一、哺乳动物精原干细胞及其生物学特性（论文文献综述）
冯天雨[1]（2021）在《白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响》文中认为精原干细胞（SSCs）位于雄性动物睾丸曲细精管的基底膜,是唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。SSCs既能自我更新以维持干细胞池的稳定,又能分化参与精子发生,因而SSCs的研究对于了解雄性生殖细胞的分化机制具有重要意义,并且在转基因动物生产和男性不育症治疗方面具有临床应用价值。细胞的冷冻保存能够保持细胞的生物学特性并保障细胞的长期供应,而SSCs冷冻保存是保存优质未成熟雄性奶山羊生殖能力的重要方法。但是,冷冻-解冻过程会增加细胞内活性氧（ROS）的产生,引起SSCs氧化应激,并导致细胞凋亡,降低冻后细胞活力,因而SSCs冷冻保存过程中所受的氧化损伤是一个亟待解决的问题。白藜芦醇是一种天然植物多酚类化合物,具有广泛的生物和药理活性,包括抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、神经保护、心血管疾病防治等作用。目前对于家畜SSCs冷冻保存的研究较少,且尚未有白藜芦醇对SSCs冷冻保存效果方面的研究报道。因此,本研究首先对不同年龄奶山羊的睾丸进行切片观察和蛋白检测,以确定SSCs的表达情况,再通过两步酶消化和差速贴壁从奶山羊睾丸分离和纯化SSCs;其次用含有不同浓度白藜芦醇的冷冻保存液重悬SSCs并利用液氮进行超低温冷冻保存,解冻后检测SSCs活力,筛选最适白藜芦醇浓度;最后通过试剂盒检测、流式细胞术、Western blot、透射电镜等方法探究冷冻-解冻细胞的抗氧化、抗凋亡以及AMPK激活情况,初步揭示白藜芦醇对奶山羊SSCs冷冻保存的保护机制。本试验主要研究结果如下:1.通过不同月龄（15日龄、1月龄、3月龄、6月龄、10月龄）奶山羊睾丸的苏木精-伊红（HE）染色和PGP9.5免疫组织化学染色观察发现,随着奶山羊年龄的增长,曲细精管直径变大,睾丸细胞种类增加,精原细胞总量增多但所占比例下降。Western blot检测不同日龄（15、30、45、60、75、90、180日龄）奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1的蛋白表达量显示,60日龄前的奶山羊睾丸中精原细胞含量显着高于75日龄后（P<0.05）,适合用于提取SSCs。2.通过机械分离和两步酶消化分离睾丸细胞,再经差速贴壁纯化收集奶山羊SSCs。利用免疫荧光染色对细胞进行鉴定显示,纯化后的细胞高表达分子标记GFRα1、PLZF、PGP9.5和THY1,表示本研究方法可获得纯度较高的SSCs。3.在冷冻保存液中添加不同浓度（0、0.1、1、10、100μmol/L）白藜芦醇,使用缓慢冷冻法保存奶山羊SSCs,37℃解冻后对细胞的活力和抗氧化能力进行测定。利用CCK-8和台盼蓝染色检测SSCs活力,结果显示当白藜芦醇浓度为10μmol/L时冻后细胞活力显着高于对照组和其他试验组（P<0.05）。与对照组相比较,冷冻保存液中添加白藜芦醇显着提高了冷冻-解冻后SSCs的总抗氧化能力（T-AOC）、线粒体膜电位和抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活性（P<0.05）,同时显着降低了细胞内ROS水平和丙二醛（MDA）含量（P<0.05）,其中10μmol/L白藜芦醇组SSCs的抗氧化效果显着优于其他试验组（P<0.05）,而ROS水平和MDA含量与100μmol/L组差异不显着（P>0.05）。4.选取对照组和10μmol/L白藜芦醇处理组进一步探究白藜芦醇在冷冻-解冻过程中保护SSCs的机制。Annexin V-FITC流式细胞检测结果表明,白藜芦醇组中SSCs的凋亡比例显着低于对照组（P<0.05）。白藜芦醇可极显着抑制促凋亡蛋白Bax的表达并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（P<0.01）;抑制细胞色素C从线粒体释放至细胞质,从而减少caspase 3和caspase 9的表达（P<0.05）。此外,白藜芦醇可激活细胞AMPK磷酸化,且此种作用可被AMPK抑制剂Compound C部分抵消。透射电镜对细胞超微结构的观察结果显示,冷冻保存液中白藜芦醇的添加显着降低了冷冻-解冻后SSCs的线粒体肿胀空泡化、膜起泡以及核变的比例（P<0.05）。以上研究结果表明,冷冻保存液中添加白藜芦醇能够有效提高冷冻-解冻后奶山羊SSCs的质量,且其最适浓度为10μmol/L。白藜芦醇通过提高细胞抗氧化能力,抑制线粒体途径凋亡,并且激活生物能量代谢调节关键因子AMPK磷酸化,从而在冷冻-解冻过程中减少损伤,发挥保护SSCs的作用。
李富远[2]（2021）在《SSEA4作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定》文中进行了进一步梳理哺乳动物体内,精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是唯一一种可以将父系遗传信息传递给后代的成体干细胞。因此,SSCs在动物遗传育种与繁殖等方面有着重要的应用前景。将基因编辑技术与SSCs移植技术相结合,可以制作转基因动物,提高动物的生产性能。同时,SSCs也是阐明干细胞自我更新与分化机制的良好模型。由于睾丸内SSCs的数目稀少,需要分离和富集SSCs才能开展相关研究。在啮齿类动物和灵长类动物,已经鉴定到若干有效的SSCs分子标记物。虽然已鉴定了几个猪未分化精原细胞的分子标记物,但是,仍然缺乏富集猪SSCs的表面分子标记物。据报道,阶段特异性胚胎抗原4（stage-specific embryonic antigen 4,SSEA4）在人和非人灵长类动物的精原干细胞外膜表面表达。因此,本研究旨在探究SSEA4在猪睾丸组织中的表达与分布,鉴定SSEA4对猪精原干细胞分离与富集的有效性。主要结果如下:（1）采集7日龄、90日龄和150日龄的猪睾丸组织,制作组织切片。苏木精-伊红染色及组织免疫荧光染色结果表明所采集的猪睾丸发育正常,SSEA4阳性细胞为生精小管基底膜处的精原细胞;统计分析显示,随着日龄的增加,平均每个生精小管内VASA阳性和UCHL-1阳性细胞数目表现为递增趋势,而SSEA4阳性细胞表现为递减趋势。这表明SSEA4可能是猪精原干细胞的表面分子标记物。（2）借助组织免疫荧光双染色鉴定表达SSEA4的细胞类型。结果表明SSEA4阳性细胞与已知的未分化精原细胞分子标记物DBA、PLZF共定位;且随着日龄增加,SSEA4阳性细胞占DBA、PLZF阳性细胞的比例逐渐下降,而不与SSEA4阳性细胞共定位的DBA、PLZF阳性细胞逐渐增加。因此,SSEA4阳性细胞是未分化精原细胞的一个小亚群。（3）采用流式细胞分选法分离SSEA4阳性精原细胞并借助免疫荧光染色、Western blot对其进行鉴定。结果表明以SSEA4为膜表面标记物,利用流式细胞分选法可高效富集SSEA4阳性精原细胞,富集效率在90%以上。细胞免疫荧光染色发现,SSEA4阳性精原细胞高度富集了未分化精原细胞。（4）借助转录组测序与分析,发现SSEA4阳性细胞高表达精原干细胞的标记基因ID4、PAX7、PIWIL4、EGR4、MSL3、TCF3等,而精原细胞（SPG）主要表达GFRA1、LIN28A、UCHL-1等生精细胞祖细胞基因以及STRA8、c-KIT和SYCE3等分化精原细胞的标记基因。GO分析表明,SSEA4阳性细胞上调的基因参与细胞黏附、干细胞群体维持和胚胎器官发生等干细胞相关功能;下调的基因则主要参与生殖细胞发育、细胞代谢过程和细胞内物质转运等生物学过程。（5）借助细胞异种移植鉴定SSEA4阳性细胞的生物学功能。异种移植结果显示,SSEA4阳性细胞生成的细胞克隆数目是未分化精原细胞（SPG）的2.5倍,是SSEA4阴性细胞的21倍,表明SSEA4阳性细胞是精原干细胞。综上所述,本研究表明SSEA4是猪精原干细胞的表面分子标记物。基于SSEA4利用流式分选法能够高效分离与富集猪精原干细胞。猪既是重要的肉用家畜,也是理想的医学模式动物。本研究结果为猪精原干细胞的体外培养及研究利用提供了条件和基础,并为其它家畜精原干细胞的分离与富集提供参考。
周子惠[3]（2021）在《Bta-miRNA-495影响牛精原干细胞增殖与凋亡的机制研究》文中研究指明雄性动物的繁殖性能与睾丸发育和精子发生密切相关。作为睾丸的重要组成细胞,精原干细胞是雄性动物体内唯一可以将遗传物质传递给子代的成体干细胞,具有极强的自我更新和分化的双重能力。其通过分化为精原细胞,而后进行有丝分裂和减数分裂源源不断地产生精子。MicroRNA（miRNA）作为一种小片段非编码RNA,其经典作用方式是通过与mRNA 3’UTR区靶向结合以调控相关生物学功能。有关研究表明,miRNA广泛参与生精过程,其在雄性繁殖性状发育上的重要性不容忽视,但目前关于miRNA在牛精原干细胞中的功能研究较少。因此,本研究根据前期安格斯牛睾丸组织转录组测序数据,筛选到在不同发育阶段的牛睾丸组织中差异表达的bta-miR-495作为研究对象。对bta-miR-495的表达特征分析后,利用过表达和干扰手段,以及RT-qPCR、流式细胞术、EdU、CCK-8、双荧光素酶报告分析、Western Blot试验等技术系统地探究了bta-miR-495对牛精原干细胞增殖和凋亡的影响及其机制。本研究为了解牛精子发生的分子调控机制及雄性繁殖性状的分子选育提供了理论依据。主要研究结果如下:1、bta-miR-495的筛选及对牛精原干细胞增殖与凋亡的影响通过已有的牛睾丸组织转录组测序数据,筛选得到初生期和性成熟后差异表达的bta-miR-495。表达特征分析结果表明bta-miR-495在初生期牛睾丸中表达量显着高于成年牛,这与测序数据一致。以牛精原干细胞永生化细胞系为模型,通过过表达和抑制bta-miR-495,使用RT-qPCR、流式细胞术、EdU、CCK-8和Western Blot试验,表明bta-miR-495抑制牛精原干细胞增殖且促进其凋亡。2、bta-miR-495的靶基因的预测与验证使用生物信息学软件Targetscan预测bta-miR-495的潜在靶基因,结合查阅文献筛选到三个可能影响牛精原干细胞增殖与凋亡的潜在靶基因（NABP1、CMTM8、RCN2）,并通过RT-qPCR、双荧光素酶报告分析验证RCN2是bta-miR-495的直接靶基因。3、RCN2-ERK调控牛精原干细胞的增殖和凋亡为了揭示bta-miR-495的靶基因RCN2在调控牛精原干细胞的增殖和凋亡中的重要作用,将RCN2的小干扰RNA转染进牛精原干细胞永生化细胞系。并利用RT-qPCR、流式细胞术、EdU、CCK-8和Western Blot实验技术证明特异性敲低RCN2后,导致MAPK通路中增殖和凋亡关键蛋白ERK的磷酸化水平显着下降,且牛精原干细胞的增殖受到抑制,其凋亡受到促进作用。以上试验结果表明,bta-miR-495和RCN2在牛精原干细胞增殖及凋亡过程中扮演重要角色,并且进一步验证了bta-miR-495对RCN2的靶向沉默作用,为进一步了解精子发生过程中复杂的分子调控机制提供了帮助。
