一、含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达（论文文献综述）
赵金[1]（2021）在《BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制》文中研究说明陕北白绒山羊是利用辽宁绒山羊与陕北黑山羊杂交选育的绒肉兼用型优质绒山羊品种,具有产绒量高、绒质优、耐粗饲和抗逆性强等优点。众所周知,母羊产羔率等繁殖性状作为绒山羊的重要经济性状之一,直接影响了其生产效率和经济效益。因此,研究影响绒山羊母羊产羔率的生物学机制,对提高绒山羊的养殖收益具有重要实践价值,也在山羊繁殖性能调控机制等基础研究中具有重要理论意义。母羊的产羔率是由多基因调控的复杂过程,其中骨形态发生蛋白受体1B（bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B）基因作为影响山羊产羔性状的候选基因,在陕北白绒山羊卵泡发育过程中的表达规律,影响BMPR1B基因表达的调控因素,以及BMPR1B调控卵泡发育的生物学机制等方面尚不清楚。本研究以陕北白绒山羊卵巢、卵泡以及卵泡颗粒细胞为研究对象,克隆BMPR1B基因并做生物信息学分析和遗传学分析,应用免疫组织化学技术、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应技术、蛋白质印迹技术、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷掺入技术、酶联免疫吸附剂测定技术、流式细胞术等研究了BMPR1B基因在陕北白绒山羊卵泡发育过程中的表达规律和影响其表达的调控因素;再通过包装慢病毒过表达BMPR1B、sh RNA干扰BMPR1B表达等方法,从颗粒细胞层面揭示了骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）通过受体BMPR1B影响陕北白绒山羊颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成、分泌的分子调控机制。获得的主要研究结果如下:1.克隆陕北白绒山羊BMPR1B基因并进行序列分析。以陕北白绒山羊卵巢总RNA反转录的c DNA为模板,克隆出BMPR1B基因CDS区,测序得到该基因全长1509 bp。蛋白跨膜区分析表明BMPR1B属于跨膜蛋白,包含TGFβ家族I型受体特有的丝氨酸/苏氨酸（Gly/Ser）激酶结构域。2.对BMPR1B基因在陕北白绒山羊生殖系统中的表达模式和特点进行分析。BMPR1B在陕北白绒山羊子宫、卵巢和输卵管中均有表达且存在差异,其中卵巢的相对表达量最高,其次是输卵管,在子宫中表达量最低。BMPR1B在各发育阶段的卵泡和黄体内均有表达,其丰度随着卵泡发育成熟逐渐升高,在黄体内略有下降但仍维持较高的表达水平。BMPR1B在卵泡颗粒细胞和卵母细胞内均有表达,在颗粒细胞中的表达显着高于卵母细胞。BMPR1B基因与产羔数密切相关,在多羔母羊卵巢组织中的表达量显着高于单羔母羊。3.从细胞水平分析了BMP15对BMPR1B的调控作用。通过向体外培养的陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞添加外源BMP15,证实BMP15可调控其I型受体BMPR1B和II型受体BMPR2的表达,并通过抑制BMPR1B基因的负调控mi RNA,mi R-125b的表达来上调BMPR1B基因的表达水平。4.研究证明BMP15通过受体BMPR1B激活MAPK通路调控山羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡。BMP15通过BMPR1B使得下游MAPK信号通路中ERKs磷酸化水平升高,激活MAPK ERK信号通路,上调细胞周期蛋白Cyclin E和周期蛋白依赖性激酶CDK2的表达,增加处于细胞周期S期细胞的比例,促进卵泡颗粒细胞的增殖;上调抑凋亡基因Bcl2的表达并下调促凋亡基因Bax和凋亡关键基因Caspase-3的表达,阻断细胞的凋亡途径,抑制颗粒细胞凋亡。5.研究证明BMP15通过受体BMPR1B激活Smad通路调控山羊卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及分泌。BMP15通过BMPR1B使得下游Smad信号通路中Smad1/5/8蛋白磷酸化水平和Smad4蛋白表达水平升高,激活Smad信号通路,上调FSHR的表达水平,进而诱导类固醇激素合成相关基因St AR、CYP11A1和CYP19A1的表达,促进卵泡颗粒细胞E2、P4的合成和分泌。综上所述,本研究通过研究体外培养的山羊颗粒细胞,构建了BMP15通过BMPR1B对颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的调控网络,揭示了BMP15通过受体BMPR1B调控绒山羊卵泡发育及闭锁的分子机制,为深入研究提高山羊繁殖力提供了新的实验依据,为提高陕北白绒山羊的繁殖性能提供理论和技术指导。
陈艳霞[2]（2020）在《LncRNA-SNHG29/miR-200b-3p调控Klotho/FGF23轴介导血管钙化的机制研究》文中指出研究背景:高血压肾病、糖尿病肾病等继发性肾脏疾病的发病率逐年增多[1],且随着慢性肾小球肾炎等原发性肾脏疾病的进展,最终引起肾脏功能不可逆衰退的终末阶段,我们称之为终末期肾脏病（End-Stage Renal Disease,ESRD）。而ESRD患者只能依赖肾移植、血液透析或腹膜透析等肾脏替代治疗方式维持生命,生存率、生活质量严重下降,同时也增加家庭、社会以及国家的负担[2],且该疾病具有预后差、花费高、耗时长等特点,在全球范围内严重危害人类的健康。由于肾移植受肾源的影响,绝大部分ESRD患者只能靠血液透析或腹膜透析维持生命,血液透析治疗或腹膜透析治疗虽延长了ESRD患者的生存时间,但其急性并发症、慢性并发症严重威胁了ESRD患者的生命,特别是心血管疾病（Cardiovascular Diseases,CVD）并发症。国内外研究表明,超过50%的ESRD患者的最终死因为CVD[3],导致CVD发病率与死亡率增加的一个重要的原因就是血管钙化（Vascular Calcification,VC）[4]。VC在ESRD患者中非常普遍,ESRD患者一旦进入血液透析治疗或是腹膜透析治疗,VC的进展就会加速,而且VC的存在和程度可作为心血管事件发生以及死亡的最有力的独立预测因子[5]。对于ESRD患者,引起VC的始动因素为钙磷代谢的失衡[6],VC的发生受多种因素的调控,其关键的因素为血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs）向成骨细胞发生转分化[7]。促进VMSCs向成骨细胞发生转分化的危险因素之一就是高磷[8]。ESRD患者的慢性并发症中高磷血症非常常见,因此研究高磷血症与VC的机制非常有临床意义。有研究表明,成纤维细胞生长因子23（Fibroblast Growth Factor 23,FGF23）与VC密切相关[9],但是FGF23在VC中是否作为一个标志物,以及在VC中作为抑制因素或促进因素存在,目前尚无定论。在非慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）或CKD早期,FGF23升高增加尿磷排泄,抑制维生素D、甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone,PTH）代谢,维持体内钙磷代谢平衡,显示出对心血管的保护作用。但是随着CKD病情恶化,进展到ESRD阶段,伴随肾小球滤过率（Glomerular Filtration Rate,GFR）的下降,肾脏表达Klotho明显减少。CKD患者VC与Klotho缺乏状态直接相关,Klotho是VC的抑制因子,ESRD患者的机体对FGF23呈现一种抵抗状态,FGF23对钙磷的调节作用减弱甚至消失,导致机体钙磷代谢紊乱,加上继发性甲状旁腺机能亢进以及维生素D缺乏的不良反应,机体对于骨矿物质的代谢呈现整体失衡的状态,一系列的紊乱及失衡促进VC的发生和发展。结合已有的文献报道Wnt/β-catenin信号通路的活化促进了VMSCs的成骨分化与钙化过程[10]。然而,关于Klotho/FGF23轴是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路中的相关信号分子,进而介导VMSCs的成骨分化与钙化,尚未见研究报道,因此本研究首先拟采用β-磷酸甘油酯（β-glycerol phosphate,β-GP）体外诱导VMSCs钙化,探讨Klotho/FGF23对其钙化的影响及其可能机制。长链非编码RNA（lnc RNA）定义为转录的RNA分子家族,具有200个以上的核苷酸,但没有蛋白质编码能力,与生物学发展、细胞生理学和各种疾病的进展相关[11]。lnc RNA的主要工作机制是与多种蛋白质和micro RNA（mi RNA）相互作用。据报道,小核仁RNA宿主基因29（Small Nucleolar RNA Host Gene 29,SNHG29）参与骨肉瘤、结直肠癌的发生[12]。有研究表明SNHG29减弱了VMSCs的钙化并降低了成骨相关因子的表达,是血管钙化的负调节剂。但是,没有提供有关特定调节机制的信息。因此,尚不清楚SNHG29在VC中的作用。mi R-200b-3p参与了不同疾病（如肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌等）中的多种调控机制[13,14]。最近,Kong证实在退化性动脉粥样硬化的动脉中存在高度表达的mi R-200b-3p[15]。但mi R-200b-3p在VMSCs中的作用不明确。我们采用生物学信息软件Starbase进行预测发现Lnc RNA-SNHG29与mi R-200b-3p具有可结合区域,同时mi R-200b-3p与α-Klotho也具有可结合区域,且有研究发现Lnc RNA-SNHG29在钙化的VMSCs中表达下调,作为VC的负调节因子。另外,在高磷酸盐诱导的大鼠主动脉外植体钙化中,mi R-200c表达上调;在主动脉瓣钙化导致的主动脉狭窄疾病中,mi R-200b表达上调,但其在VMSCs钙化中的具体分子作用机制目前尚不清楚,以上均提示lnc RNA在VC中起着重要作用,但Lnc RNA-SNHG29在VC中的具体作用机制不清楚。结合查阅相关文献及生物学信息软件Starbase的预测分析,我们推测Lnc RNA-SNHG29通过靶向下调mi R-200-3p激活α-Klotho介导的信号通路参与VMSCs的钙化,因此,本研究在探讨Klotho/FGF23对其钙化的影响及其可能机制后,拟进行深入研究Lnc RNA-SNHG29/mi R-200-3p调控Klotho/FGF23介导的血管钙化的机制研究,试图为Lnc RNA-SNHG29作为VC相关疾病的新型治疗靶点提供实验依据。第一部分:Klotho与FGF23在β-GP诱导VMSCs钙化过程中作用目的:体外培养VMSCs,采用10m Mβ-GP进行诱导,建立VMSCs钙化模型,探讨Klotho与FGF23在β-GP诱导VMSCs钙化过程中表达水平以及分别过表达Klotho和FGF23对β-GP诱导VMSCs钙化的影响。方法:1、提取大鼠胸主动脉VMSCs进行原代细胞培养,进行VMSCs鉴定后自然纯化法进行传代培养用于实验研究,采用10m Mβ-GP刺激VMSCs诱导钙化。