kg/d）。实验动物10周龄开始灌胃给药,实验期间每周测体重,每4周测血糖,连续灌胃给药20周后结束实验。取材,收集大鼠血清、肾脏、肝脏等标本,并进行血、尿生化检测,Elisa测定尿蛋白等。病理组织切片PAS、MASSON染色等评估肾脏损伤情况。3.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤纤维化模型研究糖肾方治疗DKD肾脏纤维化机制。基于药效学实验结果,选择糖肾方低剂量组完成本章节机制研究。利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR 等实验技术评估糖肾方对 DKD 大鼠的肾脏皮质中 Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,Smad 3,p-Smad 3,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3 表达水平的影响。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3mRNA 的变化情况。4.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞氧化应激损伤模型研究糖肾方治疗DKD氧化应激损伤的机制。实验分组与方法3相同,利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR等实验技术评估糖肾方对DKD大鼠的肾脏皮质中Keap1,Nrf2,HO1,3-NT的影响。利用DHE染色法检测DKD大鼠的肾脏皮质中ROS的含量。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Keap1,Nrf2,HO1的变化情况。结果1.网络药理学研究发现糖肾方的主要活性成分是:槲皮素,beta-谷甾醇,山奈酚,DiincarviloneA,阿魏酸甲酯,地黄苦苷元,羟基-3-甲氧基肉桂醛,豆甾醇,4-羟基肉桂酸甲酯,7-O-methylisomucronulatol;糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的核心靶点有:血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGFA）,表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor,EGFR）,纤连蛋白 1（fibronectin 1,FN1）,TGFβ1,SMAD3,SMAD2等。GO富集分析发现糖肾方参与了抗氧化的生物过程,据此,我们挖掘了与糖肾方有关的氧化应激相关靶点,超氧化物歧物酶1（Superoxidedismutase,SOD1）,HO1,Keap1,Nrf2。糖肾方治疗DKD肾脏纤维化可能是通过调整TGFβ/Smad通路以及Keap1/Nrf2抗氧化应激来实现的。2.药效学结果证明糖肾方能够改善DKD大鼠的肾脏损伤。DKD组大鼠从实验开始时,体重和状态较Sham组较差,随着实验的进行,体重差异持续增加。药物干预第20周时,与DKD组相比较,各给药组的大鼠状态均有改善。糖肾方低剂量、中剂量组大鼠体重从药物干预第14周时体重高于DKD组,并持续到实验结束。DKD组大鼠血糖水平从实验开始时即明显高于Sham组,直到实验结束。糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠组的血糖水平从实验药物干预第16周开始下降,持续到实验第20周时,显着低于DKD组血糖水平。DKD大鼠的脏器指数、24h尿量、尿蛋白/肌酐比值、血清肌酐、血清尿素氮、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸氨基转移酶、血脂水平等均显着高于Sham组,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠治疗DKD大鼠20周之后,均能够显着降低24h尿量,减少尿蛋白排泄量,改善肾脏功能、肝脏功能,纠正血脂紊乱;PAS和Masson’s Trichrome染色显示,DKD组大鼠肾脏出现了显着的肾小球系膜基质增生和肾小管损伤,肾间质纤维化,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠干预治疗后,能够改善DKD大鼠肾脏的病理损伤.3.糖肾方能够通过调节TGFβ1/Smad 3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化。与Sham组相比较,DKD大鼠肾脏皮质中Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin的蛋白和基因表达水平均显着升高。DKD大鼠肾脏皮质中的TGFβ1,p-Smad 2/3,Smad3,p-Smad3蛋白表达水平明显高于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中LncRNA MEG3的基因表达水平明显高于Sham组。给予糖肾方干预治疗20周后,可以显着降低DKD大鼠的Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,p-Smad2/3,Smad3,p-Smad3,LncRNA MEG3的表达。糖肾方可以改善高糖诱导的HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白的沉积以及Smad 2/3蛋白的磷酸化。下调TGFβ1 mRNA以及Lnc RNA MEG3 mRNA的表达水平。4.糖肾方能够通过调控Keap1/Nrf2信号通路改善DKD氧化应激损伤。DKD大鼠中MDA含量明显高于Sham组,SOD含量明显低于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中的3-NT、Keap1蛋白和基因表达水平显着升高,Nrf2、HO1蛋白表达水平显着降低;免疫荧光结果显示,DKD大鼠肾脏皮质中的ROS含量增加;给予糖肾方干预治疗20周后,能够显着降低DKD大鼠3-NT、Keap1蛋白和基因的表达水平,上调DKD大鼠肾脏皮质中Nrf2、HO1的蛋白表达水平。此外,糖肾方可以降低NOX4基因表达水平,提高TXNRD1和GCLC基因表达水平。糖肾方可以减少高糖诱导的HK2细胞中ROS的含量,提高Nrf2蛋白以及基因表达水平,降低Keap1蛋白以及基因表达水平。结论本研究利用网络药理学预测糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在靶点,并在DKD动物模型以及HG诱导的HK2细胞中进行验证,明确了糖肾方通过调节TGFβ1/Smad3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化;通过调控Keap1/Nrf 2信号通路改善DKD氧化应激损伤。
张磊[2]（2021）在《基于P-selectin/PSGL-1/MAPK信号通路研究清肾颗粒对炎症介导的内皮细胞损伤及纤维化的干预作用》文中认为1.目的:通过在体实验观察清肾颗粒对内皮细胞间充质转分化及肾纤维化的干预作用;通过体外实验明确P-selectin/PSGL-1/MAPK信号通路在炎症介导内皮细胞损及内皮细胞间充质转分化中的作用;研究清肾颗粒含药血清对P-selectin/PSGL-1/MAPK信号通路和炎症介导的内皮细胞损伤及纤维化的干预作用。2.方法:2.1以5/6肾切除大鼠作为肾小球内皮细胞损伤及纤维化模型,大鼠分为清肾颗粒组、假手术组、模型组干预12周。检测各组大鼠血清Scr、BUN水平;HE及Masson染色评估各组大鼠肾脏病理损伤水平;Western blot检测各组大鼠肾脏组织NLRP3及IL-18蛋白水平;免疫组化检测各组大鼠肾脏组织α-SMA蛋白表达水平;免疫荧光检测各组大鼠肾脏组织CD31、FSP-1、MCP-1表达水平。2.2以LPS诱导的HUVEC损伤为炎症介导的内皮细损伤及纤维化模型,细胞分为正常对照组、LPS组、LPS+P-selectin抑制剂组。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;Western blot法检测各组细胞中p-selectin、PSGL-1、ERK1/2和p-ERK1/2、JNK和p-JNK、p38和p-p38、ERK5和p-ERK5的蛋白含量;q RT-PCR法检测各组细胞中NLRP3、IL-18 m RNA水平;免疫荧光法检测各组细胞中ɑ-SMA、e NOS水平。2.3以LPS诱导的HUVEC损伤为炎症介导的内皮细损伤及纤维化模型,细胞分为正常对照组;LPS组;LPS+p-selectin阻断组;LPS+清肾颗粒低剂量组;LPS+清肾颗粒中剂量组;LPS+清肾颗粒高剂量组。Western blot法检测各组细胞中p-selectin、PSGL-1、ERK1/2和p-ERK1/2、JNK和p-JNK、p38和p-p38、ERK5和p-ERK5的蛋白含量;q RT-PCR法检测各组细胞中p-selectin、PSGL-1、e NOS、ET-1、FSP-1、α-SMA m RNA水平;免疫荧光法检测各组细胞中p-selectin、PSGL-1、IL-18、MCP-1、e NOS、ET-1、FSP-1、α-SMA蛋白表达。2.4使用超高效液相色谱分析清肾颗粒中活性成分。3结果:3.1.1模型组大鼠Scr、BUN水平高于假手术组（P<0.05）,清肾颗粒组大鼠Scr、BUN水平低于模型组（P<0.05）。3.1.2各组大鼠肾脏组织HE及Masson染色结果显示,假手术组大鼠肾小球及肾小管结构清晰,无粘连、增生、纤维化及炎性细胞浸润。模型组大鼠可见显着的病理损伤,镜下可见肾小球内皮细胞浸润、肾小球硬化及纤维化、肾小管萎缩坏死,清肾颗粒组大鼠肾小球内皮细胞浸润、肾小球硬化及纤维化、肾小管萎缩坏死均较模型组减轻。3.1.3模型组大鼠NLRP3及IL-18蛋白相对表达量高于假手术组（P<0.05）,清肾颗粒组NLRP3及IL-18蛋白相对表达量低于模型组（P<0.05）。3.1.4模型组大鼠α-SMA蛋白相对表达量高于假手术组（P<0.05）,清肾颗粒组α-SMA蛋白相对表达量低于模型组（P<0.05）。3.1.5假手术组大鼠CD31表达呈强阳性（绿色荧光强亮）,FSP-1和MCP-1表达微弱;模型组大鼠CD31表达微弱,FSP-1和MCP-1呈强阳性表达;清肾颗粒组大鼠CD31表达较模型组增强,FSP-1和MCP-1表达较模型组减弱。3.2.1与正常对照组比较,LPS组细胞早期及晚期凋亡率均增高（P<0.05）;LPS+P-selectin抑制剂组与LPS组比较早期及晚期凋亡率降低（P<0.05）。3.2.2与正常对照组比较,LPS组p-selectin、PSGL-1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK、p38和p-p38、ERK5、p-ERK5的蛋白水平升高（P<0.05）;LPS+P-selectin抑制剂组与LPS组比较p-selectin（P<0.05）、PSGL-1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK（P<0.05）、p38（P<0.05）、p-p38（P<0.05）、ERK5、p-ERK5的蛋白水平呈不同程度下降。3.2.3与正常对照组比较,LPS组NLRP3、IL-18 m RNA水平升高（P<0.05）;LPS+P-selectin抑制剂组与LPS组比较NLRP3、IL-18 m RNA水平下降（P<0.05）。3.2.4与正常对照组比较,LPS组ɑ-SMA呈强阳性表达（红色荧光强亮）,LPS+P-selectin抑制剂组与LPS组比较ɑ-SMA红色荧光表达减弱。e NOS的表达趋势与之相反,在正常对照组e NOS呈强阳性红色荧光表达,LPS组e NOS的表达最弱,e NOS在LPS+P-selectin抑制剂组的表达介于两组之间。3.3.1与LPS组比较,清肾颗粒各剂量组的p-selectin、PSGL-1蛋白表达下降,且呈剂量依耐性,清肾颗粒高剂量组的p-selectin、PSGL-1蛋白表达水平最低（P<0.05）。与LPS组比较,清肾颗粒各剂量组的JNK和p-JNK、p38和p-p38蛋白表达量均下降,清肾颗粒高剂量组的降低程度更为显着（P<0.05）。