宋连杰[4]（2020）在《蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定》文中研究表明马业由古老的产业向现代马术和赛马产业发展,已经成为当今重要的经济支柱,我国是养马大国,以蒙古马居多。蒙古马具有抗寒、抗病、耐粗饲的特点,在马的遗传资源中是一个及其珍贵的基因库。但是蒙古马的育种繁殖方面研究相对薄弱,从而影响了马匹改良进程。精原干细胞是雄性动物体内唯一能够进行有丝分裂,并且能把遗传信息传递给下一代的干细胞,然而在众多睾丸细胞中精原干细胞数量较少,为其后续分离纯化带来难度。迄今为止,模型动物精原干细胞的纯化培养体系日渐成熟,然而对于马属动物的精原干细胞的体外分离培养却仍然处于初级阶段。因此,本研究通过建立蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养体系,有利于对精原干细胞的长期培养和生长条件的进一步探索,不仅可以揭示蒙古马睾丸精原干细胞的体外增殖特点,还可以进一步探究蒙古马睾丸发育和精子产生机制,对蒙古马的改良以及育种有着重要意义。本实验以2岁蒙古马为研究对象,取其睾丸通过机械分离法和酶逐步消化法获得睾丸单细胞悬液,经过差速贴壁法进行分离纯化精原干细胞,然后接种于事先复苏好的支持细胞饲养层上,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、免疫荧光染色、qRT-PCR进行特异性标志基因鉴定。研究结果如下:1.支持细胞饲养层的制备,采用机械分离法和胶原酶、胰酶逐步消化法联合使用提取睾丸单细胞悬液,使用明胶包被的培养皿进行差速贴壁以期纯化支持细胞,其生长活性旺盛。2.对纯化的支持细胞进行HE染色,发现其形状不规则或者呈辐射状,细胞核染色为蓝紫色,胞质染色为红色,细胞之间紧密相连,符合支持细胞生长特征。3.连续8天检测支持细胞生长活率,发现其生长曲线呈“S”型,根据生长曲线选择前三代生存活力旺盛的细胞进行丝裂霉素C灭活留作饲养层有较高的使用价值。4.采用qRT-PCR方法检测培养5 d的蒙古马睾丸支持细胞特异性表达基因并选用蒙古马成纤维细胞（EFF）为对照,根据计算结果,P值小于0.01,表明支持细胞特异性基因GATA4和GDNF在支持细胞与成纤维细胞中的差异极显着。证明本次关于蒙古马睾丸支持细胞的体外分离与培养实验成功。5.蒙古马睾丸精原干细胞的制备,将睾丸样品进行分离消化,采用明胶、大鼠尾胶原、层粘连蛋白不同基质包被的培养皿差速贴壁法进行纯化,分离纯度为82%。6.使用经过丝裂霉素C灭活的支持细胞作为饲养层相对使用层粘连蛋白作为饲养层,精原干细胞增殖较快,一周以内出现细胞克隆团,细胞活力稳定。7.将精原干细胞进行（AKP）染色,细胞被染成棕褐色,即AKP 阳性,细胞具有干性,属于蒙古马精原干细胞。qRT-PCR检测精原干细胞特异性标志基因TSPYL2、Gfra1、Pgp9.5、CD9、MHC-I,以蒙古马成纤维细胞作为对照,结果为差异极显着（P<0.01）,即所培养的为蒙古马精原干细胞,经过免疫荧光染色,检测到干细胞标记物Pgp9.5表达,再次确定所培养的细胞为蒙古马睾丸精原干细胞。
李婷婷[5]（2019）在《水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究》文中指出水牛作为中国南方畜牧业中的重要家畜,不仅饲料转化率、乳制品的营养价值高,而且抗病力强,耐粗饲,具有较高的经济价值。然而水牛繁殖周期长,优质水牛数量少,水牛优良品种的培育成为了目前亟待解决的问题。精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是哺乳动物进行基因修饰和种系保存的理想种子细胞,由于其在医学、畜牧学等领域的广阔应用前景,受到越来越多的关注。水牛SSCs体外培养相关研究目前仍处于初级阶段,水牛SSCs尚未实现体外长期培养,原因可能在于对水牛SSCs所处微环境缺乏足够的了解,对水牛SSCs自我更新和分化等相关机制还知之甚少。本研究对比了不同培养体系对幼年水牛SSC-like cells体外培养的影响,利用转录组学手段,以曲细精管和类精原干细胞（spermatogonial stem cell-like cells,SSC-like cells）为研究对象,在成年水牛和幼年水牛间开展了差异转录组学分析,筛选调控水牛SSC-like cells自我更新的关键信号通路,挖掘关键基因。本研究的结果能为水牛SSCs自我更新和增殖相关机制及体外长期培养系统等研究提供一定的参考。本研究的内容和结果如下:（1）比较了不同体系对水牛SSC-like cells体外培养的影响。结果显示:与成分不明的培养体系相比,成分明确的培养体系在体外维持幼年水牛SSC-like cells表型的时间更长（6 d vs 10 d）,且能更好地维持幼年水牛SSC-like cells的分子特性。（2）开展了对成年和幼年水牛曲细精管转录组研究。结果显示:以幼年（4月龄）水牛睾丸的曲细精管和成年（2-3岁）水牛睾丸的曲细精管为研究对象,共鉴定到了17299个基因,其中表达量具有显着性差异的基因一共有13174个（差异倍数>2;P<0.05）。相对于成年水牛曲细精管而言,幼年水牛曲细精管上调表达基因参与的生物进程主要是关于细胞膜表面蛋白质的表达、定位和识别,与未分化精原细胞表面抗原的形成、识别或者归巢等行为密切相关;而下调表达基因主要参与的生物进程则是与精子分化形成密切相关的过程。同时还富集到了8条在曲细精管中可能调控水牛SSCs自我更新的信号调控通路及4个关键基因:MYC、FZD10、ID4和CCL27。（3）利用单细胞转录组学技术,开展了成年和幼年水牛SSC-like cells差异转录组研究。结果显示:以幼年（4月龄）水牛SSC-like cells和成年（2-3岁）水牛SSC-like cells为研究对象,共鉴定到了21803个基因,其中表达量具有显着性差异的基因一共有1419个（差异倍数>2;P<0.05）。相对于成年水牛SSC-like cells而言,幼年水牛SSC-like cells上调表达基因参与的生物进程主要是脂质代谢、细胞表面受体信号通路、迁移过程等与干细胞自我更新状态的维持以及与干细胞的迁移相关的生物进程;而下调表达基因主要参与的生物进程则是细胞减数分裂周期、减数分裂细胞周期过程以及雄性配子的生成等与后期配子形成及分化相关的生物进程。共富集到了151条可能与水牛SSCs自我更新、增殖迁移等调控过程密切相关的信号通路以及与通路相应的关键基因。总之,本研究通过水牛曲细精管及SSC-like cells差异转录组学分析及水牛SSC-like cells体外培养初步研究,为进一步探究水牛SSC-like cells体外自我更新机制以及长期培养等研究提供了丰富的参考数据,也为探究水牛SSC-like cells成分明确的体外培养体系奠定了一定的研究基础。
马方琳[6]（2019）在《LIN28A促进奶山羊精原干细胞自我更新和增殖的机制》文中认为精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是雄性体内唯一具有自我更新和分化功能的生殖细胞,又被称为雄性生殖干细胞（male germline stem cells,mGSCs）。精原干细胞虽然只占雄性总体生殖细胞的0.03%,但它却是雄性动物源源不断得产生精子,维持雄性生殖能力的基础。奶山羊是我国一种重要的经济性家畜,为人类提供丰富的奶制品和肉制品;同时它还是重要的生物反应器。但生殖力低下极大的限制了奶山羊的发展和应用。探索奶山羊精原干细胞自我更新、增殖和分化,在优秀种质资源的保存,和通过基因编辑技术获得优良奶山羊品系等方面具有重大意义。LIN28A是哺乳动物体内唯一一个同时具有冷休克结构和CCHC锌指结构的蛋白。它既可以结合DNA,在转录水平调控基因的表达;又可以结合RNA,在转录后水平调控基因的表达。LIN28A特异性表达在精原干细胞的细胞质中,可以作为雄性生殖干细胞的生物学标记。但其在奶山羊雄性生殖细胞中的表达和功能尚不清楚。在本研究中,我们探索了LIN28A在雄性奶山羊中的表达模式及其对奶山羊精原干细胞干性维持和自我更新的影响,并发现LIN28A通过表观修饰调控NANOG的表达。实验结果如下:1.LIN28A是一个广谱表达的基因,且在不同物种间具有高度的进化保守性。在本研究中,我们成功克隆了奶山羊LIN28A完整的CDS并对其序列、结构和表达谱进行了初步探索。奶山羊和牛、原鸡、人、鼠、绵羊、野猪的LIN28A氨基酸序列具有相似的亲水性和疏水性分布,序列相似性高达95.01%。结构域预测分析发现奶山羊LIN28A蛋白也具有和小鼠LIN28A蛋白相似的冷休克结构和CCHC锌指结构,这表明奶山羊LIN28A蛋白也具有一定的功能保守性。