实验分NP组与HP组,探索β-GP诱导VMSCs钙化的最佳时间;采用茜素红染色观察NP组和HP组两个实验组第0、5、9、12d细胞中的钙化情况,同时对NP组和HP组两个实验组第0、5、9、12d的细胞内钙进行测定,q RT-PCR检测NP组和HP组两个实验组中Klotho与FGF23m RNA的表达,Western blot检测NP组和HP组两个实验组中Klotho与FGF23蛋白的表达。2、构建过表达Klotho、FGF23的重组腺病毒,使用q RT-PCR及Western blot法检测方法进行过表达Klotho、FGF23基因的验证;实验分为5组:NP组、HP组、HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组;茜素红染色检测各组细胞的钙化情况;对各实验组VMSCs进行细胞内钙含量分析并检测各实验组VMSCs细胞中碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）活性的情况。结果:1、β-GP诱导VMSCs促进钙化具有时间依赖性,随着时间的延长,VMSCs钙化更加明显;细胞内钙含量呈时间依赖性逐渐增多,干预第9d时VMSCs细胞内钙的含量较第0d时增多,干预第12d时VMSCs细胞内钙的含量较第0d时显着增多;考虑细胞活性及细胞钙化的需求,我们以β-GP处理VMSCs 12d作为后续实验的时间点;β-GP诱导VMSCs后,其Klotho与FGF23m RNA的表达及Klotho与FGF23蛋白的表达均下调。2、过表达VMSCs细胞的Klotho基因后,VMSCs细胞中Klothom RNA及Klotho蛋白的表达上调,过表达VMSCs细胞FGF23基因后,VMSCs细胞中FGF23m RNA及FGF23蛋白的表达上调;在β-GP诱导的VMSCs钙化过程中,过表达Klotho基因或FGF23基因后,VMSCs细胞钙化有一定程度的缓解,细胞中钙沉积下降,ALP的活性下降。结论:1、β-GP可诱导VMSCs向成骨细胞转化,促进钙化的发生。2、β-GP诱导VMSCs钙化过程中,Klotho与FGF23的表达下调。3、过表达Klotho和FGF23能减轻β-GP诱导的VMSCs细胞内钙的沉积,降低ALP的活性,抑制β-GP诱导的VMSCs发生钙化。第二部分:Klotho/FGF23调控β-GP诱导VMSCs钙化的机制目的:探讨FGF23/Klotho轴调控β-GP诱导VMSCs钙化的机制。方法:1、实验分为2组,NP组与HP组,细胞培养干预时间为12d,qRT-PCR检测NP组和HP组两个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关基因RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA m RNA的表达,Western blot检测NP组和HP组两个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA、Klotho、FGF23蛋白的表达。2、构建Klotho、FGF23的腺病毒过表达载体,实验分为3组,HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组;细胞培养干预时间为12d。q RT-PCR检测HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组3个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关基因RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA m RNA的表达,Western blot检测HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组3个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA、Klotho、FGF23蛋白的表达。3、沉默Klotho、FGF23基因的表达,采用qRT-PCR检测和Western blot进行Klotho m RNA、FGF23 m RNA及Klotho、FGF23蛋白表达的进行基因沉默的验证;实验分组为7组:NP组、HP组、HP+DKK1组、HP+sh Klotho组、HP+sh FGF23组、HP+sh Klotho+DKK1组、HP+sh FGF23+DKK1组,细胞培养干预时间为12d。q RT-PCR检测7个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关基因RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA m RNA的表达,Western blot检测7个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA蛋白的表达。结果:1、在β-GP诱导VMSCs促进钙化的过程中,Wnt/β-catenin信号通路被激活,Wnt7b、β-catenin m RNA的表达及Wnt7b、β-catenin蛋白的表达上调,Klotho、FGF23蛋白的表达下调;VMSCs向成骨细胞转化,成骨细胞特异性标志物RUNX2、BMP9 m RNA的表达及RUNX2、BMP9蛋白的表达上调;VMSCs特异性表达标志物α-SMA m RNA的表达及α-SMA蛋白下调。2、在β-GP诱导VMSCs促进钙化的过程中,过表达Klotho基因或FGF23基因后,Wnt7b、β-catenin、RUNX2、BMP9 m RNA的表达及Wnt7b、β-catenin、RUNX2、BMP9蛋白的表达下调,α-SMA m RNA及α-SMA蛋白的表达上调。3、在β-GP诱导VMSCs促进钙化的过程中,沉默Klotho基因或FGF23基因的表达,Klothom RNA、FGF23m RNA、Klotho、FGF23蛋白的表达下调;Wnt/β-catenin信号通路被激活,Wnt7b、β-catenin m RNA及Wnt7b、β-catenin蛋白的表达上调,RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin m RNA及RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin蛋白表达上调,α-SMA m RNA及α-SMA蛋白的表达下调;予以DKK1阻断Wnt/β-catenin后,VMSCs的钙化有明显缓解,RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin m RNA及RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin蛋白表达下降,α-SMA m RNA及α-SMA蛋白的表达上调。结论:Klotho/FGF23通过Wnt/β-catenin信号通路调控β-GP诱导的VMSCs钙化。第三部分:Lnc RNA-SNHG29下调mi R-200b-3p参与Klotho/FGF23介导血管钙化的机制目的:前面两个部分的研究显示Klotho、FGF23对β-GP诱导的VMSCs钙化具有保护作用,且Klotho/FGF23通过Wnt/β-catenin信号通路调控其钙化。为深入研究Klotho/FGF23的调控机制,我们采用生物学信息软件Starbase进行预测发现Lnc RNA-SNHG29与mi R-200b-3p具有可结合区域,同时mi R-200b-3p与α-Klotho也具有可结合区域,且有研究发现Lnc RNA-SNHG29在钙化的血管平滑肌细胞中表达下调,作为VC的负调节因子。另外,在高磷酸盐诱导的大鼠主动脉外植体钙化中,mi R-200c表达上调;在主动脉瓣钙化导致的主动脉狭窄疾病中,mi R-200b表达上调,但其在血管平滑肌钙化中的具体分子作用机制目前尚不清楚,以上均提示lnc RNA在VC中起着重要作用,但Lnc RNA-SNHG29在VC中的具体作用机制不清楚。在前期研究结果的基础上结合Starbase软件预测发现,我们假设Lnc RNA-SNHG29靶向mi R-200b-3p、mi R-200b-3p靶向α-Klotho对VMSCs的钙化进行调节,本部分实验将阐明Lnc RNA-SNHG29与mi R-200b-3p的关系、mi R-200b-3p与α-Klotho的关系,及其在VMSCs钙化中的调节作用,为VC的治疗提供新策略。方法:1、采用10m Mβ-GP刺激人主动脉血管平滑肌细胞（Human aortic smooth muscle cells,HASMC）体外构建钙化模型,MTT测定干预后第0,3,6,9,12,15d HASMC的活性;采用茜素红染色观察第0,3,6,9,12,15d HASMC钙化的情况,对第0,3,6,9,12,15d HASMC的细胞内钙含量进行测定,Western blot检测第0,3,6,9,12,15d HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA蛋白的表达,q RT-PCR检测第0,3,6,9,12,15d HASMC中SNHG29、mi R-200b-3p的表达;2、采用10m Mβ-GP刺激HASMC诱导钙化,构建pc DNA3.1-SNHG29质粒及SNHG29空载质粒,q RT-PCR检测HASMC中SNHG29m RNA的表达;实验分为四组:NP组、HP组、HP+pc DNA3.1组、HP+pc DNA3.1-SNHG29组;采用茜素红染色观察各组HASMC钙化的情况,并检测各组HASMC的细胞内钙含量及细胞中ALP的活性;Western blot检测各组HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA蛋白的表达。3、使用生物学信息软件Starbase进行预测mi R-200b-3p是否为SNHG29的潜在靶标,双荧光素酶报告基因检测SNHG29与mi R-200b-3p的靶标关系。实验分四组:NP组、HP组、HP+inhibitor组、HP+mi R-200b-3p inhibitor组。采用茜素红染色观察各组HASMC钙化的情况,并检测各组HASMC的细胞内钙含量及ALP的活性;Western blot检测各组HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA蛋白的表达。4、使用生物学信息软件Starbase进行预测α-Klotho是否为mi R-200b-3p的潜在靶标。双荧光素酶报告基因检测α-Klotho与mi R-200b-3p的靶标关系。实验分四组:mimics NC组、mi R-200b-3p mimics组、inhibitor NC组、NP组、mi R-200b-3p inhibitor组。q RT-PCR检测各组α-Klotho、FGFR1、FGF23 m RNA的表达,Western blot检测各组α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白的表达。5、为探讨mi R-200b-3p的过表达和α-Klotho的沉默表达对SNHG29过表达对β-GP诱导HASMC钙化的抑制作用的影响及SNHG29下调mi R-200b-3p对α-Klotho/FGF23轴的影响。