一、HIV-1的分类与命名（论文文献综述）
林倩茹[1]（2021）在《HIV-1新发感染综合判定研究及我国出入境人群的HIV-1新发感染特征分析》文中研究指明研究背景预防HIV新发感染是防控艾滋病传播的关键环节,及时发现新发感染人群,采取干预措施,可有效遏制二代传播。艾滋病病毒（HIV）感染者体内产生的抗体种类与数量、免疫状态以及病毒数量会随着感染时间而不断变化,这些变化可以通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）结果、免疫印迹法（western blot,WB）带型、CD4+T淋巴细胞（简称CD4细胞）计数、病毒载量（viral load,VL）等免疫学和病毒学指标反映出来。通过常规检测方法的结果来及时发现HIV新发感染对于监测HIV流行趋势和评估预防工作的有效性至关重要[1]。限制性抗原亲和力法（limiting antigen avidity enzyme i mmunoassay,LAg-avidity EIA）作为HIV-1新发感染检测最有效的实验室方法之一,可初步判定HIV-1感染者的新发感染状态。此方法受CD4细胞计数、抗病毒治疗等因素的影响,为了减少对该方法的影响,可将多种常规检测方法结果,如CD4细胞计数、VL和HIV-1新发感染检测方法相结合,形成新发感染综合判定策略（recent infection testing algorithms,RITAs）[2],使得新发感染结果更加符合实际。相比其他人群,出入境人群与国内外接触广泛,流动性极大,大大增加了感染和传播HIV的风险,其中的HIV新发感染人群由于传播力度大,更是高风险传播的关键人群。全球已经有143个国家不限制HIV感染者入境,我国于2010年取消了对外国游客和回国中国人的强制性HIV检测,随着全球化进程的不断加快,我们国家对外交往不断深入的同时,也可能增加HIV传播和蔓延的风险。目前没有针对出入境中新发感染人群的研究,我们首次对其进行HIV-1传播动态监测,了解出入境中新发感染人群的主要毒株组成、耐药情况和地区传播来源,帮助掌握HIV流行情况,以期尽早发现新传入我国的毒株,为疫情防控提供科学依据。研究目的1.研究免疫学和病毒学指标作为预测HIV-1新发感染判定指标的可行性,为及时准确地判定HIV-1新发感染提供科学依据。2.了解来自我国海关出入境中新发感染人群的HIV-1病毒学特征及毒株来源地区,为出入境人群HIV-1防控提供参考。研究方法第一部分采用横断面调查,收集2017-2019年北京市、浙江省、云南省抗病毒治疗前确证阳性样本4444份,对同一采样时间的样本进行CD4细胞计数、病毒载量检测、限制性抗原亲和力新发感染检测,通过统计学分析方法,探究常规检测结果辅助判断新发感染的可行性;仅使用限制性抗原亲和力法,CD4细胞计数、VL分别和限制性抗原亲和力法相结合,CD4细胞计数、VL同时和限制性抗原亲和力法相结合形成四种RITA,比较四种不同的判定策略识别新发感染人群的效果。第二部分采用横断面调查,收集2017-2019年吉林、黑龙江、陕西、山东、四川、珠海、广西七地海关出入境体检人群中确证阳性样本,对同一采样时间的样本进行限制性抗原亲和力HIV-1新发感染检测。对限制性抗原亲和力判定的新发感染样本进行核酸提取和扩增,来获取pol区序列,通过系统进化分析判断亚型,通过斯坦福耐药数据库提供的HIV db程序判断耐药情况,采用贝叶斯离散系统地理学分析方法推测HIV-1新发感染样本的可能来源地区。研究结果第一部分1.在4444份样本中,新发感染样本和既往感染样本的WB确证实验均出现gp 160条带,但新发感染样本gp120、p66、p55、p51、gp41、p31、p17条带的阳性率均低于既往感染样本的阳性率（P<0.05）,缺失p55和p31为新发感染的危险因素。2.对1134份同时包括S/CO值、CD4细胞计数和VL结果的样本进行多因素二元Logistic回归分析,结果显示,相对于S/CO>30来说,S/CO≤20（aOR=1.822,95%CI:1.001～3.318）是新发感染样本的可能性更大;相对于CD4细胞<200个/μl 来说,CD4 细胞≥500 个/μl（aOR=3.520,95%CI:2.318～5.346）,350 个/μl≤ CD4细胞≤499 个/μl（aOR=2.921,95%CI:1.939～4.402）和 200 个/μl≤CD4 细胞≤349个/μl（aOR=1.607,95%CI:1.078～2.396）是新发感染样本的可能性更大,其中CD4细胞≥500个/μl是新发感染样本的可能性最大;相对于VL<1000 copies/ml来说,VL>100,000 copies/ml（aOR=2.646,95%CI:1.467～4.773）是新发感染样本的可能性更大。3.S/CO 比值联合CD4细胞计数和病毒载量,曲线下面积达0.674,敏感度和特异度分别为79.6%和46.7%。4.在同时包括CD4细胞计数和VL结果的1762份样本中,RITA1判定的新发感染样本占22.81%,RITA2判定的新发感染样本占19.64%,RITA3判定的新发感染样本占21.06%,RITA4判定的新发感染样本占18.00%。第二部分1.限制性抗原亲和力法判定我国海关出入境人群新发感染比例为24.76%。2.本次研究发现我国海关出入境新发感染人群HIV亚型以CRF01AE为主（75.00%）,其次为 CRF07BC 占 10.00%,CRF08BC 占 2.5%,CRF5501B占5.00%,其他亚型占5.00%。3.成功扩增的40份新发感染样本中,有5份样本出现耐药。三份样本对利匹韦林（RPV）低度耐药,一份样本对奈非那韦（NFV）高度耐药,一份样本同时对齐多夫定（AZT）和司他夫定（D4T）耐药。4.对海关出入境亚型为CRF01AE的HIV新发感染人群进行毒株分子溯源后发现,23.33%毒株来源于国外,76.67%毒株来源于国内。结论第一部分1.当出现缺失p55条带或缺失p31条带或S/CO≤20或CD4细胞≥500个/μl或VL>100,000 copies/ml时,该样本是LAg判定HIV-1新发感染的可能性大。2.S/CO+CD4+VL联合预测新发感染比单个指标分别预测效能好。3.结合了不同指标的新发感染综合判定策略可以对HIV-1新发感染进行分类,从而为采取有针对性的干预措施提供信息。第二部分1.我国海关出入境人群中的HIV-1新发感染比例较高,有必要对人口流动性大的出入境人群进行严格监测,以减少HIV的传播和蔓延。2.我国海关出入境新发感染人群中HIV-1亚型种类复杂,已出现了对NNRTI、NRTI和PI类药物耐药的毒株,需加强对出入境人群的监测以降低传播风险,在实施抗病毒治疗时需考虑感染者的耐药情况。3.我国海关出入境HIV-1新发感染人群存在跨境传播情况,需针对HIV流行特点采取有效监测和防控措施,有效控制跨境传播。
丁奕博[2]（2021）在《中缅边境地区HIV-1流行特征及其病毒对M36.4抗体敏感性研究》文中研究指明研究背景获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus,HIV）引起的严重威胁人类健康的全球范围流行的重大传染病。受“金三角”毒品泛滥影响,缅甸是全球HIV-1流行情况最严重的、亚型最复杂的国家之一。中国云南位于中缅边境地区,是我国HIV-1亚型最复杂、流行最早的地区,艾滋病防控形势尤其严峻。这一地区每年新报告的外籍HIV感染者数量不断上升。2017年边境城市德宏州新报告的感染者中缅甸籍占比达到了 71%。缅甸籍HIV-1感染者在中缅边境地区HIV-1传播中扮演了重要角色,跨境传播情况和变化值得关注。但关于这一地区HIV-1毒株的跨境传播情况、相互影响程度还不清楚。同时该地区个别地市的治疗前耐药率超过中等流行水平,尚需对耐药性进行全面而系统地描述。广谱中和抗体（Broadly Neutralizing Antibodies,bNAbs）为 HIV-1 的治疗,特别是针对耐药病毒的治疗带来了新的方案。由于中和效果好、安全性出色并参与宿主的免疫反应,bNAbs正在不断创新和发展。M36.4抗体针对辅助受体结合区,表现出对多种HIV假病毒的广谱中和活性。但缅甸入境感染者重组毒株形式复杂,与中国云南毒株联系紧密,抗体对这些毒株的中和效果不得而知。同时M36.4尚未明确结合位点和病毒耐受抗体的机制,也需进一步探索。研究目的分析中缅边境HIV-1感染者序列和流行病学特征,揭示中缅边境地区跨境传播情况,中国主要流行株在中缅边境地区的传播模式。进一步通过构建缅甸籍入境感染者假病毒,检测M36.4抗体中和敏感性,揭示病毒对M36.4抗体的逃逸位点。为精准干预HIV-1跨境传播提供科学数据。研究方法1.1994-2020年中缅边境地区分子网络的构建和传播模式分析:实验室序列库和HIV database数据库中检索所有缅甸和云南感染者pol区序列。测序2016年保存的云南边境地区感染者血浆样本。进一步在2019年3月至2020年4月期间,在中缅边境德宏州连续采样新报告的缅甸籍HIV-1感染者血浆样本测序,并进行分子溯源。使用全部已知序列,构建中缅边境地区分子传播网络,以推断序列之间的潜在传播关系,挖掘跨境传播相关因素。进一步基于贝叶斯随机搜索变量选择方法（BSSVS）分析毒株空间动态,使用非对称迁移模型（Markov Jump）估算所有地区之间预计的迁移事件计数,以量化中国主要流行株在地区间的流向和流量。计算所有预计的迁移事件的贝叶斯因子（BF）给予这种传播关系统计学支持。2.2009-2017年中缅边境地区小年龄（16-25岁）HIV-1感染者流行特征分析:从总数据集中抽取实验室2009-2017年保存中缅边境城市德宏州未治疗的小年龄组（16-25岁）HIV-1感染者序列,以代表当地传播性耐药流行情况,结合临床和人口学资料分析耐药的相关因素。通过构建小年龄分子传播网络,计算网络聚类程度。3.M36.4抗体对缅甸入境毒株的中和敏感性分析进一步从2019-2020年新报告缅甸籍中挑选有代表性的感染者样本,构建假病毒株。在TZM-bl细胞系上检测M36.4抗体对假病毒的中和敏感性。作为对照的是CD4结合区（CD4bs）mD1.22抗体,和三种进入抑制剂:T20、C34以及聚乙二醇（PEG）化 C34。在MT2细胞系上稳定传代HIV-1 SF33实验室适应株,连续12周或更长时间梯度添加M36.4抗体,给予SF33毒株体外抗体选择压力。每10天测序病毒env区全长序列,筛查抗体逃逸位点,并预测蛋白结构变化。通过点突变构建存在相关位点的假病毒。在TZM-bl细胞系上检测突变前后抗体中和敏感性的变化。研究结果1.1994-2020年中缅边境地区HIV-1分子传播网络①测序2016年病免室保存的德宏、红河、西双版纳新报告的HIV-1感染者血浆样本,获得缅甸籍序列90条,中国云南序列92条;测序2019-2020年收集的德宏新报告的缅甸籍样本,获得序列475条。②序列库中检索到云南序列1396条,缅甸籍序列327条,时间从2004-2018年。③网络中已发表序列中检索到2404条云南省和597条缅甸籍的序列,时间从1994-2018年。共计5380条序列纳入分子传播网络研究,其中中国籍3892条,缅甸籍1488条。HIV-1 亚型包括 CRF01AE 1324（24.6%）,CRF07BC 533（9.9%）,CRF08BC 1268（23.6%）,URF 1191（22.1%）,B 亚型 249（4.6%）,C 亚型 592（11.0%）,其他222（4.1%）。缅甸籍B亚型、CRF01AE和CRF08BC 比例逐年下降,URF、C比例显着上升;而中国籍CRF01AE、B亚型、URF、CRF07BC比例逐年下降,CRF08BC和C亚型比例显着上升。总体耐药率为6.5%,以耐NNRTI类药物为主,缅甸和云南耐药位点类型分布具有显着差异。1%基因阈值构建488个分子传播网络,由1915（36%）位受试者构成,形成5257条边。其中男性、MSM、C亚型更易入网成簇,2014年之后入网率显着降低。13.7%的网络为跨境网络,其中缅甸籍、PWID、MSM、C亚型及BC重组型更易进入跨境网络。4.03%（157/3892）的中国籍与缅甸籍存在链接,7.99%（119/1488）的缅甸籍与中国籍有链接,跨境节点危险因素为缅甸籍、PWID、MSM和BC重组型。累计跨境节点比例（23.4%～5.13%）和形成的跨境边比例（20.18%～9.07%）呈逐年下降趋势,2014之后跨境节点主要为德宏州和缅甸籍样本。2019-2020年德宏新报告的缅甸籍HIV-1感染者3%为跨境节点,跨境传播持续存在。分子溯源结果显示85%的毒株可能来自中国,B亚型、CRF07BC、CRF08BC更可能来源于中国。