3.3.2与LPS组比较,清肾颗粒高、中、低剂量组细胞的p-selectin、PSGL-1、ET-1、FSP-1、α-SMA m RNA表达量均显着下降（P<0.05）,且清肾颗粒高剂量组的降低程度与中、低剂量组比较有显着差异（P<0.05）。与LPS组比较,清肾颗粒高、中、低剂量组的e NOS表达量显着升高（P<0.05）,清肾颗粒高剂量组与中、低剂量组比较亦有显着差异（P<0.05）。3.3.3在正常对照组中p-selectin、PSGL-1、IL-18、MCP-1、ET-1、FSP-1、α-SMA表达较少。LPS组p-selectin、PSGL-1、IL-18、MCP-1、ET-1、FSP-1、α-SMA均呈阳性表达（红色荧光）。清肾颗粒各剂量组中,p-selectin、PSGL-1、IL-18、MCP-1、ET-1、FSP-1、α-SMA的表达与LPS组相比较明显减少,其中清肾颗粒高剂量组表达最弱。在正常对照组中e NOS表达较多,LPS组中e NOS表达较少,在清肾颗粒各剂量组中e NOS表达不同程度增加,其中清肾颗粒高剂量组表达最强。3.4基于超高效液相色谱法明确了清肾颗粒中的11个活性成分（绿原酸、盐酸小檗碱、大车前苷、滨蒿内酯6,7-二甲氧基香豆素、表小檗碱、黄连碱、丹酚酸B、巴马汀、益母草碱、大黄酸、丹参酮IIA）,并且这已知的11个成分对于炎症、MAPK信号通路、细胞转分化、纤维化等均有不同程度的干预和调节作用。4结论:4.1 P-selectin/PSGL-1通过介导MAPK信号通路活化,启动炎症效应,导致内皮细胞炎性损伤和功能障碍,进而引起End MT病理改变,促进纤维化。4.2中药清肾颗粒能够通过抑制P-selectin/PSGL-1介导的MAPK信号通路活化（p38和JNK通路）,进而减轻内皮细胞炎性损伤,逆转End MT,延缓纤维化进程,且效果呈量效关系。4.3基于超高效液相色谱法明确了清肾颗粒中的11个活性成分,且这11个活性成分对于炎症、MAPK等信号通路、End MT、纤维化均有不同程度的干预和调节作用;进一步支持了本次研究结果的科学性。
蓝芳,赵洁,史伟,莫超,孟立锋,梁春琴[3]（2020）在《益气活血法干预肾纤维化机制的研究进展》文中指出肾纤维化是各种慢性肾脏病常见的病理基础,其以炎性细胞的浸润、成纤维细胞的增殖、细胞外基质沉积为特征。中医认为气虚血瘀是肾纤维化的基本病机,运用益气活血法抗肾纤维化的机制研究取得进展,故文章从调节细胞因子的表达、减少细胞外基质的沉积、抑制上皮间充质转化、减轻炎症反应、抗氧化应激反应方面进行阐述益气活血法干预肾纤维化的作用机制,以期为今后中医药防治肾纤维化提供依据。
郭传[4]（2020）在《益肾缓衰方调控IS/AhR/NOX4通路改善动脉粥样硬化性肾病的机制研究》文中认为背景动脉粥样硬化性肾病（atherosclerotic renal disease,ARD）是指因动脉粥样硬化引起肾动脉狭窄和血流量减少,而导致的肾脏损伤,是引起终末期肾脏病（end stage renal disease,ESRD）的主要原因。随着肾灌注的不断减少,肾小管周围微血管内皮逐渐受损,呈现稀疏化,“微血管荒废—小管间质纤维化”的病理链逐渐形成,这是ARD进展的关键病理环节。目前针对ARD的治疗,主要包括药物治疗与血管重建术,以控制血压、血脂、减少心血管事件发生概率和保护肾功能,但是治疗的效果并不理想,疾病的肾脏终点并未得到改善。这也提示临床工作者在ARD的治疗过程中,应积极寻找新的干预措施和治疗靶点,如选择决定ARD患者肾脏预后的小管间质纤维化作为切入点。研究发现,当小管间质微血管受到损伤时,小管间质纤维化的速度可以明显加快,因此从保护小管间质微血管内皮的角度,探寻延缓ARD小管间质纤维化的措施具有重要意义。硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate,IS）作为一种肠源性尿毒症毒素,由肠道微生物分解色氨酸并经肝脏转化而成,主要通过肾脏清除。当肾功能下降时,IS在体内明显蓄积,因为其易与蛋白质结合,而不易被透析清除。IS可通过活化芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）,并进一步激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶氧化剂-4（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4,NOX4）,诱导氧化应激和炎症反应,导致内皮功能障碍,引起微血管荒废,加速小管间质纤维化。因此,在IS刺激条件下,AhR/NOX4通路激活并介导的的氧化应激和炎症反应,可能是ARD进展中小管间质微血管损伤的主要机制,从而加重了小管间质纤维化。本课题组基于既往的证候学研究和临床经验,考虑ARD的基本病机以脾肾气虚为本,湿、浊、瘀、毒夹杂为标。知名肾病专家戴希文教授结合多年治疗慢性肾脏病的临床经验,提出了益气活血、利湿降浊解毒的益肾缓衰方,与ARD的基本病机相吻合,在延缓ARD肾功能进展方面具有一定的临床疗效。益肾缓衰方相关的基础研究提示,该方在保护血管内皮和改善小管间质纤维化方面具有重要作用。鉴于IS与中医“浊毒”致病特点类似,且IS可通过活化AhR,激活NOX4,进而损伤血管内皮,因此可以考虑益肾缓衰方对小管间质微血管的保护作用可能与该方抑制IS的毒性作用有关,并提出“益肾缓衰方可能通过调控IS介导下的AhR/NOX4通路,改善微血管荒废,减轻小管间质纤维化,从而延缓ARD进展”的假说。围绕此假说,本研究首先对ApoE基因敲除小鼠使用高脂饮食喂养联合5/6肾切除构建ARD模型,观察益肾缓衰方对ARD小鼠血清IS水平、小管间质微血管损伤、小管间质纤维化以及AhR/NOX4通路相关分子表达水平和下游氧化应激、炎症分子变化的影响。其次,采用IS刺激人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）构建毒素损伤细胞模型,观察益肾缓衰方含药血清对IS诱导下HUVECs活力、衰老和氧化应激以及AhR/NOX4通路的的影响,旨在从IS角度出发,阐述益肾缓衰方对ARD间质微血管的保护作用和机制,为该方延缓ARD小管间质纤维化提供一定的理论依据。目的1.观察益肾缓衰方对ARD小鼠血清IS水平的变化、小管间质纤维化以及小管周围微血管内皮损伤的影响,以及该方对IS诱导下血管内皮细胞损伤的保护作用。2.从IS激活AhR/NOX4通路,并诱导氧化应激和炎症反应角度,揭示益肾缓衰方对ARD小管间质微血管的保护作用和机制,为该方延缓ARD小管间质纤维化提供一定的理论依据。方法1.体内实验:通过对ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠使用高脂饮食喂养联合5/6肾切除构建ARD模型。实验分为:对照组、假手术组、模型组、益肾缓衰方低剂量组（16.76g/kg.d）、益肾缓衰方中剂量组（33.52g/kg.d）、益肾缓衰方高剂量组（67.04g/kg.d）、爱西特组（0.4g/kg.d）,干预20周。观察小鼠一般情况,并利用自动生化仪检测小鼠肾功能（Scr、BUN）和血脂水平变化（TC、TG、LDL-c）,高效液相色谱-荧光法测血清IS水平、Elisa法测氧化应激指标（SOD、MDA）及小鼠血清内皮功能障碍指标（ADMA）水平、HE染色和VG染色判断肾动脉的动脉粥样硬化程度,HE染色、PAS染色、Masson染色判断肾组织的组织形态学变化及间质胶原沉积,电镜观察肾脏的超微结构,免疫组化检测小鼠间质纤维化相关指标（Collagen Ⅳ、α-SMA、TGF-β1）、AhR蛋白及肾间质内微血管内皮保护指标（vWF）表达水平,real time PCR检测小鼠肾组织内AhR/NOX4通路相关分子（AhR、NOX4、MCP-1）以及间质纤维化相关指标（TGF-β1）的mRNA表达水平。2.体外实验:采用500μmol/LIS刺激HUVECs 24h建立内皮损伤的毒素模型。首先,通过 CCK-8 法检测不同浓度 IS（0μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L）刺激后HUVECs活力变化及不同浓度益肾缓衰方含药血清（5%、10%、20%）对IS刺激下HUVECs活力的影响,同时确定IS的造模浓度和含药血清的干预浓度。其次,将实验分为:空白对照组、含药血清对照组、毒素模型组和含药血清实验组,并通过SA-β半乳糖苷酶法检测各组细胞衰老程度、化学荧光微孔板法检测各组细胞ROS生成量。最后,增加AhR抑制剂组（CH223191）及AhR抑制剂+含药血清组,并进一步检测各组细胞的细胞活力、细胞衰老情况、ROS生成量,并通过Western blot检测AhR与NOX4的蛋白表达,real time PCR法检测AhR、NOX4及炎症因子MCP-1的mRNA表达。结果1.体内实验:（1）与对照组比,假手术组小鼠体重虽增加,但无统计学意义（P>0.05）;血清TC、TG、LDL-c水平明显升高（P<0.05）,血清SOD活性明显下降（P<0.05）,但血清Scr、BUN、IS水平、MDA及ADMA含量升高均不明显（P>0.05）;肾动脉内膜增厚、管腔狭窄,肾小管扩张,肾小管超微结构未见明显异常,肾间质胶原纤维沉积不明显（P>0.05）;肾间质内TGF-β1、Collagen Ⅳ、α-SMA、AhR蛋白表达水平未见明显增加（P>0.05）,肾间质内vWF蛋白表达水平下降（P<0.05）;肾组织内AhR、TGF-β1及NOX4 mRNA表达水平的变化无统计学差异（P>0.05）,但MCP-1 mRNA表达水平增加,有统计学意义（P<0.05）。（2）与对照组比,模型组小鼠体重无明显差异（P>0.05）;Scr、TC、TG、LDL-c和血清IS水平显着升高（P<0.05）;血清SOD活性下降而MDA、ADMA含量增加（P<0.05）;肾动脉内膜增厚、管腔狭窄,肾小球硬化,肾小管空泡样变性、腔内微绒毛稀疏和缺失,且小管间质纤维化明显;肾间质胶原纤维沉积明显增加（P<0.05）;肾间质vWF蛋白表达水平下调而CollagenⅣ、α-SMA、TGF-β1及AhR蛋白表达水平增加（P<0.05）;肾组织内AhR、NOX4、TGF-β1及MCP-1 mRNA表达水平增加（P<0.05）。（3）与假手术组比,模型组小鼠体重平均水平较假手术组低,但仅在饮食干预8周时显示有统计学差异（P<0.05）;血清Scr、IS、MDA及ADMA水平更高（P<0.05）,而血脂水平及SOD活性无明显差异（P>0.05）;肾动脉内膜增厚及管腔狭窄程度更加明显,肾小球硬化更加明显,腔内微绒毛稀疏和缺失,肾间质胶原纤维沉积更加明显（P<0.05）;肾间质 Collagen Ⅳ、α-SMA、TGF-β1、AhR及 vWF 蛋白表达水平明显增加（P<0.05）;肾组织内TGF-β1、AhR、NOX4及MCP-1 mRNA表达水平增加更加明显（P<0.05）。（4）与模型组比较,益肾缓衰方低剂量、中剂量组,对小鼠体重影响不明显（P>0.05）,高剂量组和爱西特组在干预20周时,体重明显低于模型组（P<0.05）;益肾缓衰方低、中、高剂量组及爱西特组均可显着降低小鼠血清Scr和血清IS水平（P<0.05）,但对BUN及血脂水平的改变均不明显（P>0.05）;益肾缓衰方低剂量组可明显增加小鼠血清SOD活性、降低小鼠血清MDA和ADMA含量（P<0.05）,中剂量和高剂量组可明显降低小鼠血清MDA（P<0.05）,爱西特组可明显增加小鼠血清SOD活性并降低小鼠血清MDA含量（P<0.05）;益肾缓衰方低、中、高剂量组均可在一定程度改善肾动脉内膜增厚情况、肾小管空泡样变性以及肾小管的超微结构,但仅低剂量组可明显减轻肾间质胶原纤维沉积（P<0.05）;益肾缓衰方低剂量组和中剂量组均可明显减少肾间质Collagen Ⅳ、α-SMA、AhR蛋白表达,并增加肾间质vWF蛋白的表达（P<0.05）;益肾缓衰方低剂量组和中剂量组均可明显减少肾组织AhR、NOX4、MCP-1 mRNA的表达水平（P<0.05）,且益肾缓衰方低剂量组对于减少肾组织内TGF-β1蛋白和mRNA的表达量,均具有统计学差异（P<0.05）。益肾缓衰方高剂量组和爱西特组对肾组织Collagen Ⅳ、α-SMA、TGF-β1、AhR和vWF的蛋白表达及TGF-β1、AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达无统计学差异（P>0.05）。2.体外实验:（1）与 0μmol/LIS 组比,500μmol/LIS 组与 1000μmol/LIS 组在干预24h、48h、72h后,均可以显着降低HUVECs活力（P<0.05）,250μmol/L IS组在干预48h时可显着降低HUVECs活力（P<0.05）,但1000μmol/LIS干预后细胞数目呈下降趋势。