本部分实验分为6组:HP+pc DNA3.1组、HP+pc DNA3.1-SNHG29组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+mimics NC组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+mi R-200b-3p mimics组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+sh-NC组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+sh-α-klotho组。采用茜素红染色观察各组HASMC钙化的情况,并检测各组HASMC的细胞内钙含量及细胞中ALP的活性;q RT-PCR检测各组α-Klotho、FGFR1、FGF23 m RNA的表达,Western blot检测各组HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA、α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白的表达。结果:1、体外β-GP诱导HASMC钙化过程中,随着暴露钙化时间的延长,细胞活性逐渐下降,钙含量逐渐增加,RUNX2、BMP2表达上调,α-SMA表达下调,HASMC向成骨细胞转化。考虑细胞活性及细胞钙化的需求,因此我们以β-GP处理HASMC 12d作为后续实验的时间点。SNHG29、mi R-200b-3p表达呈现相反的趋势,随着HASMC暴露于β-GP环境下的时间延长,mi R-200b-3p的表达逐渐增强。2、体外β-GP诱导HASMC钙化过程中,过表达SNHG29使HASMC钙化减轻,细胞内钙含量下降,ALP的活性下降,RUNX2、BMP2蛋白的表达下调,α-SMA蛋白的表达上调,提示过表达SNHG29可部分逆转β-GP诱导的HASMC钙化。3、生物学信息软件Starbase预测发现SNHG29与mi R-200b-3p具有可结合性,荧光素酶活性分析示mi R-200b-3p的过表达显着降低SNHG29-WT中的荧光素酶信号。SNHG29的表达水平与mi R-200b-3p有直接相关性,呈现明显的负相关。沉默mi R-200b-3p的表达可使β-GP诱导的HASMC钙化减轻,细胞内钙的沉积减少,ALP活性下降,RUNX2、BMP2 m RNA的表达下调,α-SMA蛋白的表达上调。4、生物学信息软件Starbase预测发现α-Klotho与mi R-200b-3p具有可结合性,荧光素酶活性分析示mi R-200b-3p的过表达显着降低α-Klotho WT中的荧光素酶信号。α-Klotho的表达水平与mi R-200b-3p有直接相关性,呈现明显的负相关。过表达mi R-200b-3p,q RT-PCR结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23m RNA下调,Western blot结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白下调;抑制mi R-200b-3p的表达,q RT-PCR结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23m RNA上调,Western blot结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白上调。5、q RT-PCR方法检测验证Sh-α-Klotho的转染效率显示沉默α-Klotho基因,α-Klothom RNA的表达明显下降;SNHG29的过表达显着抑制β-GP诱导的HASMC钙化结节形成,细胞内钙的沉积和ALP活性,但mi R-200b-3p的上调和α-Klotho的下调都可以逆转这种效应,同时也可以逆转钙化模型中过度表达的SNHG29诱导的RUNX2,BMP2的抑制和α-SMA的激活;检测各实验组中涉及的关键调控因子的表达发现升高的SNHG29可促进β-GP诱导的HASMC钙化中α-Klotho、FGFR1和FGF23的表达。然而,当用mi R-200b-3p-mimics或sh-α-Klotho转染时,趋势可被扭转。结论:Lnc RNA-SNHG29可通过下调mi R-200b-3p激活Klotho/FGF23轴抑制β-GP诱导的HASMC的钙化,Lnc RNA-SNHG29可作为VC的治疗的新靶点。
赵绍云[3]（2019）在《PRRT2变异的致病性及病理机制初步探讨》文中认为PRRT2相关疾病（PRRT2-associated disorders）是以PRRT2基因变异为共同分子基础的一类常染色体显性遗传性疾病,主要包括发作性运动诱发性运动障碍（paroxysmal kinesigenic dyskinesia,PKD）、良性家族性婴儿癫痫（benign familial infantile seizures,BFIS）、婴儿惊厥伴舞蹈手足徐动症（infantile convulsions with choreoathetosis,ICCA）、偏瘫性偏头痛（hemiplegicmigraine,HM）、发作性共济失调（episodicataxia,EA）等。原发性 PKD是PRRT2相关疾病最常见的表型。目前为止,已经发现了 100多种PRRT2变异,包括无义变异、错义变异、小片段插入/缺失、剪切位点变异等。90%以上变异可导致终止密码提前出现,是PRRT2基因最常见的致病变异类型。携带错义变异的病例远远少于携带截短变异的病例,对错义变异蛋白的功能研究也寥寥无几,多数错义变异与PRRT2相关疾病的关系仍不明确,给疾病的诊治带来困难。PRRT2是中枢神经系统特异性表达的膜蛋白,通过调节神经元的突触传递和Na+离子通道功能影响神经元的兴奋性。截短变异导致蛋白表达水平下降,亚细胞定位异常。单倍体剂量不足可能是PRRT2相关疾病发生的病理机制。有研究发现2种错义变异（p.A287T和p.R308C）的蛋白表达下降或弥散到细胞浆中。我们团队前期对另2种错义变异（p.R266W和p.G305R）的研究则未发现这种改变。2016年,我们团队利用PKD患者尿上皮细胞构建了诱导多能干（inducedpluripotentstem,iPS）细胞,但发现该细胞向神经元分化的周期长,分化效率较低。有文献表明,iPS细胞携带其原始体细胞的表观遗传记忆,可能对分化等细胞特性有一定影响。目前报道的PKD患者iPS细胞模型的原始体细胞多为皮肤成纤维细胞。本研究中,我们对2017年12月以前国内外报道的PRRT2错义变异进行细胞功能实验,根据 American Col lege of Medical Genetics and Genomics（ACMG）指南对错义变异位点的性质进行判定。对于PRRT2编码区检测阴性的PKD患者,我们进一步筛查PRRT2调控区域序列的变异,并进行相关的功能实验,以探讨这些变异的致病性。同时,我们从变异蛋白的降解角度对PRRT2致病机制进行初步探索,并培养携带PRRT2热点变异患者的皮肤成纤维细胞,重编程为iPS细胞,为进一步探索PRRT2的病理机制奠定了基础。第一部分PR尺T2错义变异的致病性分析目的:通过体外细胞功能实验,评估PRRT2相关疾病中发现的错义变异的致病性。方法:对2017年12月之前国内外报道的PRRT2错义变异进行系统性文献回顾和总结。构建N端含EGFP的真核表达载体,进行体外细胞转染实验。免疫印迹法观察PRRT2蛋白水平变化,在共聚焦显微镜下观察蛋白亚细胞定位变化。根据ACMG指南分析变异的致病性。结果:PRRT2错义变异共29个。有10个错义变异蛋白同时存在蛋白水平减低和蛋白异位,3个变异仅改变蛋白的细胞膜定位,2个变异仅出现蛋白表达水平减低。经过ACMG分类,有 15 个变异（p.S275F、p.P279L、p.W281R、p.A287T、p.A291V、p.R295Q、p.G305W、p.A306T、p.A306D、p.R308C、p.S317N、p.G323R、p.G323E、p.G324R 和 p.G324E）为可能致病变异,3个变异（p.P138A、p.D147H和p.P216L）为良性变异,3个变异（p.S208Y、p.A214P 和 p.P215R）为可能良性变异,而 8 个变异（p.E177K、p.P216R、p.P216H、p.R266W、p.R266Q、p.G305R、p.R311W 和 p.I327M）为意义未明确变异。结论:在已报道的PRRT2错义变异中,51.7%（15/29）的变异可以导致PRRT2相关疾病。致病性变异主要集中在PRRT2蛋白C端,提示该区域具有重要的生理功能。第二部分PRRT2基因UTR变异在PKD中的作用探讨目的:对P尺RT2编码区检测阴性的PKD患者筛查PRRT2 UTR变异,并探讨其致病性。方法:收集PRRT2编码区测序阴性的PKD病例85例,筛查UTR变异。然后构建包含UTR变异的质粒表达载体,进行细胞转染,利用实时荧光定量PCR检测mRNA水平变化,免疫印迹法检测蛋白水平的改变。结果:在85例先证者中,分别在2例患者的3’UTR检测到了 c.*933A>G和c.*978A>G杂合变异,5’UTR未检测出异常。体外细胞实验发现,3’UTR可以明显下调mRNA水平,进而下调蛋白的表达。而c.*933A>G和c.*978A>G变异减弱了 3’UTR的下调能力,在一定程度上调了 PRRT2的mRNA和蛋白水平。结论:PRRT2蛋白功能增加也可能导致疾病的发生。对于PRRT2编码区检测阴性的PKD患者,还需进一步筛查UTR变异。第三部分PRRT2变异蛋白的致病机制初步探索目的:初步探讨PRRT2变异蛋白的致病机制,并建立人成纤维细胞来源的携带PRRT2热点致病变异的iPS细胞模型。方法:将PRRT2热点致病变异及野生型表达载体转染细胞,用蛋白酶体或溶酶体降解抑制剂乳胞素或3-MA分别进行干预,用免疫印迹法检测PRRT2蛋白变化。利用液相色谱-质谱分析联合免疫共沉淀寻找可能参与PRRT2降解的关键蛋白。培养携带PRRT2热点致病变异的人皮肤成纤维细胞,利用仙台病毒重编程试剂盒建立iPS细胞模型,分化为神经元,免疫印迹法检测神经元中PRRT2蛋白水平的改变。结果:乳胞素和3-MA分别干预后,PRRT2变异蛋白增加较野生型蛋白都增多。PRRT2变异蛋白通过蛋白酶体和溶酶体途径降解。PRRT2与E3泛素连接酶AMFR存在相互作用。成功构建携带PRRT2热点致病变异的源于人皮肤成纤维细胞的iPS细胞,并分化为神经元,蛋白水平检测发现PRRT2变异蛋白显着下降。结论:PRRT2变异蛋白降解增多导致蛋白水平的下降。携带PRRT2热点致病变异的源于人皮肤成纤维细胞的iPS细胞是研究PRRT2病理机制的理想模型之一。
