一、突变型β-连环蛋白基因对肝细胞增殖的影响（论文文献综述）
叶善平[1]（2021）在《miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究》文中进行了进一步梳理背景:肝癌是国内外严重威胁人类健康的主要癌症之一,其发病率和死亡率在全球所有恶性肿瘤中排第六和第四,其中肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的75%-85%,世界范围内每年可致75万患者死亡。HCC的发病率具有较大的地域异质性,大约有85%的HCC发生在发展中国家和欠发达地区,而其中有50%发生在中国。早期肝癌预后较好,但多数患者在首诊时已处于进展期,而这部分患者的发病率和死亡率比值接近100%。尽管近些年来HCC的治疗取得了一定的进展,但高复发率和高转移率使其预后仍不理想。因此,研究HCC的诱发因素及影响HCC侵袭和转移的过程,进而寻找肝癌的预后生物标记物及潜在治疗靶标是当下重要研究领域。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的,短而高度保守,长度约为18-25个核苷酸的小RNA,呈单链状,不能编码蛋白质,在有核生物中表达较广。miRNA在体内主要起调控作用,通过与m RNA的3’端非编码序列发生碱基配对而起抑制作用,从而实现在转录后阶段调控基因表达。自从第一个miRNA被报道以后,陆续发现并研究了许多miRNA,但对于理解肿瘤发生发展的机制仍是冰山一角。许多研究表明miRNAs与HCC的起病、侵袭、转移及预后关系紧密。其中部分miRNAs在HCC中高表达,起着癌基因的作用,部分miRNAs在HCC中低表达,起着抑癌基因的作用。miR-557是近年来新发现的miRNA,它在胰腺癌、三阴乳腺癌、肺癌中均呈低表达,作为肿瘤抑制基因参与肿瘤侵袭、转移等多种生物学过程的调控。而miR-557在肝癌中的生物学功能尚不清楚。我们首先通过生物学信息学发现miR-557在肝癌中低表达。因此,我们推测miR-557在肝癌的起病和进展中存在重要影响,其在肝癌中的功能和分子机制有待深入探索。据此,本课题首先检测了miR-557在肝癌组织及不同肝癌细胞中的表达水平,分析其与HCC患者临床病理参数及生存的关系;然后运用体内体外实验研究了miR-557对肝癌细胞株生物学行为的影响;再通过生物信息学预测并在实验中验证了miR-557通过靶向抑制RAB10的表达而影响肝癌细胞增殖、体内成瘤、迁移、侵袭、上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）、克隆形成的能力和影响细胞周期的分布;Wnt/β-catenin信号通路是HCC起病发展中极为重要的一条途径,研究表明许多miRNA影响HCC进展是通过Wnt/β-catenin信号途径实现的,最后我们初步探讨了miR-557能否调控Wnt/β-catenin信号途径。本研究具体包括以下三部分:第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系;第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响;第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究。第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系目的:探讨miR-557在肝癌中的表达水平及其与患者临床病理特征及预后的关系。方法:1、生物信息学分析miR-557在HCC瘤组织中的表达。2、运用实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测肝癌组织及对应癌旁非瘤组织中miR-557的表达水平。3、分析miR-557表达水平与HCC患者临床病理参数及生存之间的关系。4、运用RT-qPCR检测HCC细胞株和人正常肝细胞L02中miR-557的表达水平。结果:1、生物信息学分析GSE108724数据集发现,与癌旁非肿瘤组织相比,miR-557在HCC中低表达;分析GSE26323数据集发现,与原位HCC相比,肺转移性HCC中miR-557表达水平更低。2、miR-557在HCC瘤组织中的表达水平显着低于配对的癌旁非瘤组织。3、34例HCC组织标本中,miR-557在低分化患者中的表达水平低于中高分化患者,在>5cm的HCC患者中的表达水平低于≤5cm的HCC患者,在TNM III/IV的HCC患者中的表达水平低于I/II期HCC的患者,在低分化的HCC患者中的表达水平低于高中分化的HCC患者;miR-557低表达的HCC患者的总生存时间更短。4、相比正常肝细胞L02,miR-557在肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L、Huh7、Hep G2、SMMC-7721中表达均下调,其中MHCC-97H细胞表达最低,Huh7细胞表达最高。结论:miR-557在肝癌组织及细胞系中均呈低表达,且与患者恶性生物学特征及不良的预后显着相关。第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响目的:探讨干扰或促进miR-557的表达是否影响肝癌细胞的生物学行为。方法:1、在体外运用miR-557 mimics/mimic-NC或慢病毒Lv-miR-557/Lv-vector转染MHCC-97H细胞,运用inhibitors/inhibitor-NC或Lv-sponge-miR-557/Lvsponge-NC转染Huh7细胞,并用RT-qPCR验证转染效率。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测miR-557对HCC细胞增殖潜能的影响;划痕实验、Transwell实验检测miR-557对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。3、RT-qPCR及蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测miR-557对HCC细胞上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。4、运用流式细胞仪检测miR-557对HCC细胞周期分布的影响。5、裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对HCC细胞体内成瘤潜能的影响。结果:1、运用miR-557 mimics或Lv-miR-557可以显着升高MHCC-97H细胞中miR-557的表达水平,运用inhibitors或Lv-sponge-miR-557可以显着降低Huh7细胞中miR-557的表达水平,细胞可用于下一步实验。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明,上调miR-557表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调miR-557表达后可促进Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、与NC组相比,上调miR-557的表达水平后可增加MHCC-97H细胞中E-cadherin的表达而减少N-cadherin和Vimentin的表达;下调Huh7细胞miR-557的表达水平后则出现相反的结果。4、细胞周期实验表明,上调miR-557表达后可使MHCC-97H细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期;下调miR-557可促使Huh7细胞的细胞周期从G0/G1向G2/M过渡。5、体内实验表明,上调miR-557表达后会抑制MHCC-97H细胞在裸鼠皮下成瘤的能力;下调miR-557后使得Huh7细胞的裸鼠皮下成瘤能力进一步加强。结论:上调miR-557的表达会抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间充质转化、体内生长及诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。抑制miR-557的表达则呈相反趋势。第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究目的:探讨miR-557在肝癌中的潜在作用机制及下游信号通路。方法:1、通过在线生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测了miR-557的靶基因。2、双荧光素酶基因报告实验验证miR-557与RAB10的靶向调控关系。3、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用RT-qPCR和WB实验检测RAB10在m RNA和蛋白表达水平的变化。4、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测肝癌组织及癌旁组织中RAB10蛋白的表达水平,RT-qPCR检测34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10 m RNA的表达水平,并分析与miR-557的相关性。5、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,分析促进/干扰RAB10的表达能否逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。7、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。结果:1、通过生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测miR-557的靶基因为RAB10。2、双荧光素酶基因报告实验验证了miR-557能够靶向抑制RAB10的表达3、RT-qPCR检测miR-557表达上调的MHCC-97H细胞和miR-557表达下调的Huh7细胞中潜在靶基因的变化,其中RAB10变化显着,WB实验验证了RAB10的变化。4、IHC检测了34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10的表达水平,结果提示癌组织中RAB10的表达水平高于癌旁非瘤组织;RT-qPCR得出同样的结果,并与miR-557呈负相关。5、促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、上调miR-557的表达可减少GSK-3β磷酸化、增加β-catenin磷酸化和减少Non-p-β-catenin入核,从而抑制Wnt/β-catenin信号;下调miR-557的表达则出现相反的结果;促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557mimics/inhibitors对HCC中Wnt/β-catenin信号的影响。结论:miR-557通过靶向抑制RAB10的表达来调节Wnt/β-catenin信号通路的活性进而影响肝癌细胞的生物学行为。