（2）与同等浓度的正常大鼠血清组比,在IS刺激条件下,10%和20%的含药血清可显着增加细胞活力（P<0.05）;在无IS刺激条件下,5%和10%含药血清组对细胞活力无明显影响（P>0.05）,20%的含药血清可显着增加细胞活力（P<0.05）。（3）与空白对照组比较,含药血清对照组对细胞活力、细胞衰老、ROS生成及AhR和NOX4的蛋白和mRNA表达均无显着影响（P>0.05）。（4）与空白对照组比,毒素模型组的细胞活力下降、衰老细胞染色率增加及ROS相对生成量增加（P<0.05）,细胞核内AhR蛋白及NOX4蛋白表达增加,AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达增加（P<0.05）。（5）与毒素模型组比较,含药血清实验组、AhR抑制剂组、AhR抑制剂+含药血清组均可明显增加细胞活力、降低衰老细胞染色率及ROS相对生成量（P<0.05）,下调AhR蛋白及NOX4蛋白表达水平,下调AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达水平（P<0.05）。（6）与AhR抑制组比,AhR抑制剂+含药血清组在增加细胞活力、降低衰老细胞染色率及ROS相对生成量,以及下调AhR蛋白及NOX4蛋白表达水平和AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达水平方面效果更加显着（P<0.05）。结论1.益肾缓衰方可改善ARD小鼠肾功能以及肾动脉和肾组织的病理形态学损伤,减轻小鼠肾间质纤维化,从而延缓ARD进展。2.益肾缓衰方可通过降低ARD小鼠血清IS水平并改善ARD模型小鼠体内IS对血管内皮的损伤,改善小管间质微血管荒废,进而减轻小管间质纤维化。3.益肾缓衰方能够改善ARD小鼠小管间质微血管荒废和IS诱导的人脐静脉内皮细胞的损伤,机制可能与该方抑制IS诱导下AhR/NOX4通路的激活,进而改善下游的氧化应激和炎症反应有一定的关系。
潘雅婧[5]（2020）在《肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究》文中认为目的:以VEGF为切入点,在动物和细胞实验探讨肾康注射液对UUO小鼠肾纤维化和HUVEC血管生成的调控作用及作用机制。方法:1.动物实验:将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（sham）、单侧输尿管梗阻组（UUO）、氯沙坦钾组（ARB）及高、中、低剂量肾康组（SKI-H、SKI-M、SKI-L）。除sham组外的各组行UUO手术;次日ARB组予氯沙坦钾（13 mg/kg·d）灌胃;SK]-H、SKI-M、SKI-L 组分别予 7.8 g/kg·d、3.9 g/kg·d、1.95 g/kg·d SKI 尾静脉注射。观察小鼠一般状态、记录体重变化。给药14天后检测血Scr、BUN、CysC水平;micro-CT检测肾脏血管分布;HE染色观察肾组织形态改变;天狼星红染色观察胶原沉积;IHC染色观察VEGF、VEGFR-2表达。2.细胞实验:将HUVEC分为空白组（CON）、SKI高剂量组（SKI-11）、SKI-低剂量组（SKI-L）、VE GF 沉默组（Si）、VEGF 沉默-SKI 高剂量组（Si-SKI-H）、VEGF 沉默-SKI 低剂量组（Si-SKI-L）。SKI-H、SKI-L 组分别予 8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预 24 h;Si组通过RNAi转染沉默VEGF基因;Si-SKI-H、Si-SKI-L组在转染同时分别予8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预24 h。观察血管生成情况,计算血管生成参数;real-time PCR和western blot法分别检测VEGF通路重要靶点基因和蛋白表达。结果:1.动物实验:给药14天后UUO组体重较sham组减轻（P<0.01）;ARB、SKI-H、SKI-M组体重较UUO组增高（P<0.05）。UUO组Scr、BUN、CysC水平较sham组升高（P<0.05,P<0.01）;ARB、SKI-H 组 Scr、BUN、CysC 水平较 UUO 组降低（P<0.05,P<0.01）。肉眼观察sham组双肾无明显异常改变;UUO组患侧肾脏表面粗糙、膨大、积水,肾盂肾盏扩张,实质变薄;SKI组患肾结构破坏较UUO组减轻。micro-CT见sham组肾血管密集,走向清晰;UUO组患肾血管疏松,分支减少、曲度下降;SKI组患肾血管损伤较UUO组减轻。HE染色见sham组肾脏结构完整,无明显病理损害;UUO组肾小管扩张,上皮细胞肿胀坏死,间质增宽伴炎性浸润;SKI组肾脏损伤较UUO组减轻。天狼星红染色（光镜）见sham组肾脏几乎无红染胶原;UUO组肾间质大量红色胶原聚集;SKI组红染程度较UUO组减轻。偏振光镜荧光信号变化与普通光镜所见大体一致。IHC示UUO组患肾VEGF、VEGFR-2表达较sham组降低（P<0.01）;SKI 组 VEGF、VEGFR-2 表达较 UUO 组降低（P<0.01）。剂量方面,SKI 减轻肾脏纤维化损伤和促进血管生成,以中、高剂量效果更优。2.细胞实验:沉默VEGF 24 h后Si组VEGF基因表达较CON组显着降低（P<0.01）,阴性对照组与CON组VEGF无显着差异（P>0.05）,验证转染稳定可行。血管生成方面,SKI组血管连接较CON组增多、血管网密度增大,血管生成参数提高,SKI促进HUVEC血管生成（P<0.01,P<0.05）。基因表达方面,与CON组相比,SKI-H 组 VEGF、VEGFR-2、eNOS 水平升高（P<0.05,P<0.01）;与 Si 组相比,Si-SKI-H 和 Si-SKI-L 组 VEGF、eNOS 水平升高（P<0.05,P<O.01）,SKI 上调 VEGF 通路靶点基因,且该效应在VEGF沉默时更突出。蛋白表达方面,在正常培养及VEGF沉默状态,SKI 均提高 VEGFR-2、p-VEGFR-2、eNOS、p-eNOS 表达水平（P<0.05,P<0.01）。结论:1.肾康注射液可改善UUO小鼠肾功能,缓解肾纤维化病理改变,减轻纤维化损伤;可缓解肾脏微血管网损伤,上调VEGF、VEGFR-2表达,促进患侧肾脏血管生成。2.肾康注射液可促进HUVEC血管生成;可上调HUVEC的VEGF、VEGFR-2基因表达;可提高VEGFR-2、eNOS总蛋白水平及磷酸化蛋白水平。3.肾康注射液可能通过调节VEGF/VEGFR-2及下游eNOS来改善肾纤维化损伤和促进血管生成。
周珊珊[6]（2020）在《桃核承气汤抗肾脏纤维化的药效物质基础及作用机制研究》文中指出目的:桃核承气汤是《伤寒论》经典名方,临床上加减广泛用于慢性肾脏疾病的治疗。目前关于桃核承气汤的研究多集中在临床疗效研究方面,而其药效物质基础及作用机理研究十分缺乏。本研究建立在临床疗效确切的基础上,结合循证医学、中药化学、生物信息学、中药药理学、分子生物学及分析化学等多学科交叉的研究方法,对桃核承气汤加减治疗慢性肾衰竭进行了Meta分析,筛选了该方抗肾脏纤维化的有效物质部位,分析鉴定了有效物质部位的主要化学成分,最后基于网络药理学研究,对有效物质部位进行了抗肾脏纤维化的体内外作用机制研究。系统地对桃核承气汤进行了临床疗效评价、物质基础研究及药效作用机制研究,从而为该方的进一步开发利用奠定研究基础和提供科学依据。方法:1桃核承气汤加减治疗慢性肾衰竭的Meta分析通过检索中国知网（CNKI）数据库、中文科技期刊全文（维普,VIP）数据库、万方医学网（Wangfang）数据库和中国生物医学（CBMdisc）数据库、Pub Med、EMbase和Medline数据库,检索年限至2020年1月。以桃核承气汤加减治疗慢性肾衰竭的随机对照试验（RCTs）,按Cochrane系统评价的方法评价纳入研究的质量,由两位评价人员独立按照纳入与剔除标准筛选文献、提取资料并评价纳入研究的偏倚风险,并用Review Manger 5.3软件对纳入文献结果进行Meta分析。2桃核承气汤各极性部位的提取分离采用系统溶剂萃取法,将方中桃仁、大黄、桂枝、甘草混合用70%乙醇,回流提取2次,分别为2h和1.5h,减压浓缩后将醇提液挥发至无醇味。分别用不同极性的溶剂进行萃取,最后依次得到石油醚萃取物质部位,氯仿萃取物质部位,乙酸乙酯萃取物质部位,正丁醇萃取物质部位,将其进行减压浓缩干燥后备用,芒硝作为一个单独的部位。3桃核承气汤抗肾脏纤维化有效物质部位的筛选研究采用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导HK-2细胞构建体外肾纤维化模型,用桃核承气汤各萃取物质部位以不同浓度干预细胞。Elisa试剂盒检测细胞上清液胶原蛋白Iα1（COLIα1）,纤维粘连蛋白（FN）含量;利用CCK-8法确定筛选出的有效物质部位的最佳浓度;Western blot检测胶原蛋白Ⅰ（Co L-Ⅰ）,胶原蛋白Ⅲ（Co L-Ⅲ）,基质金属蛋白酶-2（MMP2）,基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP2）,结缔组织生长因子（CTGF）蛋白的表达水平;免疫荧光染色法检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达;Real time-PCR检测纤溶酶原激活抑制剂-1（PAI-1）m RNA的表达。4桃核承气汤正丁醇有效物质部位的化学成分研究使用Welch Ultimate TM uplc XB-C18 column（100 mm×2.1mm,1.8μm）分析色谱柱;流动相A为水（含0.1%甲酸）,流动相B为色谱乙腈;梯度洗脱程序:025min,5%B;2565min,95%B;柱温:40℃;流速:0.3ml/min;进样体积:2μL;吸收波长为210nm。离子源为电喷雾电离源,采用高分辨率质谱测定正离子模式和负离子模式,氮气流速800L/h,气体温度200℃,毛细管电压30k V,扫描范围m/z 50-1500。5桃核承气汤正丁醇有效部位抗肾脏纤维化的网络药理学研究通过TCMSP数据库获取桃核承气汤正丁醇有效物质部位的26个化合物的OB、DL值,以OB≥30%和DL≥0.18为阈值筛选潜在的活性成分。将筛选出的化合物导入到SEA、SIB数据库获取化合物靶标,从Dis Ge Net数据库和NCBI数据库收集疾病靶标,将化合物靶标和疾病靶标整合得到化合物潜在治疗靶标。将治疗靶标导入String数据库获取关键蛋白相互作用（PPI）信息。利用Cytoscape软件中的Clue Go Version 2.5.4插件进行KEGG通路富集分析;利用DAVID Version 6.8进行GO功能富集分析。利用Cytoscape Version 3.6.0软件构建PPI网络、活性成分-靶标网络、活性成分-靶标-信号通路网络。6桃核承气汤正丁醇有效物质部位抗肾脏纤维化的作用机制研究（1）体外实验:TGF-β1诱导HK-2细胞构建体外肾纤维化模型。CCK8法检测桃核承气汤正丁醇萃取物质部位对HK2细胞活力的影响;Western blot检测α-SMA、E-cadherin、FN以及PI3K/AKT/m TOR和HIF-1α/VEGF信号通路相关蛋白的表达;免疫荧光检测α-SMA、Ecadherin、FN和TNF-α的表达;鬼笔环肽染色观察细胞中F-actin微丝蛋白。（2）体内实验:采用单侧输尿管结扎术构建UUO大鼠肾纤维化模型,将36只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为3组,假手术组（Sham）,模型组（UUO）,桃核承气汤正丁醇有效物质部位组（NE-THCQ）。观察大鼠一般情况,分别于术后7天、14天分批次处死大鼠、采集血液制备血清标本,摘取肾脏。检测血清肌酐、尿素氮水平;H&E染色、Masson染色和透射电镜观察大鼠肾脏病理改变;Elisa试剂盒检测大鼠血清中IL-6、IL-1β的含量;免疫组化检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA和E-cadherin的表达;Western blot检测PI3K/AKT/m TOR和HIF-1α/VEGF信号通路相关蛋白的表达。结果:1桃核承气汤加减治疗慢性肾衰竭的Meta分析纳入8篇文献,共630例患者,其中治疗组321例,对照组309例。