2.1994-2020年中缅边境地区HIV-1传播模式通过贝叶斯离散地理分析方法估计本地区亚型估计起源时间:（1）B亚型从泰国进入德宏（1985.4,95%CI 1982.0-1988.8）。（2）C亚型从印度进入缅甸（1980.76,95%CI 1977.12-1983.4）。（3）CRF01AE 2 簇从越南进入红河一带（1997.7,95%CI 1997.1-1998.3）;CRF01AE 4 簇来自昆明一带（1999.9,95%CI 1996.7-2003.1）;CRF01AEother簇从泰国进入缅甸（1992.5,95%CI 1992.0-1993.0）。（4）CRF07BC other 簇起源自昆明一带（1994.3,95%CI 1993.4-1995.3）,1996.0 年（95%CI 1995.3-1996.7）出现在缅甸;CRF07 BC MSM 簇从昆明一带进入（2003.4,95%CI2001.2-2005.7）,2003.8 年（95%CI2001.1-2006.5）出现在缅甸。（5）CRF08BC 起源自云南（1992.8,95%CI 1991.1-1994.5）,1996.2 年（95%CI 1994.3-1998.1）出现在缅甸。聚类分析结果:CRF01AEother簇、B和C亚型在缅甸存在稳定的本地传播簇,其余CRF尚没有在缅甸形成稳定的本地传播簇。通过贝叶斯随机搜索变量选择方法获得了病毒流量估计比例:CRF01AE other簇、C亚型在整个流行史中缅甸输入云南的传播事件分别占该亚型总传播事件的 97.7%和 63.6%;CRF01AE2 簇、CRF01AE4 簇,CRF07BCother 簇,CRF07BC MSM簇,CRF08BC主要在云南内部传播,在整个流行史中云南输入缅甸的传播事件分别占该亚型总传播事件的28.6%、5.0%、9.5%、7.3%、16.4%。B亚型中,德宏输入缅甸传播事件占该亚型总传播事件的58.5%,缅甸输入德宏传播事件占该亚型总传播事件的24.7%。3.2009-2017云南德宏小年龄HIV-1感染者流行特征573名纳入研究的云南省德宏州2009-2017年小年龄组（16-25岁）感染者最常见的感染途径是异性性传播（70.51%）,其次是PWID（19.20%）和MSM（8.90%）。HIV-1基因型主要为独特重组型（URF）（33.7%）,CRF 35.0%,C亚型27.4%,B亚型3.8%。平均传播性耐药（TDR）率为6.3%（36/573）,传播性耐药率逐年上升显着（3.48%-9.48%,p<0.05）。NNRTIs、NRTIs 和 PIs 的耐药率分别为 3.49%、2.62%和0.52%。耐药毒株94.40%只对单一类别药物耐药,最常见的耐药突变是Y181C和K103N。携带耐药位点的感染者平均CD4计数低（373/mm3与496/mm3,p=0.013）。通过HIV-TRACE构建了83个分子网络（入网率44%）,49%为跨境网络（41/83）,MSM,缅甸籍和耐药毒株的跨境传播风险高。中国籍男性PWID网络同配性为0.30,缅甸男性PWID为0.20,MSM为0.14。4.M36.4对缅甸入境样本假病毒中和敏感性通过测序获得2019-2020年样本env区全长序列。构建了 4株有代表性的假病毒株,env 区分别为 CRF07BC 型、CRF08BC 型、URF01C 型、URFBC 型。M36.4对4株临床假病毒株平均IC50为0.11μM;对照抗体mD1.22平均IC50为0.37μM;对照药物 PEG40K-C34 平均 IC50 为 0.99μM,C34 平均 IC50 为 0.005μM,T20 平均 IC50 为 0.28μM。5.病毒对M36.4逃逸位点筛选制备了 SF33实验室适应株,测定M36.4对其IC50为3nM。共进行140天抗体压力试验,MT2细胞传代21代,培养体系中M36.4抗体浓度达到177nM（IC50的59倍）,仍可观察到病毒介导的细胞融合现象。通过多时间点测序获得了 env区5个位点的突变,经过点突变SF33env质粒构建了含有突变位点的假病毒,最终筛选到一个有效的抗体逃逸位点,SF33env327位氨基酸由R突变为K,位于其SF33 V3环第31位。使M36.4和mD1.22抗体对SF33env假病毒的中和敏感性下降了 11.5倍和60倍,对3种进入抑制剂没有显着影响。结论1.中缅边境地区亚型复杂多样,未知重组比例高。1994-2010年跨境传播节点比例逐年减弱,2010年之后稳定在5%,目前跨境传播持续存在。中缅边境地区HIV-1跨境传播桥梁人群为PWID,MSM,缅甸籍,主要携带C及BC重组型,桥梁地区是德宏。2.中缅边境HIV-1流行史中,中国主要重组流行株在中缅之间存在不均衡的双向传播。CRF01AE 2 簇、CRF01AE4 簇,CRF07BC other 簇,CRF07BC MSM簇,CRF08BC主要在云南内部传播;CRF01AEother簇和C亚型主要由缅甸输入;B亚型双向传播比例较高。量化了的病毒在中缅边境各地区之间的传播流量,可以为相应亚型的个性化干预提供参考。3.青年HIV-1感染者传播性耐药率已达到中等耐药流行水平,携带耐药位点的感染者CD4计数较低,提示在HIV重组热点地区开展抗逆转录病毒治疗前需要考虑耐药性。MSM和缅甸籍男性PWID人群存在多种途径混合传播,缅甸籍女性和中国籍男性之间异性性传播比例较高。4.M36.4抗体对4种缅甸入境者假病毒（01C重组型,BC重组型,CRF07BC,CRF08BC）抑制效果良好。V3环R31K突变会引起病毒对M36.4和mD1.22两种抗体的抵抗力显着上升。
万政伟[3]（2021）在《人持续性G病毒二型在中国人群中的检出及其感染性克隆初步探索》文中认为研究背景人持续性G病毒二型（Human Pegivirus Type2,HPgV-2）于2015年英国和美国研究团队首次报道。进化分析发现该病毒属于黄病毒科病毒,与人感染的HPgV（GBV-C）同属于黄病毒科Pegivirus属病毒。目前关于HPgV-2的研究主要是通过观察性研究描述该病毒在人群中的感染特点而HPgV-2病毒的细胞嗜性和致病性尚无任何研究报道。研究发现,HPgV-2主要经血传播,尤其是静脉注射感染。该病毒大多与丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）共感染,HCV人群中HPgV-2核酸阳性率为0.29%-2.4%。健康献血员人群、HBV单独感染者、HIV-1单独感染者中很少报道有HPgV-2核酸阳性者。Pegivirus属病毒除了人感染的HPgV（GBV-C）和HPgV-2外,也有陆续报道其他动物感染的相关病毒。和其他种属感染的Pegivirus病毒一样,HPgV-2很难在体外进行分离培养,这直接影响该病毒感染机制及生物学特性研究。研究目的和意义（1）建立HPgV-2的血清学和核酸检测方法,筛查相关人群,探索HPgV-2在不同人群中的感染情况等流行病学特征。（2）扩增国内HPgV-2病毒株全序,分析该病毒基因组特点和分子进化关系。（3）探究HPgV-2对人群宿主的潜在危害及细胞嗜性。（4）尝试建立HPgV-2的体外培养体系,进一步研究该病毒的生物学特性以及和HCV/HIV-1共感染关系。研究内容及方法1、人群调查（1）建立HPgV-2的血清学和核酸检测方法,筛查该病毒在不同人群中的感染情况。（2）扩增HPgV-2的全长基因组序列,并分析该病毒序列变异情况和分子进化关系。2、病毒的致病性和细胞嗜性研究（1）比较HPgV-2感染者肝功能血清学指标,探索HPgV-2对肝脏损伤指标的影响。（2）随访HPgV-2的HCV/HIV-1感染患者,观察HPgV-2的感染状态。对比HCV病毒清除前后肝功能血清指标和肝脏病理改变结果,探索HPgV-2与肝脏损伤的关系。（3）在随访过程中获取患者的肝脏组织和PBMCs,通过免疫组化和核酸原位杂交及核酸扩增方法确定HPgV-2的细胞嗜性。3、感染性克隆构建,探索体外培养方法（1）分析质粒载体和HPgV-2全基因组序列,确定单克隆位点,并合成单克隆位点序列,构建含单一克隆位点的质粒骨架载体。（2）运用PCR方法分段扩增HPgV-2全基因组序列,采用酶切连接方法将扩增片段逐一插入载体,构建HPgV-2全基因组克隆。（3）获得的HPgV-2全基因组克隆,经线性化及体外转录获得病毒全基因组RNA。（4）利用脂质体转染方法将HPgV-2全基因组RNA转染进入细胞系,经过细胞系培养及核酸和抗原检测等方法确定病毒是否体外拯救成功。主要结果1、HPgV-2的基因变异及感染特点研究（1）HPgV-2的抗原和核酸检测方法建立本研究合成了三条HPgV-2基因组部分序列多肽（P4,P9,P16）,以此建立了酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测血清中的anti-HPgV-2抗体。参考已报道的HPgV-2基因组序列,设计了针对HPgV-2 5’UTR和NS3区域的巢式PCR扩增方法以及该病毒的核酸定量qRT-PCR检测方法。（2）HPgV-2的基因变异性分析本研究采用RT-PCR分段扩增方式获得6条HPgV-2近似全长核酸序列。通过基因组进化分析,发现目前已发现的国内HPgV-2株和国外毒株之间的变异非常小（93.6%-97.8%）。同时,HPgV-2在进化关系上和蝙蝠体内的持续性G病毒最为接近。（3）HPgV-2人群感染特点分析本研究收集了不同人群横断面血清样本共计8198份,检测结果提示HPgV-2和HCV、HIV-1感染相关;HCV人群中,HPgV-2抗体阳性率（1.23%）是健康献血员的8.23倍。在HCV/HIV-1共感染人群中,HPgV-2抗体阳性率（8.91%）是健康献血员的59.66倍,是HCV人群的7.25倍;HPgV-2核酸阳性率（3.47%）是 HCV 人群（0.29%）的 12.08 倍。2、HPgV-2在人体内感染状态、致病性及细胞嗜性研究（1）观察到HPgV-2在人体内能形成持续性感染及一过性感染两种状态,且能够独立于HCV,HIV-1形成稳定感染本研究收集了南方医院240例HCV感染者和广州市第八人民医院512例HCV/HIV-1共感染者样本,对HPgV-2核酸阳性患者进行纵向观察,发现HPgV-2在病人体内形成长达5年的持续性感染状态。同时,也观察到HPgV-2病毒从阳性到转阴的一过性的感染状态。当HPgV-2/HCV共感染患者接受直接抗病毒药物（DAAs）治疗时,HPgV-2不受DAAs药物抑制,能够在患者体内维持稳定感染状态;HCV病毒清除后继续随访半年,HPgV-2仍能在患者体内稳定存在。（2）HPgV-2对肝脏指标（肝功能血液指标、病理指标）HCV感染者中,HPgV-2 RNA阳性和阴性感染者之间ALT水平没有显着性差异（P=0.776）;HPgV-2血清学阳性感染者与阴性感染者ALT水平无显着性差异（P=0.298）;HPgV-2抗体水平高低（OD≥1.0或者OD<1.0）感染者ALT水平也没有显着影响（P=0.623）。HPgV-2/HCV合并感染患者接受DAAs治疗后,HCV被清除而HPgV-2在患者体内单独持续感染过程中,对比感染者肝脏指标和病理特征发现,HPgV-2未导致患者的肝脏指标异常或明显肝脏病理特征改变。（3）HPgV-2的细胞嗜性免疫组化实验只在肝组织浸润的淋巴细胞内检测到HPgV-2抗原信号;RNA原位杂交在肝脏细胞和浸润淋巴细胞中都能检测到HCV信号,但只在浸润淋巴细胞中检测到微弱的HPgV-2 RNA信号。RNA正负链原位杂交实验在外周血PBMC细胞中检测到HPgV-2正负链RNA信号（阳性率分别为8%-10%,5%-6%）以及HCV病毒的正负链RNA信号（阳性率分别为6%-11%,4%-6%）。CD4+、CD8+T细胞及B淋巴细胞亚群经流式分选富集后利用HCV/HPgV-2正负链RNA扩增实验主要在B淋巴细胞亚群中扩增到HCV和HPgV-2正负链 RNA。3、HPgV-2感染性克隆构建本研究分段扩增了 HPgV-2全基因组并通过单一酶切位点逐一连入骨架载体,成功获得了 HPgV-2全长克隆。HPgV-2全长克隆经体外转录获得病毒全基因组RNA后转染Vero细胞,经核酸和抗原检测显示我们构建的全长克隆能够拯救出HPgV-2,但病毒传代发现不能形成持续有效的感染。结论1、本研究确定中国人群中存在人持续性G病毒二型（HPgV-2）感染。目前已发现的中国HPgV-2株和国外HPgV-2病毒株基因序列高度保守。HPgV-2主要感染HCV人群,合并HIV-1感染显着增加HCV人群中HPgV-2感染率。2、HPgV-2在感染者体内能形成长达5年以上的稳定感染;DAAs药物或不能抑制HPgV-2复制;HPgV-2可以不依赖HCV/HIV-1病毒在患者体内形成单独的持续感染状态。3、HPgV-2不感染肝脏细胞,也不引发明显的肝脏损伤;研究结果首次发现HPgV-2是一个淋巴细胞嗜性病毒,且主要感染B淋巴细胞。4、本课题成功构建了 HPgV-2基因组全长克隆,但尚不能稳定组装成具有持续感染性的病毒颗粒。