实时荧光定量PCR实验表明LIN28A在奶山羊的肝脏组织中表达量最高,其次是胰腺组织,在睾丸组织中的表达量较低。LIN28A在3月龄的睾丸组织中表达量最高,随着睾丸的发育其表达量降低。免疫荧光染色结果表明LIN28A主要特异性定位于奶山羊精原干细胞的细胞质中,在细胞核中也有少量表达,表明LIN28A可以作为奶山羊雄性生殖干细胞的标记。2.成功构建了奶山羊LIN28A的慢病毒过表达载体pLIN28A-CDH-CMV-EF1,并筛选出了稳定过表达LIN28A的mGSCs-I-SB细胞系GmGSCs-I-SB-Lin28a和对照组细胞系GmGSCs-I-SB-GFP。超表达LIN28A增强mGSCs-I-SB细胞系的细胞活力和增殖能力,同时不引起细胞凋亡的发生。GmGSCs-I-SB-Lin28a细胞系具有更短的群体倍增时间,增殖相关基因PCNA的表达量显着上调;BrdU的阳性率也明显高于对照组。GmGSCs-I-SB-Lin28a细胞系的干性相关基因OCT4,SOX2和自我更新相关基因PLZF,ETV5,GFRα1上调表达。以上结果表明,LIN28A在奶山羊精原干细胞的增殖、自我更新和干性维持等方面发挥重要的作用。3.GmGSCs-I-SB-Lin28a细胞系在白消安诱导的生精缺陷小鼠睾丸内环境中具有更强的增殖能力。移植GmGSCs-I-SB-Lin28a和GmGSCs-I-SB-GFP细胞系小鼠的睾丸的大小和重量没有明显差异;GmGSCs-I-SB-Lin28a移植组睾丸中具有更多VASA阳性的生殖细胞,平均每个生精小管中PCNA阳性细胞更多。但两组移植组附睾中均没有移植细胞源的精子细胞,说明GmGSCs-I-SB-Lin28a和GmGSCs-I-SB-GFP细胞系均不能完成分化过程。此外,我们发现LIN28A能通过激活mTOR/S6信号通路促进GmGSCs-I-SB的增殖。4.双荧光素酶实验和重亚硫酸盐处理测序实验表明,奶山羊15号染色体上的NANOG基因只有一个外显子,其启动子区不具有活力,转录起始位点附近的GC富集区高度甲基化;5号染色体上的NANOG基因有四个外显子,启动子GC富集区甲基化水平较低,具有很强的启动子活力,是一个功能性基因。5.5号染色体上NANOG基因的-1167→+201 5’UTR区具有最强的启动子活力,该区域存在两个可能的LIN28A结合位点（-783和-210）。启动子截短实验发现和-1167?→+?201启动子相比,LIN28A对-573→?+?201区域的启动子活力的增强能力没有明显差异,这表明LIN28A可能通过结合-210促进NANOG的表达。6.过表达LIN28A,不改变GmGSCs-I-SB整体组蛋白H3K4ME1/2/3的修饰水平和基因组整体甲基化修饰水平,但改变特定位点的DNA甲基化修饰水平。GmGSCsI-SB-Lin28a细胞系的5号染色体NANOG基因启动子的甲基化修饰水平更低。LIN28A和TET1在奶山羊精原干细胞中共定位,Co-IP实验证实两者之间存在互作关系。LIN28A结合NANOG启动子,并募集TET1对启动子区进行去甲基化修饰,促进NANOG的转录,而且该过程不依赖于Let-7g。综上所述,我们探究了LIN28A在雄性奶山羊体内的表达模式和LIN28A对其雄性生殖干细胞增殖与自我更新过程的影响,揭示了LIN28A可能通过募集TET1到NANOG的启动子,对其进行去甲基化修饰从而促进其表达的机制。我们的研究为探索奶山羊雄性生殖干细胞的增殖、自我更新、多能性的机理提供了新的科学依据;为优秀奶山羊种质资源的保存、繁育和通过基因编辑技术获得优良奶山羊品系等提供了新的方案。
季小阳[7]（2019）在《建立知识驱动的迁移学习方法比较多物种的精子功能生物学特性》文中研究表明随着社会经济的不断发展,动物繁殖在畜牧业和动物生产中变的越来越重要。提高动物繁殖率可以不断扩大良种覆盖率,提高动物生产效率以及增加经济效益。其中精子生物学特性研究是动物繁殖学的核心内容,与物种的延续和遗传进化紧密相关。随着高通量测序技术以及生物信息技术的发展,基于已发表的海量文献,我们已经获得了较为详细的精子生物学基因功能、基因表达以及突变检测位点等基因组数据信息。但这些基因功能和细胞生物学先验知识主要集中在人类或者一些模式动物中,在不同物种的知识分布上却不平衡。当我们将研究对象确定为某一种畜牧动物时,却发现并没有可靠和足够的数据信息支持该物种的生物学研究。本研究针对这一问题,基于已发表的精子生物学海量文献、比较基因组学数据、功能基因组学数据以及知识驱动的自动化文献挖掘方法,构建多个物种的精子生物学特性的知识图谱,实现物种间精子生物学特性的知识迁移。具体的研究内容与结果如下:（1）以“公共健康”关键词的文献摘要作为对照组,构建“精子”生物学特性知识图谱。基于知识驱动的自动化文献挖掘统计方法,获得精子生物学特性相关的特异性基因1195个,特异性实体2162个,以及1195个基因与2162个实体之间的关联矩阵,作为标准模型。同时基于标准化知识分类,获得89个精子生物学特性实体类别,以及与该实体类别最相关的文献摘要信息。（2）结合IPA、KEGG数据库的信号通路的通路特征（pathway signatures）数据信息,获得精子生物学特性实体类别显着相关的信号通路（即精子生物学特性类别信号通路）,以及该信号通路所富集的基因。进一步分析,我们获得每一个精子生物学特性类别中被显着激活和被显着抑制的信号通路。以及187个信号通路中每一个信号通路被显着激活和被显着抑制所对应的精子生物学特性类别。（3）基于物种基因组学数据和同源基因组数据信息,构建蒙古族五畜“山羊、绵羊、双峰驼、马、牛”的精子生物学特性知识图谱。结合人类精子生物学特性的标准知识数据库和信号通路功能数据库,进行物种间精子生物学特性的知识迁移。我们发现11个精子生物学特性类别信号通路在5个物种中是显着保守的（z-score>5）,以及获得不同物种中特异性保守的精子生物学特性类别信号通路（z-score>3）。同时,在相对保守的110个精子生物学特性类别信号通路所富集的基因网络中（z-score>3）,发现RAF1、和EGF基因是网络中的枢纽基因。（4）在“马和驴、山羊和绵羊”两对近缘物种之间进行精物生物学特性的可迁移性评估。分别获得每对近缘物种之间显着保守且可以互相进行迁移的精子生物学特性类别信号通路,以及单个物种显着特异性保守且不可迁移的精子生物学特性类别信号通路（Z-score>5）。（5）在“单峰驼、双峰驼、羊驼、野生双峰驼”4个骆驼科物种之间进行精子生物学特性的可迁移性评估。获得4个物种之间显着保守且可以迁移的13个精子生物学特性类别信号通路,以及单个物种特异性保守且不可迁移的精子生物学特性类别信号通路（Z-score>3）。同样,还获得只在某一物种的精子生物学特性类别中没有被显着激活的信号通路,如“Toll-like Receptor Signaling”信号通路在羊驼的精子细胞DNA和蛋白质结构相关的生物学特性中没有被显着激活,而在单峰驼、双峰驼和野生双峰驼中被显着激活。因此,我们以精子生物学文献摘要作为知识背景,构建知识驱动的自动化文献统计挖掘方法绘制了精子生物学标准知识图谱。同时,采用迁移学习方法构建多物种精子比较功能生物学组,进而实现物种间精子生物学特性的可迁移性评估,为深入了解不同物种的精子生物学特性提供了一定的数据和理论基础。
孙琪[8]（2019）在《精原干细胞异种移植体系的建立与早期精子发生的调控》文中认为生殖细胞是多细胞生物繁衍后代的基础,其中精原干细胞（spermatogonia stem cells,SSCs）在雄性哺乳动物的精子发生中至关重要。本研究分别从精原干细胞异种移植和早期精子发生中亚细胞器间相互作用的调控机制两个方面进行分析。我们首先通过异种移植实验,探究小鼠睾丸微环境对人的精原干细胞（human spermatogonia stem cells,h SSCs）的影响。我们发现,移植后的h SSCs在裸鼠、ICR小鼠和c-kit W/Wv小鼠睾丸内均可存活,并能够向曲细精管的基底膜处迁移,具有SSC的功能性特征。由此证明,小鼠睾丸可为h SSC的生存提供适宜的微环境,且不发生免疫排斥反应。该异种移植体系的建立为体外诱导人的类精原干细胞的功能性鉴定提供新的平台,也为h SSC的保存方式提供一个新的可能。另一方面,我们探究了线粒体与内质网（endoplasmic reticulum,ER）对早期生殖细胞的功能调控。我们发现线粒体融合蛋白（mitofusins,MFNs）或ASZ1缺失后小鼠精原细胞分化异常,且MFNs可在多种类型的细胞中（包括生殖细胞）影响线粒体-内质网连接膜（mitochondrial-associated membranes,MAM）进而调节线粒体和ER的功能。通过构建Mfns生殖细胞条件性敲除小鼠,我们发现早期生殖细胞中ER内的未折叠蛋白表达增加,内质网呈现应激状态。更有趣的是,除了生殖细胞特异性蛋白ASZ1,我们在生殖细胞中还发现了多个蛋白可与MFNs相互作用,协同参与了线粒体功能的调控。此外,我们还分离MAMs,并将通过质谱分析检测MAMs中蛋白质复合物的组分,这将进一步提高我们对早期精子发生中线粒体和ER功能调控的认识。