孙海涛[2]（2021）在《MicroRNA-126-5p在骨质疏松中的调控作用及机制研究》文中认为研究背景与目的骨质疏松症是以单位体积内骨量减少导致骨骼脆性增加为病理特点的中老年常见疾病。随着我国人口老龄化的进程加快,骨质疏松已经逐步成为重要的公共健康问题。据统计,在50岁以上的人群中,男性骨质疏松的发病率约为5.04%-7.46%,女性骨质疏松的发病率高达26.28%-39.19%。特别是在60岁以上的女性人群中,骨质疏松发病率还将激增。正常的骨代谢是成骨细胞骨生成与破骨细胞骨吸收的平衡反应过程。但随着年龄增长、雌激素水平降低等原因,骨代谢平衡被打破,骨质疏松发病率和骨质疏松性骨折风险随之逐渐增加。有效的医疗干预可预防和治疗骨质疏松症,帮助维持骨质疏松症患者的生活质量。目前急需对骨质疏松症的分子机制进行深入探寻,以期开发实用性强、价格低廉的治疗药物,提高临床疗效。同源序列C8（Homebox C,HOXC）是属于同源框家族高度保守的基因序列,是位于第12号染色体上的基因群,在调控骨组织分化具有重要的作用。破骨细胞刺激因子（Osteoclast stimulation factor 1,OSTF1）是一种在体内广泛存在蛋白因子,该蛋白可间接促进破骨细胞的形成和骨吸收。基质金属蛋白酶-13（Matrix Metalloproteinases,MMP13）的编码基因属于11号染色体的MMP基因簇,主要参如胚胎发育以及肿瘤转移等过程中的细胞外基质分解代谢。甲状旁腺素相关肽（Parathyroid hormone-related peptide,PTHrP）属于甲状旁腺激素家族的多肽类调节因子,参与调节软骨内成骨和上皮间质的相互作用等生理过程。Micro RNA（miR）是长约1925nt的非编码RNA,可作为转录后调节因子,在蛋白表达的调控过程中发挥重要作用。现有研究证明,转录生长因子-β（TGF-β）大量存在于骨与软骨组织中,与调节骨量和骨基质的性能。Micro RNA-126-5p（miR-126-5p）是位于表皮生长因子样结构域-7（EGFL-7）的内含子mRNA,可通过调控TGF-β/MMP13,ADAM9,MMP-7等骨代谢相关基因表达,在乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的侵袭转移中发挥着重要的生物学作用,但它在骨质疏松中的作用尚未阐明。研究方法与内容从2018年12月到2019年12月,分别征集抽取于海军军医大学第二附属医院骨科医院接受治疗的30名骨质疏松患者和30名正常人群的血浆样本,检测两组血浆样本中miR-126-5p表达量。通过不同浓度的雌激素和TGF-β刺激因子分别培养MC3T3-E1（鼠源性成骨前体细胞）和RAW264.7细胞（鼠源性破骨前体细胞）,通过PCR和q RT-PCR分别检测四组miR-126-5p表达情况,明确不同刺激作用下对MC3T3-E1和RAW264.7细胞中miR-126-5p的表达调控作用。通过诱导MC3T3-E1和RAW264.7细胞分化,分别予以miR-126-5p agomir和miR-126-5p antagomir刺激培养,联合应用PCR和q RT-PCR技术,分别检测成骨细胞和破骨细胞中标记基因的表达量,同时利用ALP染色、TRAP染色和细胞计数,检测观察miR-126-5p对MC3T3-E1和RAW264.7细胞分化的影响。将miR-126-5p agomir和miR-126-5p antagomir刺激培养的MC3T3-E1与RAW264.7细胞条件共培养,检测计算破骨分化和多核巨细胞数目,明确MC3T3-E1受激培养后对破骨分化的影响;同时通过CCK8试验,检测miR-126-5p对MC3T3-E1和RAW264.7细胞增殖能力的影响。利用miR-126-5p agomir和miR-126-5p antagomir刺激培养MC3T3-E1细胞,通过mRNA转录组学分析技术,检测受激培养后MC3T3-E1细胞中的基因表达差异。通过q RT-PCRh和western blot进一步验证差异基因在受激培养后MC3T3-E1细胞中的具体表达情况。并通过构建Luciferase荧光素酶报告系统,明确miR-126-5p与差异基因HOXC8、OSTF1、PTHrP、MMP13的调控关系和结合位点。为进一步验证miR-126-5p在分子、细胞水平的调控作用,定期给OVX小鼠注射miR-126-5p agomir和miR-126-5p antagomir,利用micro CT分别检测小鼠骨密度、、骨小梁厚度、骨与软组织比值、骨小梁间距、骨小梁数量。同时定期提取对照组OVX小鼠少量椎骨,通过q RT-PCR检测miR-126-5p的表达变化。研究结果与结论在此项研究中,通过上述研究途径得到如下结果:1.血浆microRNA检测提示,miR-126-5p在骨质疏松患者血浆中的表达较正常未绝经女性明显下降,差异具有统计学意义（p<0.05）;2.雌激素和TGF-β刺激因子刺激培养MC3T3-E1细胞提示,不同浓度雌激素刺激对于MC3T3-E1细胞中的miR-126-5p表达差异没有统计学意义（p>0.05）,TGF-β刺激因子刺激培养MC3T3-E1细胞中的miR-126-5p表达量约为对照组的80%（p<0.05）;3.雌激素和TGF-β刺激因子刺激培养RAW264.7细胞提示,不同浓度雌激素刺激对于RAW264.7细胞中的miR-126-5p表达差异没有统计学意义,TGF-β刺激因子刺激培养RAW264.7细胞中的miR-126-5p表达量约为对照组的49.6%（p<0.05）;4.成骨细胞分化实验中,q RT-PCR结果提示,miR-126-5p agomir组对成骨细胞标记基因表达调控作用相对于对照组没有明显差异。成骨分化ALP染色计数结果提示,miR-126-5p agomir组成骨细胞分化未见明显差异;5.破骨细胞分化实验中,q RT-PCR结果提示,miR-126-5p agomir组相对于对照组可明显抑制破骨细胞标记基因表达。破骨分化TRAP染色计数结果提示,miR-126-5p agomir组破骨细胞分化受到抑制（p<0.05）;6.条件共培养破骨分化实验中,miR-126-5p agomir组破骨细胞数目较对照组减少,破骨细胞分化受到明显抑制（p<0.05）;7.CCK8增殖实验中,miR-126-5p agomir可明显促进MC3T3-E1细胞增殖。在RAW264.7细胞中,miR-126-5p agomir组较对照组可促进细胞增殖,但无统计学差异;8.转录组学分析结果提示,HOXC8、OSTF1、PTHrP、MMP13是miR-126-5p潜在的靶基因;9.qRT-PCR及western blot结果提示,HOXC8、OSTF1、PTHrP、MMP13在miR-126-5p agomir组表达量下降。而进一步的Luciferase荧光素酶活性检测结果提示,miR-126-5p可通过结合HOXC8、OSTF1、PTHrP、MMP13的mRNA 3’UTR区直接抑制其翻译表达（p<0.05）;10.动物实验中,行卵巢摘除术后小鼠miR-126-5p表达量随时间发展明显降低;11.microCT扫描和三维重建结果提示,OVX小鼠予以外源性miR-126-5p agomir刺激后可有效延缓骨量减少,而予以miR-126-5p antagomir可加快骨质破坏,骨量流失（p<0.05）。综合上述研究结果,我们认为miR-126-5p作为一种转录后修饰因子在骨质疏松的发生发展过程中发挥着重要生物学作用。它可能受TGF-β信号通路调节,并通过作用于HOXC8、OSTF1、PTHrP、MMP13的mRNA产物调控其表达,进而影响成骨细胞前体细胞的增殖。同时RANKL、IL-10等多个因子的表达也受miR-126-5p调控,直接或间接地促进破骨细胞分化。,而且HOXC8、OSTF1、PTHrP、MMP13相互之间也存在一定的相互作用关系。因此,miR-126-5p在调控骨质疏松的过程中发挥的作用是极其复杂的。
洪帆[3]（2021）在《假基因UBDP1竞争性结合microRNA调控胶质母细胞瘤恶性增殖侵袭的机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的胶质母细胞瘤是恶性程度最高的脑肿瘤之一,同时也是最常见的脑肿瘤之一,目前胶质母细瘤的标准化治疗方案仍无法得到满意的预后。假基因是一种广泛表达的非编码基因,由编码基因突变而来,突变前的编码基因被称为真基因。多项研究已经证实假基因在人类癌症进展中起到了至关重要的作用。本研究旨在寻找影响胶质母细胞瘤恶性进展的假基因,并深入探索其影响胶质母细胞瘤恶性进展的关键分子机制,为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供新的可能。研究方法首先,通过对我们团队前期工作中已完成的胶质母细胞瘤和正常脑组织基因表达谱芯片测序数据（GEO dataset:GSE51146）进行进一步分析,最终筛选出差异表达的假基因UBDP1,其真基因UBD已被证实与胶质瘤患者预后相关;我们通过临床收集的30例胶质母细胞瘤样本和15例正常脑组织样本的QPCR实验验证UBDP1及其真基因UBD在胶质母细胞瘤中的异常表达,并对UBDP1和UBD的QPCR相对表达量和30例胶质母细胞瘤样本对应的患者临床信息进行Kaplan-Meier单因素生存分析以及Cox单因素和多因素生存分析。接下来,我们通过胶质母细胞瘤细胞系U87和U251的FISH+蛋白免疫荧光实验来探索UBDP1和UBD在胶质母细胞瘤细胞中的分布;通过构建UBDP1、UBD过表达/干扰稳转的U87、U251细胞系并进行CCK-8细胞增殖实验和transwell细胞迁移、侵袭实验来探索UBDP1和UBD对胶质母细胞瘤细胞功能的调控作用;通过构建裸鼠原位成瘤模型并进行荷瘤裸鼠的生存分析和裸鼠脑内肿瘤样本的免疫组化实验来探索UBDP1和UBD在体内对胶质母细胞瘤恶性进展的调控作用。最后,我们通过生信分析寻找与UBDP1和UBD相同结合位点的micro RNA,并进一步通过micro RNA过表达/干扰瞬转的U87、U251细胞系的western blot实验筛选出miR-6072;通过荧光素酶报告基因实验来探索UBDP1、UBD与miR-6072在细胞中的结合情况,并进行UBDP1、miR-6072、UBD的rescue实验和UBDP1、miR-6072表型回复实验来探索三者的作用机制。研究结果30例胶质母细胞瘤样本和15例正常脑组织样本的QPCR实验结果显示,UBDP1和UBD在胶质母细胞瘤中的表达较正常脑组织均显着升高;30例胶质母细胞瘤样本的UBDP1、UBD的QPCR相对表达量和对应患者临床信息的Kaplan-Meier生存分析以及Cox生存分析结果显示,UBDP1、UBD在胶质母细胞瘤中的表达均是胶质母细胞瘤患者预后的独立影响因素;U87和U251的FISH+蛋白免疫荧光实验结果显示,UBDP1和UBD主要分布于胶质母细胞瘤细胞的胞浆中;UBDP1、UBD过表达/干扰稳转的U87、U251细胞系的CCK-8细胞增殖实验和transwell细胞迁移、侵袭实验的结果显示,UBDP1和UBD均促进胶质母细胞瘤的细胞增殖、迁移和侵袭;脑内荷瘤裸鼠的生存分析结果显示,UBDP1、UBD过表达的脑内荷瘤裸鼠的生存时间显着低于对照组;裸鼠脑内脑内肿瘤样本的免疫组化结果显示,UBDP1、UBD过表达的肿瘤样本中的ki-67比例显着高于对照组。miR-6072过表达/干扰瞬转的U87、U251细胞系的western blot实验结果显示,miR-6072抑制UBD的表达;荧光素酶报告基因实验的结果显示,UBDP1、UBD均能和miR-6072在细胞中结合;UBDP1、miR-6072、UBD的rescue实验显示,在UBDP1过表达稳转U87、U251细胞中UBD表达量显着升高,进一步在UBDP1过表达稳转U87、U251细胞中过表达miR-6072后,UBD的表达量显着降低;UBDP1、miR-6072表型回复实验结果显示,在UBDP1过表达稳转U87、U251细胞中过表达miR-6072后,原本显着增加的细胞增殖、迁移和侵袭能力出现了显着的降低。研究结论假基因UBDP1通过竞争性结合miR-6072促进UBD的表达,从而促进胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭。