Meta分析显示,与对照组相比,桃核承气汤加减联合用药能改善CRF患者症状的总有效率[OR=4.89,95%CI为[3.28,7.29]];降低血尿素氮（BUN）[SMD=-0.62,95%CI为[-0.81,-0.43]]和血肌酐（Scr）[SMD=-3.12,95%CI为[-4.72,-1.52]];升高肌酐清除率（Ccr）[SMD=-0.56,95%CI为[-0.34,-077]],肾小球滤过率（e GFR）[SMD=0.62,95%CI为[0.30,0.94]]和血红蛋白（Hb）[SMD=-0.71,95%CI为[0.39,1.03]]。2桃核承气汤抗肾脏纤维化有效物质部位的筛选研究乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取物质部位在200、400mg/m L浓度下能显着降低COLIα1和FN含量,CCK8法筛选出最佳干预浓度为200mg/m L。乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取物质部位均能降低Co L-Ⅰ,Co L-Ⅲ,TIMP2、CTGF、α-SMA表达,上调MMP2的表达,其中正丁醇萃取物质部位作用效果最为显着（P<0.01）。实时荧光定量检测发现,乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取物质部位均能抑制PAI-1m RNA的表达,且正丁醇部位最为显着（P<0.01）。3桃核承气汤正丁醇有效物质部位的化学成分研究初步鉴定出桃核承气汤正丁醇有效物质部位中可能的26个化合物,其中2个来自桃仁,1个来自桂枝,8个来自大黄,15个来自甘草。主要为皂苷,黄酮,萜类化合物。4桃核承气汤正丁醇有效部位抗肾脏纤维化的网络药理学研究筛选出7个潜在活性化合物,得到活性成分靶标484个,潜在治疗靶标118个。通过活性成分-靶标网络发现,7,2’,4’-三羟基-5-甲氧基-3-苯基香豆素度值最高,表明其潜在治疗靶点最多,其余依次为甘草苷E、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、甘草苷、没食子酸-3-O-（6`-O-没食子酰）葡萄糖苷、18α-羟基甘草次酸。在PPI网络中前16个关键靶标依次是ALB、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK3、EGFR、TNF、CASP3、SRC、PTGS2、MAPK8、FN1、MMP9、JUN、KDR、IL1B。GO富集分析结果显示NE-THCQ主要影响细胞增殖、凋亡和细胞内信号级联。KEGG富集分析结果显示PI3K-AKT信号通路富集靶点最多,关联性最强,此外富集的前20条通路中,MAPK、TNF、Ras、HIF-1、NOD-like receptor、Toll-like receptor、VEGF、m TOR等信号通路均直接或间接参与了肾纤维化过程。5桃核承气汤正丁醇有效物质部位抗肾脏纤维化的作用机制研究（1）体外研究:CCK8法筛选出药物干预浓度为200mg/ml,孵育时间为12h、24h、48h时对细胞活力不产生影响。NE-THCQ能显着降低α-SMA和FN表达,并上调了E-cadherin,在48h作用最为显着（P<0.01）;显着抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞TNF-α的表达（P<0.01）和F-actin蛋白的重排;抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路磷酸化蛋白的表达,显着下调TGF-β1诱导的HK-2细胞中p-PI3K/PI3K（P<0.01）、p-m TOR/m TOR和p-AKT/AKT的比值（P<0.05）;显着抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞中HIF-1α（P<0.01）和VEGF的表达（P<0.05）。（2）体内研究:NE-THCQ能改善UUO大鼠肾脏形态病理学改变;降低血肌酐、尿素氮的水平（P<0.01）;显着减少血清IL-6、IL-β1的含量（P<0.01）;显着抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达（P<0.05或P<0.01）;抑制UUO大鼠肾组织中PI3K/AKT/m TOR信号通路磷酸化蛋白的表达,显着下调p-PI3K/PI3K、p-m TOR/m TOR（P<0.05）和p-AKT/AKT的比值（P<0.01）;显着抑制UUO大鼠肾组织中HIF-1α和VEGF的表达（P<0.01）。结论:1桃核承气汤加减辅助治疗CRF,较西药单纯治疗能提高临床疗效、改善肾功能、提高患者生存状态,但纳入文献的数量和质量有限,相关结论有待进一步验证。2初步筛选出桃核承气汤的有效物质部位群,分别为氯仿萃取物质部位,乙酸乙酯萃取物质部位和正丁醇萃取物质部位,其中正丁醇萃取物质部位为活性最佳。3初步鉴定出桃核承气汤正丁醇有效物质部位的26个可能的化合物,筛选出7个潜在活性化合物,为进一步研究其药理机制奠定了基础。4通过网络药理学研究,推测桃核承气汤正丁醇有效物质部位可能是通过调节PI3K/AKT、m TOR、HIF、VEGF等信号通路,靶向炎症因子（如TNF、IL-6、IL-1β等）,影响ECM降解酶活性（如MMP1、MMP2、MMP3等）以及刺激相关信号因子的表达从而对炎症、缺氧、血管生成、ECM的合成和降解进行综合调控,以发挥其抗肾脏纤维化的作用。5通过体内外实验发现,PI3K/AKT/m TOR和HIF-1α/VEGF信号通路介导了肾纤维化的发生。NE-THCQ抗肾脏纤维化的作用机制可能与其调控PI3K/AKT/m TOR和HIF-1α/VEGF信号通路从而抑制肾小管上皮细胞骨架重排、逆转上皮细胞间充质转化（EMT）、抑制细胞外基质（ECM）合成与分泌、抑制炎症反应、改善肾功能以及适应缺氧损伤有关。
丁昕宇[7]（2020）在《糖肾方抗氧化损伤改善肾间质纤维化的机制研究》文中研究表明肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）以成纤维细胞和肌成纤维细胞（myofibroblast,MF）大量增生、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蓄积为主要特征。RIF是几乎所有慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患者肾损害进行性加重,最终发展至终末期肾脏病（end-stage renal disease,ESRD）的共同病理基础。RIF的发病机制非常复杂,氧化应激反应是其中的重要因素之一。中医药在抗氧化、抗纤维化治疗方面具有很大潜力。糖肾方以益气养阴、活血通络、泄浊解毒为立法依据,组方包括黄芪、生地黄、山茱萸、三七、鬼箭羽、熟大黄、枳壳七味中药。前期研究证实,糖肾方在2型糖尿病模型db/db小鼠中具有明确的肾脏保护作用,减轻氧化应激是其可能的机制之一。在单侧肾切合并链脲佐菌素注射诱导的大鼠模型和单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction,UUO）的小鼠模型中,糖肾方均显示出良好的改善肾间质纤维化的作用。本研究利用UUO小鼠动物模型,探讨糖肾方通过下调NADPH氧化酶的表达,改善肾脏氧化损伤,从而发挥肾保护作用的机制。并通过体外实验验证糖肾方含药血清对过氧化氢（H2O2）诱导的人肾脏近曲小管上皮细胞株（HK-2）氧化损伤的保护作用。以期为糖肾方治疗肾间质纤维化的抗氧化机制提供实验依据。目的研究糖肾方通过降低NADPH氧化酶的表达,减轻肾脏的氧化应激水平,从而改善肾间质纤维化的机制。方法1.糖肾方对UUO小鼠肾脏保护作用及机制研究采用7周龄的雄性C57BL/6N小鼠56只,随机分为假手术组（仅将左侧输尿管游离,不结扎,不切断）8只、模型组（UUO组）16只、糖肾方组（UUO+糖肾方治疗）16只、福辛普利组（UUO+福辛普利治疗）16只。适应性喂养3天,预给药5天。糖肾方组给予糖肾方3.6g/kg/d,福辛普利组给予福辛普利1.5mg/kg/d,假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水。5天后进行左侧输尿管梗阻手术。术后继续灌胃给药7天或14天。模型组、糖肾方组、福辛普利组小鼠分别在术后7天、14天分两次取材,假手术组小鼠全部在术后14天处死。采集血清检测血肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性。摘取梗阻侧肾脏,TBA法检测肾组织匀浆中MDA含量,WST-1法检测SOD活性。制作肾脏石蜡切片,HE染色观察细胞浸润情况,MASSON染色及半定量分析观察肾间质纤维化程度,天狼星红染色观察肾脏胶原纤维增生的类型。应用免疫组化方法检测肾组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子-β1（transforming growthfactor β1,TGF-β1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）的蛋白表达情况,应用 Western blotting方法检测肾组织中NADPH氧化酶亚基、Nrf2通路的蛋白表达情况,应用quantitative real-time PCR的方法检测肾组织中TGF-β1、CTGF、NADPH氧化酶亚基、Nrf2通路的基因表达。2.糖肾方含药血清对HK-2细胞氧化损伤的干预作用研究采用雄性SD大鼠（体重200±10g）,随机分为空白组和糖肾方组,每组10只。糖肾方组给予糖肾方2.4g/kg/d,空白组给予相同体积生理盐水,连续灌胃给药7天。第7天早晨空腹,给药2h后,麻醉,采血,冷冻离心取上清,合并同组血清,56℃、30min灭活,-20℃保存。对体外培养的HK-2细胞系,用不同浓度的H2O2分别造成氧化损伤细胞模型,用CCK8法检测细胞存活率,从而筛选出制备HK-2细胞氧化损伤模型所需要的H2O2浓度和时间。然后进一步应用CCK8法检测不同浓度含药血清对H2O2诱导HK-2细胞存活率的影响,筛选出恢复受损细胞增殖作用最强的含药血清浓度。将HK-2细胞分为对照组（培养基+空白血清）、模型组（培养基+H2O2+空白血清）、糖肾方组（培养基+H2O2+含药血清）。采用TBA法检测各组细胞培养上清液MDA含量,WST-1法检测SOD活性,quantitative real-time PCR的方法检测细胞内TGF-β1的基因表达。结果1.糖肾方可以改善UUO小鼠的肾组织损伤,机制与抗氧化应激有关。（1）肾保护作用:HE染色提示,糖肾方可以明显减轻UUO小鼠肾小管上皮细胞的变性、坏死,减少肾间质炎性细胞浸润。Masson染色提示,糖肾方可以减少肾间质胶原纤维的增生;半定量分析结果也提示,无论造模第7天还是14天,糖肾方均可以显着降低胶原纤维面积百分比,统计学分析两组具有显着性差异（P<0.001）。免疫组化结果显示,造模7天时,糖肾方可以显着降低I型胶原的表达,统计学分析两组具有显着性差异（P<0.001）;造模14天时,糖肾方可以显着降低I型、III型胶原的表达,统计学分析结果均为P<0.001。免疫组化和quantitative real-time PCR的结果显示,造模7天时,糖肾方可以显着降低TGF-β1的蛋白质和mRNA相对表达量,统计学结果分别为P<0.05、P<0.001,显着降低CTGF的mRNA相对表达量,统计学分析结果为P<0.001;造模14天时,糖肾方同样可以显着降低TGF-β1的蛋白质和mRNA相对表达量,统计学结果分别为P<0.01、P<0.001,显着降低CTGF的蛋白质和mRNA相对表达量,统计学结果分别为P<0.05、P<0.001。从肾功能来看,造模14天时,糖肾方可以显着降低UUO小鼠的Scr水平,统计学分析两组具有显着性差异（P<0.01）,但对BUN没有明显影响。（2）抗氧化应激机制:无论造模7天还是14天,UUO小鼠的肾组织和血清MDA含量均显着升高,统计学分析两组具有显着性差异（P<0.001）,肾组织和血清SOD活性均显着降低,统计学分析结果分别是P<0.001、P<0.05。造模7天时,糖肾方可以显着降低肾组织和血清MDA含量,统计学分析两组具有显着性差异（P<0.001）,并显着升高肾组织和血清SOD活性,统计学分析结果分别是P<0.001、P<0.05;造模14天时,糖肾方可以显着降低肾组织和血清MDA含量,统计学结果均为P<0.001,显着升高肾组织SOD活性,统计学结果为P<0.001。免疫组化结果显示,造模14天时,糖肾方可显着降低3-NT的蛋白质相对表达量,统计学结果是P<0.01。