张小宇[9]（2018）在《钙粘素CDH22调控雌性生殖干细胞自我更新机制的研究及褪黑素在生殖力维持中的应用》文中研究表明生殖干细胞是一类具有自我更新能力,以及通过分化产生配子的生殖系干细胞,包括雄性动物中的精原干细胞,以及雌性动物中的雌性生殖干细胞（也叫卵原干细胞）。生殖干细胞的健康程度,以及自我更新和分化能力,直接决定着个体的生殖能力,但目前生殖干细胞自我更新和分化的分子机制尚不明确。本文从三个不同的方向分别讨论了生殖干细胞的特性及在生物医学领域,畜牧产业以及农业经济中的关联性与重要性,具体包括:以小鼠雌性生殖干细胞为研究对象,研究了小鼠雌性生殖干细胞命运调控的相关调控分子与信号通路;针对化疗药物白消安的生殖系毒副作用,探索了褪黑素在化疗过程中对小鼠精原干细胞生殖力保护作用的机制;以及针对畜牧业中玉米赤霉烯酮对种公畜的生殖毒性影响,初步探索了褪黑素在缓解玉米赤霉烯酮引发的猪精原干细胞损伤中的效果。具体内容和研究结果如下:在第一部分的研究里,我们发现钙粘素蛋白CDH22是调控小鼠雌性生殖干细胞的重要膜蛋白。有报道证实大鼠CDH22能编码长短两种剪切型式,其中短型剪切体能通过PI3K-AKT,JAK-STAT通路促进精原干细胞的自我更新,但不存在与β-catenin的相互作用。但我们发现在小鼠雌性生殖干细胞中CDH22只编码一种型式的蛋白,且能够通过与JAK2,PI3K以及β-catenin的相互作用,调节其自我更新。同时,我们证实GDNF能够通过GFRα1受体调节雌性生殖干细胞的自我更新,并揭示AKT3是调控雌性生殖干细胞自我更新的信号通路的一个枢纽因子,CDH22和GFRα1都需通过PI3K,SFK调控AKT3表达,从而调控雌性生殖干细胞的自我更新和维持。在第二部分中,我们研究了不同激素在化疗药物白消安诱导的生殖毒性中对精原干细胞的保护作用。通过分析了化疗药物白消安对生殖系统,尤其是对精原千细胞的毒性损伤,我们发现白消安能够诱导精原干细胞内活性氧的大量积累,激活了精原干细胞ATM-P53信号通路,诱导精原干细胞凋亡,自我更新阻滞。通过P53基因敲除老鼠验证了,P53是白消安诱导精原干细胞凋亡的重要分子,P53缺失能够避免白消安引起的凋亡。接着我们比较了促性腺激素FSH和LH,性激素DHT和E2,以及垂体激素褪黑素在白消安存在时对精原干细胞的保护效果,发现褪黑素有最佳的缓解效果。随后我们又优化了褪黑素的给药方式,发现连续注射褪黑素可以高效的缓解白消安对精原干细胞的损伤。最后我们证实了褪黑素能够通过中和精原干细胞内由于白消安产生的活性氧,避免白消安诱导的P53依赖性凋亡,防止生殖力丢失。在最后一部分中,我们初步探索了褪黑素在保护种公畜繁殖力中的作用。玉米赤霉烯酮是一种主要的粮食污染物,不仅具有雌激素毒性,而且能够引起生殖细胞的氧化应激。我们以体外培养的猪精原干细胞作为模型,初步研究了褪黑素在玉米赤霉烯酮毒性存在下,对猪精原干细胞的保护作用,结果发现褪黑素可以有效减缓玉米赤霉烯酮诱导的猪精原干细胞的损伤。综上所述,本研究分别利用模式动物小鼠和大型家畜猪的生殖干细胞作为研究对象,深入的研究了生殖干细胞自我更新的机制,生殖激素对生殖力的保护以及大型家畜的生殖毒理,为揭示生殖干细胞体外维持和微环境相互作用的分子机制提供了理论支持,为临床化疗中对生殖力保护的应用提供了很有价值的参考,并且对临床的治疗和诊断提供了依据,也对畜牧生产中雄性动物的繁殖力维持提供了新的思路。
李小勇[10]（2017）在《小鼠生殖干细胞lncRNA和circRNA分析及其发育过程中剂量补偿研究》文中提出生殖干细胞（Germline stem cell）是生殖细胞发育的早期阶段。生殖干细胞是一类特殊的成体干细胞,它不但具有干细胞的特性,而且还具有传递遗传信息的能力。生殖干细胞主要包括精原干细胞（Spermatogonial stem cell,SSC）和雌性生殖干细胞（Female germline stem cell,FGSC）两种类型。生殖干细胞的自我更新和分化,及其发育过程中的基因剂量平衡对生物体的繁殖具有重要意义。越来越多的证据表明长链非编码（long noncoding RNA,lnc RNA）和环状RNA（circular RNA,circ RNA）在生殖细胞的发育过程中发挥重要作用。然而目前关于lnc RNA和circ RNA在生殖干细胞自我更新和分化中作用的相关报道尚少。本文首先通过高通量测序的方法系统分析和比较SSC和FGSC的lnc RNA和环状RNA表达谱,找出两性生殖干细胞lnc RNA和circ RNA表达的共同点和不同点,揭示lnc RNA和circ RNA在两性生殖干细胞自我更新和分化中的重要作用。通过高通量测序技术,我们共鉴定出在生殖干细胞中表达的24376个lnc RNA（包括18573个新发现的novel lnc RNA）和18822个circ RNA。随后利用RT-PCR对鉴定的6个novel lnc RNA和6个circ RNA进行验证,结果表明测序结果与RT-PCR结果一致。通过与已注释lnc RNA的生物信息学比较,我们发现nove lnc RNA与已知lnc RNA具有相似的外显子（exon）数目、转录本（transcript）长度等。而与m RNA相比,lnc RNA的外显子数目更少、转录本长度更短、ORF长度更短、蛋白编码潜能更低。而且我们发现novel和已知lnc RNA均广泛地分布在生殖干细胞的各条染色体上。通过分析circ RNA及其hosting基因,我们发现大部分的circ RNA为外显子型,而且circ RNA hosting基因的表达水平明显高于那些没有环状转录本表达的基因。基于SSC和FGSC转录组（包括m RNA、lnc RNA和circ RNA）的比较,我们发现两种类型生殖干细胞具有相似的基因表达谱和PI3K-AKT信号通路,并通过实验验证FGSC具有和SSC相同的GDNF信号通路。通过差异分析,我们得到性别特异性表达的2331个lnc RNA（包括Xist,Atp10d,和Meg3等）和921个circ RNA（包括circ RNA Igf1r等）,通过对这些性别特异性表达lnc RNA和circ RNA靶基因或hosting基因的GO和Pathway分析,我们发现很多可能影响精原干细胞和雌性生殖干细胞分化潜能的生物过程、分子机制和信号通路,揭示了lnc RNA和circ RNA可能通过影响基因印记和调控激素分泌维持生殖干细胞向不同类型配子发育的潜能。随后,利用生物信息学工具,我们构建了m RNA和lnc RNA的共表达网络和lnc RNA-circ RNA-mi RNA-m RNA竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）网络。共表达网络显示了数百个lnc RNA可能与生殖干细胞性别不同分化潜能相关,包括lnc RNA Gm11851,lnc RNA Gm12840,lnc RNA4930405022Rik和lnc RNA Atp10d等。Ce RNA网络显示lnc RNA Meg3与circ RNA Igf1r竞争性结合mi RNA-15a-5p,从而调节靶基因Inha,Acsl3,Kif21b和Igfbp2的表达。这些性别特异性表达的lnc RNA和circ RNA为我们研究生殖细胞发育过程中的关键事件（包括减数分裂、X染色体失活、剂量补偿等）奠定基础。雌性生殖干细胞特异性表达的lnc RNA-Xist是雌性哺乳动物细胞中X染色体失活的标志。X染色体失活是剂量补偿起始事件,通过研究生殖细胞发育过程中的剂量补偿规律可以为目前还存在争议的剂量补偿效应提供依据。我们首先用单细胞RT-PCR和免疫组化等实验验证Xist在雌性生殖干细胞中表达,并阐明小鼠生殖细胞发育过程中经历了X染色体失活到重新激活过程。然后通过对生殖细胞发育过程中剂量补偿规律的研究,我们发现不管细胞含有一条或者两条有活性的X染色体,细胞都将维持X染色体和常染色体的基因剂量平衡。对哺乳动物组织和单细胞RNA-Seq数据的分析亦证实了此结果。利用SNP方法分析小鼠早期胚胎发育过程,结果直观的显示有活性的X染色体通过剂量补偿维持整个细胞中X染色体和常染色体基因剂量平衡,进一步证实上述剂量补偿规律。综上,我们首次系统分析和比较了小鼠生殖干细胞lnc RNA和circ RNA表达谱,发现了在SSC和FGSC中包括GDNF在内的多个信号通路,以及很多影响生殖干细胞向不同类型配子分化潜能的lnc RNA和circ RNA,还为小鼠生殖细胞发育过程中的剂量补偿规律提供了新的依据。本研究有助于深入认识生殖细胞发育的调控机制,为生殖细胞发育异常等相关疾病诊治提供理论基础。
二、哺乳动物精原干细胞及其生物学特性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、哺乳动物精原干细胞及其生物学特性（论文提纲范文）
（1）白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞概述 |
| 1.1.1 精原干细胞与精子发生 |
| 1.1.2 精原干细胞的分离与纯化 |
| 1.1.3 精原干细胞的标记物 |
| 1.1.4 精原干细胞微环境 |
| 1.1.5 精原干细胞的体外培养 |
| 1.2 精原干细胞的冷冻保存 |
| 1.2.1 冷冻保存原理 |
| 1.2.2 冷冻及解冻方法 |
| 1.2.3 冷冻保护剂 |
| 1.2.4 冷冻保存与氧化应激 |
| 1.2.5 冷冻保存与细胞凋亡 |
| 1.2.6 冷冻保存与细胞自噬 |
| 1.3 白藜芦醇的研究进展 |
| 1.3.1 白藜芦醇的主要信号通路 |
| 1.3.2 白藜芦醇的抗氧化作用 |
| 1.3.3 白藜芦醇的抗凋亡作用 |
| 1.3.4 白藜芦醇与细胞自噬 |
| 1.3.5 白藜芦醇与AMPK |
| 1.3.6 白藜芦醇对细胞冷冻保存的研究 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 奶山羊精原干细胞的分离与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 奶山羊睾丸的HE染色 |
| 2.3.2 奶山羊睾丸的PGP9.5 免疫组织化学染色 |
| 2.3.3 不同日龄奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1 蛋白的表达 |
| 2.3.4 奶山羊SSCs的分离与纯化 |
| 2.3.5 SSCs的免疫荧光染色鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 白藜芦醇对冷冻保存奶山羊精原干细胞活力及抗氧化能力的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活性的影响 |
| 3.3.2 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活率的影响 |
| 3.3.3 白藜芦醇对冷冻保存SSCs T-AOC的影响 |