王宁宁[4]（2021）在《长链非编码RNA MYLK-AS1内源性竞争结合miR-141-3p上调CDC25A促进肝细胞肝癌进展的机制研究》文中研究说明研究背景:原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）（下文以肝癌代称）,从全球范围来看,其发病率和死亡率分别处在第五和第四位,是消化系统比较常见、后果较为严重的疾病之一。HCC发生的危险因素包括病毒感染、酒精过量、黄曲霉素及代谢相关脂肪性肝病等多种因素,过去的几年间,人们在肝癌诊断和治疗方面飞速进步,但并未有效的改善预后效果,所以揭示出HCC的发生和发展的具体机制,确定更合适的分子标志物是我们的研究方向。随着高通量测序技术的飞速发展,越来越多的研究表明长链非编码RNA（lncRNA）参与肝癌的发生及发展,但具体的作用机制还有待深入的研究。研究目的:利用生物信息学软件及TCGA等数据库筛选出与肝癌预后相关的目标lncRNA,并分别在细胞及临床样本中进行验证,分析目标基因的表达与临床病理参数及预后的相关性,进一步探讨目标lncRNA MYLK-AS1在肝癌细胞中的生物学功能及参与肝癌发生发展的具体机制。研究方法:第一部分:利用TCGA公共数据库筛选出与肝癌预后相关的mRNA、miRNA及LncRNA。1.下载TCGA数据库中肝癌相关的RNA数据及临床资料,建立基因表达矩阵,分别提取mRNA、miRNA、lncRNA。用R 3.4.3软件做差异分析,找出差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA。2.通过miRcode、starbase、Target Scan、miRTar Base等数据库获得lncRNA-miRNA调控关系和miRNA-mRNA调控关系,利用Cytoscape v3.6构建ceRNA调控网络。3.结合Kaplan-Meier生存分析筛选出与生存预后相关lncRNA。4.运用q RT-PCR检测技术,了解预测的lncRNA在正常肝细胞和肝癌细胞系中的表达水平。第二部分:通过q RT-PCR检测44例配对原发性肝癌组织和癌旁非癌组织中长链非编码RNA MYLK-AS1的表达情况,分析其表达和各项病理参数之间的关联。然后运用原位杂交技术,检测72例原发性肝癌组织和20例癌旁非癌组织中MYLK-AS1表达情况,揭示出MYLK-AS1和病例的病理TNM分期、肿瘤分化程度、血管浸润、肿瘤标志物AFP等临床特征及预后的相关性,接着利用单/多因素回归分析,分析与肝癌预后的独立危险因素。最后通过荧光原位杂交技术（FISH）检测MYLK-AS1在肝癌细胞中的表达定位情况。第三部分:从分子层面着手,揭示出长链非编码MYLK-AS1在肝癌发生和发展过程中扮演的角色。1.首先设计合成MYLK-AS1的siRNA干扰序列和过表达质粒,分别在Huh7和Hep G2细胞中转染MYLK-AS1-siRNA和MYLK-AS1过表达质粒（MYLK-AS1-pc DNA）,通过CCK-8增殖、克隆形成、裸鼠皮下成瘤实验以及流式分析技术研究MYLK-AS1对肝癌细胞生物学功能的影响。2.通过q RT-PCR技术分析MYLK-AS1与miR-141-3p在肝癌细胞中的相互调控作用,采用双荧光素酶报告实验检测MYLK-AS1与miR-141-3p的结合情况。3.在肝癌细胞中分别或共同转染MYLK-AS1与miR-141-3p,通过流式分析技术明确二者共表达和肝癌细胞周期及凋亡之间的关系,利用Western blot检测靶基因CDC25A及细胞周期Rb/E2F通路中关键蛋白分子的表达情况。研究结果:1.通过TCGA数据库肝癌与正常肝组织RNA数据的下载及分析,筛选出肝癌中差异表达的基因,1992个mRNA,1082个lncRNA和126个miRNA;利用miRcode、star Base和miRTar Base预测lncRNA-miRNA和miRNA-mRNA的关系对,建立相互调控的ceRNA网络;Kaplan-Meier生存分析筛选出与预后相关的lncRNA13个,mRNA20个。选出4个高表达且与预后负相关的lncRNA,利用q RT-PCR在肝癌细胞系中进行验证,发现MYLK-AS1在肝癌细胞系中表达高于正常肝细胞,因此将MYLK-AS1作为目标研究基因进行进一步的功能研究。2.q RT-PCR检测表明:44例HCC组织中MYLK-AS1的表达明显高于癌旁组织（p=0.0268）,具体的表达水平和病理TNM分期（p=0.022）、肿瘤分化程度（p=0.049）正相关;72例肝癌组织原位杂交结果表明,HCC组织和非癌组织中MYLK-AS1均有表达,但肝癌组织中MYLK-AS1染色评分更高,且MYLK-AS1表达高低除了与TNM分期及肿瘤分化程度相关,还受到血管浸润及患者生存时间的影响。多因素回归分析结果表明:MYLK-AS1的表达和肿瘤大小是HCC预后的独立危险因素（p=0.015,p=0.012）。3.荧光原位杂交（FISH）结果显示MYLK-AS1在肝癌细胞Huh7及肝癌组织样本中均主要在细胞的胞浆表达。4.CCK-8增殖检测、克隆形成和小鼠成瘤实验显示,MYLK-AS1会加速肝癌细胞的增殖;流式细胞周期及凋亡检测实验显示,在Huh7细胞中沉默MYLK-AS1,加速HCC细胞凋亡,细胞周期停滞在某个阶段;提高Hep G2细胞内MYLK-AS1的表达水平,HCC细胞增殖加速,细胞的凋亡受阻,并且MYLK-AS1通过激活Rb/E2F信号通路促进细胞周期进程。5.miR-141-3p在肝癌细胞及肝癌组织中低表达,MYLK-AS1与miR-141-3p存在互相调控作用,双荧光素酶报告实验证实MYLK-AS1与miR-141-3p存在结合。6.CDC25A为miR-141-3p的靶基因,CDC25A在肝癌组织中表达增高,且其表达量与MYLK-AS1呈正相关,在肝癌细胞中miR-141-3p负向调控CDC25A的表达;细胞功能回复实验显示miR-141-3p可以减弱MYLK-AS1对CDC25A表达的调控及对细胞周期的影响。研究结论:1.本研究通过生物学软件及TCGA等公共数据库筛选出肝细胞肝癌中差异表达的mRNAs、lncRNAs及miRNAs,并构建相互调控的ceRNA网络,结合数据库中患者的临床资料确定对肝癌预后效果具有影响作用的lncRNA MYLK-AS1;2.肝癌细胞和组织内,MYLK-AS1表达水平异常升高,和肿瘤TNM分期、分化程度、血管浸润及预后之间有着紧密的关联,MYLK-AS1的表达水平以及肿瘤的大小为患者预后的独立危险因素,这表明MYLK-AS1在肝癌的进展过程中发挥致癌作用,同时可作为肝癌预后评估的分子标志物;3.MYLK-AS1通过促进肝癌细胞的增殖、细胞周期进展及抑制细胞凋亡等生物学行为在肿瘤的发生发展中发挥作用;4.MYLK-AS1与miR-141-3p存在结合,并且MYLK-AS1竞争结合miR-141-3p调控靶基因CDC25A的表达,激活Rb/E2F信号通路促进细胞周期进展。该研究的发现为肝癌发生发展的具体机制提供新的思路及研究基础。
胡博[5]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中认为背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。
李凯[6]（2021）在《异欧前胡素（ISO）通过miR-3619调控CSTB和CSTD诱导角质形成细胞黑色素降解的作用研究》文中提出背景:色素沉着性疾病是黑色素代谢紊乱引起的一种常见皮肤病,严重影响患者的心理和社会活动。对此类疾病的发病机制及其治疗措施成为当下研究热点。黑色素代谢包括合成、转运和降解三个步骤。当前对于黑色素合成和转运研究较多,而对黑色素降解的机理知之甚少。异欧胡前素（isoimperatorin,ISO）是伞形科植物兴安白芷根部的关键成分,具有抑制黑色素生物合成必需酶酪氨酸酶活性的作用,然而ISO是否影响黑色素降解还不明确。本课题研究了ISO对人角质细胞中黑色素降解的作用及其机制,为ISO作为降解黑色素类美白剂提供理论基础。目的:1.研究ISO对黑色素含量的调控作用;2.研究ISO对黑色素降解相关酶活力和表达的调控作用;3.研究mi R-3619靶向调控组织蛋白酶B（cathepsin B,CTSB）和组织蛋白酶D（cathepsin D,CTSD）的表达;4.阐明ISO调控mi R-3619进而影响CSTB和CSTD表达和酶活力的作用机制。方法:第一部分,1.使用黑素小体和梯度浓度（0、2、4、8、16、32μg/m L）ISO处理Ha Ca T细胞,MTT法检测处理后0h、24h、48h、72h细胞活力。2.使用黑素小体和梯度浓度（0、2、4、8μg/m L）IS O处理Ha Ca T细胞,Elisa检测细胞黑色素含量。3.使用黑素小体和梯度浓度（0、2、4、8μg/m L）ISO处理Ha Ca T细胞,Western Blot（WB）检测细胞中PMEL17蛋白表达水平。4.使用黑素小体和8μg/m L ISO处理Ha Ca T细胞,生化法和Western Blot法分别检测细胞碱性磷酸酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D和组织蛋白酶L2四种重要溶酶体酶活性和蛋白表达水平。第二部分,1.构建CTSB和CTSD基因的sh-RNA干扰载体,使用sh-NC、sh-CTSB、sh-CTSD转染Ha Ca T细胞,quantitative Realtime PCR（q PCR）和WB分别检测细胞中CTSB和CTSD m RNA和蛋白表达水平,以评价sh-RNA干扰载体的效率。2.使用黑素小体和8μg/m L ISO处理Ha Ca T细胞后,使用sh-NC、sh-CTSB、sh-CTS D转染细胞,Elisa检测细胞中黑色素的含量。3.使用黑素小体和8μg/m L ISO处理Ha Ca T细胞后,使用sh-NC、sh-CTSB、sh-CTS D转染细胞,WB检测细胞中PMEL17的表达。第三部分,1.利用在线工具Target Scan预测可能同时以CSTB和CSTD为靶点的mi RNAs。2.使用黑素小体和8μg/m L ISO处理Ha Ca T细胞,q PCR检测上述预测mi RNA的表达水平。3.使用mimics NC、mi R-3619 mimics、inhibitor NC、mi R-3619 inhibitor转染Ha Ca T细胞,q PCR检测细胞中mi R-3619的表达水平,以评价mimics和inhibitor效率。4.使用mimics NC、mi R-3619 mimics、inhibitor NC、mi R-3619 inhibitor转染Ha Ca T细胞,WB检测CSTB和CTSD蛋白的表达水平。5.使用黑素小体和8μg/m L ISO处理Ha Ca T细胞后,使用mimics NC、mi R-3619 mimics、inhibitor NC、mi R-3619 inhibito r转染细胞,Elisa检测细胞中黑色素含量。6.使用黑素小体和8μg/m L IS O处理Ha Ca T细胞后,使用mimics NC、mi R-3619 mimics、inhibitor NC、mi R-3619 inhibitor转染细胞,WB检测细胞中PMEL17的表达。7.构建CTS B和CTS D基因3’UT R萤光素酶报告基因载体（wt-CTSB,wt-CTSD）,使用点突变法构建突变型萤光素酶报告基因载体（mut-CTSB,mut-CTSD）。将mimics NC、mi R-3619 mimics、inhibitor NC、mi R-3619 inhibitor分别与wt-CTSB或mut-CTSB共转染293 T细胞,检测萤光素酶活性;将mimics NC、mi R-3619 mimics、inhibitor NC、mi R-3619 inhibitor分别与wt-CTSD或mut-CTSD共转染293 T细胞,检测萤光素酶活性。结果:第一部分,1.1、2、4、8μg/m L ISO对Ha Ca T细胞活力无影响,16、32μg/m L IS O在48 h和72 h使细胞活力降低,表明16、32μg/m L ISO影响细胞生长,不适合使用该浓度开展后续研究。2.1、2μg/m L ISO对Ha Ca T细胞黑色素含量无影响,4、8μg/m L ISO使细胞黑色素含量减少。3.1、2μg/m L ISO对Ha Ca T细胞PMEL17蛋白表达量无影响,4、8μg/m L ISO使细胞PMEL17蛋白表达量降低,表明4、8μg/m L ISO是较为合适的浓度。4.8μg/m L ISO对Ha Ca T细胞AP C和CTSL2酶活力无影响,使CTSB和CTSD酶活力升高。5.8μg/m L IS O对Ha Ca T细胞AP C和CTSL 2蛋白表达无影响,使CTS B和CTS D蛋白表达升高。第二部分,1.sh-CTSB和sh-CTSD分别使Ha Ca T细胞中CTS B和CTSD的m RNA和蛋白表达降低,表明sh-CTSB和sh-CTSD可以用于后续实验。2.sh-CTSB和sh-CTSD分别使Ha Ca T细胞中黑色素含量增加。3.sh-CTSB和sh-CTSD分别使Ha Ca T细胞中PMEL1 7蛋白表达升高。第三部分,1.预测到可能靶向CTSB的mi RNA 202个,可能靶向CTSD的mi RNA 49个,同时靶向CTSB和CTSD的mi RNA有16个。2.ISO使Ha Ca T细胞中mi R-24-3p、mi R-96-5p、mi R-149-5p、mi R-892b、mi R-661表达升高,mi R-940、mi R-3619、mi R-140表达降低,其中mi R-3619降低幅度最大。3.mi R-3619 mimics使Ha Ca T细胞中mi R-3619表达升高,mi R-3619 inhibitor使Ha Ca T细胞中mi R-3619表达降低,表明mi R-3619 mimics和mi R-3619 inhibitor可以用于后续实验。4.mi R-3619 mimics使Ha Ca T细胞中CTSB和CTSD蛋白表达降低,mi R-3619 inhibitor使Ha Ca T细胞中CTSB和CTSD蛋白表达升高,表明mi R-361 9可以调控CTS B和CTS D表达。