对于NADPH氧化酶亚基的影响,通过Western blotting和quantitative real-time PCR的结果提示,无论造模7天和14天,与模型组比较,糖肾方干预均能显着降低Nox4的蛋白质（统计学结果分别是P<0.001、P<0.01）和mRNA（统计学结果均为P<0.001）的相对表达量,同样也能显着降低磷酸化p47phox的蛋白质和mRNA相对表达量,统计学结果均为P<0.001。对于Nrf2通路的影响,通过Western blotting和quantitative real-time PCR的结果提示,与模型组比较,无论造模7天和14天,糖肾方均能显着降低Nrf2的蛋白质和mRNA相对表达量,统计学分析两组均具有显着性差异（P<0.001）,同样也能显着降低NQO1的蛋白质（统计学分析结果分别是P<0.01、P<0.05）和mRNA（统计学结果为P<0.001）相对表达量。2.糖肾方含药血清可以减轻H2O2诱导HK-2细胞系的氧化损伤。（1）筛选200 μmol/L浓度的H2O2作用48h,制备HK-2细胞系氧化损伤模型。并筛选恢复受损细胞增殖作用最强的糖肾方含药血清浓度为10%含药血清。（2）H2O2诱导HK-2细胞培养上清液的MDA含量显着升高,统计学分析两组具有显着性差异（P<0.01）,SOD活性显着下降,统计学分析两组具有显着性差异（P<0.01）;10%含药血清干预可以显着降低MDA含量,统计学分析结果为P<0.01,显着升高SOD活性,统计学结果是P<0.01。quantitative real-time PCR结果提示,与模型组比较,10%含药血清干预可以显着降低TGF-β1的mRNA相对表达量,统计学结果为P<0.01。结论1.糖肾方可以改善UUO小鼠肾组织病理损伤,降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达。糖肾方改善肾间质纤维化的作用可能与其下调NADPH氧化酶的表达,从而显着降低UUO小鼠血清和肾组织的氧化应激水平有关。2.糖肾方含药血清可以降低H2O2诱导HK-2细胞氧化损伤模型的氧化应激水平,下调TGF-β1的基因表达。
赵诗语[8]（2020）在《芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制影响的研究》文中进行了进一步梳理目 的:芪蓟肾康颗粒剂是导师张君教授在三十余年的临床治疗儿童肾脏病的经验上结合古经方化裁而来。本实验研究对象为肾小管上皮细胞,运用转化生长因子β 1诱导肾小管上皮细胞发生间充质转分化,再制取不同组的药理血清并作用于发生间充质转分化的肾小管上皮细胞上。选取24h、48h、72h三个不同的时间点,通过观察TGF-β 1诱导的肾小管上皮细胞FN、ColIV及E-cadherin、α-SMA两种蛋白的表达水平,分别从细胞水平和蛋白水平上探究芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制的影响。材料与方法:1材料1.1实验动物SPF级SD大鼠54只,雌雄各半,（辽宁长生生物技术有限公司）。1.2细胞株HK-2人肾小管上皮细胞株,（广州吉妮欧生物科技有限公司）。1.3实验药品1.3.1芪蓟肾康组:小蓟、白花蛇舌草、仙鹤草、牡丹皮、丹参、黄芪等多位单味药颗粒剂（江阴天江药业有限公司）。1.3.2对照组:替米沙坦片（上海勃林格殷格翰药业有限公司）。1.4.1主要仪器Co2培养（Thermo美国）;超净工作台（Thermo美国）;台式离心机（Heraeus德国）;酶标仪（TECAN瑞士）;倒置相差显微镜（Olympus日本）;超低温冰箱（SANYO日本）;电泳仪（六一仪器厂北京）;水平摇床（六一仪器厂北京）;垂直电泳槽（六一仪器厂北京）。1.4.2主要试剂RPMI-1640培养液（HyClone公司）;PBS:磷酸缓冲液（HyClone公司）;转化生长因子β1（美国peprotech公司）;小牛血清（HyClone公司）;ELISA试剂盒（AMEKO公司）;兔抗α-SMA多克隆抗体（Cell Signaling公司）;兔抗E-cadherin多克隆抗体（Cell Signaling 公司）;HRP 标记抗兔 IgG（Cell Signaling 公司）。2方法2.1细胞培养及传代细胞的培养:人肾小管上皮细胞,先观察其生长状态,生长状态良好后吸弃培养瓶内原培养液,加入新的完全培养液进行培养繁育,每两天更换一次瓶内的培养液。细胞的传代:当细胞覆盖瓶底80%左右,且细胞生长周期为对数时,吸弃瓶内原培养液,再用PBS冲洗两次,然后加入0.25%的胰酶消化,4-5min,置于37℃CO2培养箱内。消化结束后,吸弃上层培养液,反复吹打瓶壁使细胞脱落于培养液中。最后吸出瓶内所有培养液,离心后弃清液,加入新的完全培养液,制成细胞混悬液,均等分加入到多个新培养瓶中,完成细胞的传代。2.2药理血清制备SD大鼠54只,雌雄各半,随机分成6组,每组9只,组别分别为空白组,模型组,替米沙坦组,芪蓟肾康颗粒剂低、中、高剂量组。连续5天行灌胃,末次给药后的1h腹主动脉采血,离心出血请,标记、保存、备用。具体给药方法如下:空白组和模型组使用0.9%的生理盐水灌胃。替米沙坦组等同成人最大量80mg/d;芪蓟肾康低剂组等同人的有效剂量;芪蓟肾康中浓度组等同人的2倍有效剂量;芪蓟肾康高浓度组等同人的4倍有效剂量。2.3细胞活性的检测（MTT法）通过预实验结果而得知含药血清的最佳浓度为15%,TGF-β1的最佳浓度为10ng/mL。在96孔培养板上接种细胞混悬液,分为六组,分别为空白组、模型组、替米沙坦组、芪蓟肾康低、中、高剂量组,n=10。于24h、48h、72h三个时间点测定0D值（565mm）。2.4FN、ColⅣ 的检测（ELISA 法）分别于24h、48h、72h三个时间点对各组的细胞上清液进行收集并标记,用ELISA法检测FN、ColⅣ。严格按照说明书上的操作,24h和72h的n=7,48h的n=8,分组同MTT。再于三个时间点测定0D值,依照标准参数绘制标准曲线。2.5 α-SMA、E-cadherin 的检测（Western Blot 法）收集24h、48h、72h三个时间点的细胞,使用考马斯亮蓝法对各组蛋白浓度进行测定。各样本制成上样液。加压电泳,转膜,封闭,加一抗、二抗,洗膜,发光显色,用Western Blot成像系统采集图像并保存。最后用Image J软件对灰度值进行分析。结 果:1细胞活性检测结果（MTT法）。24h的高剂量组与其他5组相比均具有统计学意义。48h的高剂量组与模型组、芪蓟肾康各剂量组相比均具有统计学意义。72h的芪蓟肾康高剂量组与替米沙坦组相比具有统计学意义。与模型组相比,24h、48h的芪蓟肾康高剂量组均具有统计学意义。与替米沙坦组相比,三个时间点的芪蓟肾康高剂量组均具有统计学意义。2 FN、ColⅣ的检测结果（ELISA法）。2.1 FN 的含量（ELISA 法）。24h、48h、72h三个时间点,模型组与正常组相比、模型组和四组药物组相比均具有统计学意义。48h和72h,替米沙坦组与芪蓟肾康不同剂量组相比均具有统计学意义,24h的替米沙坦组与芪蓟肾康中、高剂量组相比有统计学意义。48h和72h的芪蓟肾康低中高三组均具有统计学意义。三个时间点的芪蓟肾康低剂量组与芪蓟肾康中、高剂量组相比,均具有统计学意义。2.2 ColⅣ 的含量（ELISA 法）。24h、48h、72h三个时间点,模型组与正常组相比、模型组和四组药物组相比均具有统计学意义。24h的替米沙坦组与芪蓟肾康低剂量组相比具有统计学意义,48h、72h的替米沙坦组与芪蓟肾康不同剂量组相比均具有统计学意义。48h和72h的芪蓟肾康各剂量组均具有统计学意义。三个时间的芪蓟肾康低剂量组与芪蓟肾康中、高剂量组相比具有统计学意义。3 E-cadherin、α-SMA 的检测结果（Western Blot 法）。3.1 E-cadherin蛋白印迹分析结果与模型组相比,其余5组均具有统计学意义;与替米沙坦组相比,芪蓟肾康低剂量组具有统计学意义;与芪蓟肾康低剂量组相比,芪蓟肾康中剂量和高剂量组具有统计学意义。3.2 α-SMA蛋白印迹分析结果（Western Blot法）与模型组相比,其余5组均具有统计学意义;与替米沙坦组相比,芪蓟肾康低剂量和高剂量组具有统计学意义;与芪蓟肾康低剂量组相比,芪蓟肾康中剂量和高剂量组的α-SMA表达具有统计学意义。与芪蓟肾康中剂量组相比,芪蓟肾康高剂量组具有统计学意义。结 论:1.本实验证明了 TGF-β 1能够诱导人肾小管上皮细胞发生肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化,而且肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化可增加细胞外基质的产生,从而对肾脏纤维化起推进作用。2.本实验证明了芪蓟肾康颗粒剂能有效的抑制肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化的发生并且减少细胞外基质的产生,而且其抑制作用随着剂量的增加而加强。3.本实验证明了替米沙坦同样能够有效的抑制肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化的发生和减少细胞外基质的产生。
朱晓婷[9]（2020）在《基于Nrf2-keap1信号通路探讨益气化湿通络方阻抑5/6肾切除大鼠肾脏纤维化机制研究》文中提出第一部分益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠一般状况、肾功能及肾组织形态学的影响目的:观察益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠一般情况、肾功能及肾脏病理形态的改善作用,为进一步探讨此方可能的作用机制提供可靠的实验依据。方法:采用Platt法建立5/6肾切除慢性肾功能衰竭大鼠模型。造模成功后,将32只雄性SD成年大鼠,随机分成为:模型组（Model）、益气化湿通络方组（Yiqi Huashi Tongluo Formula,YHT）、贝那普利组（Benazepril Hydrochloride,BH）、假手术组（Sham）,每组8只。每日灌胃治疗1次（YHT组,免煎中药颗粒水溶液0.276g/100g/d;BH组,盐酸贝那普利片剂水溶液0.09mg/100g/d灌胃;Sham及Model组,1ml/100g/d去离子水灌胃）,连续治疗12周。收集SD大鼠12周末的24小时尿液,用于24小时尿蛋白定量检测。行SD大鼠腹主动脉取血,分离出血清,用于检测血肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（urea nitrogen,BUN）含量;摘取左肾,用滤纸吸干水分后称重,分成两部分保存,一部分保存于-80℃冰箱中,一部分保存于4%多聚甲醛中固定,留待检测。将4%多聚甲醛固定的肾组织行病理切片,用HE、Masson、碘酸雪夫氏反应染色（Periodic Acid-Schiff stain,PAS）、天狼星红染色（Picrosirius red staining）,观察残存肾组织病理形态学改变情况。以上数据应用均数±标准差（（?）±s）示,各组用单因素方差（one-way ANOVA）分析的均值以Newman-Keuls检验法作两两比较。结果:1、大鼠一般状况:Sham组大鼠摄食饮水、大小便均正常,毛发光亮,耳廓红润,尾部红润,活动反应均正常。Model组、YHT组和BH组大鼠进食均有不同程度减少,饮水增多,尿量逐渐增多,脱毛少光泽,耳廓发白、尾部发白湿冷,精神萎靡不振,活动量减少,其中Model组大鼠改变最明显,治疗组均较Model组有所改善。体重记录显示Model组大鼠体重低于Sham组的大鼠体重,YHT或BH干预后体重有升高（P<0.01）,YHT组和BH组差异无统计学意义（P>0.05）。2、大鼠存活率:清洁级健康雄性SD大鼠50只,随机分为组:sham组10只,造模组40只。Sham组10只大鼠进行剥离两侧肾包膜操作,不切除肾脏,试验期间死亡2只。其余采用5/6肾切除术造模,试验期间Model组死亡7只,YHT组死亡4只,BH组死亡4只,本实验模型存活率约60%。3、左残存肾重量:与Sham组相比,Model组大鼠残肾重量明显降低。与Model组相比,YHT组和BH组残肾重量增加（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。4、大鼠24小时尿蛋白定量:与Sham组相比,Model组大鼠24h尿蛋白排出量明显增多。