李贤玉[4]（2013）在《丝氨酸蛋白酶HtrAl在牙本质形成过程中的作用研究》文中研究说明成牙本质细胞的终末分化、牙本质矿化是一个复杂的过程,该过程由许多分子组成的信号网络共同调控,但目前具体的调控机制尚未完全明确。丝氨酸蛋白酶HtrA1（high-temperature requirement protein A1）与骨矿化进程密切相关。HtrA1促进风湿性关节炎、椎间盘退行性病变等溶骨性疾病的发生,同时在骨生理性矿化过程中起促进或抑制作用。骨形成发生蛋白2（bonemorphogenetic protein-2, BMP-2）为转化生长因子-p（transforming growth proteins-β, TGF-β）家族成员之一,能促进成牙本质细胞的终末分化及牙本质矿化,而基质谷氨酸蛋白（matrix Gla protein, MGP）则在牙本质形成及矿化中起抑制作用。HtrA1能拮抗TGF-β家族成员的表达及信号传递,裂解MGP。目前HtrA1是否参与牙本质的形成尚未明确,我们推测HtrA1可能通过调控BMP-2、 MGP的表达来调节牙本质的形成进程。本课题通过体内体外两部分实验来探讨HtrA1在成牙本质细胞的终末分化及牙本质矿化过程中的作用。第一部分HtrA1在牙发育过程、牙髓-牙本质复合体及修复性牙本质形成过程中的表达研究实验一HtrA1在小鼠牙发育过程中的免疫组化研究目的：观察HtrA1在牙发育过程中的表达分布,初步探讨其在牙发育过程中的作用。方法：制备昆明小鼠磨牙发育各期标本的石蜡切片,免疫组化技术检测HtrA1蛋白在小鼠第一磨牙发育过程中的表达分布。结果：胚胎13.5至16.5天,HtrA1表达在新生牙槽骨基质中；胚胎18.5天,HtrA1在牙槽骨、牙本质基质及牙囊组织中呈阳性表达；HtrA1表达于新生小鼠未矿化的牙槽骨基质、牙本质基质、牙囊及成釉器颈环处细胞；在出生后第5天,HtrA1在未矿化的牙槽骨基质、牙本质基质、牙囊、上皮根鞘及上皮根鞘邻近的牙乳头细胞中呈阳性表达；HtrA1阳性表达在2周龄小鼠的牙周膜、牙囊及未矿化的牙槽骨、前期牙本质中,而在完全矿化的牙槽骨、牙本质组织中不表达；HtrA1阳性表达于3月龄鼠的牙周膜、牙髓细胞及前期牙本质组织中。结论：HtrA1蛋白在小鼠磨牙发育过程具有时空表达特异性,推钡HtrA1可能在小鼠牙周组织及牙本质的形成过程中起作用。实验二HtrA1、BMP-2、MGP在人牙髓-牙本质复合体的表达研究目的：观察HtrA1、BMP-2、MGP在人正常牙冠组织切片中的表达分布,初步探讨三者在牙本质形成过程中的关系及作用。方法：收集临床拔除的健康成年人牙标本,免疫组化技术检测HtrA1、BMP-2及MGP蛋白在牙髓-牙本质复合体中的表达情况。结果：HtrA1、BMP-2、MGP都阳性表达在人牙髓-牙本质复合体的成牙本质细胞中,而不表达在髓腔内的其它细胞。结论：HtrA1、BMP-2及MGP蛋白都表达在人成牙本质细胞中,可能在成牙本质细胞的终末分化及牙本质矿化过程中相互作用。实验三：HtrA1与MGP在大鼠修复性牙本质形成过程中的表达研究目的：观察HtrA1与MGP在修复性牙本质形成过程中的表达与分布,初步探讨二者在该过程中的相互关系及作用。方法：选取20只大鼠行直接盖髓术,分别在0天、7天、14天及21天处死大鼠,分离上颌骨,制备组织切片,HE染色观察牙髓腔内组织学变化,并用免疫组织化学和量子点为基础的免疫荧光双染技术及CRi’s Nuance图象采集系统分析检测HtrA1及MGP蛋白在修复性牙本质形成过程中的表达变化。结果：修复性牙本质形成的量于术后第7天显着增加并持续增长至第21天；HtrA1MGP、nestin及BSP阳性表达于成牙本质细胞、成牙本质样细胞及未完全矿化的牙本质基质中；光谱分析结果表明,HtrA1、MGP的表达在术后第7天显着升高,而在第7天、14天及21天的表达无显着差异,HtrA1、MGP的表达分别与修复性牙本质的平方测量值呈正相关,但是HtrA1与MGP的表达无明显相关性。结论：HtrA1与MGP都参与修复性牙本质的形成过程；二者可能相互作用以调节修复性牙本质的形成。第二部分HtrA1在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用研究实验四HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的表达研究目的：检测HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的表达变化,初步探讨HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的关系与作用。方法：诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化,检测分化过程中矿化结节的形成情况、碱性磷酸酶的活性情况及矿化相关指标ALP、I型胶原及DSP的表达情况,同时检测HtrA1、MGP及BMP-2的表达变化情况。结果：在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中,矿化结节形成的量、碱性磷酸酶的活性及矿化相关因子ALP、I型胶原及DSP的表达显着上调；HtrA1、 BMP-2及MGP的mRNA及蛋白的表达都呈逐渐升高趋势。结论：HtrA1、MGP及BMP-2共同参与人牙髓细胞成牙本质细胞样细胞的分化过程；三者可能在调控牙本质形成过程中相互作用。实验五HtrAl基因抑制后对牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化的影响目的：检测HtrA1基因抑制后矿化结节形成情况和矿化相关基因的表达,同时检测HtrA1、BMP-2及MGP的表达变化,探讨HtrA1在牙本质形成过程中的作用及作用机制。方法：构建两个人HtrA1基因shRNA慢病毒载体,包装病毒后感染人牙髓细胞。矿化诱导感染的牙髓细胞28天,检测HtrA1基因抑制后对矿化结节形成、碱性磷酸酶活性的表达及矿化相关基因的表达的影响,同时检测HtrA1、MGP及BMP-2的表达变化情况。结果：在矿化诱导过程中,与阴性对照组相比,HtrA1基因抑制后显着减少矿化结节的形成,降低碱性磷酸酶的活性,下调矿化相关因子ALP、I型胶原及成牙本质细胞分化标记物DSP的表达。同时,HtrA1基因抑制后下调BMP-2mRNA的表达,上调MGP mRNA及蛋白的表达。结论：HtrA1可以促进人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化及牙本质矿化,它可能通过调控BMP-2及MGP的表达来调节牙本质的形成过程。
周玉娟[5]（2010）在《合浦珠母贝TGFβ信号通路相关基因的克隆及功能研究》文中研究指明合浦珠母贝（Pinctada fucata）中已被鉴定的基质蛋白多达数十种,它们参与一系列贝壳和珍珠形成的过程。因此,研究贝中信号通路对基质蛋白表达的调控作用,将为软体动物生物矿化分子机制的研究提供一个新的突破口。本研究一方面对合浦珠母贝TGFβ信号通路相关基因进行克隆和功能研究;另一方面对该贝若干基质蛋白的启动子序列进行克隆、生物信息学分析和启动子活性研究,为鉴定贝中参与基质蛋白转录调控的TGFβ信号通路提供了重要的信息。利用聚合酶链式反应（PCR）和cDNA末端快速扩增方法（RACE）,分别得到合浦珠母贝TGFβ超家族成员Pf-ALR1和Pf-Smad3的cDNA全长,它们各自功能区的氨基酸序列非常保守。半定量反转录PCR结果表明Pf-ALR1和Pf-Smad3基因在贝中广泛分布,且在胚胎发育阶段、贝壳修复过程和珍珠囊形成过程中的mRNA表达量有显着变化。原位杂交结果表明Pf-ALR1和Pf-Smad3基因均在外套膜中褶的外表皮细胞和外褶的内表皮细胞有较高表达水平。药物刺激实验和RNA干扰试验表明,Pf-Smad3的mRNA表达水平与多种基质蛋白和贝engrailed、NF-κB信号通路的相关因子的mRNA表达水平呈正相关性,且特异性抑制Pf-Smad3的mRNA表达水平可导致基质蛋白KRMP的mRNA表达水平显着降低。上述结果提示,Pf-ALR1和Pf-Smad3基因可能在合浦珠母贝的各种生理活动中,包括在贝壳和珍珠形成的生物矿化过程中,都发挥重要作用。利用特异引物PCR获得了合浦珠母贝基质蛋白KRMP的一段5’-UTR序列,序列比对显示该序列含有一段约200 bp的在该贝另外两个基质蛋白Pearlin和Prisilkin-39的启动子序列中也存在的保守片段。通过软件还预测出KRMP的核心启动子序列以及两个Sox结合位点。通过荧光素酶报告体系检测出所获得的KRMP的启动子序列在鼠细胞中具有较高的转录活性,且过量表达Pf-Smad3可显着提高该启动子的活性以及鼠Sox9的mRNA表达水平。因此贝中可能存在通过激活Smad3基因表达,进而提高贝Sox同源基因表达水平,最终增强KRMP等基质蛋白转录水平的信号通路。本研究结果为揭示调控贝中基质蛋白基因表达的信号调控网络提供了基础,也为选择药物刺激外套膜分泌珍珠质以提高珍珠质量提供了理论依据。
李威[6]（2010）在《BMP2基因转染大鼠颊粘膜成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:利用基因转染技术对来源广泛的大鼠颊粘膜成纤维细胞（rat buccal mucosa fibroblasts RBMF）进行骨形成蛋白2（Bone Morphogenetic Proteins2 BMP2）基因转染,获得BMP2基因转染的口腔颊粘膜成纤维细胞（Bone Morphogenetic Proteins2-rat buccal mucosa fibroblasts BMP2- RBMF）;对BMP2-RBMF的细胞生物学性状进行观察,包括BMP2-RBMF的增殖活性、BMP2蛋白的合成与分泌、碱性磷酸酶活性的表达,探讨BMP2-RBMF作为基因强化组织工程种子细胞的可行性。利用构建的基因强化组织工程的种子细胞BMP2-RBMF与异种烧结骨（Xenogeneic Bone Ceramice XBC）复合,通过检测BMP2-RBMF增殖活性以及应用扫描电镜观察BMP2-RBMF在异种烧结骨中的生长情况,评价异种烧结骨作为支架材料的可行性,为将人BMP2基因转染的成纤维细胞与异种烧结骨复合进行颌骨缺损及牙体修复的研究奠定基础。方法: 1大鼠颊粘膜成纤维细胞（RBMF）的培养与来源鉴定2 pEGFP-N1-BMP2表达载体的构建与鉴定3 BMP2基因转染RBMF及筛选4 BMP2基因转染对RBMF生物学特征的影响4.1荧光显微镜观察BMP2-RBMF中BMP2蛋白的表达4.2 RT-PCR检测BMP2-RBMF中BMP2基因的表达4.3 MTT法检测BMP2-RBMF增殖活性4.4透射电镜观察BMP2-RBMF超微结构4.5免疫组化观察BMP2-RBMF中BMP2蛋白的表达4.6 BMP2-RBMF碱性磷酸酶活性检测4.7酶联免疫吸附试验观察BMP2-RBMF分泌BMP2蛋白情况5 BMP2-RBMF细胞复合异种烧结骨支架材料体外培养5.1 MTT法检测BMP2-RBMF增殖活性5.2扫描电镜观察BMP2-RBMF与异种烧结骨复合情况结果1成纤维细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察发现,原代成纤维细胞3-5天由组织块中爬出,贴壁、展开,呈梭形、三角形、多边形;刚传代的成纤维细胞呈球形,悬浮于培养瓶中,传代后2h存活细胞沉降贴壁,24h内完全伸展,胞核明显,胞体丰满。2成纤维细胞来源鉴定成纤维细胞波形丝蛋白免疫荧光染色阳性,细胞胞浆着色（绿色荧光）,胞核不着色。细胞角蛋白免疫荧光染色阴性,胞浆胞核均无绿色荧光。说明培养细胞为来源于中胚层的成纤维细胞。3 pEGFP-N1-BMP2重组质粒的鉴定对构建的BMP2真核重组质粒用XhoI、HindIII进行双酶切,其产物进行琼脂糖凝胶电泳后,在1.2kb、4.7kb可见两条特异条带;并进行全基因序列测序,报告100%符合,证明pEGFP-N1-BMP2重组质粒构建成功。4 pEGFP-N1-BMP2质粒转染的RBMF在荧光显微镜下观察RBMF转染后24h荧光显微镜下观察,可见大量细胞发出绿色荧光,其中, pEGFP-N1质粒转染组绿色荧光均匀分布在整个细胞,pEGFP-N1-BMP2质粒转染组绿色荧光分布在细胞胞浆和细胞膜,细胞核中无荧光。5细胞增殖活性MTT法检测RBMF、N1-RBMF、BMP2-RBMF增殖活性,统计结果显示BMP2-RBMF与RBMF、N1-RBMF增值活性差别无显着性（P>0.05）,即pEGFP-N1-BMP2质粒转染不影响RBMF的增殖活性。6细胞免疫组化检测BMP2-RBMF中BMP2蛋白的表达BMP2-RBMF可见有BMP2蛋白的阳性表达,细胞胞浆及胞膜被染成棕色,胞核未着色。