王云飞[4]（2021）在《基于金属有机配合物的生物传感器的制备及应用》文中指出金属有机配合物,诸如金属有机框架（MOF）、无限配位聚合物等,倍受科学家们的关注。此类材料具有优异的电化学性能,在电化学发光与分子荧光分析检测方向有着广阔的应用前景。本论文基于金属有机配合物与其他材料的有效复合,构建了具有优异性能的生物传感器并将其应用于对目标物的检测。具体工作如下:第一章:绪论部分简述了纳米复合材料、生物传感器的分类和应用及荧光分析法的原理,并对本论文的拟开展内容和意义做了简单介绍。第二章:基于多层片状Ti3C2Tx材料修饰的ZIF-8合成了一种电化学发光（ECL）传感器,并用来检测HIV-1蛋白。在1 f M1 n M范围内得到的线性关系为ΔI=0.9528 lgc–7.887（R2=0.9935）,最低检出限（LOD）为0.3 f M。结果表明,该生物传感器不仅大大提高了电极的导电性,而且具有优异的电化学性能。此外,对实际样品中HIV-1蛋白的检测也得到了令人满意的结果。第三章:报道了一种以环糊精为基础的MOF（CD-MOF）,并用其包裹Ru（bpy）32+,进而构建了一种三明治型的ECL生物传感器。在最佳的实验条件下,所建立的生物传感器具有较高的灵敏度,检测限为6 pg mL-1,能够检测细胞角蛋白19片段抗原21-1（CYFRA21-1）的线性范围为0.1200 ng mL-1。经过生物毒性试验,CD-MOF@Ru（bpy）32+对活体细胞具有较低的毒性。将所设计的生物传感器进一步应用于小鼠A549肺癌细胞中CYFRA21-1的测定,得到了令人满意的结果。第四章:通过具有框架结构的无限配位聚合物Tb-GMP来包裹铜纳米团簇（Cu NCs）,制备了一种具有良好发光性能的分子荧光生物传感器。荧光强度的变化差值与碱性磷酸酶浓度在02 U mL-1的范围内呈现良好的线性关系,LOD为0.02 U mL-1。将合成的纳米复合材料进一步应用于湖水中碱性磷酸酶的检测,回收率为96.70108.2%,结果令人满意。
李曦[5]（2021）在《HIV感染导致人内源性逆转录病毒K族（HERV-K）转录水平差异的研究》文中指出背景:人类内源性逆转录病毒（Human Endogenous Retrovirus,HERVs）是人类进化过程中感染并整合到人类基因组中的逆转录病毒,其基因组约占人类总基因组的8～9%。在人体细胞生命周期中HERVs基因具有重要的生理功能,参与人类进化、生殖发育、免疫调控等。例如,在生殖发育过程中,HERVs基因直接影响了受精卵的着床、发育、基因转录与表达。人类基因组计划的研究结果显示,大多数HERVs基因都有突变、缺失或插入等变异存在,这使大部分HERVs失去了形成感染性病毒颗粒的能力。其中,K族（HERV-K）是最具有病毒生物学活性的一类HERVs基因,有复制能力的HERV-K如果被异常激活可能会导致疾病。HML-2是HERV-K中整合进人类基因组的时间最晚,生物活性最活跃的成员。研究发现,一些疾病的发生可能与HERV-K（HML-2）的转录上调、病毒蛋白的异常表达或HERV-K（HML-2）自身抗体的产生有关。目前已在多种自身免疫性疾病和恶性肿瘤患者中发现HERV-K（HML-2）的转录和表达产物。尽管这些研究报告的数量不断增加,但是仍未确定其中的因果关系。此外,另一部分研究表明,许多外源性病毒感染也可增加HERV-K（HML-2）的转录水平,这提示其他病毒感染能够激活人类基因组中的HERV-K（HML-2）前病毒,其转录与表达可能被其他病毒感染激活。人免疫缺陷病毒1型（Human Immunodeficiency Virus,HIV-1）是一种外源性的逆转录病毒,也可以整合到被感染者的基因组中,由于HIV-1与HERV-K（HML-2）同属逆转录病毒,两者的基因组元件非常相似,在HIV-1感染和复制过程中,一些中间产物或功能元件可能导致HERV-K（HML-2）的激活。与之相反,HERV-K（HML-2）的异常激活也可能影响HIV-1的复制调控。临床研究发现,70%的HIV-1感染者体内可检测到HERV-K（HML-2）相关抗体,在HIV-1脑病患者的脑组织中HERV-K（HML-2）转录水平升高。HIV-1感染者血浆中HERV-K（HML-2）部分RNA片段转录上调。然而,截止到目前,HIV-1感染与HERV-K（HML-2）转录和表达的内在关系还没有明确的结论。目的:（1）以我国不同HIV-1亚型感染者为研究对象,检测分析外周血淋巴细胞中HERV-K（HML-2）的转录水平是否与HIV-1病毒亚型和体内病毒载量存在相关性。（2）然后利用不同亚型HIV-1毒株体外感染不同组织来源的细胞模型,观察HIV-1感染所致细胞内HERV-K（HML-2）的转录水平变化,比较不同细胞模型感染后HERV-K（HML-2）的转录表达水平差异;（3）选择HERV-K（HML-2）转录表达水平上调明显的的细胞株,构建稳定表达HIV-1不同亚型毒株Tat蛋白的单克隆细胞株,确定HIV-1不同亚型毒株Tat蛋白激活HERV-K转录的差异。最终概括HIV-1感染在体内和体外激活HERV-K（HML-2）转录的作用,并初步探索可能的机制。方法:（1）收集未经抗病毒治疗HIV-1感染者和健康献血者的外周淋巴细胞（PBMCs）样本,通过RT-PCR扩增测序法鉴定HIV-1感染者的病毒基因亚型;采用实时定量PCR技术检测PBMCs中HERV-K（HML-2）的转录水平,分析不同HIV-1亚型间及HIV感染者与健康人之间HERV-K（HML-2）转录水平的差异。结合感染者流行病背景信息中的HIV病毒载量,分析病毒载量与HERV-K（HML-2）转录水平之间的相关性。（2）使用不同HIV-1亚型毒株（B亚型、CRF01＿AE）体外感染（MT2、H9、TZM＿bl等）不同细胞模型,确定HIV-1最适感染剂量（MOI）,在感染后不同时间分别取细胞及上清液。检测培养上清液中的HIV-1 p24抗原及细胞中的HIV-1RNA,确认HIV-1是否已成功感染及复制。使用实时定量PCR和RNAscope技术方法检测各组细胞感染模型HERV-K（HML-2）的转录水平,比较各组细胞及其感染前后的差异。（3）选择最适HIV-1感染的细胞模型,依托pLVX-TetOn系统构建可调控的稳定表达不同HIV-1亚型（B亚型、CRF01＿AE）Tat蛋白的细胞模型,探索不同HIV-1亚型的Tat蛋白对HERV-K（HML-2）转录激活的影响,比较不同HIV-1亚型的Tat蛋白对细胞内HERV-K转录水平影响的差异。结果:（1）获得106例HIV-1感染者的pol区基因序列、近似全长基因序列28条、5’端半分子序列15条,3’端半分子序列2条。结合感染者的流病信息最终鉴定了其中95例HIV-1感染者的病毒基因亚型,其中B亚型占41%（39/95）,CRF01＿AE占25.3%（24/95）,CRF07＿BC占24.2%（23/95）,CRF01＿AE/CRF07＿BC重组亚型9.5%（9/95）。通过近似全长基因序列及流行病学信息分析,确认一个由CRF01＿AE与CRF07＿BC重组的毒株为新型流行二代重组毒株（Circulate Recombinant Forms,CRF）,鉴定了其基因组嵌合结构及重组片段的来源,该基因型被美国HIV Databases,btf@lanl.gov数据库收录并命名为CRF102＿0107。（2）B亚型HIV-1感染者HERV-K（HML-2）gag区的转录水平相比健康对照显着上调（P<0.05）,而非B亚型毒株（CRF01＿AE、CRF07＿BC等）感染者的HERV-K（HML-2）pol区转录水平相比健康对照组显着上调（P<0.05）。感染者体内病毒载量与HERV-K（HML-2）各区的转录水平不存在明显的相关性（P>0.05）。（3）与未感染的细胞相比,HIV-1ⅢB毒株体外感染不同细胞株48小时后HERV-K转录水平上调,感染MT2细胞系后HERV-K（HML-2）转录水平上调约5倍（p<0.05）,感染H9和TZM＿bl细胞上调约1.5倍（P<0.05）。与未感染的MT2细胞相比,HIV-1 GX002株（CRF01＿AE重组亚型）感染MT2细胞48小时后HERV-K（HML-2）转录水平上调15倍（P<0.05）,GX002株感染导致HERV-K（HML-2）转录上调的水平显着高于ⅢB株和NL4-3毒株（P<0.05）。RNAscope的实验结果显示,感染24小时后ⅢB株、NL4-3株和GX002株HERV-K（HML-2）的转录均轻微上调,感染48小时后三组均上调明显,并且GX002组上调的程度更高,与实时定量PCR实验结果一致。（4）成功构建可调控稳定表达Tat蛋白的MT2细胞模型,包括pLVX-Tet On-NL4-3-Tat（B亚型）、pLVX-Tet On-GX002-Tat（CRF01＿AE重组亚型）和pLVX-Tet On-puro（空载对照）。发现不同亚型HIV-1 Tat蛋白对MT2细胞内HERV-K（HML-2）转录水平的影响存在差异（P<0.05）,B亚型和CRF01＿AE组分别上调了约4倍和2倍。结论:（1）发现和鉴定了1个新型二代流行重组HIV-1毒株（CRF）,被美国HIV Databases,btf@lanl.gov数据库收录并命名为CRF102＿0107。CRF102＿0107的发现为我国HIV防治工作提供了新的研究参考信息。（2）通过对HIV-1感染者和健康对照者的PBMCs检测,发现未经抗病毒治疗HIV-1 B亚型感染者体内HERV-K（HML-2）gag区的转录水平较健康人有所上调。HIV-1非B亚型（CRF01＿AE、CRF07＿BC）感染者体内HERV-K（HML-2）pol区的转录水平较健康人有所上调。不同基因亚型HIV-1感染者的HERV-K（HML-2）转录水平存在差异,需要进一步研究解释可能的机制。感染者体内病毒载量与HERV-K（HML-2）各区的转录水平不存在明显的相关性。（3）通过体外感染实验发现,不同细胞模型对HIV-1易感性不同,主要体现为相同时间内病毒复制能力不同,以MT2细胞系最为易感。不同亚型的HIV-1毒株感染导致MT2细胞HERV-K（HML-2）转录水平上调程度差异较大。CRF01＿AE毒株比B亚型毒株调节HERV-K（HML-2）转录水平上调的作用更强。（4）Tat蛋白可以激活MT2细胞内HERV-K（HML-2）的转录,且不同HIV-1亚型毒株的Tat蛋白上调HERV-K（HML-2）的能力存在差异,B亚型毒株相比CRF01＿AE毒株的Tat蛋白具有更强的调节HERV-K（HML-2）上调的作用。