5.mi R-3619 mimics使Ha Ca T细胞中黑色素含量增加,mi R-3619inhibitor使Ha Ca T细胞中黑色素含量减少。6.mi R-3619 mimics使Ha Ca T细胞中PMEL17蛋白表达升高,mi R-3619 inhibitor使Ha Ca T细胞中PMEL17蛋白表达降低。7.mi R-3619 mimics使wt-CTSB萤光素酶活性降低,对mut-CTSB无影响;mi R-3619 inhibitor使wt-CTSB萤光素酶活性升高,对mut-CTSB无影响,表明mi R-361 9靶向调控CTSB基因表达。mi R-3619 mimics使wt-CTSD萤光素酶活性降低,对mut-CTSD无影响;mi R-3619 inhibitor使wt-CTSD萤光素酶活性升高,对mut-CTSD无影响,表明mi R-3619靶向调控CTSD基因表达。结论:1.异欧前胡素显着减少Ha Ca T细胞中黑色素的含量,抑制黑素小体特异性蛋白PMEL17的表达,促进溶酶体中组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的活力和表达。2.组织蛋白酶B和组织蛋白酶D能够显着减少Ha Ca T细胞中黑色素的含量,抑制黑素小体特异性蛋白PMEL17的表达。3.异欧前胡素显着抑制mi R-3619的表达。4.mi R-3619显着抑制增加Ha Ca T细胞中黑色素的含量,促进黑素小体特异性蛋白PMEL17的表达,抑制溶酶体中组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的活力和表达。5.异欧前胡素通过降低mi R-3619表达,促进组织蛋白酶B和组织蛋白酶D表达,从而减少Ha Ca T细胞中黑色素的含量,抑制黑素小体特异性蛋白PMEL17的表达。
李明洋[7]（2021）在《LNC＿000052调节骨髓间充质干细胞生物学行为的机制研究》文中研究说明目的:骨质疏松是一种以骨量减少、骨微结构退行病变、骨脆性增加为特征的一种全身代谢性骨病。随着我国老龄化程度的加深,骨质疏松的发病率也在逐年升高。骨质疏松主要划分为原发性和继发性骨质疏松,其中原发性骨质疏松占比较大,主要见于绝经后的女性,其原因多为雌激素水平下降引发的骨生成能力的降低同时伴有骨吸收破坏的增加,从而导致骨微结构破坏,骨密度与骨强度降低,极大地增加了骨折的风险。目前长期应用抗骨质疏松药物依然是治疗原发性骨质疏松的重要手段。但是值得注意的是,目前临床上应用的药物仍以抗骨吸收为主,缺少高效的促骨形成的治疗方案。而骨髓间充质干细胞作为成骨细胞的重要来源,是骨形成过程中的关键细胞,其在骨质疏松发生发展过程中的重要角色越来越为研究人员所认可。然而目前在骨质疏松病理状态下,骨髓间充质干细胞的生物学行为发生了怎样的变化以及其中的潜在机制仍不明确。在研究病理状态下某种细胞内各种因子变化的方法中,转录组测序是近年来比较先进和高效的方法,其可以对细胞在不同状态下转录出的所有RNA进行高通量测序,快速、精确、完整地分析出细胞内转录水平的变化,同时可以发掘出很多尚未报道的未知RNA,为相关研究领域填补大量空白。通过转录组测序对骨质疏松的骨髓间充质干细胞进行探究,有助于揭示骨质疏松的发生发展机制以及探索更加高效的治疗方案。方法:构建去卵巢骨质疏松组和假手术组大鼠模型,使用全骨髓贴壁法提取骨髓间充质干细胞。使用大鼠股骨HE染色确认骨质疏松模型是否成功建立,从形态学、表型鉴定和分化能力鉴定骨髓间充质干细胞。收集培养至第三代的骨质疏松组和假手术组的骨髓间充质干细胞进行转录组测序,应用PCR验证LNC＿000052在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中高表达。构建LNC＿000052过表达病毒和敲低质粒,利用CCK-8以及Ed U实验探究LNC＿000052对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响,利用Transwell实验探究LNC＿000052对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响,利用流式细胞仪探究LNC＿000052对骨髓间充质干细胞凋亡和细胞周期的影响,利用茜素红染色实验探究LNC＿000052对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。应用PCR验证miR-96-5p在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中低表达,应用PCR、western blot验证PIK3R1在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中高表达。应用PCR检测调节LNC＿000052表达后miR-96-5p表达量的变化,应用PCR、western blot、免疫荧光检测调节LNC＿000052表达后PIK3R1表达量的变化。构建miR-96-5p过表达和敲低质粒,应用PCR、western blot、免疫荧光检测调节miR-96-5p表达后PIK3R1表达量的变化,利用CCK-8以及Ed U实验探究miR-96-5p对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响,利用Transwell实验探究miR-96-5p对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响,利用流式细胞仪探究miR-96-5p对骨髓间充质干细胞凋亡和细胞周期的影响,利用茜素红染色实验探究miR-96-5p对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。构建LNC＿000052和PIK3R1野生型和突变型荧光素酶载体,应用双荧光素酶实验验证LNC＿000052与miR-96-5p、miR-96-5p与PIK3R1之间的靶向结合作用。共同敲低LNC＿000052和miR-96-5p,探究敲低miR-96-5p后对LNC＿000052调节骨髓间充质干细胞增殖、迁移、凋亡、周期、成骨能力的影响以及下游PIK3R1表达的影响。将敲低了LNC＿000052和过表达miR-96-5p的骨髓间充质干细胞通过鼠尾静脉注射移植入去卵巢骨质疏松的大鼠中,通过血清学、组织学、形态计量学检测骨髓间充质干细胞移植对骨质疏松的治疗效果。结果:大鼠股骨HE染色可见去卵巢骨质疏松组的骨小梁减少、脂肪空泡增多,证明成功构建了去卵巢骨质疏松组和假手术组大鼠模型。提取的骨髓间充质干细胞表现为间充质干细胞形态,阳性表达CD29和CD90,阴性表达CD45,具有成骨成脂分化能力,符合鉴定标准,可以用于转录组测序。经过对转录组测序结果的验证,证实LNC＿000052在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中表达升高,miR-96-5p在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中表达降低,PIK3R1在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中表达升高。生物学行为实验证明了过表达的LNC＿000052抑制骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨能力,促进骨髓间充质干细胞的凋亡和细胞周期停滞在G0-G1期;敲低的LNC＿000052促进骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨能力,骨髓间充质干细胞的凋亡和细胞周期停滞在G0-G1期的比例降低。PCR和western blot实验证明了LNC＿000052负性调节miR-96-5p的表达,PCR、western blot和免疫荧光实验证明了LNC＿000052正向调节PIK3R1的表达,而且miR-96-5p负性调节PIK3R1的表达。生物学行为实验证明了低表达的miR-96-5p抑制骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨能力,促进骨髓间充质干细胞的凋亡和细胞周期停滞在G0-G1期;过表达的miR-96-5p促进骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨能力,骨髓间充质干细胞的凋亡和细胞周期停滞在G0-G1期的比例降低。双荧光素酶实验验证了LNC＿000052与miR-96-5p,miR-96-5p与PIK3R1之间存在一定的靶向结合关系。共转染实验发现低表达的miR-96-5p可以抑制低表达的LNC＿000052对骨髓间充质干细胞增殖、迁移、成骨能力的促进作用以及细胞凋亡和周期的抑制作用。体内实验中,同时敲低LNC＿000052和过表达miR-96-5p的骨髓间充质干细胞移植后大鼠血清ALP升高、骨小梁增多、促进骨形成,对骨质疏松的治疗效果更显着。结论:LNC＿000052和PIK3R1在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中高表达,miR-96-5p在骨质疏松的骨髓间充质干细胞中低表达。过表达的LNC＿000052和低表达的miR-96-5p干扰骨髓间充质干细胞的正常生物学行为,且通过PIK3R1发挥作用。LNC＿000052与miR-96-5p,miR-96-5p与PIK3R1之间存在一定的靶向结合关系。敲低LNC＿000052和过表达miR-96-5p的骨髓间充质干细胞表现出明显的促进骨形成作用,对骨质疏松的治疗效果更显着。
赵佳福[8]（2020）在《MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究》文中指出前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是全球第二大最常见的男性癌症。几乎所有晚期PCa患者在接受内分泌治疗后都会发展成去势抵抗性前列腺癌。尽管雄激素受体是治疗转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castrate-resistant prostate cancer,mCRPC）的有效方法,但2018年美国依然有29430人死于PCa。近年来对14-3-3蛋白家族的研究发现,该家族成员14-3-3ε在前列腺癌的发生发展中发挥了重要作用,可能成为前列腺癌诊断治疗的分子靶点。同样,大量研究也证实miRNAs在前列腺癌的发生发展中同样发挥了重要作用,在前列腺癌的分子诊断和靶向治疗方面同样具有广阔的应用前景,然而miRNAs调控14-3-3ε在前列腺癌发生发展中的具体分子机制尚不清楚。本研究采用UALCAN-TCGA在线数据库结合qRT-PCR、CCK-8、细胞划痕、Transwell、双荧光素酶系统、流式细胞术等试验手段,从细胞水平和分子水平,阐明miRNAs调控14-3-3影响前列腺癌细胞增殖凋亡的分子机制。相关研究可为前列腺癌的分子诊断和靶向抗癌药物研发提供新思路。主要研究结果如下:1.14-3-3ε在PCa组织和细胞中的表达及其对22Rv1细胞增殖的影响UALCAN-TCGA数据库分析结果表明,14-3-3蛋白不同亚型在PCa组织和癌旁组织具有不同的表达模式,其中14-3-3ε/YWHAE、14-3-3γ/YWHAG和14-3-3τ/YWHAQ在PCa组织中表达上调,14-3-3η/YWHAH、14-3-3β/YWHAB和14-3-3ζ/YWHAZ在PCa组织中表达下调;在前列腺癌不同细胞系中的研究发现,14-3-3ε在PC3、22Rv1、LNCaP中具有同PCa组织中相同的表达模式。CCK-8细胞增殖试验、细胞划痕试验和Transwell试验结果表明,干扰14-3-3ε的表达,严重影响了22Rv1细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力（P<0.01）。以上结果暗示14-3-3ε在PCa中可能扮演原癌基因的角色。2.调控14-3-3ε表达的microRNAs筛选及功能验证TargetScan、miRSystem、miRanda和PicTar等在线软件预测发现,miR-155-5p、miR-31-5p、miR-29b-3p、miR-29a-3p及miR-29c-3p是调控14-3-3?