RBMF、N1-RBMF中BMP2蛋白的表达阴性。7 RT-PCR检测BMP2-RBMF中BMP2基因表达应用RT-PCR技术可检测到BMP2-RBMF中有BMP2基因表达, RBMF、N1-RBMF中未检测到BMP2基因表达。8碱性磷酸酶（ALP）活性检测BMP2-RBMF的ALP活性较RBMF、N1-RBMF有所提高,统计结果显示差异有显着性（P<0.05）,即pEGFP-N1-BMP2质粒转染可提高成纤维细胞碱性磷酸酶的活性。9 BMP2-RBMF上清中BMP2蛋白的表达BMP2-RBMF培养上清液光密度值明显高于RBMF、N1-RBMF,统计结果显示差异有显着性（P<0.05）即pEGFP-N1-BMP2质粒转染可促进成纤维细胞分泌BMP2。10透射电镜观察BMP2-RBMF细胞表面突起增多;细胞质内见大量呈板层状排列或同心圆状的髓样化结构,粗面内质网普遍扩张,内有中等电子密度的蛋白质沉淀,粗面内质网膜表面核糖体分布较密集;在细胞膜的部位,可见大量呈串珠样排列的电子密度较低的小泡,附近有电子密度较高的颗粒样物质。11 MTT法检测与异种烧结骨复合的BMP2-RBMF细胞增殖情况BMP2-RBMF复合异种烧结骨组细胞增殖活性与单层贴壁培养BMP2-RBMF组细胞增殖情况差异无显着性（P>0.05）。说明异种烧结骨上黏附的细胞增殖情况良好。12扫描电镜观察异种烧结骨上BMP2-RBMF黏附、生长的情况可见异种烧结骨的孔径为100-600μm,材料表面粗糙,利于细胞的黏附生长;孔隙中可见大量BMP2-RBMF,BMP2-RBMF贴附于材料上,生长旺盛、伸展良好。结论:1骨形成蛋白2（BMP2）基因转染大鼠口腔颊粘膜成纤维细胞（RBMF）,可以稳定表达BMP2,对细胞增殖无影响。2 BMP2-RBMF具有成骨细胞的表型,可以作为组织工程的种子细胞。3 BMP2-RBMF可分泌BMP2,参与诱导成骨作用。4 BMP2-RBMF可在异种烧结骨表面及孔隙中生长、增殖,异种烧结骨可以作为骨及牙组织工程的支架材料。总之:BMP2-RBMF与异种烧结骨复合可作为颌骨及牙本质修复的组织工程材料,有待于下一步进行动物实验及临床应用。
刘伟[7]（2009）在《bFGF和BMP12基因联合修饰BMSCs后向韧带成纤维细胞分化的实验研究》文中研究表明[摘要]目的:探索bFGF和BMP12基因的联合修饰使兔骨髓间充质干细胞向韧带成纤维细胞分化的方法。方法:（1）分离、培养兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）和韧带成纤维细胞（Ligament Fibroblast, LF）,通过细胞学和分子生物学方法对两种细胞进行鉴别分析;（2）构建携带人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）基因和人骨形态发生蛋白12（bone morphogenetic protein 12 , BMP12 ）基因的重组腺病毒载体Ad.bFGF-eGFP及Ad.BMP12-eGFP,并进行鉴定、扩增;（3）将Ad.bFGF-eGFP和Ad.BMP12-eGFP联合转染兔BMSCs,观察BMSCs表达、分泌bFGF、BMP12的情况,及转染后对BMSCs增殖、分化及产生韧带特异性细胞外基质的影响。结果: （1）成功分离和培养兔骨髓间充质干细胞和韧带成纤维细胞,两种细胞在细胞形态上相似,但在细胞的超微结构、增殖特性、细胞表型、细胞分子生物学水平上均有显着差异;（2）成功构建和扩增了携带人bFGF基因和BMP12基因的重组腺病毒载体Ad.bFGF-eGFP及Ad.BMP12-eGFP,其中含有eGFP荧光蛋白报告基因;（3） Ad.bFGF-eGFP和Ad.BMP12 -eGFP共转染BMSCs后,bFGF蛋白及BMP12蛋白显着表达,且明显促进BMSCs增殖和向韧带成纤维细胞表型分化,加强韧带特异性细胞外基质产生的能力并诱导韧带特异性转录因子Scleraxis的表达。结论:经Ad.bFGF-eGFP和Ad.BMP12-eGFP共同修饰改造后,兔骨髓间充质干细胞能明显向韧带成纤维细胞表型分化,韧带特异性细胞外基质的能力显着增强,为组织工程韧带的构建提供了一种更优良的种子细胞。
唐昊喆[8]（2008）在《重组pIRES2-EGFP-hBMP2载体的构建及其对人牙龈成纤维细胞表型的影响》文中研究表明牙周治疗的最终目标是实现牙周组织完全功能性再生,其中包括牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨协调一致地、生理性再生。传统的牙周治疗和引导性组织再生技术虽取得一定的临床效果,但总的看来,尚不能达到牙周组织完全再生的目的。组织工程技术引入牙周病治疗的研究领域,为这一目标的实现带来了新的希望。组织工程学研究的主要内容包括种子细胞的来源、生物载体支架的选择以及细胞/载体支架复合体的构建等三个方面。种子细胞的研究是牙周组织工程的重要内容。牙周膜（PDL）细胞是一组具有多向分化潜能的异质性细胞,其中的未分化间充质细胞可分化为成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞,是牙周组织再生的主要细胞。作为种子细胞,PDL细胞具有一定的局限性,它来源有限,须拔除一定量自体牙后才能获得,难以在临床上广泛开展。牙龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分,来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力,在适当的刺激下,可表达成骨细胞表型。人骨形成蛋白2（hBMP2）是BMP家族中诱骨活性最强的一种,也是唯一能单独诱导成骨的因子,在牙周组织再生和修复中具有重要的作用。本研究利用基因转染技术,将hBMP2基因转染牙龈成纤维细胞,赋予其成骨细胞特性,探讨将其作为理想的种子细胞应用于牙周组织工程的可能性。为此,本研究进行了如下几方面的实验:①用RT-PCR方法从人成骨肉瘤细胞系OS-9901中成功克隆了hBMP2基因,测序鉴定完全正确后,通过基因重组技术成功构建了该基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2,该实验结果为后续研究hBMP2对牙龈成纤维细胞表型的影响奠定了基础。②利用脂质体转染法成功地将hBMP2基因转入人牙龈成纤维细胞中,经G418筛选后,获得了稳定表达hBMP2的细胞克隆;通过荧光显微镜、RT-PCR、蛋白印迹和ELISA等方法进一步检测了稳定转染细胞中hBMP2的表达情况,实验结果表明本实验获得了稳定表达hBMP2的转染细胞,此细胞可稳定表达分泌型hBMP2达至少9代以上。③在上述实验的基础上,对稳定表达hBMP2的人牙龈成纤维细胞从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶活性和骨钙素合成以及体外形成矿化结节的能力等方面,对其生物学特性进行了观察。结果显示,部分转染细胞由梭形转化为多角形;细胞倍增时间和细胞增殖周期无明显改变;与未转染细胞相比,转染细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素合成水平明显升高（P<0.01）;并在矿化液作用下形成矿化结节。结果提示:hBMP2基因转染后人牙龈成纤维细胞生物学特性发生明显改变,表达成骨细胞表型,具有了某些成骨细胞的特点。本实验结论:外源性的hBMP2基因能够在牙龈成纤维细胞中稳定表达并促进其向成骨细胞转化,因此,可以初步认为hBMP2基因转染牙龈成纤维细胞具能作为牙周组织工程种子细胞的潜在可能。
雷少榕[9]（2008）在《BMP-2反义寡核苷酸对皮肤疤痕组织中成纤维细胞生长及胶原合成的影响》文中提出背景:瘢痕曾被认为是人类创伤愈合的必然产物,随着烧伤治愈率的提高,深度烧伤创面愈合后瘢痕遗留问题日益成为烧伤整形治疗的主要难题。瘢痕的基本病理学改变是细胞外基质大量堆积,主要是胶原蛋白的无序堆积和比例失衡,成纤维细胞是胶原合成和分泌的主要功能细胞,成纤维细胞的生长增殖、胶原合成活动与瘢痕形成密切相关。胎儿创面无瘢痕愈合现象的发现,提示我们人类创伤也可无瘢痕愈合,有学者发现这一现象与骨形态蛋白（BMPs）相关。BMPs是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的成员,最初因其诱导成骨的作用引起人们重视,随着研究的深入,人们发现它是一个多功能因子,在胚胎发生和发育、组织与细胞的分化和增殖等方面起重要作用。BMP-2是BMPs中最活跃的细胞因子之一,与成纤维细胞关系密切,以往研究多集中于骨、关节周围的成纤维细胞,皮肤及瘢痕成纤维细胞尚无深入研究的报道。Stelnicki EJ等研究表明在胎儿皮肤组织里BMP-2低水平表达,而加入外源性BMP-2作用下胎儿创面像成人一样愈合后留有瘢痕,提示BMP-2参与瘢痕形成。实验中Stelnicki EJ发现BMP-2在表皮细胞和成纤维细胞均有表达。BMP-2在成人瘢痕组织中的表达如何?BMP-2在人类瘢痕成纤维细胞内的表达与正常皮肤有无区别?它对瘢痕形成的主要功能细胞—成纤维细胞的增殖、生长及胶原合成功能有无影响?国内外目前还无相关报道,因此我们设计此实验,通过Western blot、RT-PCR等方法检测BMP-2在正常皮肤组织中、成纤维细胞内的表达;并通过寡义核苷酸干扰BMP-2的表达,观察其对成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。第一章皮肤、瘢痕及瘢痕疙瘩组织中BMP-2的表达目的:检测BMP-2在正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中的表达。方法:收集54份成人标本,其中正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩各18份,切片,免疫组化染色,观察各组织块内BMP-2的表达,统计分析采用F检验,两组间采用方差分析的两两比较（LSD法）。结果:1、BMP-2在正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中有表达,在表皮细胞、成纤维细胞均有表达。2、BMP-2在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表达较正常皮肤明显增强,三组标本中BMP免疫染色计分的均数差别有统计学意义（F=6.971,P=0.002）,瘢痕疙瘩组与正常皮肤组、增生性瘢痕组与正常皮肤组BMP免疫染色计分的均数差别有统计学意义（P=0.004及P=0.001）,但瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组的BMP免疫染色计分的均数差别无统计学意义（P=0.670）。结论:BMP-2在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达较在正常皮肤中明显高。第二章皮肤及瘢痕成纤维细胞内BMP-2的表达目的:探讨BMP-2在正常皮肤及增生瘢痕成纤维细胞内的表达情况。方法:1、细胞培养:无菌条件下获取整形手术切除的成人增生性瘢痕（病程为0.5～1年）及皮肤,采用组织块贴壁法培养成纤维细胞,传代。2、采用Western blot检测皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞内BMP-2的蛋白表达。3、采用RT-PCR检测皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞内BMP-2的mRNA表达。