王晓蕊[6]（2021）在《2011-2018年深圳地区HIV-1新型重组毒株形成及流行特点研究》文中认为人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）分为HIV-1型和HIV-2型,HIV-1型又分为M、N、O、P组,其中,M组为HIV在全球引起广泛流行与传播的主要组。HIV-1具有高度的基因多态性,现已发现HIV-1型M组至少包括10种纯亚型（A-D、F-H和J-L）,由于其亚型间易发生重组,目前已报道118种HIV-1 流行重组毒株（Circulating Recombinant Forms,CRFs）,同时,许多HIV-1独特重组毒株（Unique Recombinant Form,URF）也不断被发现。HIV-1重组是造成HIV-1基因多样性的主要原因,不同基因型的HIV-1可能导致HIV-1感染者的疾病进展存在差异。自1990年以来,全球HIV-1重组毒株引起的感染已从9.3%（1990-1999年）快速上升到22.8%（2010-2015年）,中国在内的东亚地区是全球HIV-1亚型间重组最高的地区,高达80.5%。研究发现,中国男男同性性行为者（Men who have sex with men,MSM）中存在高水平的URFs（10例中的9例）传播,提示目前关于CRFs的流行数据可能是被低估的,很多URFs实际已流行和传播。深圳作为我国重要的出入境口岸城市,大量人员流动有利于HIV-1的快速播散,且容易出现各种亚型毒株同时分布及流行的复杂态势。前期在深圳的研究发现,该地区MSM人群至少存在10个以上HIV基因型,同一地区同一人群多个亚型的同时流行为该地区URFs的产生提供了条件。本研究以HIV国际基因数据库和实验室前期在深圳地区产出的大量HIV基因数据为基础,阐明了中国HIV重组毒株的流行状况,鉴定了重要重组毒株基因组结构,分析了重组形成机制和流行特点。目的:1.阐明我国HIV-1新型重组毒株的实际流行状况。2.确定深圳HIV-1新型重组毒株发生状况及其基因组特点。3.分析深圳HIV URFs毒株感染者双重感染与劣势耐药的发生状况。方法:1.基于HIV国际数据库中国HIV-1 pol（2253-3252nt）基因片段序列（至2018年）,通过亚型分析、系统进化分析和聚簇分析鉴定潜在流行重组型毒株（pCRFs）和新型CRFs,分析pCRFs和CRFs的基因组特点,推断新型CRFs的起源时间。2.以深圳地区新诊断的HIV-1感染者为研究对象,结合其背景信息,分析其体内HIV-1 pol区部分基因片段（1.3kb）序列,探究2011-2018年深圳HIV-1 URFs感染比例变化,鉴定新型CRFs;随机选取部分URFs感染者血浆样本（N=126例）,提取病毒核酸（RNA）,经过巢式聚合酶链反应（Nested Polymerase Chain Reaction,Nested PCR）分别扩增HIV-1 5’和3’半分子,拼接HIV-1近似全长基因组（Nearly Full-length genome,NFLG）,分析其基因组特征,发现新的CRFs。3.以病毒核酸为模板,利用Barcode标记引物,经过巢式PCR分别扩增HIV-1 gag 区（p24:1350nt-1831nt）、pol区（A 段:2147nt-2605nt;B段:2525nt-2976nt;C 段:2808nt-3250nt）和 env 区（gp41:8193nt-8654nt）基因片段,PCR 产物经纯化、定量后,送至测序公司进行深度测序,研究2011-2018年深圳地区HIV-1 URFs感染者体内病毒准种多态性,阐明双重感染与劣势耐药的发生状况,分析HIV-1重组机制。结果:1.我国HIV-1具有高度的基因多样性,存在许多潜在的CRFs和新的CRFs。至2018年,中国提交HIV国际基因数据库的病毒序列基因型超过30种,CRFs和URFs高达75.72%,一些在西非、古巴等地流行的CRFs（CRF06cpx和CRF18cpx等）已在中国出现,一些新的CRFs也在我国形成并短期内快速播散,如CRF5501B（323,2.12%）。系统进化分析最终发现pCRFs 17个,其基因组主要是由CRF01AE、B和C亚型重组构成。pCRFs流行人群分析显示,近半数（41.18%,7/17）pCRFs是在MSM人群中发现,提示MSM人群是CRFs形成和流行的关键人群。pCRFs序列组成分析显示,pCRF4和pCRF7包含的序列较多（16条和9条）,提示它们可能已经在中国流行与传播。研究同时鉴定1个新的CRF（CRF11501C）,其由CRF01AE和C亚型重组构成,包含11个来源不同的基因片段,起源时间分析显示其可能于2009.1-2009.7发生重组。2.深圳存在高水平的HIV-1亚型间重组,基因组构成主要以CRF01AE和CRF07BC为亲本毒株。深圳地区HIV-1流行以重组毒株为主（占94.29%）,高于全国（75.72%）。近年在深圳起源并暴发流行的新型重组毒株CRF5501B已成为仅次于CRF07BC 和 CRF01AE 的主要流行毒株。URFs（2.16%）主要由 CRF01AE、B和C亚型毒株重组形成,流行人群以30-39岁未婚男性青壮年人群为主,传播途径以男男同性性行为传播途径为主。近似全长基因组扩增测序共获得19条URFs近似全长基因组序列,都是以CRF01AE、B和C亚型为骨架,与参考序列比对显示B和C亚型片段均为CRF07BC起源,且CRF1090107的发现也说明深圳已出现大量以CRF01AE和CRF07BC为亲本毒株的二代重组毒株。3.深圳地区HIV-1双重感染率较高,二代测序更易检出劣势耐药株。深度测序分析显示,深圳地区HIV-1 URFs毒株感染者中双重感染流行率为38.10%,多基因区段分析结果表明双重感染的HIV-1基因型主要为CRF01AE和CRF07BC。基于1%的劣势耐药株检出限,HIV-1耐药发生率为26.19%。一代测序和二代测序检测蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitor,PIs）、非核a苷反转录酶抑制剂（Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NNRTIs）和核苷反转录酶抑制剂（Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NRTIs）耐药率分别为 0.00,11.90%;0.79%,3.97%（P=0.219）;0.79%,13.49%（P=0.000）,二代测序的NRTIs耐药位点检出率高于一代测序。结论:1.HIV国际基因数据库分析表明中国具有大量潜在的流行重组毒株（pCRFs）和新的CRFs,证实中国CRFs的实际流行情况被低估。2.深圳2011-2018年HIV-1新诊断感染者中存在大量的HIV-1 URFs感染,这些毒株的基因组构成以CRF01AE和CRF07BC为主,存在新的CRFs。3.深度测序可以应用于不同人群HIV-1感染者体内毒株准种研究,能够检出更多的HIV-1劣势耐药位点,能够用于HIV-1双重感染流行分析。
高庆华[7]（2021）在《云南地区艾滋病患者中预存耐药基因流行特征及HIV-1新重组型的命名》文中研究指明高效抗病毒逆转录疗法（HAART）在临床广泛的应用显着降低了HIV-1的感染率、发病率及其死亡率。然而,在长期的药物选择压力下HIV-1药物作用位点发生基因突变导致了药物的耐药性,为HIV-1的有效治疗带来了巨大挑战。近年来,全球HIV-1耐药人群有逐年增加趋势,WHO呼吁全球关注HIV-1耐药。云南位于我国西南边陲,毗邻东南亚国家,具有4060公里的边境线,自1989年德宏首次发现HIV-1以来,云南省一直受到HIV-1的危害,是目前我国HIV-1感染人数较多,艾滋病人群经HAART治疗最早的省份之一。基于云南的特殊地理位置,随着云南和东南亚国家的贸易往来和频繁的人口流动,致使云南地区HIV-1的流行呈现出变异速度快、基因型和重组型复杂多样的流行特征。然而,近年来云南地区未经治疗的HIV-1患者中预存耐药的比例如何?耐药基因突变特征与基因型和重组型之间的相关性如何?缺少系统和大样本的研究报道。基于此,本论文针对2017-2020年间1411例未经HAART治疗的艾滋病患者,研究该人群HIV-1预存耐药,以及耐药基因突变与基因型、重组型的相关性研究。首先,我们随机筛选2017-2020四年间的未经治疗的1411例艾滋病患者的血液样本。利用巢氏PCR技术对HIV-1的蛋白酶区和逆转录酶区进行扩增,其中1319例扩增成功并完成测序,成功率达93.5%。该人群中存在预存高度耐药突变比例为2.34%（32例）,耐药基因突变为K103N和G190A,对应的耐药性为非核苷类逆转录酶抑制剂依非韦伦和奈韦拉平产生高度耐药。此外,非高度耐药相关突变比例为19.1%,相关基因突变位点为V179D/T/E、E138A/G和V106I,对应的耐药性为非核苷类逆转录酶抑制剂利匹韦林低度影响。以上HIV-1预存耐药比例在2017-2020年间呈现出较为平稳的低流行特征。其次,为了进一步研究耐药突变和基因型之间的相关性,我们对云南地区2017-2020年HIV-1的基因型和重组型的流行进行分析。研究发现1319例HIV-1感染者中CRF08＿BC占40.3%、CRF01＿AE（21.7%）、CRF07＿BC（12.3%）、B（2.6%）、C（1.4%）、CRF55＿01B（0.45%）、CRF62＿BC（0.15%）及URF（21%）。URF中主要以B和C亚型的重组为主（20.5%）。从年度变化分析,CRF07＿BC比例呈现出由41%到20.5%的逐年减少,CRF08＿BC从20.9%增加到35.7%,URF从14.9%增加到44.9%。进一步经耐药突变特征和基因型、重组型相关性分析发现,CRF08＿BC中的预存耐药比例为2.83%,其耐药突变基因以K103N（1.32%）为主,对应的耐药性为奈韦拉平,其耐药率1.86%;其次为CRF01＿AE预存耐药比例为2.81%,其耐药突变基因以K103N（1.75%）为主,对应的耐药性为奈韦拉平2.81%和依非韦伦2.46%;CRF07＿BC预存耐药比例为1.86%,其耐药突变基因以Y181C（1.24%）为主,对应的耐药性为奈韦拉平1.86%。最后,基于上述云南地区HIV-1基因型和重组型研究,我们发现三组潜在HIV-1新的流行重组型（CRF）。为了进一步验证这三组序列为新的CRF。我们对这些样本分别进行了HIV-1全长序列同源关系进化树分析、基因重组模式分析、基因重组位点分析以及基于重组基因片段亚基因进化树分析。经过以上分析这三组HIV-1基因组符合HIV-1新重组型命名的规则,我们命名为CRF110＿BC、CRF118＿BC和一组待命名的以C为骨架插入了B片段的重组模式。为了进一步研究这三种新重组型毒株预存耐药特征,我们利用Sanger测序探究了其预存耐药性。研究结果发现,CRF110＿BC存在M184V（34%）/N（66%）、K103N（62%）/S（38%）、G190A（71%）、P225H（98%）四个位点突变,会对拉米夫定、奈韦拉平和依非韦伦产生高度耐药。CRF118＿BC存在M184V、V106A、V179D三个耐药相关突变位点,这些位点的突变会对恩曲他滨（FTC）、拉米夫定（3TC）、奈韦拉平（NVP）和依非韦伦（EFV）这四种药物产生高度耐药。未命名的CRF用NGS检测到E138A（6%）和S147G（6%）位点低频预存耐药基因突变,耐药性为利匹韦林低度耐药。综上所述,本论文总结了2017-2020年间云南地区HIV-1的预存耐药比率、耐药基因突变特征以及耐药性、耐药基因突变与基因型和重组型的相关性分析。此外,我们还发现和命名了三种新的HIV-1的重组型。该研究为云南地区艾滋病患者临床精准救治提供了重要科学数据,对于我国艾滋病治疗达到“三个90%”的目标具有重要的科学意义。
于丹葳[8]（2021）在《HIV-1融合蛋白gp41代偿性突变的功能及机制研究》文中进行了进一步梳理膜融合过程是HIV-1病毒入侵宿主靶细胞的首要步骤,而HIV-1包膜蛋白上的gp41亚单位是抗病毒治疗中的一个重要靶点。源自病毒CHR序列的多肽可以与病毒NHR区结合形成外源性的六螺旋束,从而有效阻止病毒膜融合过程的发生。恩夫韦肽（T20）是目前为止唯一美国FDA批准的可以用于临床治疗的多肽类膜融合抑制剂,近年来研究者们也设计了很多高效广谱的新型膜融合抑制剂,然而耐药问题始终是膜融合抑制剂发展中一个亟待解决的重要问题。在对新型短肽类膜融合抑制剂MTSC22的耐药筛选中,我们发现了两个位于gp41蛋白CHR区的代偿性氨基酸突变N126K和E136G,这两个突变经常伴随NHR一级耐药突变位点的产生而出现,并能提高病毒耐药性。本论文主要研究了 N126K和E136G两个代偿性突变对包膜蛋白结构和功能的影响,并对膜融合抑制剂的耐药机制进行了探索。本研究首先鉴定了N126K和E136G两个代偿性突变对多种膜融合抑制剂的敏感性,发现N126K单点突变能够产生轻度耐药（2-5倍）,E136G能够产生中度耐药（5-10倍）,而N126K/E136G双点突变能够产生较强的耐药效果（>10倍）。同时我们还选取了 HIV-1病毒中不同嗜性不同亚型的8个毒株NL4-3,92RW020,JRFL,AC10.29,REJO4541,QH0692,ZM53M.PB12,ZM109F.PB4,分别构建了带有N126K和E136G突变的假毒,确定了 N126K和E136G对多肽类膜融合抑制剂的敏感性的影响。功能研究结果表明,代偿性突变不影响包膜蛋白的表达和加工,但可以影响病毒感染靶细胞的能力;从结构生物学的角度出发,我们首先以病毒C34序列为模板合成了 N126K和E136G突变多肽,圆二色谱及等温量热滴定检测二级结构及其稳定性,结果表明N126K突变形成的6-HB稳定性和结合常数均高于野生型,而E136G突变形成的6-HB稳定性下降,结合常数增大。晶体结构解析直观反映gp41结构的变化:N126K突变后可以改变周围氨基酸侧链的构象,赖氨酸K取代天冬酰胺N后,可以与上游氨基酸E123形成氢键,使CHR自身稳定性增强,E123侧链位置的变化可以使6-HB疏水口袋与口袋结合区结合更紧密;同时,Y127与H53之间形成π键,稳定六螺旋束,这些构象变化共同导致了 N126K与病毒NHR结合更加稳定。E136G突变导致E136和H132间的离子键破坏,螺旋稳定性下降,但同时E49和E136间的电离排斥作用消失,NHR和CHR结合力增强。其次,本研究还探索了 N126和E136位点自然突变对病毒功能的影响,发现N126Y能够显着提高六螺旋稳定性,导致其对膜融合抑制剂产生较强的耐药作用。E136位点自然突变对病毒功能影响很大,多数E136自然突变均导致病毒入侵和融合能力严重下降。最后,我们鉴定了带有N126K和N126Y突变的C34多肽和T20多肽对于不同亚型的HIV-1病毒以及T20耐药株的抑制活性,发现这两个突变都能够使C34多肽的抗病毒活性略有升高,N126Y能够提高T20活性。对于包膜糖蛋白gp41结构和功能的研究是阐明膜融合抑制剂作用机制和耐药机制的重要前提。本文以CHR区N126K和E136G两个代偿性突变作为主要研究对象,阐明该点突变对病毒功能的影响及对膜融合抑制剂敏感性的影响,从结构生物学角度分析其作用机制,并对N126和E136位点的自然突变也进行了扩展研究,另外还基于N126K和N126Y对六螺旋稳定性的影响,鉴定了带有N126K和N126Y突变的C34及T20抑制活性。这样的研究不仅丰富了人们对HIV-1包膜蛋白的结构与功能的认识,而且能够加深对膜融合抑制剂的作用机制和耐药机制的理解,有助于研究者从多角度全面审视病毒和抑制剂之间的相互作用,为多肽类膜融合抑制剂的研发、改进和应用提供新的思路。