与Model组相比,YHT组和BH组24小时尿蛋白排出量减少（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。5、大鼠BUN、SCr水平:与Sham组相比,Model组大鼠BUN、SCr明显升高。与Model组相比,YHT组或BH组大鼠的BUN、SCr水平明显降低（P<0.01）,YHT组与BH组比较,结果未表现出显着差异（P>0.05）。6、大鼠残存肾脏组织病理学6.1残存肾大体形态变化Sham组,组织呈红褐色,表面光滑湿润,被膜易剥离,切面皮质髓质界限清楚。Model组左残存肾组织呈灰褐色,体积小、重量轻,质地硬脆,表面呈均匀弥漫细颗粒,被膜不易剥离,切面皮质变薄。YHT组和BH组左侧残存肾组织体积增大、重量增加,质地较软,表面少量细颗粒状,被膜不易剥离,切面皮质较厚。6.2残存肾组织光镜下形态变化HE、Masson、PAS、天狼星红染色后显示:Sham组大鼠的肾小球结构清晰,未见充血、萎缩、肾小管上皮细胞排列整齐,基底膜完整,间质中未见明显炎症细胞浸润。Model组大鼠的肾小球硬化,玻璃样变,肾小球萎缩,毛细血管袢塌陷,肾小管上皮细胞变性、坏死,脱落,小管萎缩、消失,肾小管出现扩张,肾间质基质明显增多、大量淋巴细胞为主炎细胞浸润,泡沫细胞出现。YHT组和BH组肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化程度均有不同程度减轻。小结:1、本研究采用5/6肾切除术成功复制了SD大鼠慢性肾功能衰竭的病理模型,为研究治疗慢性肾功能衰竭CRF及肾脏纤维化提供了典型稳定可靠的实验基础;2、益气化湿通络方能有效改善CRF大鼠的一般状况、肾功能及肾脏纤维化的程度,其疗效与盐酸贝那普利相当;3、益气化湿通络方是在中医理论指导下,根据CRF临床病因病机特点,结合“三焦分而治之”法则创立的且长期应用于临床的有效自拟方,本研究为其临床应用提供了有力的实验数据。第二部分益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠肾脏纤维化相关蛋白的影响目的:探讨益气化湿通络方通过调节5/6肾切除大鼠肾纤维化相关蛋白的表达以阻抑肾脏纤维化的机制。方法:造模、分组与用药同第一部分,用Western blot技术检测大鼠肾组织转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（CollagenⅢ）的蛋白表达情况;免疫组化法观察FN、CollagenⅢ蛋白在残存肾组织的表达情况;荧光染色观察TGF-β1在残存肾组织中的表达情况;实时荧光定量PCR检测FN m RNA表达水平。结果:1、益气化湿通络方对肾组织中TGF-β1蛋白表达的影响1.1.Westernblot技术检测大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达情况,与Sham组相比,Model组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达水平明显增高（P<0.01）;与Model组比较,各治疗组TGF-β1表达水平均明显降低（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。1.2.荧光染色观察TGF-β1在肾组织表达情况,标记TGF-β1蛋白染色为绿色荧光,DAPI染色细胞核为蓝色荧光。TGF-β1免疫荧光结果显示,Sham组几乎没有绿色荧光表达;Model组绿色荧光强度高,提示Model组中TGF-β1蛋白高表达;YHT或BH干预后绿色荧光强度较Model组降低。2、益气化湿通络方对肾脏组织中FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的影响2.1.Westernblot技术检测大鼠肾组织FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达水平明显增高（P<0.01）;与Model组比较,各治疗组FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平均明显降低（P<0.01）。YHT组和BH组差异比较,无统计学意义（P>0.05）。2.2.免疫组化法观察FN、CollagenⅢ蛋白表达情况。与Sham组比较,Model组大鼠肾组织FN、CollagenⅢ蛋白呈棕黄色小颗粒状,主要在肾小球中呈现阳性反应,各蛋白表达量明显增高（P<0.01）;与Model组比较,各治疗组FN、CollagenⅢ蛋白表达量均明显降低（P<0.01）。YHT组和BH组差异无统计学意义（P>0.05）。2.3.qPCR（quantitative real-time PCR,实时荧光定量PCR）法检测FN m RNA在各组大鼠肾组织中的表达。与sham组相比,Model组大鼠肾组织中FN m RNA表达量增高（P<0.01）;与Model组比较,各治疗组FN m RNA表达量降低（P<0.01）。比较YHT组和BH组差异无统计学意义（P>0.05）。小结:益气化湿通络方可能是通过调节TGF-β1及其介导的促肾脏纤维化蛋白FN、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达,起到阻抑肾脏纤维化的作用。本研究为益气化湿通络方治疗CRF及肾脏纤维化提供了分子生物学依据。第三部分益气化湿通络方对5/6肾切除大鼠肾组织Nrf2-keap1信号通路的影响目的:探讨Nrf2-keap1信号通路在益气化湿通络方阻抑5/6肾切除大鼠肾纤维化中的作用,并进一步探讨益气化湿通络方治疗作用的可能机制,为临床应用提供试验依据。方法:造模、分组与用药同第一部分,12周末剖杀大鼠检测肾组织匀浆超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）的活性和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量;ELISA法检测肾组织中炎性因子白介素6（Interleukin-6,IL-6）,白介素1（Interleukin-1,IL-1）白介素10（Interleukin-10,IL-10）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）的表达情况;Western blot技术检测肾组织中氧化应激相关因子,核因子NF-E2相关因子（Nuclear factor-erythroid 2-related factor2,Nrf2）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4,Nox4）、血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1,HO-1）、活化核因子-kappa B（Nuclear factor kappa b,NF-κB）、细胞间黏附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的表达;免疫组化法观察NF-κB、ICAM-1、Nox4蛋白表达情况;荧光染色观察Nrf2和TNF-α在肾组织细胞核内的表达情况;实时荧光定量PCR检测Nrf2 m RNA表达水平。结果:1、益气化湿通络方对肾脏组织SOD活性和MDA含量的影响与Sham组相比,Model大鼠肾组织中SOD活性降低和MDA含量升高,与Model组相比,YHT组和BH组大鼠的肾脏组织SOD活性增加和MDA含量下降（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2、益气化湿通络方对肾脏组织中炎症相关因子IL-6,IL-1,IL-10和TNF-α、NF-κB、ICAM-1的影响2.1.ELISA法检测各组大鼠肾组织IL-6,IL-1,IL-10和TNF-α蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织IL-6,IL-1和TNF-α蛋白表达水平明显增高,IL-10蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;与Model组比较,各治疗组IL-6,IL-1和TNF-α蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,IL-10蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2.2.Westernblot技术检测大鼠肾组织NF-κB、ICAM-1的蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织NF-κB和ICAM-1蛋白表达水平明显增高（P<0.01）;与Model组比较,YHT或BH干预治疗后NF-κB和ICAM-1蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2.3.免疫组化法观察NF-κB、ICAM-1蛋白表达情况。与Sham组比较,Model组大鼠肾组织NF-κB、ICAM-1蛋白呈棕黄色小颗粒状,主要在肾小球中呈现阳性反应。蛋白表达量明显增高（P<0.01）;Model与组比较,各治疗组NF-κB、ICAM-1蛋白表达量均明显降低（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2.4.荧光染色观察核NF-κB在细胞核内的表达情况,红色荧光标记NF-κB蛋白,DAPI染色细胞核为蓝色荧光。结果显示:NF-κB蛋白Sham组几乎没有红色荧光表达;Model组红色荧光强度高,NF-κB蛋白高表达;YHT或BH干预后细胞核中红色荧光强度较Model组降低。3、益气化湿通络方对肾脏组织中氧化应激相关因子Nrf2、Keap1、Nox4、HO-1的影响3.1.Westernblot技术检测大鼠肾组织Nrf2、Keap1、Nox4、HO-1的蛋白表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织Keap1、Nox4蛋白表达水平明显增高,Nrf2、HO-1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;与Model组比较,YHT或BH干预治疗后Keap1、Nox4蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,Nrf2、HO-1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3.2.免疫组化法观察Nox4蛋白表达情况。与Sham组比较,Model组大鼠肾组织Nox4蛋白呈棕黄色小颗粒状,主要在肾小球中呈现阳性反应。蛋白表达量明显增高（P<0.01）;与Model组比较,各治疗组Nox4蛋白表达量均明显降低（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3.3.荧光染色观察核Nrf2在细胞核内的表达情况,标记Nrf2蛋白为红色荧光,DAPI染色细胞核为蓝色荧光。结果显示:与Sham组相比较,Model组肾组织细胞核内Nrf2蛋白的表达明显减少,YHT组或BH组较Model组Nrf2的表达增多明显。3.4.qPCR法检测Nrf2 m RNA在各组大鼠肾组织中的表达情况。与Sham组相比,Model组大鼠肾组织中Nrf2 m RNA表达量减少（P<0.01）;与Model组比较,各治疗组Nrf2 m RNA表达量增加（P<0.01）。YHT组和BH组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。小结:1、5/6肾切除大鼠肾组织SOD活性显着降低,MDA含量显着增加,IL-1、IL-6等炎性介质的表达明显升高,IL-10抗炎因子表达减少,此模型存在抗氧化能力减低和氧化应激增强、抗炎能力减低和炎症损伤加重;2、5/6肾切除大鼠肾组织中Nrf2/Keap1信号通路可影响氧化应激和炎症相关蛋白Nox4、HO-1、IL-6、IL-1、IL-10、NF-κB、TNF-α、ICAM-1的表达。YHT干预调节Nrf2/Keap1信号通路,影响了上述蛋白表达,纠正了5/6肾切除大鼠肾组织炎症信号与抗氧化反应的失衡,明显提高5/6肾切除大鼠抗氧化能力,抑制其氧化应激,减轻其炎症反应,这可能就是YHT治疗CRF,阻抑肾纤维化的机制之一。结论:1、本研究采用5/6肾切除术成功制造了SD大鼠慢性肾功能衰竭的病理损伤,为研究治疗慢性肾功能衰竭及肾脏纤维化提供了典型稳定可靠的动物模型;2、益气化湿通络方能有效改善慢性肾功能衰竭大鼠的一般状况、肾功能及肾脏纤维化进程,其疗效与盐酸贝那普利相当;3、益气化湿通络方是在中医理论指导下,根据CRF临床病因病机特点,结合“三焦分而治之”法则创立的且长期应用于临床的有效自拟方,本研究为其临床应用提供了有力的实验数据;4、益气化湿通络方通过影响TGF-β1及其介导的促肾脏纤维化进展的相关蛋白的表达,阻抑肾脏纤维化;5、益气化湿通络方通过影响Nrf2-Keap1信号通路调节了炎症信号与抗氧化反应的失衡,影响促纤维化蛋白表达,从而实现治疗CRF及阻抑肾纤维化,此可能为YHT的作用机制之一,因此Nrf2-Keap1信号通路可作为阻抑肾脏纤维化治疗的新靶点。