得分最高的5条miRNAs;综合qRT-PCR试验、双荧光素酶试验和CCK-8试验结果发现,在22Rv1细胞中miR-31-5p与14-3-3?具有逆向表达关系,是调控14-3-3?表达效率最高的miRNA。通过构建野生型和突变型荧光素酶载体,我们发现:14-3-3?3’UTR中“UCUUGCC”7个碱基位点是miR-31-5p调控14-3-3?表达的特异性功能靶点,该位点的缺失,严重影响了miR-31-5p对14-3-3?基因的调控能力。3.miR-31-5p调控14-3-3ε对22Rv1细胞表型的影响CCK-8试验、细胞划痕试验、Transwell试验结果发现:mi R-31-5p过表达,严重影响了22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力;流式细胞试验发现:miR-31-5p的上调直接导致22Rv1细胞停滞在G1期,间接抑制了22Rv1细胞增殖;细胞凋亡试验结果发现:miR-31-5p的上调促进了22Rv1细胞的早期凋亡和细胞坏死。补偿试验结果发现,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力,同时也部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞周期的抑制和对22Rv1细胞的促凋亡能力。4.miR-31-5p调控14-3-3?对PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响对miR-31-5p调控14-3-3?影响22Rv1增殖凋亡的信号通路研究发现,miR-31-5p的上调,显着下调了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值,上调了Bad、Bax/Bcl-2的表达水平,激活了caspase-9和caspase-3等与细胞凋亡相关的级联反应;然而,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了这一现象。以上结果暗示miR-31-5p靶向调控14-3-3?抑制22Rv1细胞增殖和促进细胞凋亡是通过调节PI3K/AKT/Bcl-2信号通路实现的。综上所述,本文明确了14-3-3?蛋白在前列腺癌组织和细胞中显着升高,发现miR-31-5p是靶向调控14-3-3?基因表达的最佳miRNAs,解析了miR-31-5p靶向调控14-3-3?与22Rv1细胞增殖凋亡的关联性,阐明了miR-31-5p靶向调控14-3-3?影响22Rv1细胞增殖凋亡的分子机制。为miR-31-5p和14-3-3ε联合应用于CRPC精准治疗提供了新的理论依据。
乔郭洁[9]（2020）在《SEMA3C错义突变在肝癌发生发展中的作用和机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:神经轴突导向因子Semaphorin3C（信号素SEMA3C）在多种肿瘤中都有表达,但是它在不同类型肿瘤细胞中对于细胞的增殖侵袭转移等功能的影响结果不同,因为SEMA3C突变在肝癌发生过程中的研究还未有先例,而且SEMA3C在肿瘤中异常表达的作用机制也尚未被阐明。所以本研究主要探讨SEMA3C突变在肝癌生长、侵袭转移中的作用机制,并分析抑制剂凡德他尼（Vandetanib）对SEMA3C表达异常的作用效果。方法:1、采用外显子组测序方法对40例肝癌病人的肿瘤标本进行测序。2、构建SEMA3C野生型WT和突变型MT的真核表达载体。3、研究过表达SEMA3C的野生型和突变型rs1527482 G>A对肝癌细胞的迁移能力,克隆形成能力,增殖能力,并对此分子机制进行分析。生长因子受体酪氨酸激酶（RTK）途径激活是介导肿瘤生长、生存和治疗抵抗的关键机制。同源配体在这些RTK途径的自分泌或旁分泌刺激中起着关键作用。本文展示了SEMA3C通过自身受体丛蛋白PLXND1和PLXNB1以一种与配体无关的方式驱动包括EGFR、VEGFR2和MET在内的多个RTK的激活。4、研究过表达SEMA3C的野生型和突变型对裸鼠皮下成瘤能力的影响,以及EGFR抑制剂凡德他尼（Vandetanib）对皮下瘤的疗效,SEMA3C抑制是治疗晚期肝癌的新策略。结果:1、在40例肝癌病人的外显子组测序结果中发现,在20例高转移潜能病例组中SEMA3C突变rs1527482 G>A有8例,在20例低转移潜能组病例中SEMA3C突变rs1527482 G>A有1例。2、在肝癌细胞系PLC/PRF/5和Hu H-7中,SEMA3C突变型（MT）稳转株的侵袭迁移能力,克隆形成能力,增殖能力均比野生型（WT）和空载体对照组（NC）增强,但NC,WT,MT三者之间的细胞凋亡水平无明显差异。3、在肝癌细胞系PLC/PRF/5的裸鼠皮下瘤模型中,非喂药组中SEMA3C突变型（MT）的肿瘤质量与体积比野生型（WT）和空载体对照组（NC）大很多,凡德他尼（Vandetanib）用药组中,NC,WT,MT三组皮下瘤均明显减小,从减小幅度上来看,MT减小的更多。结论:本研究表明,SEMA3C对肝癌的发生发展具有重要作用。综上所述,在肝癌中高表达SEMA3C或者表达rs1527482 G>A突变的SEMA3C可以作为诊断肝癌的候选标志物;同时,它在肝癌中表现为促癌基因的特点和功能,将为阐明SEMA3C表达异常与肝癌发生发展机制的关系奠定理论基础,并为肝癌的临床治疗和诊断提供了新的靶点和方向。
黄叶[10]（2020）在《大白猪胴体性状全基因组关联分析及遗传参数估计》文中提出猪是我国重要的肉用畜种,通过遗传改良提高其胴体性状是猪育种工作的重要目标。采用基于数量遗传学为基础的常规育种方法进行胴体性状的遗传改良,进展较慢,且无法解析其遗传和变异的本质。采用数量遗传学和分子生物学相结合的手段进行遗传改良,可以加速遗传进展。分子遗传学可为数量遗传学的数学建模提供指导,而分子遗传学在现阶段解决不了的问题可以借助数量遗传学做出比较合理的推断。本研究通过对一个大白猪群体的胴体性状进行了全基因组关联分析（GWAS）,初步筛选了影响猪眼肌面积和眼肌厚的候选基因,同时估计胴体性状的遗传参数,为鉴定影响猪胴体性状的主效基因和关键分子标记提供科学依据。主要研究结果如下:1.收集整理了666头大白猪种猪系谱以及胴体性状测定数据,利用GLM线性模型分析年份、性别、胎次、季节对大白猪校正100 kg（100 kg BF）及校正115 kg背膘厚（115 kg BF）、校正100 kg（100 kg LMA）及校正115kg眼肌面积（115 kg LMA）、校正100 kg眼肌厚（100 kg LMDEP）、校正100 kg（100 kg LEANP）及校正115 kg瘦肉率（115 kg LEANP）的影响。结果表明,年份、性别、季节对7个胴体性状均有极显着影响（P<0.01）,胎次对100 kg/115 kg LEANP有显着影响（P<0.05）,对其余胴体性状影响不显着（P（29）0.05）。2.采用DMU软件的DMUAI模块结合REML算法计算大白猪胴体性状的遗传力和遗传相关;利用SAS软件的Pearson方法计算性状之间的表型相关。结果表明:（1）100 kg BF、115 kg BF、100 kg LMA、115 kg LMA、100 kg LMDEP、100 kg LEANP、115 kg LEANP的遗传力分别为0.290、0.346、0.297、0.297、0.299、0.412、0.391。100 kg/115 kg BF与100 kg/115 kg LEANP遗传相关系数分别为-0.622、-0.530、-0.518、-0.492;100 kg LMA与100 kg LEANP（0.451）、115 kg LEANP（0.50）及115 kg LMA与100 kg LEANP（0.414）、115 kg LEANP（0.459）具有中等程度的遗传正相关,其余胴体性状间的遗传相关程度较低。100 kg BF与100 kg LEANP（-0.388）和115 kg LEANP（-0.412）及115 kg BF与100 kg LEANP（-0.380）和115 kg LEANP（-0.405）具有中等程度的表型负相关;100 kg LMDEP与100 kg LMA（0.509）和115 kg LMA（0.509）有中等的表型正相关。100 kg LMA与100 kg LEANP（0.832）和115 kg LEANP（0.855）具有高程度的表型正相关。3.对349头大白猪个体进行简化基因组测序与基因分型,获得91314个SNP标记。对7个胴体性状进行GWAS分析,结果在6号和X染色体上筛选到7个与眼肌面积显着关联的SNP位点（P<1.0E-06）,在16号染色体上筛选到2个与眼肌厚显着关联的SNP位点（P<1.0E-06）。对显着关联SNP位点上下游各1M范围内分析筛选与胴体性状相关的候选基因,获得3个与眼肌面积相关的候选基因:PIK3C3、MID1、WWC3;获得9个与眼肌厚相关的候选基因:PLPP1、IL6ST、SLC38A9、MAP3K1、GPX8、ARL15、DHX29、ANKRD55、DDX4。4.采用飞行时间质谱检测技术,对10个候选基因ANKRD55、WWC3、PIK3C3、DDX4、ARL15、SLC38A9、IL6ST、GPX8、MAP3K1、PLPP1的30个SNP位点进行检测,分型成功的SNP位点有23个。Hardy-Weinberg检验结果表明,有11个SNP位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P（27）0.05）;多态信息含量分析结果表明,除ARL15基因的rs326155236位点为低度多态,其余位点均属于中度多态。5.运用GLM模型将23个SNP位点与100 kg LMA、115 kg LMA、100kg LMDEP进行关联分析,其中与100 kg LMA和115 kg LMA显着相关的SNP位点有11个（P<0.05）,分别位于ANKRD55、SLC38A9、GPX8、DDX4基因中,与100 kg LMDEP显着相关的SNP位点共有13个（P<0.05）,其中7个SNP位点位于ANKRD55基因中,2个SNP位点位于SLC38A9基因中,3个SNP位点位于GPX8基因中,1个SNP位点位于DDX4基因中。6.运用Haplo View软件进行单倍型分析,运用R语言环境下的Haplo.stats package程序包进行单倍型关联分析。结果表明,6号染色体上形成一个单倍型区段,由SNP9-13组成,其中与100 kg LMA、115 kg LMA显着相关的单倍型均有3个（P<0.05）;与100 kg LMDEP显着相关的单倍型2个（P<0.05）。16号染色体上形成3个单倍型区段,分别由SNP2-8、SNP10-18、SNP19-29组成。其中Block1中与100 kg LMA、115 kg LMA、100 kg LMDEP显着相关的单倍型均有2个（P<0.05）;Block2中与100 kg LMA、115 kg LMA、100 kg LMDEP显着相关的单倍型分别为4、3、3个（P<0.05）;Block3中与100 kg LMA、115 kg LMA、100 kg LMDEP显着相关的单倍型均有4个（P<0.05）。综上所述,本研究通过GWAS分析,挖掘发现了3个可能与眼肌面积相关的候选基因及9个可能与眼肌厚相关的候选基因,采用飞行时间质谱技术检测了其中10个候选基因SNP位点,发现了多个与眼肌面积和眼肌厚相关的SNP,这些SNP有望成为大白猪胴体性状遗传选择的分子标记。
二、突变型β-连环蛋白基因对肝细胞增殖的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、突变型β-连环蛋白基因对肝细胞增殖的影响（论文提纲范文）
（1）miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文略缩词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肝细胞癌 |
| 1.1.1 肝细胞性肝癌的流行病学 |
| 1.1.2 肝细胞性肝癌的危险因素 |
| 1.1.3 肝细胞性肝癌的筛查 |
| 1.1.4 肝细胞性肝癌的诊断 |
| 1.1.5 肝细胞性肝癌的分期 |
| 1.1.6 肝细胞性肝癌的治疗 |
| 1.1.7 肝细胞性肝癌的生物学 |
| 1.2 microRNAs(miRNAs) |
| 1.2.1 miRNA概述 |
| 1.2.2 miRNA与 HCC |
| 1.2.3 miRNA-557与HCC |
| 1.3 上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT) |