周建卫[9]（2020）在《猪圆环病毒的入核机制研究》文中研究表明猪圆环病毒（PCV）是猪圆环病毒病（PCVAD）的主要病原,是目前发现能在哺乳动物体内复制的最小DNA病毒,主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）。已有的研究分析了 PCV2的吸附、入侵、基因组的复制和转录调控等过程,但其胞内运输和入核机制尚不明确,病毒能否成功将遗传物质（环状DNA）运输至细胞核周并最终入核决定它能否进行有效复制。病毒与宿主间的相互作用是机体致病机理和免疫防御之间的一场旷日持久的拉锯战,其最终结局或是激活宿主的免疫防御系统以消灭病毒,抑或是劫持宿主的免疫防御机制以促进病毒的传播。因此,全面系统地了解宿主和病毒蛋白之间的相互作用以及病毒如何通过与宿主间的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPIs）劫持宿主细胞的生物学过程,可为探究病毒的复制与致病机制和开发新的抗病毒药物提供有效的信息和线索。本研究首先发现PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性,有利于PCV2病毒粒子的核靶向运输过程,且通过与HDAC6蛋白相互作用抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能,并最终促进圆环病毒的复制过程。其次从免疫共沉淀串联质谱方法入手,发现核仁磷蛋白NPM1能与PCV2Cap蛋白相互作用,且证明PCV2病毒以完整衣壳蛋白的形式经微管运输至细胞核周时,Cap蛋白能促使NPM1蛋白发生核穿梭,导致其由核仁易位至核质和胞质处,并通过与Cap蛋白直接结合介导病毒粒子的入核,从而促进猪圆环病毒的复制。最后,NPM1蛋白还能通过与PCV3 Cap蛋白NLS结合促进PCV3 Cap蛋白的核仁定位,NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用。1、PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程本实验室前期结果表明在PCV2病毒感染早期衣壳蛋白能通过募集胞浆动力蛋白的IC1亚基进行核靶向运输过程。为了分析其他宿主蛋白是否能通过影响微管的功能发挥参与调控PCV2的胞内运输过程以及PCV2能否调节微管蛋白的乙酰化修饰从而影响微管稳定性,我们通过PCV2感染和Cap蛋白表达处理PK-15细胞并分析乙酰化α-tubulin的表达水平,结果发现α-tubulin的乙酰化修饰水平大大提高;而通过HDAC6去乙酰化酶特异性抑制剂-Tubacin药物处理PK-15细胞后可以增强α-tubulin的乙酰化修饰水平并能促进PCV2的复制过程,该结果暗示了 PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性的功能。另外,我们还发现PCV2 Cap蛋白能与HDAC6蛋白共定位和直接相互作用,且Cap蛋白的N端区域（42-100aa）介导与HDAC6蛋白全长相互作用。PCV2 Cap蛋白能在体外和细胞内抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性。HDAC6蛋白能通过诱导α-tubulin发生去乙酰化修饰抑制PCV2病毒的复制从而发挥抗病毒作用,反过来PCV2也能通过Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能。综上所述,PCV2 Cap蛋白能通过与HDAC6相互作用抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性,维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并最终促进猪圆环病毒2型的复制过程。2、PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱PCV2 Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白,可以作为研究圆环病毒与宿主蛋白间相互作用的模型,以便更好地了解病毒的复制周期。本研究将免疫共沉淀（Co-IP）与液相质谱（LC-MS）技术相结合,在PCV2感染PK-15细胞中鉴定到222个与Cap蛋白潜在互作的宿主蛋白,并绘制出一张蛋白质-蛋白质相互作用网络图。GO注释和KEGG通路分析结果表明,与PCV2 Cap蛋白互作的宿主蛋白可能参与了蛋白质结合、DNA转录和复制、物质和能量代谢、先天性免疫应答、MAPK信号通路和剪接体信号通路激活等不同的生物学过程。Co-IP和 GST pull-down 实验证明 PCV2Cap 蛋白能与 hnRNPC、NPM1、DDX21、IC1等蛋白直接相互作用。PCV2Cap蛋白互作宿主蛋白可能会形成新的转录/复制复合体（replication-transcriptioncomplex,RTC）,在 PCV2 的复制和致病过程中起着极其重要的调控作用。3、NPM1蛋白调控PCV2病毒入核的机制研究病毒粒子的入核是PCV2复制的必要条件。然而,核仁穿梭蛋白在PCV2入核过程中的作用机制仍不清楚。本研究首次在PCV2Cap蛋白中鉴定到一个先前未知的、新的核仁定位信号（NoLS）,并发现PCV2能利用宿主的NPM1蛋白促进病毒的复制。激光共聚焦显微镜结果显示,在PCV2感染过程中,NPM1蛋白能从核仁易位至核质和胞质处。Co-IP和GST pull-down实验结果表明,PCV2 Cap蛋白能与NPM1蛋白直接相互作用。互作功能域的精细定位结果显示,PCV2 Cap蛋白NLS-A（1MTYPRRRYRRRRHRPRSHLG20）的精氨酸富集区（ARM）与NPM1-OligoD结构域的Ser48是介导二者相互作用的关键性氨基酸位点。病毒拯救结果表明,PCV2 Cap蛋白NLS-A中ARM的9个精氨酸（Arg）都突变为丙氨酸（Ala）将导致病毒的复制能力降低。NPM1蛋白的敲降和Ser48突变为Glu48都能抑制PCV2的复制。此外,激光共聚焦显微镜结果表明PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM是核仁定位信号（NoLS）。综上所述,PCV2Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,能够通过与NPM1蛋白直接结合促进PCV2病毒的入核。4、NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究NPM1蛋白对非组装的PCV3 Cap蛋白入核的作用机制尚不清楚。本研究首次鉴定到PCV3Cap蛋白新的核仁定位信号（NoLS）,它能利用NPM1蛋白促进自身的核仁定位。激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3Cap蛋白能与NPM1共定位于核仁。Co-IP和GST pull-down实验结果显示,PCV3 Cap蛋白能与NPM1蛋白相互作用。互作结构域的精细定位结果表明,来自陆地的、水生的和禽类的（包括猪、金丝雀、犬、水貂、蜻蜓、鸽、鸭、蝙蝠、鹅和鹦鹉）圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用,表明该互作在进化上极为保守;另外,NPM1-OligoD结构域中Ser48是介导与PCV3 Cap蛋白相互作用的关键性氨基酸位点。NPM1蛋白敲降后将抑制PCV3 Cap蛋白的核仁定位。此外,激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3 Cap蛋白的NLS是核仁定位信号（NoLS）,且NPM1蛋白中Ser48的电荷性质决定与PCV3 Cap蛋白的相互作用。综上所述,PCV3 Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,NPM1蛋白中Ser48的电荷性质对其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用至关重要。上述数据旨在阐明猪圆环病毒复制过程中借助HDAC6和NPM1蛋白实现胞内运输和入核的策略以及“核穿梭”机制,有助于进一步解析猪圆环病毒复制的分子机制以及鉴定潜在的抗病毒药物靶点。
周佳佳[10]（2020）在《我国16-25岁异性性传播感染者HIV基因变化及耐药特征研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:2019年1月-10月新报告HIV感染者中,异性性传播（heterosexual transmission,HET）占73.7%。该途径已成为我国HIV感染者/AIDS病人最主要的感染途径。2015年一份全国性调查显示在我国流行的HIV毒株有20多种,是全球流行毒株较多的国家之一,其中CRF01AE（39.0%）、CRF07BC（35.6%）和CRF08BC（8.9%）三种重组型毒株的构成比已经超过80%,所以我国不仅HIV流行毒株种类众多,而且是以重组型流行株为主的国家,因此这也是我国不同于其他国家的艾滋病流行特点,也是防控的难点之一。16-25岁较年青HIV感染者的性行为被认为在近几年发生,可近似代表HIV新近感染者的流行现状。故本研究拟以2008年-2018年11年间我国16-25岁HET的HIV感染者为研究对象,以期揭示HET人群中HIV毒株基因变化及耐药特征。研究方法:1.从我实验室2008-2018年历年的耐药监测数据中筛选16-25岁HET的HIV感染者（自报为HET）pol基因区序列,利用邻近参与法（Neighbor-Joining）进行系统进化分析,结合贝叶斯中的GTR模型和Gamma模型进行亚型及亚簇的流行史分析。应用HIV耐药数据库（https://hivdb.stanford.edu/）参考WHO耐药指南推荐选取的12种常用抗病毒药物,判别其耐药传播特征。2.对上述研究中不能明确归类为已知亚型（不能明确划分亚型）的po1基因区序列,进行下述进一步研究（1）了解我国部分地区2008-2018年16-25岁po1基因区不能明确划分亚型的HIV HET感染者基因特征。（2）选取部分代表性样本进行近全长基因扩增（约9000bp）。用HIV database在线工具（RIP和jpHMM）及SimPlot软件进行序列重组分析,确定新的HIV流行重组株。研究结果:第一部分共收集2008-2018年16-25岁HET感染者1990例,主要流行亚型为:CRF01AE（37.3%,742/1990）、CRF07BC（33.2%,661/1990）、CRF08BC（8.1%,162/1990）、B亚型（5.4%,107/1990）、CRF5501B（2.3%,46/1990）和新型重组亚型（1.5%,29/1990）,另有11.4%不能明确划分亚型（226例）;主要流行的亚簇为CRF01AE-Cluster 1（13.4%,267/1990）、CRF01AE-Cluster 4簇（11.7%,232/1990）CRF01AE-Cluster 5 簇（3.0%,60/1990）和 CRF07BC-MSM 簇（15.8%,314/1990）。