谢程程[10]（2019）在《基于Hedgehog信号通路对加味肾康方抗肾纤维化的作用及机制研究》文中指出目的:本研究通过观察Hedgehog信号通路相关分子在单侧输尿管结扎大鼠肾组织以及转化生长因子β 1诱导体外培养的HK-2细胞中的表达变化,探讨加味肾康方抗肾纤维化的作用及其机制,以期为中医药防治肾纤维化提供新的思路。方法:实验一:加味肾康方对UUO模型大鼠肾纤维化及HH信号通路表达的影响将126只SPF级雄性SD大鼠随机分为7组:正常组、假手术组、UUO模型组、西药组、中药低/中/高浓度组。正常组不予处理,假手术组切开皮肤后仅游离左侧输尿管随即缝合,其余各组进行左侧输尿管结扎手术。从术后第三天开始灌胃,中药低/中/高浓度组分别给予低/中/高浓度加味肾康方中药液,西药组给予盐酸贝那普利,正常组、假手术组和UUO模型组分别给予等量生理盐水。7组大鼠分别于灌胃后7/14/21天在10%水合氯醛的麻醉下行腹主动脉采血用于血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）检测,并取左侧肾脏组织,制作病理切片。行HE染色观察肾组织病理变化,Masson染色观察肾纤维化的程度,免疫组化检测α-SMA及HH信号通路相关分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1的表达情况,采用SPSS24.0数据统计软件进行统计学分析。实验二:加味肾康方含药血清对HK-2细胞的影响选取SPF级雄性SD大鼠制备加味肾康方含药血清和空白血清。培养HK-2细胞,随机分为4组:对照组、TGF-β1诱导模型组、单纯含药血清组、中药治疗组。各组细胞干预48小时后行RT-PCR检测Vimentin、E-Cad、Shh、Gli1的mRNA表达量,采用SPSS24.0数据统计软件进行统计学分析。结果:实验一:（1）生化检测:在7天阶段,与假手术组相比,UUO模型组的尿素氮水平升高（P<0.05）;与UUO模型组相比,西药组以及中药低/中/高浓度组的尿素氮均有所降低（P<0.05）。在14天阶段,各组大鼠尿素氮水平差异无统计学意义（P>0.05）。在21天阶段,与正常组和假手术组比,UUO模型组的尿素氮水平升高（P<0.05）。在7天阶段、14天阶段,各组大鼠肌酐水平差异无统计学意义（P>0.05）。在21天阶段,与正常组和假手术组比,UUO模型组的尿素氮水平升高（P<0.05）;与UUO模型组相比,西药组肌酐水平降低（P<0.05）。（2）HE染色和Masson染色:正常组和假手术组无明显病理改变,其余各组均可见不同程度的炎性细胞浸润、肾小管上皮细胞和肾间质的损伤、肾小管扩张,间质面积增大,间质胶原纤维沉积。其中UUO模型组纤维化病变程度较重。（3）免疫组化检测:α-SMA的表达:在7天阶段,各组大鼠α-SMA表达差异无统计学意义（P>0.05）。在14天阶段、21天阶段,UUO模型组的表达水平最高,与UUO模型组比较,西药组以及中药低/中/高浓度组的表达水平均显着降低（P<0.05）。Shh的表达:UUO模型组的表达最高,与UUO模型组比较,西药组以及中药低/中/高浓度组的表达均有所降低（P<0.05）。Ptch1的表达:UUO模型组表达最低,与UUO模型组比,西药组以及中药低/中/高浓度组的表达均有所升高（P<0.05）。Smo的表达:UUO模型组的表达最高,西药组以及中药低/中/高浓度组的表达比UUO模型组比较均有所降低（P<0.05）。Gli1的表达:UUO模型组表达最高,西药组以及中药低/中/高浓度组的表达比UUO模型组均有所降低（P<0.05）。实验二:（1）E-Cad的表达变化:与对照组比,TGF-β 1诱导模型组E-Cad mRNA表达量显着下降;与TGF-β 1诱导模型组相比,中药治疗组E-CadmRNA表达量明显上升（P<0.05）。（2）Vimentin的表达变化:与对照组比,TGF-β1诱导模型组Vimentin mRNA表达量显着升高;与TGF-β 1诱导模型组相比,单纯中药治疗组VimentinmRNA表达量明显下降（P<0.05）。（3）Shh的表达变化:与对照组相比,TGF-β 1诱导模型组Shh mRNA表达量显着上升;与TGF-β1诱导模型组比,中药治疗组ShhmRNA表达量明显下降（P<0.05）。（4）Gli1的表达变化:与对照组相比,TGF-β 1诱导模型组Gli1 mRNA表达量升高;与TGF-β 1诱导模型组比,中药治疗组的表达量有所下降（P<0.05）。结论:（1）加味肾康方能够改善肾纤维化大鼠炎性细胞浸润及肾小管上皮细胞和肾间质的损伤,减轻胶原纤维沉积,上调E-Cad的表达,下调α-SMA和Vimentin的表达,对肾纤维化具有一定的治疗作用。（2）UUO模型大鼠肾组织中Shh、Smo、Gli1的表达显着升高,而Ptch1的表达下降,提示HH信号通路的激活可能参与肾纤维化的发生发展。（3）加味肾康方可以下调HH信号通路的相关分子Shh、Smo、Gli1的表达水平,同时上调Ptch1的表达,从而达到抗纤维化作用,提示加味肾康方治疗肾纤维化的作用机制可能与抑制HH信号通路活性有关。
二、缓衰方对5/6肾切除大鼠细胞外基质的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、缓衰方对5/6肾切除大鼠细胞外基质的影响（论文提纲范文）
（1）糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 LncRNA在DKD肾脏纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中药改善DKD氧化应激损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于网络药理学探讨糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的机制 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 糖肾方治疗单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 糖肾方通过调控TGFβ1/Smad3和LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第四章 糖肾方通过调控Keap1/Nrf2减轻DKD氧化应激损伤的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）基于P-selectin/PSGL-1/MAPK信号通路研究清肾颗粒对炎症介导的内皮细胞损伤及纤维化的干预作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 清肾颗粒对5/6 肾切除大鼠肾小球内皮细胞损伤及纤维化的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 P-selectin/PSGL-1/MAPK信号通路在LPS诱导的内皮细胞损伤及纤维化中的作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 清肾颗粒含药血清对LPS诱导的内皮细胞损伤和纤维化的干预及P-selectin/PSGL-1/MAPK信号通路的调节 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基于超高效液相色谱法分析清肾颗粒有效成分 |
| 1.前言 |
| 2.仪器与试药 |
| 3.实验方法 |
| 4.质量评估 |
| 5.UPLC 指纹图谱的建立 |
| 6.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与创新 |
| 不足与展望 |
| 综述一:中医药防治慢性肾衰进展 |
| 参考文献 |
| 综述二:JNK信号通路与肾纤维化 |
| 参考文献 |
| 综述三:p38 MAPK信号通路与肾纤维化 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（3）益气活血法干预肾纤维化机制的研究进展（论文提纲范文）
| 1 肾纤维化形成的机制 |
| 1.1 转化生长因子的表达 |
| 1.2 细胞外基质沉积 |
| 1.3 上皮间充质转化 |
| 1.4 炎症反应 |
| 1.5 氧化应激反应 |
| 2 古今医学对肾纤维化血瘀的认识 |
| 3 益气活血法干预肾纤维化的机制研究 |
| 3.1 调节细胞因子的表达 |
| 3.2 减少细胞外基质的沉积 |
| 3.3 抑制上皮间充质转化 |
| 3.4 减轻炎症反应 |
| 3.5 抗氧化应激反应 |
| 4 总结与思考 |
（4）益肾缓衰方调控IS/AhR/NOX4通路改善动脉粥样硬化性肾病的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 动脉粥样硬化性肾病的中西医研究概况 |
| 参考文献 |
| 综述二 硫酸吲哚酚对多系统毒性作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 蛋白结合毒素的中西医治疗现状 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 益肾缓衰方对ARD小鼠小管间质纤维化的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 益肾缓衰方改善ARD小鼠小管间质纤维化的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验三 益肾缓衰方对IS刺激下血管内皮损伤的作用和机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（5）肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药防治慢性肾脏病肾纤维化研究进展 |
| 1. 病名 |
| 2. 病因病机 |
| 3. 临床治疗 |
| 4. 实验研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 肾康注射液治疗肾脏疾病研究概述 |
| 1. 药物基本情况 |
| 2. 临床疗效研究 |
| 3. 基础药理机制研究 |
| 4.发展前景 |
| 参考文献 |
| 综述三 血管生成在肾纤维化发生发展中作用的研究进展 |
| 1. 血管生成发生发展 |
| 2. 肾纤维化发生发展 |
| 3. 血管生成障碍与肾纤维化密切相关 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 肾康注射液对UUO小鼠肾纤维化和血管生成的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对HUVEC血管生成和VEGF/VEGFR-2/eNOS的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要成果 |
（6）桃核承气汤抗肾脏纤维化的药效物质基础及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 桃核承气汤加减治疗慢性肾衰竭的Meta分析 |
| 引言 |
| 1 方法 |
| 1.1 文献检索 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 资料提取与评价 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 文献筛选 |
| 2.2 纳入文献的基本特征 |
| 2.3 文献质量评价 |
| 2.4 Meta分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 桃核承气汤抗肾脏纤维化有效物质部位的筛选研究 |