| 3.3.4 白藜芦醇对冷冻保存SSCs内 ROS水平的影响 |
| 3.3.5 白藜芦醇对冷冻保存SSCs MDA含量的影响 |
| 3.3.6 白藜芦醇对冷冻保存SSCs线粒体膜电位的影响 |
| 3.3.7 白藜芦醇对冷冻保存SSCs抗氧化酶活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 白藜芦醇保护冷冻保存奶山羊精原干细胞机制的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 流式细胞术检测SSCs凋亡 |
| 4.3.2 SSCs凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.3.3 SSCs自噬相关蛋白的表达 |
| 4.3.4 SSCs的 AMPK磷酸化水平 |
| 4.3.5 SSCs的超微结构观察 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）SSEA4作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 精子发生与精原干细胞 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 精原干细胞 |
| 1.2.1 精原干细胞的起源 |
| 1.1.2 精原干细胞巢 |
| 1.2.3 精原干细胞的增殖 |
| 1.2.4 精原干细胞的分化 |
| 1.2.5 精原干细胞的鉴定方法 |
| 1.2.6 精原干细胞的分离与富集 |
| 1.2.7 精原干细胞的表面分子标记物 |
| 1.3 SSEA4 研究进展 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 试验部分 |
| 第二章 SSEA4 作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及组织准备 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪睾丸组织石蜡包埋 |
| 2.2.2 猪睾丸组织的冷冻组织包埋 |
| 2.2.3 组织切片苏木精-伊红染色 |
| 2.2.4 组织切片免疫荧光染色 |
| 2.2.5 睾丸细胞的分离 |
| 2.2.6 流式细胞分选(FACS) |
| 2.2.7 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.2.10 转录组数据分析 |
| 2.2.11 猪精原干细胞的异种移植 |
| 2.2.12 异种移植后细胞克隆数的计数 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 猪睾丸的组织学分析 |
| 2.3.2 SSEA4 阳性细胞的定位分析 |
| 2.3.3 免疫荧光染色鉴定猪睾丸组织中表达SSEA4 的细胞类型 |
| 2.3.4 FACS分离的SSEA4 阳性细胞富集猪未分化精原细胞 |
| 2.3.5 SSEA4 阳性精原细胞的转录组分析 |
| 2.3.6 SSEA4 阳性细胞的生物学功能分析 |
| 2.4 讨论 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）Bta-miRNA-495影响牛精原干细胞增殖与凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞的研究进展 |
| 1.1.1 精原干细胞的生成 |
| 1.1.2 精原干细胞与精子发生 |
| 1.1.3 精原干细胞的生物标记 |
| 1.1.4 牛精原干细胞的研究进展 |
| 1.2 miRNA的研究进展 |
| 1.2.1 miRNA的生物合成及作用 |
| 1.2.2 miRNA与精子生成 |
| 1.2.3 miRNA与精原干细胞 |
| 1.3 RCN2 的研究进展 |
| 1.3.1 RCN2 的结构特征 |
| 1.3.2 RCN2 的生物学功能 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 bta-miR-495 的筛选及其对牛精原干细胞增殖与凋亡的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验样品准备 |
| 2.1.2 牛精原干细胞的培养 |
| 2.1.3 细胞转染 |
| 2.1.4 总RNA提取、cDNA合成与RT-qPCR实验 |
| 2.1.5 细胞总蛋白提取与Western Blot实验 |
| 2.1.6 流式细胞仪检测细胞周期实验 |
| 2.1.7 EdU细胞增殖试剂盒检测细胞增殖实验 |
| 2.1.8 CCK-8 试剂检测细胞增殖实验 |
| 2.1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡实验 |
| 2.1.10 数据统计 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 bta-miR-495 在牛各个组织中的表达 |
| 2.2.2 bta-miR-495 抑制牛精原干细胞的增殖 |
| 2.2.3 bta-miR-495 促进牛精原干细胞的凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 bta-miR-495 靶基因的预测与验证 |
| 3.1 试验方法和材料 |
| 3.1.1 细胞准备 |
| 3.1.2 细胞培养 |
| 3.1.3 细胞转染 |
| 3.1.4 构建载体 |
| 3.1.5 双荧光素酶活性检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 miR-495 保守性分析及靶基因预测 |
| 3.2.2 bta-miR-495 直接靶向RCN2 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RCN2-ERK调控牛精原干细胞的增殖和凋亡 |
| 4.1 试验方法和材料 |
| 4.1.1 材料准备 |
| 4.1.2 总RNA提取、cDNA合成与RT-qPCR实验 |
| 4.1.3 细胞总蛋白提取与Western Blot实验 |
| 4.1.4 流式细胞仪检测细胞周期实验 |
| 4.1.5 EdU细胞增殖试剂盒检测细胞增殖实验 |
| 4.1.6 CCK-8 试剂检测细胞增殖实验 |
| 4.1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡实验 |
| 4.1.8 数据统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RCN2 促进牛精原干细胞的增殖 |
| 4.2.2 RCN2 抑制牛精原干细胞的凋亡 |
| 4.2.3 RCN2对ERK的调控机制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论和创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蒙古马简介及其特点 |
| 1.2 睾丸发育和精子发生过程 |
| 1.2.1 睾丸组织学构造及功能 |
| 1.2.2 精子发生过程 |
| 1.2.3 精子发生的微环境 |
| 1.3 精原干细胞(spermatogonial stem cells SSCs) |
| 1.3.1 精原干细胞简介 |
| 1.3.2 精原干细胞来源 |
| 1.3.3 精原干细胞生物学特点 |
| 1.3.4 精原干细胞的特殊生长环境 |
| 1.3.5 精原干细胞表面分子标记物 |
| 1.3.6 精原干细胞自我更新分化方式 |
| 1.3.7 精原干细胞的培养 |
| 1.3.8 精原干细胞体外培养研究进展 |
| 1.3.9 温度对精原干细胞的影响 |
| 1.4 精原干细胞应用前景 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 实验一 蒙古马睾丸支持细胞(饲养层)的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 支持细胞原代分离培养及纯化 |
| 2.2.2 支持细胞的低渗处理 |
| 2.2.3 支持细胞生长曲线绘制 |
| 2.2.4 支持细胞饲养层制备 |
| 2.2.5 支持细胞鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 支持细胞生长曲线观察 |
| 2.3.2 HE染色结果 |
| 2.3.3 qRT-PCR结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.2 实验前工作准备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 蒙古马睾丸单细胞悬液制备 |
| 3.3.2 利用差异贴壁法将蒙古马睾丸精原干细胞的纯化 |
| 3.4 将精原干细胞转移到支持细胞饲养层上培养 |
| 3.4.1 支持细胞饲养层复苏 |
| 3.4.2 精原干细胞的培养 |
| 3.4.3 精原干细胞的纯化效率 |
| 3.5 精原干细胞的鉴定 |
| 3.5.1 精原干细胞生长情况检测和形态学观察 |
| 3.5.2 精原干细胞(SSCs)碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定 |
| 3.5.3 精原干细胞SSCs免疫荧光化学染色鉴定 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 支持细胞饲养层形态 |
| 3.6.2 精原干细胞分离纯化效率检测 |
| 3.6.3 在不同饲养层上的形态 |