结果:1、Western blot结果发现,正常皮肤组织的BMP-2表达较少,而瘢痕组织中BMP-2的蛋白表达明显增多,结果具有统计学意义（P＜0.05）。2、RT-PCR结果显示正常皮肤组织的BMP-2的mRNA表达较少,而瘢痕组织中BMP-2的mRNA表达明显明显增多,结果具有统计学意义（P＜0.05）结论:增生性瘢痕成纤维细胞内BMP-2的mRNA、蛋白表达较正常皮肤明显增高。第三章BMP-2反义寡核苷酸对皮肤瘢痕组织中成纤维细胞生长活性及胶原合成的影响目的:观察反义寡核苷酸干扰BMP-2表达后培养的瘢痕成纤维细胞生长增殖、胶原合成的变化。方法:1、反义寡核苷酸及错义寡核苷酸的设计及合成根据人BMP-2的DNA序列,选择跨越起始密码子的-6～9位点作为靶位点,由碱基互补原则设计BMP-2反义寡核苷酸,错义寡核苷酸序列则为反义寡核甘酸序列碱基随意变动后经Blast比对,互补碱基数少于5个即可,正义寡核甘酸为DNA序列中随意的一段。BMP-2在GenBank接受号为NM 001200。经DNA合成仪合成后硫代修饰,高压液相色谱纯化。2、分组及细胞转染将培养的瘢痕成纤维细胞分为4组:A组（对照组）、细胞+培养液;B组、细胞+培养液+正义寡核苷酸;C组,细胞+培养液+错义寡核苷酸;D组、细胞+培养液+反义寡核苷酸。将各寡核苷酸与脂质体的混合物分别加入对应组转染成纤维细胞。3、测定各组BMP-2的表达采用Western blot方法检测各组BMP-2的表达。4、检测成纤维细胞生长抑制率:采用MTT分析法测定各组成纤维细胞的生长抑制率。5、检测BMP-2对成纤维细胞功能的影响:采用羟脯氨酸（hydroxypline,HP）比色法测定四组细胞胶原合成情况;采用RT-PCR测定四组细胞内I型胶原rnRNA表达情况。结果:1、反义寡核苷酸可抑制BMP-2的表达Western blot结果显示正义寡核苷酸（sODN）与错义寡核苷酸（mODN）对BMP-2的表达无明显影响,而反义寡核苷酸（asODN1,asODN2）均有不同程度抑制BMP-2的表达,特别是asODN2对BMP-2表达的抑制率达80%。2、BMP-2反义寡核苷酸抑制成纤维细胞的增殖MTT分析显示在不同时间点B组及C组与A组（对照组）的细胞生长率无显着性差别,而BMP-2反义寡核苷酸（asODN2）可抑制成纤维细胞生长、增殖（P＜0.05）。3、BMP-2反义寡核苷酸抑制成纤维细胞的胶原合成采用羟脯氨酸（hydroxypline,HP）比色法分析结果发现,BMP-2反义寡核苷酸降低成纤维细胞内BMP-2的表达,可抑制细胞中胶原的生成,而BMP-2正义寡核苷酸组及BMP-2错义寡核苷酸组,细胞中胶原的合成与对照组无明显变化。4、BMP-2反义寡核苷酸可抑制细胞中I型胶原的合成RT-PCR测定四组细胞内I型胶原mRNA表达情况显示BMP-2反义寡核苷酸可抑制细胞中I型胶原的合成,而BMP-2正义寡核苷酸组及BMP-2错义寡核苷酸组,细胞中I型胶原的合成与对照组无明显变化。结论:通过反义寡核苷酸干扰BMP-2的mRNA表达,阻碍BMP-2的蛋白表达,可抑制成纤维细胞的生长、增殖。可减少成纤维细胞内胶原的合成,I型胶原的mRNA表达减少。BMP-2具有促进成纤维细胞生长、增殖及胶原合的功能。
蒋佳[10]（2008）在《双基因修饰组织工程骨的构建及其成骨的研究》文中指出背景:大段骨缺损的修复是骨科临床治疗的难题。近年来,骨组织工程发展迅速,利用骨组织工程治疗骨缺损成为研究的热点。组织工程骨的血管化问题是影响其应用于临床的重要原因之一。骨形态发生蛋白2（BMP2）的成骨作用已获得公认,内皮细胞生长因子（VEGF）是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,可促进新生血管形成。研究表明,在骨形成和骨折愈合过程中,VEGF和BMP2的表达相互促进,并在骨再生过程中产生协同效应。联合应用BMP2和VEGF双基因,可实现骨与血供的联合重建,成为促进骨缺损修复的一种有效方法。利用重组病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞并与支架材料复合形成基因修饰组织工程骨是当今骨缺损的基因治疗研究的热点。慢病毒载体能够感染大多数非分裂细胞,并具有高效、稳定地表达目的基因的能力,已被广泛应用于基因治疗实验研究。目的:（1）利用BMP2和VEGF165两种基因间的协同作用,促进组织工程骨的成骨及血管化。（2）掌握重组慢病毒的生产技术,以便应用于今后其它研究中,从而使相应的外源基因高效稳定地表达。材料和方法:（1）从人骨肉瘤成骨样细胞（MG-63细胞）中调取人BMP2和VEGF165基因;分别构建携带BMP2、VEGF165基因的重组慢病毒表达载体;分别进行携带BMP2、VEGF165基因的重组慢病毒（lv-bmp、lv-vegf）的包装和生产。（2）wistar大鼠的骨髓间充质干细胞（mscs）的分离培养、体外扩增。（3）按照未转染细胞组、vegf165单转染细胞组、bmp2单转染细胞组、bmp2及vegf165共转染细胞组分别转染mscs;（4）转染后7天,通过实时荧光定量检测各组人bmp2和vegf165基因的表达状况;转染后1、4、8周后,通过elisa检测bmp2和vegf165蛋白表达水平变化（5）转染后14天,按上述分组对各组细胞行成骨能力的检测（碱性磷酸酶染色及定量检测）。（6）按分组将细胞与支架材料复合并行细胞材料复合物的检测:细胞接种后14天行电镜观察、接种后14天行碱性磷酸酶定量检测、接种后2周观察细胞生长曲线。（7）按分组将组织工程骨回植到裸鼠皮下试验,回植后4、8周组织学观察体内成骨情况,回植后4周cd31免疫组化染色观察血管生成情况。结果:（1）分别成功构建携带bmp2、vegf165的重组慢病毒。（2）仅在bmp+vegf组,人bmp2和vegf165基因在mrna和蛋白水平高效共表达,且其表达水平与相应单转组无明显差异（p>0.05）。elisa检测显示人bmp2和vegf165基因在蛋白水平高效共表达可长达8周。（3）双转组中mscs的alp活性明显高于各单转组（p<0.01）。（4）细胞接种到支架材料后,扫描电镜观察细胞在接种后14天在支架材料上生长增殖良好。hoechstdna检测表明接种后14天内各组细胞生长曲线无明显异常（p>0.05）。但双转组中mscs的alp活性明显高于各单转组（p<0.01）。（5）裸鼠实验中,联合应用bmp2与vegf165组和单用bmp2组有异位骨形成,其他各组均无成骨。植骨后4、8周,he染色显示联合应用BMP2组与VEGF165组成骨面积多于单用BMP组（P<0.01）。植骨后4周,双转组CD31染色阳性细胞明显多于单转BMP组。结论:通过慢病毒载体系统进行双基因转染的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）复合磷酸三钙（TCP）体外构建组织工程骨及体内成骨的实验研究,证实（1）利用较新的慢病毒载体系统共转染的方法可使种子细胞高效稳定地共表达人BMP2及VEGF165基因（2）利用两种基因间的协同作用,联合应用BMP2和VEGF可明显促进组织工程骨的成骨及血管化,其成骨及血管化效果均优于单用一种生长因子。
二、含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物的卵泡发育和卵泡闭锁 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 哺乳动物的卵泡结构和卵泡发育 |
| 1.3 哺乳动物的卵泡闭锁 |
| 1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.1 颗粒细胞增殖在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.2 颗粒细胞凋亡在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.3 颗粒细胞分泌C型钠肽对卵母细胞的作用 |
| 第二章 BMPR1B基因研究进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 BMPR1B基因的发现和定位 |
| 2.3 BMPR1B基因结构和蛋白结构 |
| 2.4 BMPR1B在绵羊和山羊各器官和组织中的表达 |
| 2.5 BMPR1B参与的信号通路 |
| 2.5.1 BMP15 |
| 2.5.2 TGFβ/Smad信号转导通路 |
| 2.6 BMPR1B基因的生物学功能 |
| 2.6.1 BMPR1B对繁殖性能的影响 |
| 2.6.2 BMPR1B对羊毛细度的调控作用 |
| 2.6.3 BMPR1B对骨骼发育及维持的作用 |
| 2.6.4 BMPR1B对肿瘤的影响 |
| 2.6.5 BMPR1B的其它生物学功能 |
| 2.7 本研究的目的意义 |
| 2.8 本研究的技术路线图 |
| 试验研究 |
| 第三章 陕北白绒山羊BMPR1B基因的序列特征与表达模式研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 山羊BMPR1B m RNA序列的克隆及多态性分析 |
| 3.2.2 山羊BMPR1B氨基酸序列特征分析 |
| 3.2.3 BMPR1B在不同产羔数绒山羊组织中的差异表达分析 |
| 3.2.4 BMPR1B在不同大小卵泡及卵母细胞和颗粒细胞中的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 BMP15 对绒山羊卵泡颗粒细胞生物学功能的调控作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 山羊卵泡颗粒细胞的分离培养 |
| 4.2.2 山羊卵泡颗粒细胞的鉴定 |
| 4.2.3 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.2.5 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 BMP15对绒山羊卵泡颗粒细胞BMPR1B及Smad通路和MAPK通路的调控作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BMP15对BMPR2和BMPR1B表达的影响 |
| 5.2.2 BMP15对BMPR1B的表达调控 |
| 5.2.3 BMP15对Smad信号通路的影响 |
| 5.2.4 BMP15协同FSH对类固醇激素分泌的影响 |
| 5.2.5 BMP15对MAPK信号通路的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 BMP15通过BMPR1B对绒山羊卵泡颗粒细胞的调控作用研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 BMPR1B过表达载体的构建 |
| 6.2.2 BMPR1B干扰载体的构建和筛选 |
| 6.2.3 慢病毒包装纯化及滴度测定 |
| 6.2.4 卵泡颗粒细胞BMPR1B基因过表达及干扰效率检测 |
| 6.2.5 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞增殖的影响 |
| 6.2.6 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞凋亡的影响 |
| 6.2.7 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响 |