| 1.3.1 EMT概述 |
| 1.3.2 EMT和 miRNAs |
| 1.3.3 EMT和 HCC |
| 1.4 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.4.1 Wnt/β-catenin信号通路概述 |
| 1.4.2 Wnt/β-catenin信号通路与HCC |
| 1.4.3 Wnt/β-catenin信号通路与miRNAs |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 miR-557 在肝癌中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 miR-557在GSE108724 的表达情况 |
| 2.3.2 miR-557在GSE26323 的表达情况 |
| 2.3.3 miR-557 在肝癌细胞系中的表达情况 |
| 2.3.4 miR-557 在肝癌组织中的表达情况 |
| 2.3.5 miR-557 在肝癌组织中的表达水平与患者生存时间的关系 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 miR-557 对肝癌细胞体内外生物学行为的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 mimics和 inhibitors可以显着影响miR-557 的表达 |
| 3.3.2 miR-557 抑制肝癌细胞增殖 |
| 3.3.3 miR-557 抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.3.4 miR-557 过表达和敲减均影响肝细胞癌的细胞周期分布 |
| 3.3.5 miR-557 抑制肝癌细胞EMT |
| 3.3.6 慢病毒稳转株的筛选及miR-557 对细胞克隆形成的影响 |
| 3.3.7 miR-557 对肝细胞癌克隆形成和裸鼠皮下成瘤的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 miR-557 通过靶向RAB10 抑制Wnt/β-catenin信号的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 生物信息学预测miR-557 的靶基因 |
| 4.3.2 双荧光素酶报告实验验证miR-557与RAB10 的靶向性 |
| 4.3.3 miR-557 负性调控RAB10 的表达水平 |
| 4.3.4 RAB10 在肝癌组织中表达及其与miR-557 的相关性 |
| 4.3.5 促进或干扰RAB10 的表达会影响 miR-557对HCC细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.6 miR-557 抑制肝细胞性肝癌Wnt/β-catenin信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 总结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 综述 MicroRNA 在肝细胞癌中的作用及其机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）MicroRNA-126-5p在骨质疏松中的调控作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 MicroRNA-126-5p在骨质疏松中表达改变的研究 |
| 一、实验材料及方法 |
| 二、实验项目及具体流程 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 MiR-126-5p在体外和体内对骨微环境的调控作用研究 |
| 前言 |
| 一、实验器材 |
| 二、实验项目及流程 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 MiR-126-5p对骨微环境调控的分子机制研究 |
| 前言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法与步骤 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNAs及其信号通路在骨质代谢中的作用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和获得专利情况 |
| 致谢 |
（3）假基因UBDP1竞争性结合microRNA调控胶质母细胞瘤恶性增殖侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胶质母细胞瘤基因表达谱芯片及临床样本分析研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二部分 UBDP1和UBD在胶质母细胞瘤细胞中作用的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三部分 UBDP1/mi RNA/UBD调控胶质母细胞瘤进展机制的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第四部分 UBDP1和UBD在体内对胶质母细胞瘤的调控作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 FAT10 基因及其编码蛋白的功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表论文及参加科研情况 |
| 致谢 |
（4）长链非编码RNA MYLK-AS1内源性竞争结合miR-141-3p上调CDC25A促进肝细胞肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分:基于TCGA数据库肝细胞肝癌预后相关长链非编码RNA的筛选及鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 细胞来源 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 数据下载及分析 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 RNA浓度测定 |
| 2.2.6 逆转录合成cDNA |
| 2.2.7 实时定量荧光PCR |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 差异表达mRNAs、lncRNAs和 miRNAs的筛选 |
| 3.2 构建竞争性内源性RNA(ceRNA)网络 |
| 3.3 靶基因的功能注释 |
| 3.4 肝细胞肝癌预后相关基因的筛选 |
| 3.5 肝细胞肝癌预后相关候选lncRNA在肝癌细胞中的表达情况 |
| 3.6 TCGA数据库中MYLK-AS1 的表达与肿瘤分化等级的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 MYLK-AS1 在肝癌临床样本的表达及与临床病理参数的相关性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 标本和临床病理资料收集 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 冰冻组织RNA提取 |
| 2.2.2 RNA浓度测定 |
| 2.2.3 逆转录合成cDNA |
| 2.2.4 实时定量荧光PCR |
| 2.2.5 组织原位杂交 |
| 2.2.6 组织石蜡切片荧光探针原位杂交 |
| 2.2.7 细胞荧光探针原位杂交 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MYLK-AS1 在肝癌组织中表达增高,且与临床病理参数具有相关性 |
| 3.2 MYLK-AS1 表达与肝癌患者预后相关,且为患者预后的独立危险因素 |
| 3.3 长链非编码RNA MYLK-AS1 主要定位于细胞质中 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 MYLK-AS1 内源性竞争结合miR-141-3p上调CDC25A促进肝细胞肝癌进展的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 细胞及组织来源 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 MYLK-AS1 稳定表达细胞株的构建 |
| 2.2.4 RNA提取、逆转录成cDNA及荧光定量PCR |
| 2.2.5 CCK-8 法检测细胞的增殖作用 |
| 2.2.6 克隆集落形成实验 |
| 2.2.7 细胞周期检测 |
| 2.2.8 细胞凋亡检测 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.10 Western blot法检测蛋白表达 |
| 2.2.11 肿瘤模型建立 |
| 2.2.12 裸鼠处死取瘤,制作石蜡切片 |
| 2.2.13 计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 构建MYLK-AS1 沉默和过表达细胞模型 |
| 3.2 沉默或过表达MYLK-AS1 对肝癌细胞的增殖作用 |
| 3.2.1 CCK-8法检测MYLK-AS1 对肝癌细胞的增殖作用 |
| 3.2.2 克隆集落形成实验观察细胞增殖能力 |
| 3.2.3 沉默MYLK-AS1 抑制肝癌移植瘤的生长 |
| 3.3 沉默或过表达MYLK-AS1 对肝癌细胞凋亡的影响 |
| 3.4 沉默或过表达MYLK-AS1 对肝癌细胞周期的影响 |
| 3.5 MYLK-AS1 通过Rb/E2F信号通路影响肝癌细胞周期进展 |
| 3.6 MYLK-AS1对miR‐141‐3p的调控作用 |
| 3.7 miR-141-3p减弱MYLK-AS1 对肝癌细胞周期及细胞凋亡的影响 |
| 3.8 靶基因CDC25A在肝癌组织中表达增高,并且与MYLK-AS1 呈正相关 |
| 3.9 MYLK-AS1竞争结合miR‐141‐3p调控CDC25A的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA在肝细胞肝癌发生发展及预后中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分: 应用生物信息学方法筛选新的肝细胞癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522调控轴在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 非编码RNA在肝细胞癌发生与发展中的调节作用及临床应用(文献综述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作为ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝细胞癌发展中的可能作用及机制 |
| 第三章 ncRNA在HCC诊断及预后中的临床应用 |
| 第四章 结论、局限性和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）异欧前胡素（ISO）通过miR-3619调控CSTB和CSTD诱导角质形成细胞黑色素降解的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 ISO调控HaCaT细胞黑色素降解的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.3 试剂配置 |
| 3 方法 |
| 3.1 细胞体外培养 |
| 3.2 黑素小体分离纯化 |
| 3.3 MTT法细胞活力检测 |
| 3.4 蛋白质样品制备 |
| 3.5 BC A法蛋白质含量测定 |
| 3.6 Elisa法细胞黑色素含量测定 |
| 3.7 Western Blot |
| 3.8 溶酶体酶活力检测 |