以往主要在HET人群中流行的CRF01AE-Cluster 1呈下降趋势（P=0.001）,源自同性性传播人群的CRF01AE-Cluster 5、CRF07BC-MSM亚簇和CRF5501B亚型却呈上升趋势（P<0.01）。按性别分层发现,HET男性感染者中主要流行的亚簇为CRF01AE-Cluster 4（19.0%,188/990）和CRF07BC-MSM（25.1%,248/973）;HET女性感染者中主要流行的亚簇为CRF01-AE-Cluster 1（18.4%,179/973）和CRF07BC-Other（25.2%,245/973）,上述亚型亚簇构成比的变化趋势与分层前一致。CRF01AE-Cluster 4和CRF01AE-Cluster 5进入我国HET的时间约为 1996年和2000年,而进入MSM人群的时间分别为1994年和1995年,在两个人群中快速增长的时间段均为1997-2006年;CRF07BC-MSM和CRF5501B在HET人群中与MSM人群增长时期相同。本研究人群耐药率为2.8%（55/1990）,与16-25岁年龄组男男性行为（men having sex with men,MSM）人群（耐药率为3.0%）接近,低于2015年一份全国性调查中全年龄组人群的耐药率（3.6%）。分2008-2011年、2012-2014年和2015-2018年3个时间点看耐药率基本一致,无明显变化（P=0.458）。第二部分（1）不能划分亚型毒株以URFC和URFBC为主,二者共占总调查人群的84.1%（190/226）。43.8%（99/226）的不能明确划分亚型毒株在po1基因区发现存在2个及以上的亚型片段,另确定1例URFA1和5例URFG。（2）通过全长序列扩增新确定了两个CRFs（CRF10301B和CRF106cpx）。CRF103-01B是由3个B片段插入CRF01AE骨架重组形成的;CRF106cpx由2个CRF01-AE片段和3个B片段插入到C骨架重组形成的。研究结论:16-25岁年龄组异性HIV感染者男性中主要流行的HIV毒株的亚簇多于女性,与MSM人群流行亚簇种类一致。结合贝叶斯流行史分析结果显示HET中各亚簇的起源和流行上升时间与MSM相近。以往在异性人群流行的CRF01AE-Cluster 1在16-25岁异性人群中构成比在下降,而源自MSM人群的CRF01AE-Cluster 4、CRF01AE-Cluster 5、CRF07BC-MSM亚簇及CRF5501B亚型却在上升。我国16-25岁异性未治疗感染者中传播性耐药尚处于低水平。16-25岁年龄组中超过10%的异性传播感染HIV毒株不能归类为已知流行亚型,并存在多种潜在的新重组毒株;新流行重组株CRF10301B和CRF106cpx的确定不仅阐释了我国HIV亚型的复杂性,而且可以为以后更好的进行亚型分类分析提供帮助,同时也为诊断试剂疫苗药物等的研发提供数据支持。
二、HIV-1的分类与命名（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HIV-1的分类与命名（论文提纲范文）
（1）HIV-1新发感染综合判定研究及我国出入境人群的HIV-1新发感染特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 HIV -1新发感染综合判定研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 我国部分地区出入境人群的HIV-1新发感染特征分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HIV-1限制性抗原亲和力新发感染检测方法的影响因素及应用 |
| 参考文献 |
| 个人介绍 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（2）中缅边境地区HIV-1流行特征及其病毒对M36.4抗体敏感性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 中缅边境HIV/AIDS流行特征分析 |
| 第一章 中缅边境HIV-1传播模式分析 |
| 引言 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第二章 中缅边境小年龄组(16-25岁)HIV-1人群流行特征分析 |
| 引言 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第二部分 M36.4抗体对缅甸入境者假病毒株敏感性分析及体外逃逸位点筛选81引言 |
| 引言 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 结论与创新 |
| 研究局限性 |
| 附件 |
| 参考文献 |
| 综述 云南省与毗邻国家HIV-1流行现况 |
| 参考文献 |
| 个人基本情况 |
| 致谢 |
| 文章发表情况 |
（3）人持续性G病毒二型在中国人群中的检出及其感染性克隆初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 黄病毒科病毒 |
| 1.2 GBV-C病毒(HPgV)简介 |
| 1.3 HPgV-2病毒简介 |
| 1.4 Pegivirus病毒的培养体系探索 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 HPgV-2在国内人群中的发现 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 HPgV-2感染人的致病性及细胞嗜性 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 技术路线 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 HPgV-2感染性克隆探索 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 技术路线 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本研究的不足之处 |
| 5.3 下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词汇总表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（4）基于金属有机配合物的生物传感器的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 纳米材料 |
| 1.1.1 纳米材料的分类 |
| 1.1.1.1 金属有机框架(MOFs) |
| 1.1.1.2 金属纳米团簇(MNCs) |
| 1.1.2 纳米材料的应用 |
| 1.1.2.1 环境领域 |
| 1.1.2.2 生物医药领域 |
| 1.2 生物传感器 |
| 1.2.1 生物传感器的定义 |
| 1.2.2 生物传感器的分类 |
| 1.2.2.1 免疫传感器 |
| 1.2.2.2 酶传感器 |
| 1.2.2.3 ECL传感器 |
| 1.3 荧光分析法 |
| 1.3.1 荧光产生的原理 |
| 1.3.2 荧光分析法的分类及其影响因素 |
| 1.4 本论文拟开展研究内容及意义 |
| 2 Ti_3C_2T_x/ZIF-8纳米复合材料的合成及其对HIV-1适配体蛋白的检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 纳米材料的合成 |
| 2.2.2.1 Ti_3C_2T_x,ZIF-8和Ti_3C_2T_x/ZIF-8 的合成 |
| 2.2.2.2 Ti_3C_2T_x/GCE、ZIF-8/GCE和Ti_3C_2T_x/ZIF-8/GCE纳米材料的合成 |
| 2.2.2.3 CCB/MNPs猝灭剂和ssDNA/CCB/MNPs纳米复合材料的合成 |
| 2.2.2.4 构建ECL适配体传感器并检测HIV-1 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 纳米复合材料的形貌表征 |
| 2.3.2 实验条件优化 |
| 2.3.3 Ti_3C_2T_x/ZIF-8的ECL响应机制 |
| 2.3.4 不同修饰电极上的ECL行为 |
| 2.3.5 生物传感器对HIV-1的ECL响应 |
| 2.3.6 稳定性,重复性和选择性 |
| 2.3.7 实际样品的检测 |
| 2.4 小结 |
| 3 基于金属有机骨架包裹Ru(bpy)_3~(2+)并用来检测CYFRA21-1的电化学发光生物传感器 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 纳米材料的合成 |
| 3.2.2.1 CD-MOF和CD-MOF@Ru(bpy)_3~(2+)的合成 |
| 3.2.2.2 CdTe纳米材料的合成 |
| 3.2.2.3 构建ECL传感器并用来检测CYFRA21-1 |
| 3.2.2.4 细胞毒性的测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 CD-MOF@Ru(bpy)_3~(2+)纳米复合材料的形貌表征 |
| 3.3.2 实验条件优化 |
| 3.3.3 不同修饰电极上的ECL行为 |
| 3.3.4 生物传感器对CYFRA21-1的ECL响应 |
| 3.3.5 细胞毒性检测、稳定性和选择性 |
| 3.3.6 实际样品的检测 |
| 3.4 小结 |
| 4 CuNCs@Tb-GMP纳米复合材料的制备及其对碱性磷酸酶的检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 纳米材料的合成 |
| 4.2.2.1 CuNCs的合成 |
| 4.2.2.2 Tb-GMP及CuNCs@Tb-GMP纳米材料的合成 |
| 4.2.2.3 比率型检测ALP的活性 |
| 4.2.2.4 实际样品的处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 纳米复合材料的形貌表征 |
| 4.3.2 实验条件优化 |
| 4.3.3 生物传感器对ALP的荧光响应 |
| 4.3.4 稳定性和选择性 |
| 4.3.5 实际样品的检测 |
| 4.4 小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）HIV感染导致人内源性逆转录病毒K族（HERV-K）转录水平差异的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 HIV-1 感染者外周血淋巴细胞中HERV-K转录水平的研究及HIV-1 全新第二代重组亚型CRF102_0107 的鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 样本来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要耗材 |
| 1.2 方法步骤 |
| 1.2.1 提取细胞内总RNA |
| 1.2.2 RNA反转录cDNA |
| 1.2.3 HIV-1 pol-1.3k区 PCR扩增 |
| 1.2.4 第二轮PCR产物鉴定 |
| 1.2.5 PCR扩增产物测序及序列拼接 |
| 1.2.6 序列分析方法 |
| 1.2.7 潜在CRF样本进行近似全长扩增 |
| 1.2.8 半分子序列第二轮PCR产物鉴定 |
| 1.2.9 半分子序列PCR扩增产物测序及近似全长序列拼接 |
| 1.2.10 近似全长序列分析方法 |
| 1.2.11 实时定量PCR |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 HIV-1 感染者与健康对照的流行病学背景信息 |
| 1.3.2 不同HIV-1 亚型感染者体内HERV-K(HML-2)转录水平的对比 |
| 1.3.3 新型HIV-1 流行重组毒株亚型(CRF102_0107)鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 利用体外细胞模型研究 HIV-1 感染导致HERV-K转录水平的变化的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要耗材 |