| 引言 |
| 第一节 桃核承气汤醇提物的制备及各部位的分离 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 小结 |
| 第二节 桃核承气汤有效物质部位的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 桃核承气汤正丁醇有效物质部位的化学成分研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 试药与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 供试药品制备 |
| 2.2 色谱条件 |
| 2.3 质谱条件 |
| 3 分析结果 |
| 3.1 桃核承气汤正丁醇萃取物质部位总离子图 |
| 3.2 色谱峰中主要化学成分的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 桃核承气汤正丁醇有效物质部位抗肾脏纤维化的网络药理学研究 |
| 引言 |
| 1 方法 |
| 1.1 活性成分的筛选 |
| 1.2 活性成分作用靶标预测 |
| 1.3 疾病靶标收集 |
| 1.4 网络构建与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 桃核承气汤正丁醇有效物质部位的活性成分 |
| 2.2 桃核承气汤正丁醇有效物质部位活性成分-治疗靶标网络构建 |
| 2.3 PPI网络构建 |
| 2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 |
| 2.5 桃核承气汤正丁醇有效物质部位活性成分-靶标-信号通路网络构建 |
| 3 讨论 |
| 第五章 桃核承气汤正丁醇有效物质部位抗肾脏纤维化的作用机制研究 |
| 引言 |
| 第一节 体外实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 体内实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 1 研究结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 |
| 综述1:肾脏纤维化机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2:中医药抗肾脏纤维化的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 26个化合物分子离子峰图 |
| 附录三 攻读博士期间论文发表及参编论着情况 |
| 致谢 |
（7）糖肾方抗氧化损伤改善肾间质纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肾间质纤维化与氧化应激 |
| 1 慢性肾脏病、肾间质纤维化与氧化应激之间的关系 |
| 2 活性氧促进肾间质纤维化的作用 |
| 3 NOX家族源性活性氧在肾间质纤维化中的作用 |
| 4 Nrf2/ARE信号通路及其调控的抗氧化蛋白 |
| 5 抗纤维化、抗氧化治疗现状 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药复方抗氧化治疗减轻肾间质纤维化的研究进展 |
| 1 中医对肾间质纤维化的认识 |
| 2 中医对肾间质纤维化的辨证论治 |
| 3 中药复方抗氧化、抗肾间质纤维化治疗的组方规律 |
| 4 中药复方抗氧化、抗肾间质纤维化治疗的机制研究 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 糖肾方抗氧化应激改善UUO小鼠肾间质纤维化的机制研究 |
| 前言 |
| 一 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 1 各组小鼠一般情况和体重的比较 |
| 2 各组小鼠肾脏外形和梗阻侧肾脏重量的比较 |
| 3 糖肾方对UUO小鼠肾功能的影响 |
| 4 各组小鼠梗阻侧肾脏的病理改变 |
| 5 糖肾方对UUO小鼠肾间质纤维化相关指标的影响 |
| 6 糖肾方对UUO小鼠氧化应激相关指标的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 糖肾方对H_2O_2诱导HK-2细胞氧化损伤模型的干预作用研究 |
| 前言 |
| 一 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 1 不同浓度H_2O_2对HK-2细胞增殖率的影响 |
| 2 不同浓度含药血清对H_2O_2诱导HK-2氧化损伤模型的干预作用 |
| 3 10%含药血清对H_2O_2诱导的HK-2细胞氧化损伤指标的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 肾小管上皮细胞-间质转分化的研究进展及中医药防治 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）基于Nrf2-keap1信号通路探讨益气化湿通络方阻抑5/6肾切除大鼠肾脏纤维化机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 益气化湿通络方对5/6 肾切除大鼠一般状况、肾功能及肾组织形态学的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益气化湿通络方对5/6 肾切除大鼠肾脏纤维化相关蛋白的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 益气化湿通络方对5/6 肾切除大鼠Nrf2-keap1 信号通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 慢性肾衰治疗进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 Nrf2-keap1信号通路与肾脏纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于Hedgehog信号通路对加味肾康方抗肾纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 研究内容 |
| 第一部分: 加味肾康方对UUO模型大鼠肾纤维化及HH信号通路表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验药物 |
| 1.1.3 实验主要设备 |
| 1.1.4 实验主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组 |
| 1.2.2 实验动物造模 |
| 1.2.3 实验动物给药 |
| 1.2.4 生化检测 |
| 1.2.5 肾脏病理检查 |
| 1.2.5.1 病理切片制作 |
| 1.2.5.2 HE染色 |
| 1.2.5.3 Masson染色 |
| 1.2.5.4 免疫组化检测 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠一般情况 |
| 2.2 大鼠生化检测情况 |
| 2.2.1 肌酐情况 |
| 2.2.2 尿素氮情况 |
| 2.3 大鼠肾脏病理检查情况 |
| 2.3.1 HE染色结果 |
| 2.3.2 Masson染色结果 |
| 2.3.3 免疫组化检测结果 |
| 2.3.3.1 α-SM的表达结果 |
| 2.3.3.2 Shh的表达结果 |
| 2.3.3.3 Ptch1的表达结果 |
| 2.3.3.4 Smo的表达结果 |
| 2.3.3.5 Gli1的表达结果 |
| 第二部分: 加味肾康方含药血清对HK-2细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验细胞 |
| 1.1.3 实验药物 |
| 1.1.4 实验主要试剂 |
| 1.1.5 实验主要设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 血清的制备 |
| 1.2.2 细胞培养及分组 |
| 1.2.3 RT-PCR检测 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 E-Cad mRNA的表达情况 |
| 2.2 Vimentin mRNA的表达情况 |
| 2.3 Shh mRNA的表达情况 |
| 2.4 Gli1 mRNA的表达情况 |
| 讨论 |
| 1 西医关于肾纤维化的研究 |
| 1.1 西医关于肾纤维化机制的研究 |
| 1.1.1 炎性细胞浸润 |
| 1.1.2 肾间质成纤维细胞增殖、活化和表型转化 |
| 1.1.3 肾小管上皮细胞表型转化 |
| 1.1.4 细胞外基质转换失衡 |
| 1.1.5 细胞因子的作用 |
| 1.1.6 信号通路的调控 |
| 1.2 西医关于肾纤维化治疗的研究 |
| 2 中医对于肾纤维化的认识 |
| 2.1 中医对于肾纤维化病机的认识 |
| 2.1.1 正虚是发病之本 |
| 2.1.2 邪实乃发病之标 |
| 2.1.3 肾络痹阻为核心病机 |
| 2.2 中医对于肾纤维化治疗的认识 |
| 3 加味肾康方药物组成分析 |
| 4 加味肾康方对肾纤维化治疗作用及机制的探讨 |
| 4.1 加味肾康方对大鼠肾功能的影响 |
| 4.2 加味肾康方对大鼠肾组织病理的影响 |
| 4.3 加味肾康方对肾纤维化的影响 |
| 4.3.1 下调α-SMA的表达 |
| 4.3.2 下调Vimentin mRNA的表达 |
| 4.3.3 上调E-Cad mRNA的表达 |
| 4.4 加味肾康方对HH信号通路相关分子的影响 |
| 4.4.1 下调Shh的表达 |
| 4.4.2 上调Ptch1的表达 |
| 4.4.3 下调Smo的表达 |
| 4.4.4 下调Gli1的表达 |
| 结论 |
| 特色及创新性 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1: 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
四、缓衰方对5/6肾切除大鼠细胞外基质的影响（论文参考文献）
- [1]糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究[D]. 周学锋. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]基于P-selectin/PSGL-1/MAPK信号通路研究清肾颗粒对炎症介导的内皮细胞损伤及纤维化的干预作用[D]. 张磊. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [3]益气活血法干预肾纤维化机制的研究进展[J]. 蓝芳,赵洁,史伟,莫超,孟立锋,梁春琴. 世界科学技术-中医药现代化, 2020(10)
- [4]益肾缓衰方调控IS/AhR/NOX4通路改善动脉粥样硬化性肾病的机制研究[D]. 郭传. 中国中医科学院, 2020(01)
- [5]肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究[D]. 潘雅婧. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]桃核承气汤抗肾脏纤维化的药效物质基础及作用机制研究[D]. 周珊珊. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [7]糖肾方抗氧化损伤改善肾间质纤维化的机制研究[D]. 丁昕宇. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制影响的研究[D]. 赵诗语. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [9]基于Nrf2-keap1信号通路探讨益气化湿通络方阻抑5/6肾切除大鼠肾脏纤维化机制研究[D]. 朱晓婷. 河北中医学院, 2020
- [10]基于Hedgehog信号通路对加味肾康方抗肾纤维化的作用及机制研究[D]. 谢程程. 成都中医药大学, 2019(04)