| 6.2.8 BMP15通过BMPR1B对Smad信号通路和MAPK信号通路的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 总结论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 下一步需要研究的主要问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 主要试验仪器 |
| 附录二 主要试验试剂与耗材 |
| 附录三 试验操作步骤 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）LncRNA-SNHG29/miR-200b-3p调控Klotho/FGF23轴介导血管钙化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 Klotho与 FGF23 在β-GP诱导VMSCs钙化过程中作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验用VMSCs来源 |
| 1.2 实验用主要仪器 |
| 1.3 实验用主要试剂 |
| 1.4 实验用主要试剂的配置 |
| 2、实验方法与步骤 |
| 2.1 VMSCs细胞培养 |
| 2.2 细胞钙化模型的建立 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.4 Klotho、FGF23 过表达腺病毒及阴性对照腺病毒的构建和转染 |
| 2.5 茜素红染色 |
| 2.6 钙离子含量测定 |
| 2.7 ALP活性测定 |
| 2.8 RNA的提取 |
| 2.9 逆转录 |
| 2.10 qRT-PCR检测 |
| 2.11 Western blot检测 |
| 2.12 统计学方法 |
| 结果 |
| 1、Klotho与 FGF23 在β-GP诱导VMSCs钙化过程中表达水平 |
| 2、过表达 Klotho 和 FGF23 可抑制β-GP 诱导 VMSCs 的钙化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Klotho/FGF23 调控β-GP诱导VMSCs钙化的机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验用VMSCs来源 |
| 1.2 实验用主要仪器 |
| 1.3 实验用主要试剂 |
| 1.4 实验用主要试剂的配置 |
| 2、实验方法与步骤 |
| 2.1 VMSCs细胞复苏 |
| 2.2 VMSCs细胞的换液及传代 |
| 2.3 VMSCs细胞钙化模型的建立 |
| 2.4 实验分组 |
| 2.5 shKlotho、shFGF23 转染 |
| 2.6 统计学方法 |
| 结果 |
| 1、β-GP诱导VMSCs钙化过程中Wnt/β-catenin信号通路激活 |
| 2、过表达Klotho和FGF23抑制β-GP诱导VMSCs钙化过程中Wnt/β-catenin信号通路的激活 |
| 3、Klotho/FGF23 通过抑制Wnt/β-catenin信号转导途径减轻β-GP诱导的VSMC钙化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 LncRNA-SNHG29 下调miR-200b-3p参与Klotho/FGF23 介导血管钙化的机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1、材料 |
| 1.1 实验用HASMC来源 |
| 1.2 实验用主要仪器 |
| 1.3 实验用主要试剂的配置 |
| 2、实验方法与步骤 |
| 2.1 HASMC细胞培养、细胞换液、细胞冻存、细胞复苏及HASMC钙化模型的建立 |
| 2.2 MTT测定 |
| 2.3 茜素红染色、钙化分析、ALP测定 |
| 2.4 qRT-PCR检测 |
| 2.5 质粒构建和细胞转染 |
| 2.6 荧光素酶报告实验 |
| 2.7 实验分组 |
| 2.8 Western blot检测 |
| 2.9 统计学方法 |
| 结果 |
| 1、SNHG29和miR-200b-3p在β-GP诱导的钙化模型HASMC中的差异表达 |
| 2、SNHG29 抑制β-GP诱导HASMC的钙化 |
| 3、SNHG29“海绵”miR-200b-3p,沉默miR-200b-3p表达可抑制β-GP诱导HASMC的钙化 |
| 4、miR-200b-3p靶向α-klotho并负向调控α-Klotho/FGF23轴 |
| 5 、SNHG29 对β-GP诱导HASMC钙化的调控机制 |
| 5.1 miR-200b-3p的过表达和α-Klotho的沉默表达均可逆转SNHG29 过表达对β-GP诱导HASMC钙化的抑制作用 |
| 5.2 SNHG29 下调miR-200b-3p激活α-Klotho/FGF23 轴 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（3）PRRT2变异的致病性及病理机制初步探讨（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Absract |
| 英汉缩略词对照 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PRRT2错义变异的致病性分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 PRRT2基因UTR变异在PKD中的作用探讨 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 PRRT2变异蛋白的致病机制初步探索 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介和在读期间取得的研究成果 |
（4）丝氨酸蛋白酶HtrAl在牙本质形成过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 第一部分 HtrAI在牙发育、牙髓-牙本质复合体及修复性牙本质形成过程中的表达研究 |
| 实验一 HtrA1在小鼠牙发育过程中的免疫组化研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓-牙本质复合体的表达研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 HtrA1与MGP在大鼠修复性牙本质形成过程中的表达研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 HtrAl在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的作用研究 |
| 实验四 HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的表达研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验五 HtrA1基因抑制对人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）合浦珠母贝TGFβ信号通路相关基因的克隆及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 TGFβ超家族及其信号通路 |
| 1.1.1 TGFβ信号通路概述 |
| 1.1.2 TGFβ信号通路的分子生物学基础 |
| 1.1.3 软体动物TGFβ信号通路研究进展 |
| 1.2 TGFβ信号通路重要的生理功能 |
| 1.2.1 TGFβ信号通路与生长发育 |
| 1.2.2 TGFβ信号通路与创伤修复 |
| 1.2.3 TGFβ信号通路与免疫反应 |
| 1.2.4 TGFβ信号通路与生物矿化 |
| 1.2.5 生物矿化与创伤修复、免疫反应的关系 |
| 1.3 合浦珠母贝基质蛋白研究进展 |
| 1.3.1 贝壳和珍珠形成机理 |
| 1.3.2 合浦珠母贝基质蛋白的类型 |
| 1.3.3 合浦珠母贝基质蛋白的区域化分布 |
| 1.4 真核启动子研究概述 |
| 1.4.1 真核启动子的特点 |
| 1.4.2 植物启动子研究成果的启示 |
| 1.4.3 启动子序列的克隆方法 |
| 1.4.4 启动子生物信息学分析方法 |
| 1.4.5 启动子功能研究的方法 |
| 1.4.6 软体动物启动子研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 论文各部分主要研究内容 |
| 第2章 合浦珠母贝ALR1 基因克隆及其功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 总RNA 的提取 |
| 2.2.3 cDNA 第一链的合成 |
| 2.2.4 Pf-ALR1 基因保守片段的扩增 |
| 2.2.5 Pf-ALR1 基因cDNA 末端快速扩增 |
| 2.2.6 Pf-ALR1 基因cDNA 全长序列的扩增 |
| 2.2.7 Pf-ALR1 基因cDNA 全长序列的分析 |
| 2.2.8 半定量RT-PCR |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Pf-ALR1 基因的克隆 |
| 2.3.2 合浦珠母贝Pf-ALR1 基因cDNA 序列特征 |
| 2.3.3 合浦珠母贝Pf-ALR1 蛋白序列特征 |
| 2.3.4 合浦珠母贝Pf-ALR1 蛋白L45 loop 序列特征 |
| 2.3.5 Pf-ALR1 蛋白序列同源性比较及进化关系分析 |
| 2.3.6 Pf-ALR1 基因在贝各组织及发育阶段中的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 Pf-ALR1 基因的克隆 |
| 2.4.2 Pf-ALR1 蛋白序列分析及其分类 |
| 2.4.3 Pf-ALR1 基因功能的初步分析 |
| 第3章 合浦珠母贝Smad3 基因克隆及其功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 Pf-Smad3 基因保守片段的扩增 |
| 3.2.3 Pf-Smad3 基因cDNA 末端快速扩增 |
| 3.2.4 Pf-Smad3 基因cDNA 全长序列的扩增及分析 |
| 3.2.5 半定量RT-PCR |
| 3.2.6 原位杂交 |
| 3.2.7 贝壳缺刻实验 |
| 3.2.8 原代培养外套膜组织细胞 |
| 3.2.9 药物刺激实验 |
| 3.2.10 RNA 干扰 |
| 3.2.11 实时相对定量PCR |
| 3.2.12 扫描电镜观察新生贝壳形貌 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Pf-Smad3 基因的克隆 |
| 3.3.2 合浦珠母贝Pf-Smad3 基因的cDNA 序列特征 |
| 3.3.3 合浦珠母贝Pf-Smad3 蛋白序列特征 |
| 3.3.4 Pf-Smad3 蛋白序列同源性比较及进化关系分析 |
| 3.3.5 Pf-Smad3 基因在贝各组织和不同发育阶段中的表达 |
| 3.3.6 Pf-Smad3 和Pf-ALR1 基因在外套膜组织中的表达分布 |