| 3.6.4 碱性磷酸酶(AKP)染色法鉴定SSCs |
| 3.6.5 精原干细胞免疫荧光染色结果 |
| 3.6.6 qRT-PCR结果 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 小结 |
| 4 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（5）水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 精原干细胞的研究进展 |
| 1.1 精子发生与的精原干细胞起源与发展 |
| 1.2 精原干细胞干细胞龛 |
| 1.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 1.4 精原干细胞的表型鉴定 |
| 1.5 精原干细胞的体外培养 |
| 1.6 精原干细胞的体外分化及应用前景 |
| 2 干细胞的衰老 |
| 3 转录组学的研究与应用 |
| 3.1 单细胞转录组学的研究进展 |
| 3.2 单细胞转录组学的发展历程 |
| 3.3 单细胞转录组学测序的基本步骤 |
| 3.4 单细胞转录组学的应用 |
| 4 选题依据及研究内容 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 不同体外培养系统对水牛类精原干细胞体外培养效果的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.2.1 主要试验试剂 |
| 1.2.2 试验材料来源 |
| 1.2.3 主要的实验仪器: |
| 1.2.4 主要溶液的配置 |
| 1.2.4.1 成分不明的SSC-like cells培养液的配置 |
| 1.2.4.2 成分明确的SSC-like cells培养液的配置 |
| 1.2.5 引物合成 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 水牛睾丸材料的收集 |
| 1.3.2 水牛睾丸组织的固定及石蜡包埋 |
| 1.3.3 水牛睾丸组织的石蜡切片免疫荧光染色 |
| 1.3.4 水牛睾丸总细胞的分离 |
| 1.3.5 水牛原代类精原干细胞的富集及抹片鉴定 |
| 1.3.6 细胞总RNA的提取以及荧光定量聚合酶链反应 |
| 1.3.7 不同体系对水牛类精原干细胞体外培养的效果对比及传代方法 |
| 1.3.8 体外培养水牛类精原干细胞的功能鉴定 |
| 1.4 试验结果 |
| 1.4.1 水牛睾丸组织的石蜡切片免疫荧光染色 |
| 1.4.2 水牛原代类精原干细胞的富集及抹片鉴定 |
| 1.4.3 水牛类精原干细胞在不同培养体系中的体外培养 |
| 1.4.4 在成分明确的培养体系中使用RA进行体外诱导 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 2 成年与幼年水牛曲细精管的差异转录组学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 生物信息学分析工具 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 引物合成 |
| 2.2.6 实验过程 |
| 2.2.6.1 水牛睾丸组织的固定及石蜡包埋 |
| 2.2.6.2 水牛睾丸曲细精管HE切片染色 |
| 2.2.6.3 水牛睾丸曲细精管的分离 |
| 2.2.6.4 水牛睾丸曲细精管转录组测序基本流程 |
| 2.2.6.5 Gene Ontology(GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 成年水牛曲细精管和幼年水牛曲细精管HE染色分析 |
| 2.3.2 成年水牛曲细精管和幼年水牛曲细精管转录组的差异分析 |
| 2.3.3 幼年水牛曲细精管相对于成年水牛曲细精管显着上调基因集的分析 |
| 2.3.4 幼年水牛曲细精管相对于成年水牛曲细精管显着下调基因集的分析 |
| 2.3.5 qRT-PCR的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 成年和幼年水牛的类精原干细胞差异转录组学研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 生物信息学分析工具 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 引物合成 |
| 3.3 实验过程 |
| 3.3.1 水牛睾丸单细胞悬液的获取 |
| 3.3.2 THY1阳性单细胞的获取 |
| 3.3.3 水牛类精原干细胞的免疫鉴定 |
| 3.3.4 单细胞转录组的扩增 |
| 3.3.5 单细胞转录组测序文库的建立 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 成年与幼年水牛类精原干细胞的分离与鉴定 |
| 3.4.2 水牛睾丸中类精原干细胞mRNA转录组图谱的构建 |
| 3.4.3 成年和幼年水牛类精原干细胞转录组的差异分析 |
| 3.4.4 幼年水牛类精原干细胞相对于成年水牛类精原干细胞显着上调表达基因集的分析 |
| 3.4.5 幼年水牛类精原干细胞相对于成年水牛类精原干细胞显着下调表达基因集的分析 |
| 3.4.6 qRT-PCR的验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
（6）LIN28A促进奶山羊精原干细胞自我更新和增殖的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 精原干细胞研究进展 |
| 1.1 精原干细胞的起源与发生 |
| 1.1.1 精原干细胞的起源 |
| 1.1.2 出生后雄性生殖细胞的发育 |
| 1.1.3 精原干细胞的生物标记 |
| 1.2 精原干细胞自我更新的模型 |
| 1.2.1 碎片化模型(fragmentation model) |
| 1.2.2 修订的As模型(Revised As model) |
| 1.3 生精发生的调控 |
| 1.3.1 精原干细胞niche的微环境 |
| 1.3.2 维持SSCs的细胞信号通路 |
| 1.3.3 mTORC1 信号通路在SSCs命运决定中的作用 |
| 1.4 表观修饰调控精子发生和雄性生殖 |
| 1.4.1 DNA起始甲基化修饰和去甲基化修饰 |
| 1.4.2 染色质重构 |
| 1.5 单细胞测序(single cell sequencing,SNS) |
| 第二章 LIN28A研究进展 |
| 2.1 Lin28 基因与蛋白质结构 |
| 2.2 LIN28A的表达和功能 |
| 2.2.1 LIN28A在个体发育中的表达模式 |
| 2.2.2 LIN28A在多能干细胞的作用 |
| 2.2.3 LIN28A在发育和生理的作用 |
| 2.2.4 LIN28A与细胞分化的控制 |
| 2.3 LIN28A作用的分子机制:两个独立的机制通路 |
| 2.3.1 Let-7 依赖的通路 |
| 2.3.2 不依赖于Let-7 的通路 |
| 2.4 LIN28A在生殖中的功能 |
| 2.4.1 LIN28A在雄性生殖中的作用 |
| 2.4.2 LIN28A在雌性生殖中的作用 |
| 2.4.3 LIN28A在 PGC发育的功能 |
| 2.4.4 LIN28A在生殖相关疾病中的功能 |
| 2.5 小结与展望 |
| 实验部分 |
| 第三章 LIN28A在奶山羊体内的表达模式 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 LIN28A在奶山羊睾丸组织中的表达定位 |
| 3.2.2 LIN28A在奶山羊不同组织的表达模式 |
| 3.2.3 奶山羊LIN28A基因的克隆与生物信息学分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 LIN28A促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 异位过表达LIN28A的 mGSCs-I-SB细胞系的获得 |
| 4.2.2 异位过表达LIN28A促进GmGSCs-I-SB细胞的增殖 |
| 4.2.3 异位过表达LIN28A不导致GmGSCs-I-SB细胞的凋亡 |
| 4.2.4 异位过表达LIN28A促进GmGSCs-I-SB细胞的干性与自我更新 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 过表达LIN28A的 GmGSCs-I-SB的体内功能验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 LIN28A促进GmGSCs-I-SB细胞体内的增殖 |
| 5.2.2 体内移植的GmGSCs-I-SB不能完成分化 |
| 5.2.3 LIN28A通过mTOR信号通路促进奶山羊精原干细胞的增殖 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 LIN28A促进GmGSCs-I-SB干性维持、自我更新和增殖的机制探索 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 过表达LIN28A不影响H3K4ME1/2/3 修饰水平 |
| 6.2.2 过表达LIN28A不改变基因组整体的甲基化修饰水平 |
| 6.2.3 奶山羊5 号染色体上的NANOG基因是功能性基因 |
| 6.2.4 奶山羊5 号染色体上的NANOG基因启动子区域的生物信息学分析 |
| 6.2.5 LIN28A与 TET1 互作调控NANOG基因启动子的甲基化修饰水平 |