| 3.9 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 ISO对 HaCaT细胞增殖的影响 |
| 4.2 ISO对 HaCaT细胞黑色素含量的影响 |
| 4.3 ISO对 HaCaT细胞PMEL17蛋白表达的影响 |
| 4.4 ISO对 HaCaT细胞溶酶 体酶 活力的影响 |
| 4.5 ISO对 HaCaT细胞溶酶 体酶 表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二章 CTSB和 CTSD调控HaCaT细胞黑色素降解的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.3 试剂配置 |
| 3 方法 |
| 3.1 干扰载体构建 |
| 3.2 质粒提取 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 qPCR |
| 3.5 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 CTSB基因干扰效率检测 |
| 4.2 干扰CTSB基因对HaCaT细胞黑色素含量的影响 |
| 4.3 干扰CTSB基因对HaCaT细胞PMEL17蛋白表达的影响 |
| 4.4 CTSD基因干扰效率检测 |
| 4.5 干扰CTSD基因对HaCaT细胞黑色素含量的影响 |
| 4.6 干扰CTSD基因对HaCaT细胞PMEL17蛋白表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 miR-3619调控HaCaT细胞黑色素降解的分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 miRNAs预测 |
| 3.2 miRNAs表达检测 |
| 3.3 萤光素酶载体构建 |
| 3.4 突变型载体构建 |
| 3.5 萤光素酶活性检测 |
| 3.6 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 CTSB和 CTSD基因上游调控miRNAs预测与筛选结果 |
| 4.2 ISO对 HaCaT细胞中候选miRNA表达的影响 |
| 4.3 miR-3 619 过表达和沉默效果检测 |
| 4.4 miR-3 619对HaCaT细胞CSTB和 CSTD蛋白表达的影响 |
| 4.5 miR-3 619对HaCaT细胞黑色素含量的影响 |
| 4.6 miR-3 6 19对HaCaT细胞PMEL 17蛋白表达的影响 |
| 4.7 miR-3 619对CTSB和 CTSD萤光素酶报告基因活性的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A: 异欧前胡素结构示意图 |
| 附录 B: psi- CHECK-2载体结构示意图 |
| 附录 C: pLVX- ShRNA2 -Puro载体结构示意图 |
| 综述:黑色素代谢及中医药美白剂研究进展 |
| 参考文献 |
（7）LNC＿000052调节骨髓间充质干细胞生物学行为的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:去卵巢骨质疏松组与假手术组大鼠骨髓间充质干细胞转录组测序及LNC＿000052的功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 去卵巢骨质疏松组大鼠和假手术组大鼠模型的建立 |
| 2.2.2 原代骨髓间充质干细胞的提取和培养 |
| 2.2.3 骨髓间充质干细胞的鉴定 |
| 2.2.4 去卵巢骨质疏松组与假手术组大鼠造模效果的鉴定 |
| 2.2.5 去卵巢骨质疏松组与假手术组的骨髓间充质干细胞全转录组测序 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 细胞转染与感染 |
| 2.2.9 CCK-8细胞增殖实验 |
| 2.2.10 Edu细胞增殖实验 |
| 2.2.11 细胞凋亡检测实验 |
| 2.2.12 细胞周期检测实验 |
| 2.2.13 Transwell细胞迁移实验 |
| 2.2.14 成骨分化实验 |
| 2.2.15 实验统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 去卵巢骨质疏松组与假手术组骨髓间充质干细胞符合鉴定标准 |
| 3.2 去卵巢骨质疏松组与假手术组大鼠造模效果的鉴定 |
| 3.3 去卵巢骨质疏松组与假手术组骨髓间充质干细胞转录组测序结果 |
| 3.4 LNC_000052对骨髓间充质干细胞增殖、迁移、凋亡以及细胞周期和成骨分化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LNC＿000052通过miR-96-5p-PIK3R1影响骨髓间充质干细胞的生物学行为的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛋白质提取、浓度测定及变性 |
| 2.2.2 Western blot实验 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 免疫荧光实验 |
| 2.2.5 双荧光素酶报告基因检测实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 miR-96-5p和PIK3R1在去卵巢骨质疏松组和假手术组骨髓间充质干细胞中差异表达 |
| 3.2 miR-96-5p对骨髓间充质干细胞增殖、迁移、凋亡以及细胞周期和成骨分化的影响 |
| 3.3 miR-96-5p通过PIK3R1影响骨髓间充质干细胞的生物学行为 |
| 3.4 LNC＿000052通过miR-96-5p/PIK3R1影响骨髓间充质干细胞的生物学行为 |
| 3.5 LNC＿000052与miR-96-5p、miR-96-5p与PIK3R1之间存在靶向调控关系 |
| 3.6 抑制miR-96-5p可以阻断si-LNC＿000052对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:敲低LNC＿000052与过表达miR-96-5p后的骨髓间充质干细胞可以提升对骨质疏松的治疗作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞转染与感染 |
| 2.2.2 骨髓间充质干细胞移植 |
| 2.2.3 血清学检测 |
| 2.2.4 形态计量学检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 骨髓间充质干细胞移植后血清ALP水平升高 |
| 3.2 骨髓间充质干细胞移植后骨小梁增多增厚,脂肪空泡减少 |
| 3.3 骨髓间充质干细胞移植后骨体积/组织容积升高 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 综述 调节骨髓间充质干细胞分化治疗骨质疏松的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1.前列腺癌(Prostate Cancer,PCa) |
| 1.1 PCa的发病率和死亡率 |
| 1.2 PCa发病的遗传因素 |
| 1.3 PCa发生发展的分子机制 |
| 2.miRNAs与PCa |
| 2.1 MicroRNA与表观遗传 |
| 2.2 miRNA的表观遗传调控和PCa的关系 |
| 2.3 PCa中具有癌基因作用的miRNAs |
| 2.4 PCa中具有抑癌基因作用的miRNAs |
| 2.5 miRNAs在PCa诊断、治疗中的应用 |
| 3.14-3-3蛋白 |
| 3.1 14-3-3蛋白的结构与分子功能 |
| 3.2 14-3-3蛋白的细胞生物学功能 |
| 3.3 14-3-3蛋白与肿瘤 |
| 4.14-3-3蛋白与PCa |
| 4.1 通过自身表观遗传学修饰在PCa中发挥作用 |
| 4.2 通过影响与PCa发生相关的关键蛋白的细胞定位发挥作用 |
| 4.3 通过提高或降低自身表达水平发挥作用 |
| 5.本研究目的意义 |
| 6.研究技术路线 |
| 第一章 14-3-3ε在 PCa组织和细胞中的表达及其对22Rv1细胞增殖的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 14-3-3ε基因荧光定量PCR引物的设计和合成 |
| 3.2 14-3-3ε基因siRNA的设计及合成 |
| 3.3 细胞培养和细胞转染 |
| 3.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 3.5 细胞蛋白提取及Western blotting检测 |
| 3.6 CCK-8试验检测细胞的增殖能力 |
| 3.7 Transwell试验检测细胞的侵袭能力 |
| 3.8 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力 |
| 3.9 数据分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 14 -3-3ε基因在PCa组织和细胞中呈明显上调趋势 |
| 4.2 siRNA-4对14-3-3ε基因具有较强的干扰效率 |
| 4.3 干扰14-3-3ε基因对PCa细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第二章 调控14-3-3ε表达的microRNAs筛选及功能验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 miRNAs筛选及序列合成 |
| 3.2 引物设计及序列信息 |
| 3.3 细胞转染及qRT-PCR试验 |
| 3.4 双荧光素酶试验筛选调控14-3-3ε表达的最佳miRNAs |
| 3.5 CCK-8试验检测5条miRNA对22Rv1细胞的增殖能力 |
| 3.6 miR-31-5p与14-3-3ε相互作用位点的鉴定 |
| 3.7 统计学处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 生物在线软件筛选调控14-3-3ε基因的microRNAs |
| 4.2 五条候选microRNAs在 PCa细胞中的表达 |
| 4.3 五条miRNAs在 PCa各细胞系中转染效率检测 |
| 4.4 五条miRNAs对14-3-3ε表达的影响 |
| 4.5 靶向调控14-3-3ε基因的miRNAs的筛选及鉴定 |
| 4.6 miR-31-5p与14-3-3ε/3’UTR具有直接相互作用 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第三章 miR-31-5p调控14-3-3ε对22Rv1细胞表型的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 质粒和菌株 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 miR-31-5p不同miRNA浓度的细胞转染 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 Western blot检测细胞转染效率 |
| 3.5 CCK-8检测细胞增殖试验 |
| 3.6 Transwell试验 |
| 3.7 细胞划痕试验 |
| 3.8 细胞周期试验 |
| 3.9 细胞凋亡试验 |
| 3.10 统计学处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 miR-31-5p转染24h后转染效率检测 |
| 4.2 miR-31-5p不同转染浓度对14-3-3ε表达的影响 |
| 4.3 miR-31-5p对22Rv1细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 4.4 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞增殖能力的影响 |
| 4.5 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞侵袭能力的影响 |