| 2.2 方法步骤 |
| 2.2.1 MT2、H9 细胞的培养 |
| 2.2.2 ⅢB毒株感染MT2、H9 细胞 |
| 2.2.3 TZM-bl、293T细胞的培养 |
| 2.2.4 ⅢB毒株感染TZM-bl、293T细胞 |
| 2.2.5 提取细胞内总RNA |
| 2.2.6 RNA反转录cDNA |
| 2.2.7 实时定量PCR |
| 2.2.8 ⅢB、NL4-3、GX002 毒株感染MT2 细胞 |
| 2.2.9 细胞总RNA提取,反转录,实时定量PCR |
| 2.2.10 RNAscope检测MT2 细胞内HIV-1和HERV-K转录水平 |
| 2.2.11 检测培养上清液的HIV-1 p24 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HIV-1ⅢB株感染不同组织来源的细胞HERV-K转录水平存在差异 |
| 2.3.2 不同亚型HIV-1 毒株感染MT2 细胞,HERV-K转录水平变化存在差异 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HIV-1 Tat蛋白对细胞HERV-K转录影响的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞与质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要耗材 |
| 3.2 方法步骤 |
| 3.2.1 293T细胞系的培养 |
| 3.2.2 293T细胞铺6 孔板 |
| 3.2.3 转染293T细胞 |
| 3.2.4 慢病毒培养上清液p24 抗原测定 |
| 3.2.5 pLVX-Tat和 pLVX-TetOn慢病毒共同感染MT2 细胞 |
| 3.2.6 细胞内总RNA提取,反转录反应,实时定量PCR |
| 3.2.7 Tat表达情况分析 |
| 3.2.8 有限稀释培养单克隆细胞 |
| 3.2.9 细胞内总RNA提取,反转录反应,实时定量PCR |
| 3.2.10 多西环素DOX激活Tat蛋白表达 |
| 3.2.11 细胞内Tat蛋白鉴定 |
| 3.2.12 细胞内总RNA提取,反转录反应,实时定量PCR |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 成功构建高表达Tat蛋白的MT2 细胞 |
| 3.3.2 不同Tat蛋白亚型对MT2 细胞HERV-K(HML-2)转录水平变化存在差异 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）2011-2018年深圳地区HIV-1新型重组毒株形成及流行特点研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、HIV-1基因多态性与全球流行状况 |
| 二、HIV-1重组毒株的流行与传播 |
| 三、我国深圳HIV-1流行情况复杂 |
| 四、HIV-1双重感染对HIV-1重组的影响 |
| 五、深度测序在HIV-1双重感染与劣势耐药检测中的应用 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、常用实验仪器设备 |
| 三、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、中国HIV-1新型重组毒株流行状况研究 |
| 二、深圳HIV-1新型重组毒株发生与近似全长基因组特点研究 |
| 三、深圳HIV-1双重感染与劣势耐药的发生与流行研究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）云南地区艾滋病患者中预存耐药基因流行特征及HIV-1新重组型的命名（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 艾滋病病毒(HIV)与艾滋病(AIDS) |
| 1.1.1 HIV的起源 |
| 1.1.2 HIV与艾滋病(AIDS) |
| 1.1.3 HIV病毒学特征及其基因组结构 |
| 1.1.4 HIV病毒的复制 |
| 1.2 HIV的感染与流行 |
| 1.2.1 HIV的感染 |
| 1.2.2 HIV在全球,中国及云南的流行情况 |
| 1.3 HIV-1 的耐药与耐药检测 |
| 1.3.1 HIV-1 的临床治疗 |
| 1.3.2 HIV-1 的临床药物 |
| 1.3.3 HIV-1 的耐药相关突变 |
| 1.3.4 HIV-1 的预存耐药 |
| 1.3.5 HIV-1 的耐药性检测 |
| 1.4 HIV-1 的基因型与重组 |
| 1.4.1 HIV-1 的基因型 |
| 1.4.2 HIV-1 的重组及其流行 |
| 1.5 下一代测序技术在HIV-1 的耐药性检测中的应用 |
| 1.6 本论文研究内容及目的和意义 |
| 1.7 本论文技术路线 |
| 第二章 云南地区2017-2020 年预存耐药研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验对象和材料 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.2.3 实验仪器和设备 |
| 2.2.4 实验数据分析 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 引物设计和合成 |
| 2.3.2 病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 HIV-1 样本的pol区(1.2kb)进行巢式扩增 |
| 2.3.4 PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.5 样本纯化及送测序 |
| 2.3.6 双峰样品TA克隆 |
| 2.3.7 耐药位点分析方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 2017-2020 年未经治疗的 HIV-1 感染患者人口学特征 |
| 2.4.2 1411 例未经治疗的 HIV-1 患者的 PR、RT 区扩增 |
| 2.4.3 1411 例未治疗的 HIV-1 患者中高度耐药相关突变位点及其耐药性 |
| 2.4.4 2017-2020 年未经治疗的 HIV-1患者的非高度耐药相关突变及其耐药性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 云南地区2017-2020 年HIV-1耐药相关突变与基因型流行关系 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验对象及材料 |
| 3.2.1 实验对象 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 2017-2020 年总体HIV-1 基因型分子流行特征 |
| 3.4.2 2017-2020 年间基因型流行变化 |
| 3.4.3 高度耐药相关突变和基因型流行关系 |
| 3.4.4 非高度耐药相关突变和基因型流行关系 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 云南地区新的HIV-1 重组型的发现和命名 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验对象及材料 |
| 4.2.1 实验对象 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 引物设计和合成 |
| 4.3.2 病毒RNA的提取 |
| 4.3.3 进行巢式PCR扩增 |
| 4.3.4 PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 4.3.5 样本纯化及送测序 |
| 4.3.6 双峰样品TA克隆 |
| 4.3.7 基因型重组分析方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 HIV-1 2.6kb(gag-pol区)序列分析结果 |
| 4.4.2 全长样品扩增结果 |
| 4.4.3 CRF110_BC重组的结果分析 |
| 4.4.4 CRF118_BC重组的结果分析 |
| 4.4.5 一组新的B和C重组的结果分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A攻读硕士期间发表论文目录 |
（8）HIV-1融合蛋白gp41代偿性突变的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 细胞及质粒 |
| 1.3 工具酶及感受态 |
| 1.4 抗体 |
| 1.5 多肽 |
| 1.6 引物 |
| 1.7 溶液和培养基 |
| 1.8 试剂盒 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 以实验株包膜蛋白质粒为模板的氨基酸点突变 |
| 2.2 包膜蛋白的表达检测 |
| 2.3 假病毒包装及滴度测定 |
| 2.4 定量单次入侵实验 |
| 2.5 抗病毒实验 |
| 2.6 细胞融合实验 |
| 2.7 Native-PAGE |
| 2.8 圆二色谱检测螺旋稳定性 |
| 2.9 等温滴定量热仪检测多肽相互作用亲和力 |
| 2.10 晶体结构解析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 N126K和E136G突变的功能及机制研究 |
| 3.1.1 N126K和E136G突变假病毒对膜融合抑制剂敏感性的鉴定 |
| 3.1.2 不同亚型HIV-1病毒N126K和E136G突变对膜融合抑制剂的耐药特征 |
| 3.1.3 N126K和E136G突变对病毒包膜蛋白功能的影响 |
| 3.1.4 N126K和E136G突变不影响包膜蛋白的表达和加工 |
| 3.1.5 代偿性突变能够改变六螺旋束(6-HB)结构的稳定性 |
| 3.1.6 N126K,E136G融合后晶体结构解析 |
| 3.2 N126和E136自然突变的功能及机制研究 |
| 3.2.1 自然突变对膜融合抑制剂敏感性的影响 |
| 3.2.2 自然突变对病毒功能的影响 |
| 3.2.3 自然突变不影响包膜蛋白表达和加工 |
| 3.2.4 自然突变对六螺旋束结构的影响 |
| 3.3 代偿性突变对膜融合抑制剂活性的影响 |
| 3.3.1 N126K突变C肽对病毒的抑制作用增加 |
| 3.3.2 自然突变影响C34多肽的抗病毒活性 |
| 3.3.3 含有N126K和N126Y突变的C34多肽抗病毒活性鉴定 |
| 3.3.4 N126Y突变可以提高T20多肽的抗病毒活性 |
| 4. 讨论 |
| 5. 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 HIV-1膜融合抑制剂及耐药作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）猪圆环病毒的入核机制研究（论文提纲范文）
| 本研究获得以下项目资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文创新点 |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的发现与分类学地位 |
| 2 猪圆环病毒的流行 |
| 3 猪圆环病毒的基因组结构 |
| 4 猪圆环病毒基因组的编码蛋白及其功能 |
| 4.1 Rep蛋白和Rep'蛋白 |
| 4.2 Cap蛋白 |
| 4.3 ORF3蛋白 |
| 4.4 ORF4蛋白 |
| 5 猪圆环病毒的起源 |
| 6 猪圆环病毒的跨种传播 |
| 7 猪圆环病毒的培养增殖和感染性克隆研究进展 |
| 第二章 HDAC6蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 HDAC6:它与其他HDACs有什么不同? |
| 2 HDAC6蛋白的结构特征 |