| 6.2.6 LIN28A以不依赖Let-7g方式促进NANOG的转录 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点和进一步研究计划 |
| 创新点 |
| 进一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）建立知识驱动的迁移学习方法比较多物种的精子功能生物学特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 精子生物学特性概述 |
| 1.2.1 精子结构 |
| 1.2.2 精子发生 |
| 1.2.3 受精 |
| 1.3 知识驱动的自动化学习方法 |
| 1.3.1 信息检索 |
| 1.3.2 生物医学命名实体的识别 |
| 1.3.3 命名实体之间关系的抽取 |
| 1.3.4 文本标准化分类 |
| 1.3.5 信号通路的功能分析 |
| 1.4 工具与数据库介绍 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.6 论文组织结构 |
| 2 搭建知识驱动的自动化学习方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 构建主题文献摘要数据库 |
| 2.3 主题文献摘要中特异性基因与实体的识别 |
| 2.3.1 特异性基因的识别 |
| 2.3.2 主题特异性实体的识别 |
| 2.3.3 主题实体的标准化分类 |
| 2.3.4 主题类别最显着相关的摘要集 |
| 2.3.5 基因与主题实体之间关系距离(relational distance,RD)的计算 |
| 2.3.6 “主题”实体类别与特异性基因的关系距离计算 |
| 2.3.7 “主题”实体类别的信号通路分析 |
| 3 构建“精子”生物学特性知识图谱 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 “精子”生物学特性的实体识别 |
| 3.2.1 构建“精子”生物学特性的特片性基因库 |
| 3.2.2 构建“精子”生物学特性的特异性实体库 |
| 3.3 “精子”生物学特性的特异性实体的标准化分类 |
| 3.4 “精子”生物学特性相关的文献摘要集 |
| 3.5 “精子”生物学特性实体与基因之间关系距离的计算 |
| 3.6 “精子”生物学特性类别与特异性基因关联 |
| 3.7 “精子”生物学特性实体类别的信号通路分析 |
| 4 蒙古族“五畜”的精子生物学特性研究及迁移性评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 迁移学习 |
| 4.1.2 直系同源基因 |
| 4.2 “五畜”精子生物学特性基因库的构建 |
| 4.3 5个物种精子生物学特性类别的信号通路构建方法 |
| 4.4 5个物种的精子生物学特性类别的信号通路分析 |
| 4.4.1 5个物种之间全局保守的信号通路分析 |
| 4.4.2 5个物种特异性高保守的信号通路分析 |
| 4.4.3 5个物种全局以及特异性保守信号通路的相关基因分析 |
| 4.5 讨论 |
| 5 近缘物种之间的精子生物学特性研究及迁移性评估 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 马和驴的精子生物学特性的可迁移性研究 |
| 5.3 山羊和绵羊的精子生物学特性的可迁移性研究 |
| 5.4 讨论 |
| 6 骆驼科物种精子生物学特性及迁移性评估 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 骆驼科物种的精子生物学特性基因库的构建 |
| 6.3 骆驼科物种的精子生物学特性类别信号通路的构建方法 |
| 6.4 骆驼科物种的精子生物学特性类别信号通路分析 |
| 6.4.1 4个物种之间全局保守的精子生物学特性类别信号通路 |
| 6.4.2 4个物种特异性高度保守且不可迁移的精子生物学特性类别信号通路 |
| 6.4.3 单个物种没有被显着激活的精子生物学特性类别信号通路 |
| 6.5 讨论 |
| 7 结论与创新性 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（8）精原干细胞异种移植体系的建立与早期精子发生的调控（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 小鼠早期精子发生过程 |
| 2 精原干细胞异种移植体系的建立 |
| 2.1 精原干细胞 |
| 2.2 精原干细胞移植 |
| 2.3 干细胞移植的免疫原性 |
| 2.4 人精原干细胞的分选与鉴定 |
| 2.5 生精障碍受体小鼠模型 |
| 3 亚细胞器与早期精子发生的调控 |
| 3.1 线粒体动力学与精子发生调控 |
| 3.2 内质网与精子发生调控 |
| 3.3 MAM |
| 3.4 亚细胞器间的相互作用与生殖调控 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 睾丸组织的消化 |
| 2.2 hSSC的分选 |
| 2.3 生精障碍小鼠模型的制备 |
| 2.4 显微注射技术 |
| 2.5 组织石蜡包埋 |
| 2.6 组织免疫荧光 |
| 2.7 细胞免疫荧光 |
| 2.8 苏木精-伊红染色 |
| 2.9 淋巴细胞流式分析 |
| 2.10 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.11 实验小鼠的饲养繁殖 |
| 2.12 激光扫描共聚焦实验 |
| 2.13 活性氧检测实验 |
| 2.14 钙离子荧光检测 |
| 2.15 MAM提取方法 |
| 第三章 精原干细胞异种移植体系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 人特异性抗体检测与显微注射技术 |
| 2.2 c-kitW/W~v小鼠免疫功能检测 |
| 2.3 分选hSSC的鉴定 |
| 2.4 生精障碍受体小鼠的鉴定 |
| 2.5 hSSCs在小鼠睾丸内具有免疫耐受特性 |
| 2.6 体外诱导分化形成h SSCs具有免疫耐受特性 |
| 3 本章小结 |
| 第四章 早期精子发生中MAM的调控机制 |
| 1 引言 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 Mfn2 敲除引起ER应激反应 |
| 2.2 ASZ1与MFNs共同参与精子发生中MAM的调控 |
| 2.3 潜在的MFNs相互作用蛋白 |
| 3 本章小结 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 1 hSSC异种移植体系的建立 |
| 2 早期精子发生中MAM的调控机制 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）钙粘素CDH22调控雌性生殖干细胞自我更新机制的研究及褪黑素在生殖力维持中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 研究背景 |
| 1.1 生殖干细胞 |
| 1.2 原始生殖细胞 |
| 1.3 雌性生殖干细胞 |
| 1.4 精原干细胞 |
| 1.5 生殖干细胞命运相关的关键分子 |
| 1.6 生殖干细胞的自我更新研究进展 |
| 1.7 化疗药物白消安及其生殖系毒副作用 |
| 1.8 褪黑素 |
| 1.9 凋亡促进因子P53 |
| 1.10 玉米赤霉烯酮 |
| 第一章 CDH22对FGSCs命运的调控机制研究 |
| 引言 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 试验仪器 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 小鼠卵巢的固定与包埋 |
| 1.2.2 免疫组织化学 |
| 1.2.3 H.E.染色 |
| 1.2.4 细胞免疫荧光 |
| 1.2.5 BrdU荧光标记 |
| 1.2.6 免疫蛋白印迹 |
| 1.2.7 RNA提取 |
| 1.2.8 反转录及RT-PCR |
| 1.2.9 胶回收 |
| 1.2.10 感受态的制备 |
| 1.2.11 连接 |
| 1.2.12 转化 |
| 1.2.13 筛选阳性克隆 |
| 1.2.14 慢病毒的包装 |
| 1.2.15 STO细胞培养 |
| 1.2.16 STO细胞的传代 |
| 1.2.17 STO细胞的换液 |
| 1.2.18 STO细胞的冻存 |
| 1.2.19 STO饲养层的制备 |
| 1.2.20 雌性生殖干细胞的分离和纯化 |
| 1.2.21 雌性生殖干细胞的换液 |
| 1.2.22 雌性生殖干细胞的传代 |
| 1.2.23 雌性生殖干细胞的冻存 |
| 1.2.24 雌性生殖干细胞的解冻 |
| 1.2.25 差异表达分析 |
| 1.2.26 统计分析 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 CDH22在不同时期小鼠卵巢的表达特征分析 |
| 1.3.2 小鼠雌性生殖干细胞的分离培养与鉴定 |
| 1.3.3 小鼠CDH22只编码一种剪切型式的蛋白 |
| 1.3.4 Cdh22 shRNA敲低效果的验证 |
| 1.3.5 CDH22对雌性生殖干细胞自我更新的影响 |
| 1.3.6 CDH22对雌性生殖干细胞凋亡的影响 |
| 1.3.7 在FGSCs中CDH22与JAK-STAT通路的相互作用 |
| 1.3.8 在FGSCs中CDH22与β-catenin通路的相互作用 |
| 1.3.9 CDH22在雌性生殖干细胞微环境中的调控 |
| 1.3.10 雌性生殖干细胞生物信息学分析 |