| 3.3.7 Pf-Smad3 和Pf-ALR1 基因在贝壳缺刻修复过程中表达的变化 |
| 3.3.8 Pf-Smad3 和Pf-ALR1 基因在珍珠囊形成过程中表达的变化 |
| 3.3.9 Pf-Smad3 与合浦珠母贝基质蛋白基因表达水平的相关性 |
| 3.3.10 抑制Pf-Smad3 基因表达对贝KRMP 基因表达水平的影响 |
| 3.3.11 药物刺激对新生贝壳棱柱层表面超微结构的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Pf-Smad3 蛋白序列的高度保守性 |
| 3.4.2 Pf-ALR1 和Pf-Smad3 基因表达的相关性 |
| 3.4.3 Pf-Smad3 基因功能的初步分析 |
| 3.4.4 Pf-Smad3 与基质蛋白基因表达的关系 |
| 第4章 合浦珠母贝基质蛋白启动子克隆及活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 合浦珠母贝基因组DNA 的提取 |
| 4.2.3 KRMP 启动子克隆及测序 |
| 4.2.4 KRMP 启动子序列的生物信息学分析 |
| 4.2.5 真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 细胞培养 |
| 4.2.7 瞬时转染 |
| 4.2.8 荧光素酶活性检测 |
| 4.2.9 半定量RT-PCR |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 贝基质蛋白KRMP 启动子的克隆 |
| 4.3.2 KRMP 启动子与贝其它启动子的序列相似度 |
| 4.3.3 KRMP 启动子序列特征 |
| 4.3.4 KRMP 启动子的活性 |
| 4.3.5 过表达Pf-Smad3 对KRMP 启动子活性的影响 |
| 4.3.6 过表达Pf-Smad3 对鼠细胞Sox9 基因表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 合浦珠母贝启动子序列的克隆方法 |
| 4.4.2 合浦珠母贝启动子功能的初步分析 |
| 4.4.3 基质蛋白KRMP、Pearlin 和Prisilkin-39 之间的异同点 |
| 4.4.4 贝Sox 同源蛋白功能的预测分析 |
| 4.4.5 TGFβ信号通路对贝基质蛋白调控机制的初步分析 |
| 第5章 合浦珠母贝Smad3 与engrailed 关系的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要实验材料和仪器 |
| 5.2.2 PCR 扩增合浦珠母贝Pf-engrailed 基因的片段 |
| 5.2.3 半定量RT-PCR |
| 5.2.4 实时相对定量PCR |
| 5.2.5 融合蛋白表达载体的构建 |
| 5.2.6 重组蛋白的诱导表达及分离纯化 |
| 5.2.7 BCA 法测定蛋白质含量 |
| 5.2.8 贝外套膜组织总核蛋白的提取 |
| 5.2.9 GST pull-down 实验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 合浦珠母贝Pf-engrailed 基因片段的序列特征 |
| 5.3.2 合浦珠母贝Pf-engrailed 蛋白EH4 片段高度保守 |
| 5.3.3 Pf-engrailed 基因在不同胚胎发育过程中的表达 |
| 5.3.4 Pf-engrailed 基因在贝壳缺刻修复过程中表达的变化 |
| 5.3.5 Pf-Smad3 和Pf-engrailed、Pf-BMP2 基因表达的相关性 |
| 5.3.6 药物刺激对Pf-Rel 和Pf-IKK 基因表达的影响 |
| 5.3.7 Pf-Smad3 蛋白MH1、MH2 结构域的重组表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 贝engrailed 基因功能初步分析 |
| 5.4.2 TGFβ与NF-κB 等其他信号通路的关系 |
| 5.4.3 贝中可能与Smad3 作用的蛋白 |
| 第6章 结论 |
| 第7章 附件：重组PRH 蛋白与3 种启动子结合特性的研究 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器 |
| 7.2.3 化学交联 |
| 7.2.4 胰蛋白酶酶切 |
| 7.2.5 质谱分析 |
| 7.2.6 表面等离子共振成像实验 |
| 7.2.7 足迹法 |
| 7.2.8 紫外激光足迹图谱法 |
| 7.3 结果和讨论 |
| 7.3.1 重组PRH 蛋白化学交联结果 |
| 7.3.2 质谱测定重组PRH 蛋白分子量 |
| 7.3.3 胰蛋白酶切后质谱结果 |
| 7.3.4 PRH 与3 种人启动子序列的结合特性 |
| 7.3.5 PRH 在3 种启动子上的DNA 结合区域的确定 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）BMP2基因转染大鼠颊粘膜成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 BMP2 基因转染大鼠颊粘膜成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 BMP 在成骨和成牙本质中的研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）bFGF和BMP12基因联合修饰BMSCs后向韧带成纤维细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写 |
| 详细摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 兔骨髓间充质干细胞及韧带成纤维细胞的分离、培养及其生物学特性分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 携带人bFGF 基因和BMP12 基因重组腺病毒载体的构建及转染骨髓间充质干细胞后bFGF 和 BMP12 蛋白的表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 bFGF 基因及BMP12 基因联合修饰骨髓间充质干细胞后向韧带成纤维细胞的分化 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 研究生在读期间主要学术活动 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）重组pIRES2-EGFP-hBMP2载体的构建及其对人牙龈成纤维细胞表型的影响（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 文献回顾 |
| 第一部分 BMP生物学特性及其在牙周组织再生中的作用 |
| 第二部分 基因转染技术在牙周组织修复再生中的应用 |
| 前言 |
| 正文 |
| 1 重组真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP-2的构建与鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 实验讨论 |
| 2 hBMP2基因在人牙龈成纤维细胞内的稳定表达及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 实验讨论 |
| 3 hBMP2基因转染人牙龈成纤维细胞后的生物学特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 实验讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和发表论文 |
| 致谢 |
（9）BMP-2反义寡核苷酸对皮肤疤痕组织中成纤维细胞生长及胶原合成的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略表 |
| 第一章 皮肤、瘢痕及瘢痕疙瘩组织中BMP-2的表达 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二章 皮肤及瘢痕成纤维细胞内BMP-2的表达 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三章 BMP-2反义寡核苷酸对皮肤瘢痕组织中成纤维细胞增殖及胶原合成的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 攻读博士学位期间承担的课题 |
| 攻读博士学位期间获奖情况 |
（10）双基因修饰组织工程骨的构建及其成骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 参考文献 |
| 第二章 人血管内皮细胞生长因子165基因重组慢病毒和人骨形态发生蛋白2因重组慢病毒的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第三章 VEGF165、BMP2基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其表达效率的检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 体外双基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的检测及组织工程骨的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 双基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞复合TCP体 内成骨的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制[D]. 赵金. 西北农林科技大学, 2021
- [2]LncRNA-SNHG29/miR-200b-3p调控Klotho/FGF23轴介导血管钙化的机制研究[D]. 陈艳霞. 南昌大学, 2020(08)
- [3]PRRT2变异的致病性及病理机制初步探讨[D]. 赵绍云. 浙江大学, 2019(03)
- [4]丝氨酸蛋白酶HtrAl在牙本质形成过程中的作用研究[D]. 李贤玉. 武汉大学, 2013(07)
- [5]合浦珠母贝TGFβ信号通路相关基因的克隆及功能研究[D]. 周玉娟. 清华大学, 2010(08)
- [6]BMP2基因转染大鼠颊粘膜成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究[D]. 李威. 河北医科大学, 2010(04)
- [7]bFGF和BMP12基因联合修饰BMSCs后向韧带成纤维细胞分化的实验研究[D]. 刘伟. 第二军医大学, 2009(10)
- [8]重组pIRES2-EGFP-hBMP2载体的构建及其对人牙龈成纤维细胞表型的影响[D]. 唐昊喆. 第四军医大学, 2008(04)
- [9]BMP-2反义寡核苷酸对皮肤疤痕组织中成纤维细胞生长及胶原合成的影响[D]. 雷少榕. 中南大学, 2008(12)
- [10]双基因修饰组织工程骨的构建及其成骨的研究[D]. 蒋佳. 上海交通大学, 2008(08)