| 3 HDAC6蛋白的功能特异性 |
| 3.1 去乙酰化酶依赖性功能 |
| 3.2 泛素依赖性功能 |
| 4 HDAC6蛋白抑制病毒的感染(抗病毒) |
| 4.1 调节微管稳定性以抑制病毒感染 |
| 4.2 融合和入侵 |
| 4.3 核靶向运输 |
| 4.4 复制 |
| 4.5 组装和释放 |
| 4.6 调控抗病毒免疫应答 |
| 5 HDAC6蛋白促进病毒的感染(促病毒) |
| 5.1 HDAC6介导的聚集体途径有利于病毒的脱衣壳 |
| 5.2 促进病毒的致病过程 |
| 6 展望 |
| 第三章 病毒入核机制的研究进展 |
| 1 细胞的核转运过程概述 |
| 2 病毒入核与核膜 |
| 3 病毒破坏核膜或核纤层入核 |
| 4 囊膜病毒的入核 |
| 5 无囊膜病毒的入核 |
| 第四章 NPM1蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 核仁磷蛋白NPM1的结构特征和主要功能 |
| 2 在病毒感染过程中NPM1蛋白与不同病毒蛋白的相互作用 |
| 2.1 腺病毒(AdV) |
| 2.2 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) |
| 2.3 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) |
| 2.4 丙型肝炎病毒(HCV) |
| 2.5 乙型肝炎病毒(HBV) |
| 2.6 丁型肝炎病毒(HDV) |
| 2.7 其他病毒 |
| 3 NPM1蛋白抑制剂作为抗病毒治疗药物 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 HDAC6酶活性测定 |
| 2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.13 原核表达 |
| 2.14 GST pull-down |
| 2.15 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.16 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.17 病毒滴度测定 |
| 2.18 细胞活力检测实验 |
| 2.19 HDAC6蛋白过表达细胞系的构建 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 Cap蛋白能促进PK-15细胞中α-tubulin的乙酰化修饰水平 |
| 3.2 微管蛋白乙酰化水平调节对PCV2感染增殖的影响 |
| 3.3 PCV2感染的PK-15细胞或质粒转染的293T细胞中Cap蛋白和HDAC6的亚细胞定位分析 |
| 3.4 PCV2 Cap蛋白与HDAC6的互作关系分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白的42-100位氨基酸介导与HDAC6蛋白的相互作用 |
| 3.6 HDAC6蛋白的HD1、HD2和ZnF结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性 |
| 3.8 HDAC6蛋白抑制PCV2病毒的复制 |
| 4 讨论 |
| 第二章 PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 病毒接种 |
| 2.9 蛋白样品制备 |
| 2.10 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.11 原核表达 |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 银染 |
| 2.15 蛋白质相互作用网络的构建与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀串联质谱方法鉴定PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白 |
| 3.2 蛋白质相互作用网络图谱的绘制与分析 |
| 3.3 GO注释与分析 |
| 3.4 KEGG通路富集分析 |
| 3.5 验证PCV2 Cap蛋白与宿主蛋白的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第三章 核仁磷蛋白NPM1调控PCV2病毒入核的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.15 病毒滴度测定 |
| 2.16 细胞活力检测实验 |
| 2.17 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.18 wt-和mA-PCV2突变体病毒拯救 |
| 2.19 胞浆/胞核组分抽提 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2感染PK-15细胞中NPM1蛋白水平的变化 |
| 3.2 NPM1的RNAi细胞系的建立 |
| 3.3 NPM1蛋白促进PCV2病毒的复制 |
| 3.4 PCV2感染或质粒转染的PK-15细胞中病毒蛋白Cap、Rep、ORF3、ORF4和NPM1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白与NPM1的互作关系分析 |
| 3.6 PCV2 Cap蛋白的核定位信号(NLS)介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白NLS-A的精氨酸富集区(ARM)是与NPM1蛋白互作的关键氨基酸位点 |
| 3.8 PCV2 Cap蛋白的ARM是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1-OligoD结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.10 NPM1蛋白的Ser48介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.11 NPM1蛋白Ser48的保守性和PCV2 Cap蛋白NLS-A与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.12 NPM1蛋白敲降细胞系中回补mNPM1不同突变体对PCV2复制的影响 |
| 3.13 NPM1蛋白促进PCV2病毒的入核 |
| 3.14 在PCV2感染晚期,NPM1蛋白从核仁易位至胞质 |
| 3.15 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的拯救 |
| 3.16 PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM对于PCV2的复制具有重要作用 |
| 3.17 wt-PCV2和mA-PCV2的Cap蛋白与NPM1在病毒感染细胞中的互作关系分析 |
| 3.18 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的入核能力分析 |
| 3.19 NPM1蛋白与PCV2病毒衣壳蛋白结合促进PCV2病毒入核的分子模型 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.8 蛋白样品制备 |
| 2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.10 GST pull-down |
| 2.11 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.12 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NPM1蛋白对于PCV3 Cap蛋白的核仁定位是必需的 |
| 3.2 PCV3 Cap蛋白与NPM1蛋白在转染细胞中的共定位分析 |
| 3.3 PCV3 Cap蛋白与NPM1在质粒转染细胞中的互作关系分析 |
| 3.4 质粒共转外源性表达蛋白的互作关系分析 |
| 3.5 体外表达纯化蛋白的互作关系分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 不同种属的圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的互作 |
| 3.8 PCV3 Cap蛋白的NLS同时也是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1蛋白与PCV3 Cap蛋白互作关键氨基酸位点的鉴定 |
| 3.10 PCV3 Cap蛋白NLS(1-34aa)与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.11 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定NPM1/PCV3 Cap的相互作用 |
| 3.12 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质影响NPM1蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 本文所用引物列表 |
| 附录B 不同种属的圆环病毒Cap蛋白的NLS序列 |
| 附录C 全文缩略词 |
| 附录D 常用缓冲液及培养基配方 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）我国16-25岁异性性传播感染者HIV基因变化及耐药特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分: 我国16-25岁异性性传播感染者中主要HIV流行株基因亚型和亚簇的变化及耐药情况1.1 材料和方法 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本部分小结 |
| 第二部分: 我国16-25岁异性性传播感染者HIV不能明确划分亚型分析2.1 材料和方法 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本部分小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 我国HIV重组株快速传播相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人经历 |
| 个人发表文章 |
| 致谢 |
四、HIV-1的分类与命名（论文参考文献）
- [1]HIV-1新发感染综合判定研究及我国出入境人群的HIV-1新发感染特征分析[D]. 林倩茹. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]中缅边境地区HIV-1流行特征及其病毒对M36.4抗体敏感性研究[D]. 丁奕博. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [3]人持续性G病毒二型在中国人群中的检出及其感染性克隆初步探索[D]. 万政伟. 南方医科大学, 2021(02)
- [4]基于金属有机配合物的生物传感器的制备及应用[D]. 王云飞. 烟台大学, 2021(09)
- [5]HIV感染导致人内源性逆转录病毒K族（HERV-K）转录水平差异的研究[D]. 李曦. 军事科学院, 2021(02)
- [6]2011-2018年深圳地区HIV-1新型重组毒株形成及流行特点研究[D]. 王晓蕊. 山东大学, 2021(11)
- [7]云南地区艾滋病患者中预存耐药基因流行特征及HIV-1新重组型的命名[D]. 高庆华. 昆明理工大学, 2021(02)
- [8]HIV-1融合蛋白gp41代偿性突变的功能及机制研究[D]. 于丹葳. 北京协和医学院, 2021(02)
- [9]猪圆环病毒的入核机制研究[D]. 周建卫. 浙江大学, 2020
- [10]我国16-25岁异性性传播感染者HIV基因变化及耐药特征研究[D]. 周佳佳. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)