| 1.3.11 CDH22,AKT3,GFRα1,PI3K在雌性生殖千细胞中的表达及AKT3 |
| 1.3.12 CDH22与PI3K-AKT通路的相互作用 |
| 1.3.13 GDNF与PI3K-AKT通路对小鼠雌性生殖干细胞的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 褪黑素挽救白消安诱导的精原干细胞凋亡及其生物学机制研究 |
| 引言 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 DNA提取及转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 2.2.2 流式分选 |
| 2.2.3 MEF细胞的分离 |
| 2.2.4 MEF细胞的传代 |
| 2.2.5 MEF细胞的换液 |
| 2.2.6 MEF细胞的冻存 |
| 2.2.7 MEF饲养层的制备 |
| 2.2.8 精原干细胞的分离和纯化 |
| 2.2.9 TUNEL凋亡检测 |
| 2.2.10 细胞内活性氧检测 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 通过体外试验验证不同激素缓解白消安的毒性效果 |
| 2.3.2 检测褪黑素受体在精原干细胞中的表达情况 |
| 2.3.3 新注射方法的设计 |
| 2.3.4 褪黑素对白消安注射的小鼠精原干细胞的体内挽救作用 |
| 2.3.5 褪黑素对白消安处理的小鼠精原干细胞的体外挽救作用 |
| 2.3.6 褪黑素对白消安处理的K562细胞系的影响 |
| 2.3.7 白消安对P53敲除小鼠的精原干细胞的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 褪黑素挽救玉米赤霉烯酮对猪精原干细胞的毒性作用研究 |
| 引言 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 猪精原干细胞分离步骤 |
| 3.2.2 猪睾丸组织的固定与包埋 |
| 3.2.3 免疫组织化学 |
| 3.2.4 H.E.染色 |
| 3.2.5 细胞免疫荧光 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪精原干细胞体外分离培养 |
| 3.3.2 猪精原干细胞鉴定 |
| 3.3.3 玉米赤霉烯酮对猪精原干细胞的影响 |
| 3.3.4 褪黑素对猪精原干细胞在玉米赤霉烯酮处理后的挽救作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表(或待发表)的学术论文 |
（10）小鼠生殖干细胞lncRNA和circRNA分析及其发育过程中剂量补偿研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 生殖干细胞 |
| 1.2 精原干细胞 |
| 1.2.1 精原干细胞及精子发生 |
| 1.2.2 精原干细胞特征 |
| 1.2.3 精原干细胞的自我更新 |
| 1.2.4 特异性基因对精原干细胞的调控 |
| 1.2.5 表观遗传修饰对精原干细胞的调控 |
| 1.3 雌性生殖干细胞 |
| 1.3.1 雌性生殖干细胞的起源与定位 |
| 1.3.2 雌性生殖干细胞的分离、纯化和培养 |
| 1.3.3 雌性生殖干细胞的鉴定 |
| 1.4 长链非编码RNA |
| 1.4.1 长链非编码RNA的分类 |
| 1.4.2 长链非编码RNA的作用机制 |
| 1.4.3 LncRNA相关数据库 |
| 1.5 环状RNA |
| 1.5.1 环状RNA的发现 |
| 1.5.2 环状RNA特征 |
| 1.5.3 环状RNA的形成机制 |
| 1.5.4 环状RNA分子功能 |
| 1.5.5 环状RNA与生殖发育及作为生殖系统疾病诊断标志物 |
| 1.5.6 环状RNA数据库 |
| 1.6 X染色体失活 |
| 1.6.1 X染色体失活的机制 |
| 1.6.2 X染色体失活的发生方式 |
| 1.6.3 小鼠生殖细胞和早期胚胎发育过程中经历X染色体失活/激活周期 |
| 1.7 剂量补偿效应 |
| 1.8 转录组高通量测序 |
| 1.8.1 RNA-Seq |
| 1.8.2 长链非编码RNA测序 |
| 1.8.3 环状RNA测序 |
| 第二章 生殖干细胞lncRNA和 circRNA表达谱的系统分析和比较 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 本研究所用试剂 |
| 2.2.3 引物序列 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 FGSC的分离和纯化 |
| 2.3.2 SSC的分离和纯化 |
| 2.3.3 免疫荧光组织化学检测 |
| 2.3.4 EDU检测细胞增殖实验 |
| 2.3.5 高通量测序建库与测序实验流程 |
| 2.3.6 生物信息分析流程 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 小鼠精原干细胞和雌性生殖干细胞的分离及鉴定 |
| 2.4.2 精原干细胞和雌性生殖干细胞总RNA提取及鉴定 |
| 2.4.3 测序数据质量预处理 |
| 2.4.5 参考基因组比对 |
| 2.4.6 LncRNA筛选 |
| 2.4.7 LncRNA基因组内可视化 |
| 2.4.8 LncRNA、mRNA的结构特征比较 |
| 2.4.9 Novel lncRNA的特征分析和验证 |
| 2.4.10 FGSC具有SSC相似的基因表达谱和自我更新机制 |
| 2.4.11 转录组分析揭示SSC和 FGSC具有大量的性别特异性表达基因 |
| 2.4.12 生殖干细胞性别特异性lncRNA靶基因预测和功能分析 |
| 2.4.13 生殖干细胞性别特异性lncRNA靶基因预测和共表达网络分析 |
| 2.4.14 CircRNA鉴定和分析 |
| 2.4.15 CeRNA网络构建 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 生殖细胞发育过程中剂量补偿研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 本研究所用试剂和抗体 |
| 3.2.3 本研究所用引物序列 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 FGSC的分离和纯化 |
| 3.3.2 PGC的分离与纯化 |
| 3.3.3 分离雌性小鼠尾尖成纤维细胞 |
| 3.3.4 单细胞RT-PCR |
| 3.3.5 免疫荧光 |
| 3.3.6 RNA-seq数据 |
| 3.3.7 估计基因表达水平 |
| 3.3.8 计算X:A值 |
| 3.3.9 操作系统和分析软件 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 生殖细胞发育过程中的剂量补偿效应 |
| 3.4.2 最新哺乳动物组织RNA-seq数据分析证实剂量补偿效应 |
| 3.4.3 单细胞RNA-seq证实剂量补偿效应 |
| 3.4.4 利用小鼠胚胎发育过程单细胞RNA-seq证实剂量补偿 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 4.1 主要创新点 |
| 4.2 主要结论 |
| 4.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 实验仪器 |
| 附录 Ⅱ 实验试剂的配制方法 |
| 附录 Ⅲ 所有单细胞测序数据X:A值 |
| 附录 Ⅳ 所有小鼠早期胚胎发育时期单细胞测序数据X:A值 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表(或待发表)的学术论文 |
| 攻读博士学位期间参加的国家项目 |
四、哺乳动物精原干细胞及其生物学特性（论文参考文献）
- [1]白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响[D]. 冯天雨. 西北农林科技大学, 2021
- [2]SSEA4作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定[D]. 李富远. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]Bta-miRNA-495影响牛精原干细胞增殖与凋亡的机制研究[D]. 周子惠. 西北农林科技大学, 2021
- [4]蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定[D]. 宋连杰. 内蒙古农业大学, 2020(05)
- [5]水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究[D]. 李婷婷. 广西大学, 2019(02)
- [6]LIN28A促进奶山羊精原干细胞自我更新和增殖的机制[D]. 马方琳. 西北农林科技大学, 2019
- [7]建立知识驱动的迁移学习方法比较多物种的精子功能生物学特性[D]. 季小阳. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [8]精原干细胞异种移植体系的建立与早期精子发生的调控[D]. 孙琪. 华东师范大学, 2019(08)
- [9]钙粘素CDH22调控雌性生殖干细胞自我更新机制的研究及褪黑素在生殖力维持中的应用[D]. 张小宇. 南京农业大学, 2018(07)
- [10]小鼠生殖干细胞lncRNA和circRNA分析及其发育过程中剂量补偿研究[D]. 李小勇. 上海交通大学, 2017(05)