| 4.6 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞迁移能力的影响 |
| 4.7 共转染miR-31-5p与对22Rv1细胞周期的影响 |
| 4.8 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞凋亡的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第四章 miR-31-5p调控14-3-3ε对 PI3K/Akt/Bcl-2 信号通路的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系及质粒载体 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 细胞转染 |
| 3.2 Western blot检测细胞转染效率 |
| 3.3 数据统计 |
| 4.结果 |
| 4.1 miR-31-5p调控14-3-3ε对 PI3K/AKT/m TOR信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.2 miR-31-5p调控14-3-3ε对 BCL-2 信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.3 miR-31-5p调控14-3-3ε影响22Rv1细胞增殖和凋亡的分子机制 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ:在读博士期间取得的科研成果 |
| 附录Ⅱ:论文涉及的试剂配方 |
（9）SEMA3C错义突变在肝癌发生发展中的作用和机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1.肝癌 |
| 2.SEMA3C与肿瘤 |
| 2.1 SEMA3C蛋白简介 |
| 2.2 SEMA3C在发育中的功能 |
| 2.3 SEMA3C在癌症和癌干细胞中的作用 |
| 2.4 SEMA3C受体在癌变中的作用 |
| 2.5 针对SEMA3C及其受体的治疗策略 |
| 第一章 SEMA3C在肝癌患者中的突变情况以及过表达载体和稳转株的构建 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 组织样本和细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 SEMA3C在肝癌临床组织样本中突变情况 |
| 2.2 SEMA3C在不同肝癌细胞系中的表达情况 |
| 2.3 SEMA3C过表达稳转株的构建 |
| 3.讨论 |
| 第二章 过表达SEMA3C对肝癌细胞体外功能的影响 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验样本细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 过表达SEMA3C对肝癌细胞增殖的影响 |
| 2.2 过表达SEMA3C对肝癌细胞克隆形成的影响 |
| 2.3 过表达SEMA3C对肝癌细胞迁移的影响 |
| 2.4 过表达SEMA3C对肝癌细胞凋亡的影响 |
| 3.讨论 |
| 第三章 SEMA3C影响RTK通路 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验样本细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 过表达SEMA3C激活RTK通路 |
| 2.2 SEMA3C的6个受体的敲低稳转株的构建 |
| 2.3 SEMA3C通过受体PLXND1和PLXNB1 激活RTK通路 |
| 3.讨论 |
| 第四章 Vandetanib通过RTK抑制肝癌生长 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验动物和细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 肝癌细胞对Vandetanib的 IC50值 |
| 2.2 Vandetanib对肝癌细胞RTK通路的影响 |
| 2.3 Vandetanib抑制肝癌皮下瘤的生长 |
| 2.4 Vandetanib通过抑制RTK通路蛋白抑制肝癌体内生长 |
| 2.5 Vandetanib的安全性评价 |
| 3.讨论 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 潜在的应用价值 |
| 文献综述 SEMA3C在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）大白猪胴体性状全基因组关联分析及遗传参数估计（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 影响猪胴体性状的主要因素 |
| 1.2.1 遗传因素 |
| 1.2.2 非遗传因素 |
| 1.3 遗传参数估计概况 |
| 1.3.1 遗传力 |
| 1.3.2 遗传相关 |
| 1.3.3 遗传参数的研究进展 |
| 1.4 猪胴体性状的研究进展 |
| 1.4.1 猪基因组草图 |
| 1.4.2 猪胴体性状QTL |
| 1.5 全基因组关联分析 |
| 1.5.1 全基因组关联分析(GWAS)的研究背景 |
| 1.5.2 GWAS的统计分析方法 |
| 1.5.3 GWAS试验设计 |
| 1.5.4 GWAS多重假设检验校正 |
| 1.5.5 GWAS的优点与不足 |
| 1.5.6 猪GWAS的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 胴体性状数据处理及非遗传因素相关分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验数据 |
| 2.2.1 数据来源 |
| 2.2.2 数据整理 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 数据分析软件 |
| 2.3.2 胴体性状表型值统计分析及正态分布检验 |
| 2.3.3 固定效应的划分 |
| 2.3.4 统计分析模型 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 表型数据描述性统计及正态分布检验 |
| 2.4.2 非遗传因素分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 年份效应对胴体性状的影响分析 |
| 2.5.2 性别效应对胴体性状的影响分析 |
| 2.5.3 胎次效应对胴体性状的影响分析 |
| 2.5.4 季节效应对胴体性状的影响分析 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 大白猪胴体性状遗传参数估计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料与方法 |
| 3.2.1 数据整理 |
| 3.2.2 构建遗传参数估计文本 |
| 3.2.3 系谱文件整理与数据文本格式转化 |
| 3.2.4 遗传力估计 |
| 3.2.5 遗传相关参数估计 |
| 3.2.6 表型相关计算 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 大白猪胴体性状的描述性统计及遗传力参数估计 |
| 3.3.2 大白猪胴体性状间的遗传相关与表型相关比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 胴体性状遗传力估计 |
| 3.4.2 胴体性状间的遗传与表型相关 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于全基因组关联分析筛选与猪胴体性状相关候选基因 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料与方法 |
| 4.2.1 试验动物和数据来源 |
| 4.2.2 试验试剂和仪器 |
| 4.2.3 样品采集和DNA提取 |
| 4.2.4 表型数据收集 |
| 4.2.5 文库构建与测序 |
| 4.2.6 SNP检测与分型 |
| 4.2.7 主成分分析 |
| 4.2.8 关联分析方法 |
| 4.2.9 单倍型分析 |
| 4.2.10 功能注释 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 表型数据描述性统计 |
| 4.3.2 SNP标记在每条染色体上的分布及平均距离 |
| 4.3.3 SNP注释 |
| 4.3.4 主成分分析 |
| 4.3.5 基于SNP的系统进化树 |
| 4.3.6 显着关联SNP和候选基因 |
| 4.3.7 候选基因及GO和 KEGG分析 |
| 4.3.8 单倍型分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 单倍型分析 |
| 4.4.2 候选基因的筛选 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 候选基因SNP筛选与关联分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 试验样品及数据来源 |
| 5.2.2 主要试验试剂与仪器 |
| 5.2.3 使用软件 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 DNA提取 |
| 5.3.2 引物设计和PCR扩增 |
| 5.3.3 引物特异性检测和筛选最适温度 |
| 5.3.4 飞行时间质谱技术对SNP位点进行分型 |
| 5.3.5 群体遗传学统计分析 |
| 5.3.6 候选基因SNP位点与胴体性状的关联分析 |
| 5.4 试验结果与分析 |
| 5.4.1 大白猪DNA质量检测结果 |
| 5.4.2 检测引物特异性和筛选最适温度 |
| 5.4.3 候选基因SNP位点的筛选及位置的确定 |
| 5.4.4 质谱分型结果 |
| 5.4.5 候选基因SNP位点的群体遗传学分析 |
| 5.4.6 候选基因多态性位点与对应胴体性状的关联分析 |
| 5.4.7 SNP位点单倍型分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 ANKRD55 基因SNP位点与对应胴体性状进行关联分析 |
| 5.5.2 GPX8 基因SNP位点与对应胴体性状进行关联分析 |
| 5.5.3 SLC38A9 基因SNP位点与对应胴体性状进行关联分析 |
| 5.5.4 DDX4 基因SNP位点与对应胴体性状进行关联分析 |
| 5.5.5 单倍型关联分析 |
| 5.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、突变型β-连环蛋白基因对肝细胞增殖的影响（论文参考文献）
- [1]miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究[D]. 叶善平. 南昌大学, 2021(01)
- [2]MicroRNA-126-5p在骨质疏松中的调控作用及机制研究[D]. 孙海涛. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [3]假基因UBDP1竞争性结合microRNA调控胶质母细胞瘤恶性增殖侵袭的机制研究[D]. 洪帆. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]长链非编码RNA MYLK-AS1内源性竞争结合miR-141-3p上调CDC25A促进肝细胞肝癌进展的机制研究[D]. 王宁宁. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
- [6]异欧前胡素（ISO）通过miR-3619调控CSTB和CSTD诱导角质形成细胞黑色素降解的作用研究[D]. 李凯. 湖南中医药大学, 2021
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- [10]大白猪胴体性状全基因组关联分析及遗传参数估计[D]. 黄叶. 广西大学, 2020